治療炎癥疾病的方法和無(wú)細(xì)胞組合物的制作方法
【專利說(shuō)明】治療炎癥疾病的方法和無(wú)細(xì)胞組合物
[0001 ] 介紹
[0002] 本技術(shù)設(shè)及一種治療炎性疾病，包括骨關(guān)節(jié)炎的方法。特別是，方法包括使用含細(xì) 胞因子的無(wú)細(xì)胞溶液。
[0003] 炎癥是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞和生化過(guò)程，其發(fā)生在受影響的血管和鄰近組織中，W應(yīng) 答由物理、化學(xué)或生物制劑，例如病原體、過(guò)敏原或刺激物，引起的損傷或異常刺激。炎癥過(guò) 程包括局部反應(yīng)和在組織中產(chǎn)生的形態(tài)變化;破壞或去除致病物；W及導(dǎo)致修復(fù)和愈合的 應(yīng)答。在大多數(shù)情況下，炎癥是一種有益的且短暫的過(guò)程，當(dāng)機(jī)體攻擊和克服了傳染原或其 他有害物質(zhì)，就會(huì)消退。然而，在某些情況下，炎癥能夠是慢性自我延續(xù)的過(guò)程，例如，作為 正在進(jìn)行的退化過(guò)程(如關(guān)節(jié)炎)或自身免疫性疾病的部分，導(dǎo)致組織破壞。慢性炎癥與多 種疾病相關(guān)，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、缺血性屯、臟病、牙周炎、結(jié)腸炎和一些癌 癥。
[0004] 炎癥應(yīng)答由許多生化反應(yīng)組成，設(shè)及局部血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，W及受損組織內(nèi) 的各種細(xì)胞。該過(guò)程設(shè)及釋放許多來(lái)源于細(xì)胞的介質(zhì)，包括組胺、丫干擾素、白介素8、白= 締、一氧化氮、前列腺素、腫瘤壞死因子a和白介素-1。尤其是，白介素-1(化-1)包括細(xì)胞因 子家族，其能刺激淋己細(xì)胞和巨隧細(xì)胞，活化隧菌細(xì)胞，增加前列腺素的產(chǎn)生，有助于骨關(guān) 節(jié)退化，提高骨髓細(xì)胞的增殖，并參與許多慢性炎性病癥?；?1可由巨隧細(xì)胞、單核細(xì)胞和 樹突細(xì)胞產(chǎn)生，并且可W是抗感染的炎性應(yīng)答的部分。
[0005] IL-I的作用模式可W通過(guò)白介素-1受體括抗蛋白（化-Ira;也稱為"IRAP")來(lái)介 導(dǎo)。比-Ira與]X-I結(jié)合細(xì)胞表面上相同的受體，從而阻止]X-I發(fā)送信號(hào)到該細(xì)胞。比-Ira分 泌自白細(xì)胞，包括單核細(xì)胞、巨隧細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、多形核細(xì)胞(P麗)和其他細(xì)胞，并且可 W調(diào)節(jié)各種化-1相關(guān)的免疫和炎性應(yīng)答，如Arend WP，Malyak M，Guthridge CJ，Gabay C (1998)"Interleukin-l receptor antagonist:role in biology"Annu.Rev.Immunol.16: 27-55所述?；?Ira的產(chǎn)生是由一些物質(zhì)刺激的，所述物質(zhì)包括粘附免疫球蛋白G(IgG)、其 他細(xì)胞因子W及細(xì)菌或病毒組分。比-Ira，W及其它細(xì)胞因子，如可溶性腫瘤壞死因子受體 1 (STNF-Rl )、可溶性腫瘤壞死因子受體2 (STNF-R2)和可溶性白介素受體II (SlklRII )，是 關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎、和肉芽腫性肺病中的重要的天然抗炎蛋白。
[0006] IL-Ira可W用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，一種自身免疫性疾病，其中IL-I起著關(guān)鍵 的作用，減輕與所述疾病相關(guān)的炎癥和軟骨退化。例如，Kineret?(anakinra)是重組的、非 糖基化形式的Iklra(Amgen Manufacturing,Ltd. ,Thousand Oaks,California)。各種重 組白介素-I抑制劑和治療方法描述于美國(guó)專利號(hào)6599873，Sommer等人，公開于2003年7月 29日；美國(guó)專利號(hào)5075222,化nnum等人，公開于1991年12月24日；美國(guó)申請(qǐng)公開號(hào)2005/ 0197293 ,Mellis等人，公開于2005年9月8日。另外，從體液產(chǎn)生比-Ira，包括使用自體的液 體的方法，描述于美國(guó)專利號(hào)6623472，Reinecke等人，公開于2003年9月23日；美國(guó)專利號(hào) 6713246 ,Reinecke等人，公開于2004年3月30日；美國(guó)專利號(hào)6759188 ,Reinecke等人，公開 于2004年7月6日。
[0007] 許多炎癥治療是已知的現(xiàn)有技術(shù)。本領(lǐng)域中已知的治療，可針對(duì)去除引起的炎癥 反應(yīng)的潛在刺激物或物質(zhì)，或通過(guò)介導(dǎo)炎性應(yīng)答的一個(gè)或多個(gè)方面。實(shí)例包括糖皮質(zhì)類固 醇(例如氨化可的松、可的松、潑尼松和倍氯米松）、非類固醇抗炎藥(例如阿司匹林、布洛芬 和糞普生)和免疫選擇性抗炎藥。然而，許多治療存在副作用，特別是在長(zhǎng)期施用期間，或者 具有限制其使用的藥理學(xué)特性。例如，雖然使用IL-Ira的組合物和方法是本領(lǐng)域已知的，它 們可能與比-Ira的穩(wěn)定性和半衰期相關(guān)，W及與所供比-Lra的量和速率有關(guān)。此外，許多治 療無(wú)助于解決炎癥過(guò)程的潛在原因。因此，需要治療炎癥的改進(jìn)的方法，提供提高的功效， 降低的副作用，W及改進(jìn)的給藥特性的一種或多種。
[000引 概要
[0009] 本技術(shù)提供生成包含抗炎性細(xì)胞因子的無(wú)細(xì)胞組合物的方法，所述組合物用于治 療由白介素-1和腫瘤壞死因子a介導(dǎo)的炎癥和其他疾病。此類組合物包含下列組分：
[0010] (a)白介素-1受體括抗劑（比-Ira);和
[0011] (b)可溶性腫瘤壞死因子受體I(sTNF-rl);
[0012] 其中，至少一個(gè)組分源于尿液、血液凝塊或組織培養(yǎng)物。在各種實(shí)施方案中，化-Ira的濃度至少約1〇,〇〇〇9旨/1111，31冊(cè)-1?1的濃度至少約120〇9旨/1111。該組合物可進(jìn)一步包含 可溶性腫瘤壞死因子受體II(STNF-RII)、來(lái)源于血小板的生長(zhǎng)因子AB和BB(PDGF-AB和 PDGF-BB)、表皮生長(zhǎng)因子化GF)和其混合物。在一些實(shí)施方案中，所述組合物還包含肝細(xì)胞 生長(zhǎng)因子(HG巧或可溶性白介素-1受體II(sIL-lRII)中的至少一種。
[0013] 還提供了生產(chǎn)組合物的方法，包括制備用于治療由IL-I介導(dǎo)的疾病的無(wú)細(xì)胞組合 物的方法，包括：
[0014] (a)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，所述細(xì)胞生產(chǎn)IL-IraW及，任選地，其它細(xì)胞因子， 如腫瘤壞死因子-a;
[0015] (b)分離培養(yǎng)基;和
[0016] (C)冷凍干燥組合物。
[0017] 培養(yǎng)可W單層培養(yǎng)的形式、在生物反應(yīng)器中或W非貼壁培養(yǎng)的形式來(lái)進(jìn)行，所述 培養(yǎng)使用經(jīng)基因工程化W過(guò)量生產(chǎn)IL-Ira的培養(yǎng)的細(xì)胞。
[0018] 方法還可W包括將細(xì)胞置于電磁場(chǎng)。
[0019] 所述無(wú)細(xì)胞組合物的組分也可源于生物學(xué)材料，例如血液凝塊和尿液。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1是用于產(chǎn)生血液凝塊的裝置的示意圖。
[0021] 圖2顯示用于濃縮血液凝塊提取物W產(chǎn)生抗炎性細(xì)胞因子的裝置，離屯、前（圖2A) 和離屯、后（圖2B)。
[0022] 相應(yīng)的參照數(shù)字表明整個(gè)附圖的幾個(gè)視圖中相應(yīng)的部分。應(yīng)當(dāng)指出的是，運(yùn)里所 闡述的附圖旨在舉例說(shuō)明本技術(shù)中的材料、組合物、裝置和方法的一般特征，目的在于描述 某些實(shí)施方案。運(yùn)些圖可能不會(huì)精確地反映任一給定實(shí)施方案的特征，且未必意在完全定 義或限制該技術(shù)的范圍內(nèi)的具體的實(shí)施方案。
[002引發(fā)明詳述
[0024] W下技術(shù)的描述僅僅示例一個(gè)或多個(gè)發(fā)明的組合物及其制備和使用的特性，并且 無(wú)意限制本申請(qǐng)或要求本申請(qǐng)優(yōu)先權(quán)的其他申請(qǐng)或由其獲得的專利中要求保護(hù)的任何特 定的發(fā)明的范圍、應(yīng)用或使用。在此發(fā)明詳述的結(jié)尾處提供旨在幫助理解本技術(shù)的術(shù)語(yǔ)和 短語(yǔ)的非限制性的討論。
[0025] 本技術(shù)設(shè)及組合物，制備組合物的方法，W及使用組合物治療炎性疾病，W及由白 介素-1介導(dǎo)的其他疾病的方法。組合物包括兩種或多種細(xì)胞因子，其中至少一種來(lái)源于尿 液、凝結(jié)的血液或組織培養(yǎng)物。
[0026] 蛋白質(zhì)組合物
[0027] 本技術(shù)提供用于治療人或其他哺乳動(dòng)物對(duì)象的炎性疾病，W及由白介素-1介導(dǎo)的 其他疾病的方法，所述方法使用包含生理學(xué)上可接受的培養(yǎng)基中溶解、懸浮或另外為輸送 到哺乳動(dòng)物對(duì)象而攜帶的蛋白質(zhì)的組合物(本文中稱為"蛋白質(zhì)溶液"）。在各種實(shí)施方案 中，運(yùn)樣的組合物包含原產(chǎn)于正常哺乳動(dòng)物對(duì)象的全血中的蛋白質(zhì)(例如，細(xì)胞因子）。
[0028] 本技術(shù)的組合物是無(wú)細(xì)胞。運(yùn)樣的"無(wú)細(xì)胞"的組合物不包含，或基本上不含，活的 白細(xì)胞、血小板或其它細(xì)胞。優(yōu)選地，雖然組合物可含有細(xì)胞來(lái)源的蛋白，但所述組合物不 包含能夠在哺乳動(dòng)物對(duì)象中引起免疫原性應(yīng)答的細(xì)胞碎片。
[0029] 在各種實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)溶液包含選自比-1^、31^-1?1、31^-1?11(可溶性 腫瘤壞死因子受體2)、10。-1(膜島素樣生長(zhǎng)因子1)、66。(表皮生長(zhǎng)因子）、服。(肝細(xì)胞生長(zhǎng) 因子）、PDGF-AB(來(lái)源于血小板的生長(zhǎng)因子AB)、PDGF-BB(來(lái)源于血小板的生長(zhǎng)因子BB)、 VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）、TGF-ei(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子m)和SlklRII(可溶性白介素受體II)的 至少兩種蛋白質(zhì)，其中組合物中每種蛋白的濃度大于其在正常血液中的濃度。為了清楚起 見，蛋白質(zhì)溶液可W含有所列舉的=個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)。雖然組合物中的每一個(gè)蛋白的濃度 有可能大于正常血液中它們各自的濃度，但沒有必要多于兩個(gè)蛋白質(zhì)的濃度大于正常的血 液它們各自的濃度。
[0030] 在各種實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)溶液包括W下組分。
[0031 ]表1蛋白質(zhì)溶液示范組分



[0036] 蛋白質(zhì)濃度可W使用本領(lǐng)域中已知的方法來(lái)測(cè)量。例如，可W根據(jù)制造商的說(shuō)明 用Quantikine人免疫測(cè)定（R&&D Systems , Inc . ,Minneapolis ,MN)來(lái)測(cè)定化-Ira、化-10、 比-8、sTNF-RI、TNF-a、化-6、sTNF-RII、比-10、比-13和化-4。免疫測(cè)定可測(cè)定肝細(xì)胞生長(zhǎng)因 子和可溶性IL-IRII。
[0037] 在各種實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)溶液中的一種或多種蛋白質(zhì)或其它組分的濃度大于其 在正常血液中的濃度。（較高濃度組分的組合物被說(shuō)成是"富含"運(yùn)些組分。）如本文所述，在 "正常"血液或其它組織中的組分的濃度是在哺乳動(dòng)物對(duì)象的一般群體，例如，在正常的全 血中發(fā)現(xiàn)的濃度。應(yīng)該理解的是，該濃度是物種特異的。
[0038] 因此，在各種實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)溶液的一種或多種組分的濃度大于正常血液中 的成分的濃度高于大約1.5倍、約2倍或約3倍。例如，相對(duì)于正常(全)血，組合物中的組分濃 度更高，具體如下：
[0039] ?比-Ira，其濃度高至少約2.5倍，或至少約3倍，或至少約5倍；
[0040] ? STNF-RI，其濃度高至少約2倍，或至少約2.5倍，或至少約3倍；
[00川 ?31肥-1?11，其濃度高至少約2倍，或至少約2.5倍，或至少約3倍；
[004引 ? slklRII，其濃度高至少約1.5倍，或至少約1.8倍，或至少約2倍；
[004引 ? EGF，其濃度高至少約2倍，或至少約3倍，或至少約5倍；
[0044] ? HGF，其濃度高至少約2倍，或至少約3倍，或至少約4倍；
[004引 ? PDGF-AB，其濃度高至少約2倍，或至少約3倍，或至少約5倍；
[0046] ? PDGF-BB，其濃度高至少約2倍，或至少約3倍，或至少約5倍；
[0047] ? TGF-化，其濃度高至少約3倍，或至少約4倍，或至少約6倍；
[004引 ? IGF-I，其濃度高至少約1.2倍，或至少約1.4倍，或至少約1.5倍；
[0049] 和
[0050] ? VEGF，其濃度高至少約2倍，或至少約2.5倍，或至少約3倍。
[0051] 例如，蛋白質(zhì)溶液可包括：
[0052] (a)至少約 10,000pg/ml 比-lra;
[0053] (b)至少約l，200pg/ml sTNF-RI;和
[0054] (C)選自 sTNF-RII、IGF-1、EGF、服F、PDGF-AB、PDGF-BB、VEGF、TGF-m和