本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及白介素25在銀屑病的發(fā)育中的作用。更具體地，本發(fā)明涉及試劑在制備藥物中的用途、制劑在制備藥物中的用途、激活免疫細(xì)胞的方法、抑制免疫細(xì)胞激活的方法、疫苗以及篩選藥物的方法。

背景技術(shù)：

銀屑病俗稱牛皮癬，是一種慢性炎癥性皮膚病，病程較長(zhǎng)，有易復(fù)發(fā)傾向，有的病例幾乎終生不愈。該病發(fā)病以青壯年為主，對(duì)患者的身體健康和精神狀況影響較大。其特征是表皮的過(guò)度增殖和真皮的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，臨床表現(xiàn)以紅斑、鱗屑為主，全身均可發(fā)病，以頭皮、四肢伸側(cè)較為常見(jiàn)，多在冬季加重。

然而，目前對(duì)于銀屑病仍有待研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題至少之一。為此，本發(fā)明提出了試劑在制備藥物中的用途、制劑在制備藥物中的用途、激活免疫細(xì)胞的方法、抑制免疫細(xì)胞激活的方法、疫苗以及篩選藥物的方法。

在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提出了試劑在制備藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物用于抑制免疫系統(tǒng)激活，所述試劑選自下列的至少之一：(1)白介素25拮抗劑或其功能類似物；(2)il-17rb拮抗劑或其功能類似物；(3)stat3拮抗劑或其功能類似物；(4)白介素17拮抗劑或其功能類似物；以及(5)白介素25、il-17rb、白介素17或者stat3的表達(dá)抑制劑。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的試劑能夠有效地抑制免疫細(xì)胞活化，從而抑制免疫系統(tǒng)的激活。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述試劑在制備藥物中的用途還可以具有下列附加技術(shù)特征：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物用于治療自身免疫性疾病。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的試劑能夠有效地抑制免疫細(xì)胞活化，抑制免疫系統(tǒng)的激活，從而起到治療自身免疫性疾病的效果。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物用于治療銀屑病。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的試劑能夠有效地抑制免疫細(xì)胞活化，抑制免疫系統(tǒng)的激活，從而起到治療銀屑病的效果。

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提出了制劑在制備藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物用于激活免疫系統(tǒng)，所述制劑選自下列的至少之一：(a)白介素25或其功能類似物；(b)分泌白介素25或其功能類似物的細(xì)胞；(c)白介素25激動(dòng)劑或其類似物；(d)il-17rb或其功能類似物；(e)il-17rb激動(dòng)劑或其功能類似物；(f)stat3或其功能類似物；(g)白介素17或其功能類似物；以及(h)(a)～(g)任一項(xiàng)的表達(dá)促進(jìn)劑。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的制劑能夠有效地促進(jìn)免疫細(xì)胞活化，從而激活免疫系統(tǒng)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物用于治療免疫缺陷性疾病。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的制劑能夠有效地促進(jìn)免疫細(xì)胞活化，激活免疫系統(tǒng)，從而起到治療免疫缺陷性疾病的效果。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述分泌白介素25的細(xì)胞為角質(zhì)形成細(xì)胞。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的制劑能夠有效地促進(jìn)免疫細(xì)胞活化，激活免疫系統(tǒng)。

在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種激活免疫細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：使免疫細(xì)胞與選自下列的至少之一接觸：(a)白介素25或其功能類似物；(b)分泌白介素25或其功能類似物的細(xì)胞；(c)白介素25激動(dòng)劑或其類似物；(d)il-17rb或其功能類似物；(e)il-17rb激動(dòng)劑或其功能類似物；(f)stat3或其功能類似物；(g)白介素17或其功能類似物；以及(h)(a)～(g)任一項(xiàng)的表達(dá)促進(jìn)劑。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法能夠有效地激活免疫細(xì)胞。

在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種抑制免疫細(xì)胞激活的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：使免疫細(xì)胞與選自下列的至少之一接觸：(1)白介素25拮抗劑或其功能類似物；(2)il-17rb拮抗劑或其功能類似物；(3)stat3拮抗劑或其功能類似物；(4)白介素17拮抗劑或其功能類似物；以及(5)白介素25、il-17rb、白介素17或者stat3的表達(dá)抑制劑。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法能夠有效地抑制免疫細(xì)胞激活。

在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種疫苗。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述疫苗含有抗原以及選自下列的至少之一：(a)白介素25或其功能類似物；(b)分泌白介素25或其功能類似物的細(xì)胞；(c)白介素25激動(dòng)劑或其類似物；(d)il-17rb或其功能類似物；(e)il-17rb激動(dòng)劑或其功能類似物；(f)stat3或其功能類似物；(g)白介素17或其功能類似物；以及(h)(a)～(g)任一項(xiàng)的表達(dá)促進(jìn)劑。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法能夠有效地促進(jìn)免疫細(xì)胞活化，從而激活免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。

在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種篩選藥物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：將候選試劑與細(xì)胞接觸，所述細(xì)胞分泌白介素25；以及確定所述接觸前后，所述細(xì)胞的白介素25表達(dá)水平，其中，所述接觸后所述白介素25表達(dá)升高，是所述候選試劑作為免疫缺陷性疾病藥物的指示；所述接觸后所述白介素25表達(dá)降低，是所述候選試劑作為自身免疫性疾病藥物的指示。由此，利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的篩選藥物的方法能夠獲得自體免疫疾病藥物或免疫激活藥物。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

附圖說(shuō)明

本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：

圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的白介素25誘導(dǎo)小鼠皮膚增厚和炎癥的分析示意圖；

圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的銀屑病皮膚炎癥在白介素25敲除的小鼠中的表型分析示意圖；

圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的白介素17介導(dǎo)的銀血病發(fā)育過(guò)程中起始白介素25表達(dá)的分析示意圖；

圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的角質(zhì)形成細(xì)胞中白介素25的敲除對(duì)小鼠銀屑病癥狀影響的分析示意圖；

圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的白介素25的受體il-17rb在非髓系中的敲除對(duì)imq誘導(dǎo)的銀屑病表型影響的分析示意圖；

圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的銀屑病25促進(jìn)皮膚表皮細(xì)胞的增殖且調(diào)節(jié)皮膚增殖與炎癥相關(guān)基因的表達(dá)的分析示意圖；

圖7顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的接頭蛋白act1和stat3的信號(hào)通路對(duì)于白介素25誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖影響的分析示意圖；以及

圖8顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的白介素25激活接頭蛋白act1和stat3來(lái)發(fā)揮在角質(zhì)形成細(xì)胞上的功能的分析示意圖。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。

定義和一般術(shù)語(yǔ)

本發(fā)明意圖涵蓋所有的替代、修改和等同技術(shù)方案，它們均包括在如權(quán)利要求定義的本發(fā)明范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，許多與本文所述類似或等同的方法和材料能夠用于實(shí)踐本發(fā)明。本發(fā)明絕不限于本文所述的方法和材料。在所結(jié)合的文獻(xiàn)、專利和類似材料的一篇或多篇與本申請(qǐng)不同或相矛盾的情況下(包括但不限于所定義的術(shù)語(yǔ)、術(shù)語(yǔ)應(yīng)用、所描述的技術(shù)，等等)，以本申請(qǐng)為準(zhǔn)。

應(yīng)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的某些特征，為清楚可見(jiàn)，在多個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案中進(jìn)行了描述，但也可以在單個(gè)實(shí)施例中以組合形式提供。反之，本發(fā)明的各種特征，為簡(jiǎn)潔起見(jiàn)，在單個(gè)實(shí)施方案中進(jìn)行了描述，但也可以單獨(dú)或以任意適合的子組合提供。

除非另外說(shuō)明，本發(fā)明所使用的所有科技術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的通常理解相同的含義。本發(fā)明涉及的所有專利和公開出版物通過(guò)引用方式整體并入本發(fā)明。

除非另有說(shuō)明或者上下文中有明顯的沖突，本文所使用的冠詞“一”、“一個(gè)(種)”和“所述”旨在包括“至少一個(gè)”或“一個(gè)或多個(gè)”。因此，本文所使用的這些冠詞是指一個(gè)或多于一個(gè)(即至少一個(gè))賓語(yǔ)的冠詞。例如，“一組分”指一個(gè)或多個(gè)組分，即可能有多于一個(gè)的組分被考慮在所述實(shí)施方案的實(shí)施方式中采用或使用。

術(shù)語(yǔ)“含有”為開放式表達(dá)，即包括本發(fā)明所指明的內(nèi)容，但并不排除其他方面的內(nèi)容。

術(shù)語(yǔ)“功能類似物”是指具有相似功能的物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)不限定相同，只要具有相同或類似的功能即可。

術(shù)語(yǔ)“激動(dòng)劑”是指與某生物活性物質(zhì)的受體結(jié)合，呈現(xiàn)該活性物質(zhì)的作用的物質(zhì)或藥品。

術(shù)語(yǔ)“拮抗劑”是指能與受體結(jié)合，但不具備內(nèi)在活性的一類物質(zhì)。拮抗劑分為競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑和非競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑。

本發(fā)明所使用的“自身免疫性疾病”是指與體液或細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)身體自身組分應(yīng)答相關(guān)的組織損傷的任意疾病的集合。

本發(fā)明提出了試劑在制備藥物中的用途、制劑在制備藥物中的用途、激活免疫細(xì)胞的方法、抑制免疫細(xì)胞激活的方法、疫苗以及篩選藥物的方法。下面將分別對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)描述。

試劑在制備藥物中的用途

在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提出了試劑在制備藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物用于抑制免疫系統(tǒng)激活，所述試劑選自下列的至少之一：(1)白介素25拮抗劑或其功能類似物；(2)il-17rb拮抗劑或其功能類似物；(3)stat3拮抗劑或其功能類似物；(4)白介素17拮抗劑或其功能類似物；以及(5)白介素25、il-17rb、白介素17或者stat3的表達(dá)抑制劑。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，白介素25能夠激活免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致一些自身免疫性疾病的發(fā)生，例如銀屑病。白介素25在銀屑病人的皮膚中以及銀屑病小鼠模型中高表達(dá)，在小鼠皮膚中注射白介素25可以直接誘導(dǎo)出類似銀屑病的表型，而類似銀屑病表型在白介素25敲除的銀屑病小鼠模型中有顯著下降。體外實(shí)驗(yàn)證明白介素25對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的刺激可以引起多種炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的高表達(dá)，且這種作用是通過(guò)stat3的激活實(shí)現(xiàn)的。發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入研究發(fā)現(xiàn)，白介素25可以刺激其受體il-17rb的酪氨酸磷酸化，從而招募并且激活stat3來(lái)產(chǎn)生下游反應(yīng)。另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，白介素17可以顯著誘導(dǎo)白介素25的表達(dá)，而白介素17的缺失使得白介素25的表達(dá)不管在mrna水平還是蛋白水平都有顯著下降。因此，推斷出白介素25在銀屑病的發(fā)病過(guò)程中作為白介素17的一個(gè)重要的下游因子。為此，白介素25拮抗劑或其功能類似物、il-17rb拮抗劑或其功能類似物、stat3拮抗劑或其功能類似物、白介素25表達(dá)抑制劑、il-17rb表達(dá)抑制劑以及stat3表達(dá)抑制劑均能夠有效地抑制炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的高表達(dá)，抑制免疫系統(tǒng)激活，從而可以起到預(yù)防或者治療自身免疫性疾病的效果。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物用于治療自身免疫性疾病。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的試劑能夠有效地抑制免疫細(xì)胞活化，抑制免疫系統(tǒng)的激活，從而起到治療自身免疫性疾病的效果。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物用于治療銀屑病。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的試劑能夠有效地抑制免疫細(xì)胞活化，抑制免疫系統(tǒng)的激活，從而起到治療銀屑病的效果。

制劑在制備藥物中的用途

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提出了制劑在制備藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物用于激活免疫系統(tǒng)，所述制劑選自下列的至少之一：(a)白介素25或其功能類似物；(b)分泌白介素25或其功能類似物的細(xì)胞；(c)白介素25激動(dòng)劑或其類似物；(d)il-17rb或其功能類似物；(e)il-17rb激動(dòng)劑或其功能類似物；(f)stat3或其功能類似物；(g)白介素17或其功能類似物；以及(h)(a)～(g)任一項(xiàng)的表達(dá)促進(jìn)劑。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，白介素25能夠激活免疫系統(tǒng)，體外實(shí)驗(yàn)證明白介素25對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的刺激可以引起多種細(xì)胞因子和趨化因子的高表達(dá)，且這種作用是通過(guò)stat3的激活實(shí)現(xiàn)的。發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入研究發(fā)現(xiàn)，白介素25可以刺激其受體il-17rb的酪氨酸磷酸化，從而招募并且激活stat3來(lái)產(chǎn)生下游反應(yīng)。另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，白介素17可以顯著誘導(dǎo)白介素25的表達(dá)，而白介素17的缺失使得白介素25的表達(dá)不管在mrna水平還是蛋白水平都有顯著下降。因此，推斷出白介素25作為白介素17的一個(gè)重要的下游因子。為此，上述制劑能夠有效地促進(jìn)免疫細(xì)胞的高表達(dá)，激活免疫系統(tǒng)。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述藥物用于治療免疫缺陷性疾病。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的制劑能夠有效地促進(jìn)免疫細(xì)胞活化，激活免疫系統(tǒng)，從而起到治療免疫缺陷性疾病的效果。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述分泌白介素25的細(xì)胞為角質(zhì)形成細(xì)胞。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，角質(zhì)形成細(xì)胞是白介素25的主要來(lái)源。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的制劑能夠有效地促進(jìn)免疫細(xì)胞活化，激活免疫系統(tǒng)。

激活免疫細(xì)胞的方法

在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種激活免疫細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：使免疫細(xì)胞與選自下列的至少之一接觸：(a)白介素25或其功能類似物；(b)分泌白介素25或其功能類似物的細(xì)胞；(c)白介素25激動(dòng)劑或其類似物；(d)il-17rb或其功能類似物；(e)il-17rb激動(dòng)劑或其功能類似物；(f)stat3或其功能類似物；(g)白介素17或其功能類似物；以及(h)(a)～(g)任一項(xiàng)的表達(dá)促進(jìn)劑。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法能夠有效地激活免疫細(xì)胞。

本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的是，前面針對(duì)制劑在制備藥物中的用途所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，同樣適用于該激活免疫細(xì)胞的方法，在此不再贅述。

抑制免疫細(xì)胞激活的方法

在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種抑制免疫細(xì)胞激活的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：使免疫細(xì)胞與選自下列的至少之一接觸：(1)白介素25拮抗劑或其功能類似物；(2)il-17rb拮抗劑或其功能類似物；(3)stat3拮抗劑或其功能類似物；(4)白介素17拮抗劑或其功能類似物；以及(5)白介素25、il-17rb、白介素17或者stat3的表達(dá)抑制劑。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法能夠有效地抑制免疫細(xì)胞激活。

本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的是，前面針對(duì)試劑在制備藥物中的用途所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，同樣適用于該抑制免疫細(xì)胞激活的方法，在此不再贅述。

疫苗

在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種疫苗。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述疫苗含有抗原以及選自下列的至少之一：(a)白介素25或其功能類似物；(b)分泌白介素25或其功能類似物的細(xì)胞；(c)白介素25激動(dòng)劑或其類似物；(d)il-17rb或其功能類似物；(e)il-17rb激動(dòng)劑或其功能類似物；(f)stat3或其功能類似物；(g)白介素17或其功能類似物；以及(h)(a)～(g)任一項(xiàng)的表達(dá)促進(jìn)劑。由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法能夠有效地促進(jìn)免疫細(xì)胞活化，從而激活免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。

本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的是，前面針對(duì)制劑在制備藥物中的用途所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，同樣適用于該疫苗，在此不再贅述。

篩選藥物的方法

在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種篩選藥物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述方法包括：將候選試劑與細(xì)胞接觸，所述細(xì)胞分泌白介素25；以及確定所述接觸前后，所述細(xì)胞的白介素25表達(dá)水平，其中，所述接觸后所述白介素25表達(dá)升高，是所述候選試劑作為免疫缺陷性疾病藥物的指示；所述接觸后所述白介素25表達(dá)降低，是所述候選試劑作為自身免疫性疾病藥物的指示。

如前所述，白介素25的高表達(dá)能夠促進(jìn)免疫細(xì)胞活化，進(jìn)而激活免疫系統(tǒng)，起到預(yù)防和治療免疫缺陷性疾病的效果；白介素25表達(dá)被抑制會(huì)抑制免疫細(xì)胞活化，進(jìn)而抑制免疫系統(tǒng)，起到預(yù)防和治療自身免疫性疾病的效果。由此，利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的篩選藥物的方法能夠獲得自體免疫疾病藥物或免疫激活藥物。

需要說(shuō)明的是，“細(xì)胞分泌白介素25”應(yīng)作廣義理解，主要是指該細(xì)胞能夠分泌白介素25或者具有分泌白介素25的潛能。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，所述細(xì)胞為角質(zhì)形成細(xì)胞。

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方案進(jìn)行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

為了研究白介素25在銀屑病中的作用，首先檢測(cè)了在銀屑病病人中白介素25的表達(dá)。和正常病人的皮膚相比，銀屑病病人皮膚中的白介素25的表達(dá)在mrna和蛋白水平都有顯著上升。imq是一種普遍用來(lái)在小鼠身上誘導(dǎo)銀屑病表型的一種藥，采用該方法建立了小鼠銀屑病模型，在小鼠皮膚中，白介素25在mrna和蛋白水平均高表達(dá)。

為了進(jìn)一步探索25的作用，采用在皮膚中直接注射白介素25的蛋白。在一段時(shí)間的注射之后，皮膚表現(xiàn)出類似銀屑病的特征，包括表皮的過(guò)度增殖，真皮炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。更為重要的是，白介素25的注射顯著地在皮膚中提高了白介素25本身以及其受體的表達(dá)，還包括白介素17、白介素17c的表達(dá)，而白介素17和17c是已經(jīng)被證實(shí)在銀屑病發(fā)育過(guò)程中起重要作用的。

以上的數(shù)據(jù)暗示了白介素25在銀屑病的發(fā)育過(guò)程中可能的重要作用。為了進(jìn)一步確證這種作用，在白介素25缺失的小鼠上誘導(dǎo)了imq銀屑病模型，結(jié)果如圖1和圖2所示。圖1中，a：白介素25在正常皮膚和牛皮癬患者中的基因表達(dá)；b：白介素25在正常和銀屑病患者皮膚石蠟切片中的免疫熒光染色；c：白介素25在正常和imiquimod處理的小鼠皮膚中mrna水平的表達(dá)；d：在正常小鼠皮膚以及imq處理過(guò)的小鼠皮膚切片中白介素25的免疫熒光染色；e：分別用pbs(n＝5)或il-25(n＝5)注射的c57bl/6小鼠背部皮膚然后進(jìn)行色；f：用pbs(n＝5)或il-25(n＝5)注射c57bl/6小鼠的耳朵，進(jìn)行的h&e染色；g：用pbs(n＝5)或il-25(n＝5)注射c57bl/6小鼠耳朵，每天測(cè)試小鼠耳朵厚度；h：用pbs或者il-25注射小鼠皮膚后兩組間部分基因的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)三次，結(jié)果一致。比例尺在(b)和(d)中代表100μm，在(e)和(f)中代表50μm(放大圖)或100μm(縮小圖)。*p<0.05，**p<0.01；n.s.，沒(méi)有差別，p值用t-test來(lái)決定，數(shù)據(jù)以平均值正負(fù)標(biāo)注誤的形式來(lái)表示。

圖2中，a：野生型小鼠和白介素25基因敲除小鼠分別涂抹imq(咪喹莫特)來(lái)誘導(dǎo)銀屑病，持續(xù)3.5天做h&e染色并做表皮與真皮厚度統(tǒng)計(jì)。同時(shí)，分離真皮細(xì)胞并做流式分析髓系細(xì)胞比例，即cd45+細(xì)胞在各組中的比例(見(jiàn)b)；c：分析真皮髓系細(xì)胞同時(shí)分析在cd45+細(xì)胞中各種類型細(xì)胞的比例變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)三次,結(jié)果一致。比例尺代表50μm；*p<0.05，**p<0.01；n.s.，沒(méi)有差別，p值用t-test來(lái)決定，數(shù)據(jù)以平均值正負(fù)標(biāo)注誤的形式來(lái)表示。

結(jié)果表明，這種小鼠的銀屑病表型的嚴(yán)重程度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)輕于野生型的誘導(dǎo)了銀屑病模型的小鼠，而且這種小鼠皮膚中免疫細(xì)胞的數(shù)量和比例也要遠(yuǎn)低于野生型的小鼠。真皮中減少的免疫細(xì)胞包括樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和γδt細(xì)胞。除了中性粒細(xì)胞的比例相對(duì)于野生型有略微上升，這些細(xì)胞的比例和總細(xì)胞數(shù)都相對(duì)于野生型有較明顯的下降。同時(shí)，白介素25的缺失還導(dǎo)致了例如白介素17、22、6、23的mrna表達(dá)量下降。

總之，以上數(shù)據(jù)表明白介素25確實(shí)在銀屑病的發(fā)生發(fā)育過(guò)程中起重要作用。

實(shí)施例2

免疫熒光的數(shù)據(jù)證明了白介素25只在銀屑病皮膚的表皮層有表達(dá)，暗示了角質(zhì)形成細(xì)胞可能是白介素25的主要來(lái)源。由于缺乏托樣受體7/8，角質(zhì)形成細(xì)胞不能直接對(duì)imq做出反應(yīng)。為了證實(shí)白介素25是如何在皮膚中被起始表達(dá)的，在體外培養(yǎng)了角質(zhì)形成細(xì)胞并用不同的已經(jīng)被證實(shí)在銀屑病發(fā)生過(guò)程中有作用的因子去刺激這些細(xì)胞來(lái)檢測(cè)白介素25的表達(dá)被誘導(dǎo)的情況，這些因子包括白介素17、17c和tnf-α等。結(jié)果如圖3所示。其中a：在體外培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞并用不同的細(xì)胞因子去刺激來(lái)檢測(cè)白介素25的表達(dá)被誘導(dǎo)的情況；b和c：在銀屑病模型中，白介素25的表達(dá)在白介素17的缺失小鼠中不管在mrna水平還是蛋白水平都有顯著下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)三次，結(jié)果一致。比例尺在(c)中代表100μm，*p<0.05，**p<0.01；n.s.，沒(méi)有差別，p值用t-test來(lái)決定，數(shù)據(jù)以平均值正負(fù)標(biāo)注誤的形式來(lái)表示。

結(jié)果表明，在這些因子當(dāng)中，只有白介素17可以顯著地誘導(dǎo)白介素25的表達(dá)。而白介素17的缺失導(dǎo)致在銀屑病模型中白介素25的表達(dá)不管在mrna水平還是蛋白水平都有顯著下降。因此，白介素25可能在銀屑病的發(fā)病過(guò)程中作為白介素17的一個(gè)重要的下游因子。

實(shí)施例3

因?yàn)榘捉樗?5的表達(dá)主要局限于高增生角質(zhì)形成細(xì)胞在銀屑病人的損傷皮膚中，從而假設(shè)在角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)的白介素25可促進(jìn)銀屑病的發(fā)展。圖4表明了角質(zhì)形成細(xì)胞中特異性的白介素25敲除使得小鼠中銀屑病癥狀下降。其中，a：野生型小鼠和白介素25特異性皮膚表皮細(xì)胞基因敲除小鼠(il-25f/fk5cre)分別涂抹imq(咪喹莫特)來(lái)誘導(dǎo)銀屑病，持續(xù)3.5天做h&e染色并做表皮與真皮厚度統(tǒng)計(jì)，同時(shí)，分離真皮細(xì)胞并做流式分析髓系細(xì)胞比例，即cd45+細(xì)胞在各組中的比例(見(jiàn)圖b)；c：分析真皮髓系細(xì)胞同時(shí)分析在cd45+細(xì)胞中各種類型細(xì)胞的比例變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)三次,結(jié)果一致。比例尺代表50μm；*p<0.05，**p<0.01；n.s.，沒(méi)有差別，p值用t-test來(lái)決定，數(shù)據(jù)以平均值正負(fù)標(biāo)注誤的形式來(lái)表示。

白介素25基因(il25)的floxed小鼠與k5cre基因小鼠雜交可在角質(zhì)形成細(xì)胞中選擇性去除角質(zhì)形成細(xì)胞的il25表達(dá)。il25的表達(dá)在誘導(dǎo)了銀屑病模型的小il25f/fk5cre小鼠相比imq誘導(dǎo)wt小鼠皮損中明顯降低。類似于il25生殖系基因敲除小鼠，白介素25在角質(zhì)形成細(xì)胞中的缺乏大大降低表皮棘細(xì)胞增生，真皮厚度和真皮層免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。此外，樹突狀細(xì)胞(cd45⁺、cd11c⁺)、中性粒細(xì)胞(cd45⁺、cd3^-、cd11b⁺、gr1⁺)和δt細(xì)胞(cd45⁺、cd3⁺、δt⁺)的數(shù)量和百分比的都降低，但與il25f/fk5cre的銀屑病模型小鼠相比，il25f/f組中，巨噬細(xì)胞(cd45+cd3-cd11b+f4/80+)的數(shù)量沒(méi)有明顯減少。這些數(shù)據(jù)表明，表皮角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生的白細(xì)胞介素25可以作為驅(qū)動(dòng)的牛皮癬病理發(fā)展的主要來(lái)源。

實(shí)施例4

白細(xì)胞介素25可以通過(guò)靶標(biāo)到白介素受體復(fù)合物il17rb和il17ra作用到機(jī)體的免疫及非免疫細(xì)胞。為了確認(rèn)白介素25如何通過(guò)激活的il17rb的活動(dòng)，首先用重組白細(xì)胞介素25來(lái)刺激小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞。結(jié)果如圖5所示。其中，a：在體外培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞并用白介素25去刺激來(lái)檢測(cè)白介素25和其受體il-17rb的表達(dá)；b：野生型小鼠和白介素25基因受體敲除小鼠分別涂抹imq(咪喹莫特)來(lái)誘導(dǎo)銀屑病，持續(xù)3.5天做h&e染色并做表皮與真皮厚度統(tǒng)計(jì)，同時(shí)，分離真皮細(xì)胞并做流式分析髓系細(xì)胞比例，即cd45⁺細(xì)胞在各組中的比例(見(jiàn)圖c)；d：分析白介素25受體在白介素25敲除的小鼠的銀屑病模型皮膚的mrna水平的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)三次，結(jié)果一致。比例尺代表50μm；*p<0.05，**p<0.01；n.s.，沒(méi)有差別。p值用t-test來(lái)決定，數(shù)據(jù)以平均值正負(fù)標(biāo)注誤的形式來(lái)表示。

白細(xì)胞介素25的刺激大大增強(qiáng)原發(fā)性角質(zhì)形成細(xì)胞中il17rb和il25的表達(dá)(圖5a)。接下來(lái)，應(yīng)用il17rb^/-小鼠銀屑病模型，發(fā)現(xiàn)銀屑病病理在imq誘導(dǎo)il17rb^-/-的小鼠中大大減輕(圖5b)。此外，還觀察到il17rb的表達(dá)在il25缺陷小鼠的表皮中大大減少(圖5c，5d)。為了進(jìn)一步評(píng)估銀屑病模型中白介素25的靶細(xì)胞，進(jìn)行了骨髓轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，從骨髓細(xì)胞分離的wt和il17rb^/-小鼠分別轉(zhuǎn)入受致死劑量照射wt或il17rb^-/-小鼠，8周后，受鼠用imq誘發(fā)銀屑病。il17rb^-/-受體小鼠有明顯緩解的銀屑病樣癥狀，而il17rb^-/-的供體骨髓細(xì)胞則無(wú)此表型(圖5e)。綜上所述，白介素25調(diào)節(jié)很大程度上是通過(guò)靶向非造血細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)銀屑病的發(fā)生，且很有可能是通過(guò)自分泌的形式。

實(shí)施例5

為了確定白介素25中角質(zhì)形成細(xì)胞的功能下游因子，用白介素25刺激角質(zhì)形成細(xì)胞8小時(shí)，然后用rna測(cè)序的方法研究白介素25調(diào)節(jié)的基因mrna情況。總體上，在白介素25的刺激下，8,449種基因表達(dá)上調(diào)，7,272種基因表達(dá)下調(diào)。白細(xì)胞介素-25誘導(dǎo)的基因中，其中有大量的趨化因子和細(xì)胞因子可以吸引或誘導(dǎo)各種銀屑病相關(guān)免疫細(xì)胞到皮膚中，包括ccl2可以招募單核細(xì)胞、t細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，ccl7可以招募單核細(xì)胞、單核細(xì)胞和t細(xì)胞，cx3cl1和csf3可刺激粒系造血細(xì)胞。此外，許多白細(xì)胞介素25誘導(dǎo)的基因曾被報(bào)道可調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程，包括ccl2，fn1。

因此，白介素25可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)炎癥基因來(lái)促進(jìn)銀屑病發(fā)展。為了做進(jìn)一步的證實(shí)，用白細(xì)胞介素25在體外刺激角質(zhì)形成細(xì)胞。具體地，從小鼠中分離培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞并用白介素25刺激8h，以培養(yǎng)基作為對(duì)照，提取rna做表達(dá)譜測(cè)序檢測(cè)。結(jié)果如圖6所示。其中，a：對(duì)白介素25調(diào)節(jié)的差異表達(dá)基因信號(hào)通路的分析；b：白介素25調(diào)節(jié)的基因的散點(diǎn)圖；c：原代角質(zhì)形成細(xì)胞用白介素25或是培養(yǎng)基刺激在不同濃度和時(shí)間點(diǎn)計(jì)算細(xì)胞數(shù)變化；e：培養(yǎng)小鼠皮膚角質(zhì)細(xì)胞并用白介素25去刺激，48h后染ki67去看細(xì)胞增殖狀態(tài)；f：培養(yǎng)小鼠皮膚角質(zhì)細(xì)胞用白介素25去刺激，24h后染dapi看細(xì)胞周期變化；g：在野生型和白介素25缺失的小鼠皮膚中做ki67的免疫熒光染色(10x)；比例尺代表50μm；*p<0.05。**p<0.01；n.s.，沒(méi)有差別。p值用t-test來(lái)決定。數(shù)據(jù)以平均值正負(fù)標(biāo)注誤的形式來(lái)表示。

發(fā)現(xiàn)白介素25在較后的時(shí)間點(diǎn)(圖6d)以劑量依賴的方式(圖6c)促進(jìn)促進(jìn)細(xì)胞增殖提高細(xì)胞數(shù)量。同樣地，白介素25也提高了增殖標(biāo)記ki67的表達(dá)比例(圖6e)，且有更多的細(xì)胞進(jìn)入活躍細(xì)胞周期(s和g2/m期)(圖6f)。相反，il25缺失大大減少誘導(dǎo)銀屑病的小鼠皮膚表皮層組化染色的ki67的比例和數(shù)量(圖6g和圖6a)，進(jìn)一步表明白介素25在調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞在銀屑病發(fā)病中的增殖的必不可少的作用。

實(shí)施例6

在此將研究白介素25介導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和炎癥因子產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。此前已知act1作為接頭蛋白，介導(dǎo)白細(xì)胞介素25信號(hào)通路，我們比較了wt和act1/-小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞中幾種白介素25介導(dǎo)的相關(guān)基因表達(dá)與細(xì)胞增殖或或與炎癥反應(yīng)有關(guān)的基因。結(jié)果如圖7所示。其中，a：在野生型和act1缺失的角質(zhì)形成細(xì)胞中用白介素25刺激或是不刺激8h，觀察由rnaseq挑選出的基因的表達(dá)誘導(dǎo)情況；b：在野生型和act1缺失的角質(zhì)形成細(xì)胞中，用白介素25刺激或是不刺激24h去看細(xì)胞增殖標(biāo)記ki67(左)以及細(xì)胞周期(右)變化；c：角質(zhì)形成細(xì)胞用白介素25刺激或者24小時(shí)，觀察stat3在兩組中的磷酸化情況；d：磷酸化stat3(p-stat3)在用pbs或是經(jīng)過(guò)白介素25注射誘導(dǎo)16天后的皮膚中的免疫組化；e：角質(zhì)形成細(xì)胞用白介素25刺激或者不刺激24h，在stat3磷酸化抑制劑或者白介素6抗體處理或是不處理的情況下的ki67和細(xì)胞周期分析；f：角質(zhì)形成細(xì)胞用白介素25刺激或是不刺激或是加上stat3的磷酸酶抑制劑之后并處理8h之后，觀察挑選出來(lái)的rnaseq相關(guān)基因的表達(dá)變化。比例尺代表50μm；*p<0.05，**p<0.01；n.s.，沒(méi)有差別。p值用t-test來(lái)決定。數(shù)據(jù)以平均值正負(fù)標(biāo)注誤的形式來(lái)表示。

act1的缺失會(huì)使白介素25的刺激作用消失。此外，正如所預(yù)測(cè)的那樣，被白介素25誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖依賴于act1(圖7b)。

stat3是眾所周知的在不同細(xì)胞中控制細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的因子，其中包括角質(zhì)形成細(xì)胞，并已被證明能夠參與銀屑病樣皮膚炎癥。為了確定白介素25是否可以調(diào)節(jié)通過(guò)活化stat3來(lái)調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，我們測(cè)試了角質(zhì)形成細(xì)胞在白介素25的刺激下stat3的磷酸化。結(jié)果表明，白介素25的刺激在24個(gè)小時(shí)導(dǎo)致了明顯的stat3磷酸化(圖7c)。同樣地，皮膚注射白細(xì)胞介素25也誘導(dǎo)明顯stat3磷酸化(圖7d)。此外，阻斷stat3激活的stat3的抑制劑sttatic顯著減少白細(xì)胞介素25誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期變化，且這個(gè)過(guò)程是獨(dú)立于白細(xì)胞介素6的作用的(圖7e)。我們還發(fā)現(xiàn)與角質(zhì)形成細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)或與招募炎癥細(xì)胞相關(guān)的基因中，如ccl2、ccl7和csf3，取決于stat3的激活，而其他的基因，如naip5和dclre1c，則獨(dú)立的stat3激活(圖7f)?？傊琣ct1和stat3信號(hào)對(duì)于白介素25誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)是非常必要的。

實(shí)施例7

上述的數(shù)據(jù)表明，白介素25對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的有絲分裂影響依賴stat3激活但獨(dú)立白細(xì)胞介素6介導(dǎo)的信號(hào)(圖7e和7f)，由此，預(yù)測(cè)白介素25可以直接激活stat3。為了檢驗(yàn)這種可能性，用白介素25體外刺激角質(zhì)形成細(xì)胞，在較短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行stat3激活的檢測(cè)以排除這種作用是二級(jí)作用。圖8表明了白介素25可激活接頭蛋白act1和stat3來(lái)發(fā)揮在角質(zhì)形成細(xì)胞上的功能。其中，a：用白介素25刺激從野生型和act1缺失的乳鼠中分離的原代角質(zhì)形成細(xì)胞細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞做免疫印跡實(shí)驗(yàn)，研究p-stat3和stat3的蛋白表達(dá)；b：野生型角質(zhì)形成細(xì)胞用白介素25刺激，在白介素6中和抗體或是jak1/2抑制劑處理或者不處理情況下研究p-stat3和stat3的表達(dá)；c：在293t細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ha標(biāo)簽的白介素25受體il-17rb和stat3或是空質(zhì)粒和stat3，收集細(xì)胞裂解，免疫共沉淀il-17rb，接著免疫印跡stat3和ha標(biāo)簽；d：在293t細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ha標(biāo)簽的白介素25受體il-17rb，不同的時(shí)間點(diǎn)用白介素25刺激，收集細(xì)胞免疫共沉淀ha標(biāo)簽蛋白，免疫印跡酪氨酸磷酸化抗體和ha標(biāo)簽抗體；e：培養(yǎng)小鼠原代角質(zhì)形成細(xì)胞用白介素25刺激一小時(shí)，用受體白介素25的另一受體il-17ra進(jìn)行免疫共沉淀，免疫印跡il-17ra和stat3。

與功能檢測(cè)(圖7e)結(jié)果一致，白介素25在10分鐘后誘導(dǎo)明顯stat3磷酸化，且這個(gè)過(guò)程依賴于act1，但是獨(dú)立于白細(xì)胞介素6。并且，與報(bào)道的一樣，這種作用在jak1/2抑制劑處理下完全消失(圖8a、8b)。這一結(jié)果表明stat3可能被白介素25直接激活。接下來(lái)我們?cè)?93t細(xì)胞中用ha標(biāo)記的il-17rb檢驗(yàn)了stat3是否能與il-17rb直接相互作用。意外發(fā)現(xiàn)，在免疫沉淀后的含il-17rb的蛋白復(fù)合物中檢測(cè)到stat3(圖8c)。此外，白介素25能在10分鐘后誘導(dǎo)il17rb上的酪氨酸磷酸化(圖8d)。因?yàn)榘捉樗?5是通過(guò)結(jié)合到il-17ra/il-17rb復(fù)合物受體來(lái)進(jìn)行下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，我們研究在小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞中白細(xì)胞介素25的刺激是否能促進(jìn)il-17ra/rb復(fù)合物與stat3的相互作用。內(nèi)源性白細(xì)胞介素-17ra被發(fā)現(xiàn)與stat3基因共同沉淀(圖8e)。綜上所述，研究結(jié)果為白介素25在角質(zhì)形成細(xì)胞中可以直接激活stat3的磷酸化的提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

在本說(shuō)明書的描述中，參考術(shù)語(yǔ)“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說(shuō)明書中，對(duì)上述術(shù)語(yǔ)的示意性表述不必須針對(duì)的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將本說(shuō)明書中描述的不同實(shí)施例或示例以及不同實(shí)施例或示例的特征進(jìn)行結(jié)合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。