本申請(qǐng)為專利申請(qǐng)201310298737.1的分案申請(qǐng)，原案發(fā)明名稱為“一種禽流感疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用”。

本發(fā)明涉及獸用生物制品，特別是涉及一種禽流感疫苗及其在預(yù)防和/或治療不同亞型禽流感病毒的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

禽流感(avianinfluenza，ai)是禽流行性感冒的簡稱，由禽流感病毒(avianinfluenzavirus，aiv)引起的多種禽類感染的急性呼吸道傳染病，也能感染人類，被國際獸醫(yī)局(oie)和我國《家畜家禽防疫條例》列為a類烈性傳染病。

流感病毒屬于正黏病毒科流感病毒屬，含有囊膜、為多形態(tài)的負(fù)鏈rna病毒。根據(jù)流感病毒內(nèi)部核蛋白(nucleoprotein，np)和基質(zhì)蛋白(matrixprotein，mp)抗原及其基因特性的不同，可將流感病毒分為甲(a)、乙(b)、丙(c)三種類型，其中，能夠引起大流行的流感病毒主要是甲型。禽流感病毒即為甲型流感病毒，其基因組共由8個(gè)單獨(dú)的負(fù)鏈rna片段組成，由片段1至片段8依次為pb1、pb2、pa、ha、np、na、m、ns。

根據(jù)位于禽流感病毒囊膜上的血凝素ha(hemagglutinins，由禽流感基因組的第4個(gè)片段編碼)和神經(jīng)氨酸酶na(neuraminidase，由禽流感基因組的第6個(gè)片段編碼)抗原性的不同，禽流感病毒可分為若干個(gè)亞型，目前已知的ha有16個(gè)亞型(h1-h16)、na有9個(gè)亞型(n1-n9)，這兩種不同的亞型之間可以進(jìn)行自由組配，從而形成一個(gè)龐大而復(fù)雜的禽流感病毒家族。正是由于流感病毒基因組自身的特點(diǎn)決定了其不斷發(fā)生抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)換，從而使得新的流行毒株不斷出現(xiàn)。目前，世界上的許多國家和地區(qū)都對(duì)該病進(jìn)行過相關(guān)報(bào)道，常見的且能感染人的高致病性禽流感病毒以h5n1、h7n7、h9n2為代表，以快速爆發(fā)和高死亡率為主要臨床特征，常常導(dǎo)致飼養(yǎng)的雞群全部死亡；這一事件也表明家禽是人畜傳播潛在的中間宿主。特別地，近期發(fā)生的禽流感h7n9疫情，不僅使感染的人類出現(xiàn)高死亡現(xiàn)象，而且?guī)韾盒缘倪B鎖反應(yīng)，使家禽業(yè)這一整個(gè)產(chǎn)業(yè)都遭遇重大的危機(jī)，給人類和家禽的預(yù)防、控制流感疫情帶來了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

截止到目前，接種疫苗仍然是預(yù)防和控制禽流感病毒大流行的最有效手段。由于禽流感病毒的變異速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于變異株相應(yīng)疫苗的制備速度，尤其是ha和na抗原性的變異頻率較高，而且不同亞型之間幾乎上不產(chǎn)生交叉免疫保護(hù)。如果禽流感疫苗的生產(chǎn)隨著病毒的變異而不斷更新，那么針對(duì)流感病毒流行株相應(yīng)疫苗的生產(chǎn)周期較長、生產(chǎn)成本較高，造成人力、物力的浪費(fèi)，還可能達(dá)不到預(yù)想的防控效果。因而，制備通用流感疫苗已博得世界各國科學(xué)家和疫苗生產(chǎn)公司的青睞，所謂的通用流感疫苗是指一種能夠預(yù)防所有流感病毒毒株，并可誘導(dǎo)持久性保護(hù)性免疫的流感疫苗。

由禽流感病毒基因組第7片段編碼的m蛋白(matrixproteins)為基質(zhì)蛋白，其基因含有兩個(gè)開放的閱讀框(orf)，可轉(zhuǎn)錄出兩個(gè)rna分子，分別翻譯出兩種基質(zhì)蛋白m1和m2。其中，基質(zhì)蛋白m2是禽流感病毒蛋白中除ha、na外的第三種跨膜蛋白，由三個(gè)區(qū)域(即n端24個(gè)氨基酸殘基組成的胞外域、19個(gè)氨基酸組成的跨膜區(qū)、54個(gè)氨基酸殘基組成的胞漿尾)組成，不含糖基，具有高度保守性。特別地，m2胞外部分的n端24氨基酸肽段(即m2e)在所測(cè)得的禽流感和人流感病毒中，其基因序列幾乎完全相同。這表明以m2蛋白作為抗原的主要成分，可對(duì)不同亞型的禽流感病毒產(chǎn)生保護(hù)性免疫，是研究交叉保護(hù)性流感疫苗的理想候選抗原。另外，現(xiàn)有的研究結(jié)果還表明：m2蛋白的功能主要包括兩點(diǎn)，(1)在流感病毒表面血凝素糖蛋白的合成過程中，m2蛋白作為質(zhì)子通道控制高爾基體跨膜轉(zhuǎn)移通道的ph值，從而導(dǎo)致ha的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；(2)在病毒脫殼時(shí)，m2蛋白可酸化病毒粒子形成病毒包涵體顆粒的內(nèi)部環(huán)境，引起細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的ha和m1、m1和rnps之間或者rnps蛋白自身解聚。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種新型的禽流感疫苗，該疫苗既能對(duì)不同亞型禽流感病毒產(chǎn)生交叉保護(hù)性免疫，又能在減少免疫劑量的條件下達(dá)到明顯的免疫效果，還能延長疫苗的免疫保護(hù)時(shí)間。

本發(fā)明的主要目的在于提供一種禽流感疫苗組合物，所述的禽流感疫苗組合物包括脂質(zhì)體、免疫量的m2和/或3m2e蛋白；所述m2蛋白的序列為seqidno.2，所述3m2e蛋白的序列為seqidno.4。

本發(fā)明所述的m2蛋白基因的核苷酸序列可以為seqidno.1。

本發(fā)明所述的3m2e蛋白基因的核苷酸序列可以為seqidno.3，其中，所述的3m2e是指將m2蛋白膜外部分n端的24個(gè)氨基酸肽段m2e串聯(lián)成三拷貝的形式。

優(yōu)選地，所述的脂質(zhì)體膜材包括磷脂、固醇類；更優(yōu)選地，所述脂質(zhì)體的膜材包括卵磷脂、豆磷脂、腦磷脂、磷脂酰乙醇胺、膽固醇、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰膽堿、膽固醇乙酰、牛膽酸鈉、蛋磷脂酰膽堿、磷脂酰絲胺酸、磷脂酰肌醇、神經(jīng)鞘磷脂、鞘髓磷脂、二鯨蠟磷酸酯、二肉豆蔻卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、硬質(zhì)酰胺、二氧乙烯十六烷基醚、四氧乙烯十二烷基醚中的一種或幾種。

脂質(zhì)體的膜材主要由磷脂與膽固醇構(gòu)成，這兩種成分不但是形成脂質(zhì)體雙分子層的基礎(chǔ)物質(zhì)，而且本身也具有極為重要的生理功能。其中，磷脂類包括天然磷脂和合成磷脂二類，磷脂的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為一個(gè)磷酸基和一個(gè)季銨鹽基組成的親水性基團(tuán)，以及由兩個(gè)較長的羥基組成的親脂性基團(tuán)；膽固醇是兩親性物質(zhì)，與磷脂混合使用，可以調(diào)節(jié)雙分子層的流動(dòng)性、減低脂質(zhì)體膜的通透性等。由它們所形成的“人工生物膜”易被機(jī)體消化分解，不像合成微囊(如尼龍微型膠囊)那樣往往在機(jī)體中難以排除。

優(yōu)選地，所述的脂質(zhì)體是中性脂質(zhì)體、負(fù)電性脂質(zhì)體或正電性脂質(zhì)體；更優(yōu)選地，所述的脂質(zhì)體為正電性脂質(zhì)體。

優(yōu)選地，所述的脂質(zhì)體將m2和/或3m2e包裹于脂質(zhì)體內(nèi)或鑲嵌于脂質(zhì)體膜中或由于電荷作用而吸附于膜上。

優(yōu)選地，所述的脂質(zhì)體為小單室、大單室和多室脂質(zhì)體共存的脂質(zhì)體。

優(yōu)選地，所述的流感疫苗單位劑量中含流感病毒m2和/或3m2e蛋白組分的含量為40-500μg，優(yōu)選為50-100μg。

本發(fā)明所述的脂質(zhì)體是一種生物膜雙分子層囊性微球，由水相中脂質(zhì)雙層疏水區(qū)的脂肪鏈通過疏水鍵相互聚集自行收縮排列而形成。

本發(fā)明所述的流感疫苗在脂質(zhì)體的作用下，可在注射部位形成抗原庫，使抗原緩慢釋放，引起注射部位的炎性反應(yīng)，增加細(xì)胞的穿透能力，提高注射部位的抗原遞呈細(xì)胞濃度，使抗原易被抗原遞呈細(xì)胞吞噬，并誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子如il-2、il-4、il-6、il-12、tnf-α、ifn-α、il-10、ifn-γ等；而且由于巨噬細(xì)胞攝取脂質(zhì)體后破壞其膜結(jié)構(gòu)，以及補(bǔ)體依賴的脂質(zhì)體免疫溶解作用，產(chǎn)生抗原釋放并形成免疫復(fù)合物，而經(jīng)后者又能使其維持長期的效價(jià)抗體及產(chǎn)生免疫記憶所致。在脂質(zhì)體膜的保護(hù)下，抗原分子可以不受體液成分的破壞，脂質(zhì)體類疫苗可用于多種黏膜途徑的免疫接種。更重要地，脂質(zhì)體還是理想的免疫佐劑，能同時(shí)激活機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫，通過誘導(dǎo)抗原遞呈細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同刺激因子，增加主要組織相容性抗原的表達(dá)，使抗原遞呈成熟，增強(qiáng)抗原的遞呈作用。

總而言之，脂質(zhì)體是用作疫苗的傳遞載體和免疫佐劑的良好選擇。

優(yōu)選地，所述的禽流感疫苗組合物進(jìn)一步包括免疫調(diào)節(jié)組分，所述免疫調(diào)節(jié)組分優(yōu)選維生素e。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備所述的禽流感疫苗組合物的方法，所述制備方法包括：

(1)將m2、3m2e蛋白分別用含穩(wěn)定劑的緩沖液制備成禽流感抗原原液；

(2)將脂質(zhì)體原料溶于有機(jī)溶劑中，將所述脂質(zhì)體溶液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，成膜；在膜材中加入所述緩沖液，并加入幾粒小玻璃珠，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，待薄膜從瓶壁上完全脫落后，靜置得空脂質(zhì)體；

(3)將所述禽流感抗原原液加入制得的空脂質(zhì)體中，用高壓勻漿機(jī)高壓均質(zhì)循環(huán)脂質(zhì)體顆粒，除菌過濾，即成所述禽流感疫苗組合物。

優(yōu)選地，所述步驟(1)中的所述穩(wěn)定劑為氨基酸、單糖、二糖、多元醇中的一種或幾種；所述步驟(2)中的所述有機(jī)溶劑為二氯甲烷、氯仿、乙醚、丙酮溶液中的一種或幾種；所述步驟(2)中所述膜材的終濃度為1％-5％(w/w)，優(yōu)選為2％(w/w)；所述步驟(2)中所述旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溫度為30-65℃,所述高壓壓力為15-30kpa；所述步驟(1)、(2)中的所述緩沖液為ph值為5.4-7.8范圍內(nèi)的磷酸鹽緩沖液、tris-hcl緩沖液、碳酸鈉緩沖液、生理鹽水中的一種或幾種。

本發(fā)明所述禽流感疫苗組合物制備方法，還包括薄膜法與冷凍干燥法相結(jié)合法、逆相蒸發(fā)法與冷凍干燥法結(jié)合、薄膜分散法、冷凍干燥法、注入法、加壓擠出法、熔融法、復(fù)乳法、凍融法、表面活性劑處理法、前脂質(zhì)體法、空白前脂質(zhì)體法、ph及醋酸梯度法等。

本發(fā)明的再一目的在于提供所述的禽流感疫苗在制備預(yù)防和/或治療不同亞型禽流感的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了所述的m2或3m2e蛋白以及流感疫苗在制備預(yù)防和/或治療不同亞型禽流感的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的流感疫苗在制備用于保護(hù)動(dòng)物免患不同亞型禽流感所引起的疾病的疫苗中的應(yīng)用時(shí)，所用流感疫苗的免疫量為0.3ml/羽。所述流感疫苗在給予免疫動(dòng)物時(shí)，可以通過腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、口服途徑、靜脈注射或鼻內(nèi)途徑，優(yōu)選為通過皮下注射或肌肉注射。

基于此，本發(fā)明具有以下突出的優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明所述的流感疫苗具有廣譜性，能抗多種型或亞型的禽流感病毒，免疫動(dòng)物后可誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生抗多種亞型禽流感病毒的抗體；

(2)本發(fā)明所述的流感疫苗具有持久性，在脂質(zhì)體的作用下具有緩慢釋放抗原的效能，給予動(dòng)物免疫后可使機(jī)體延緩腎排泄和代謝，從而延長作用時(shí)間。

(3)本發(fā)明所述的禽流感疫苗利用脂質(zhì)體所具有的生物膜雙分子層形成的囊泡微球?qū)⒘鞲幸呙缢乖闹饕M分m2和/或3m2e蛋白進(jìn)行包含。該疫苗在脂質(zhì)體的作用下，能將包含的抗原高效、靶向地載給抗原遞呈細(xì)胞，能同時(shí)刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，具有廣譜性和持久性，且可被機(jī)體降解無毒副作用，該疫苗有利于大規(guī)模生產(chǎn)。

序列表中：

序列1為m2核苷酸序列；

序列2為m2氨基酸序列；

序列3為3m2e核苷酸序列；

序列4為3m2e氨基酸序列。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

本實(shí)施例中所用的“免疫量”是指提供針對(duì)流感疫苗的免疫劑量，主要取決于以下因素：被免疫動(dòng)物的物種、品種、年齡、重量大小、健康狀態(tài)以及動(dòng)物之前是否接受過對(duì)抗同樣病毒的疫苗。

本實(shí)施例中所用的免疫調(diào)節(jié)組分優(yōu)選為維生素e(ve)。

本實(shí)施例中所用的穩(wěn)定劑優(yōu)選為海藻糖。

本實(shí)施例中所用的h9亞型禽流感病毒分離株包含禽流感病毒h9亞型sz株(aivaninfluenzavirush9subtypestrainsz)，其保藏編號(hào)為：cctccno:v201240，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)；地址：湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16號(hào)武漢大學(xué))，保藏日期：2012年9月16日。

下述實(shí)施例中所述的實(shí)驗(yàn)方法，若無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述的生物材料，若無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1人工合成m2、3m2e蛋白

根據(jù)ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)報(bào)道的a/duck/hongkong/y439/97(h9n2，登錄號(hào)：af156462)中m2、m2e蛋白基因的核苷酸序列(詳見序列表seqidno.1和seqidno.3)，經(jīng)人工分別合成m2、3m2e蛋白的氨基酸多肽序列(詳見序列表seqidno.2和seqidno.4)，所合成多肽序列經(jīng)高效液相色譜純化，分別得到純化后的m2、3m2e蛋白。然后，將m2、3m2e蛋白分別用含1％海藻糖的生理鹽水制備成1mg/ml的儲(chǔ)備液。

實(shí)施例2流感疫苗的制備

本發(fā)明所述的流感疫苗的制備方法之薄膜法與冷凍干燥法相結(jié)合，包括以下操作步驟：

(1)將大豆卵磷脂m1、膽固醇m2、維生素e(ve)m3按表1的量混合溶于v1三氯甲烷中，將該溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的茄型瓶中，45℃水浴作為蒸發(fā)溫度，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，成膜。

(2)按膜材終濃度為2％(w/w)加生理鹽水v2，加入幾粒小玻璃珠，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，待薄膜從瓶壁上完全脫落后，靜置約25min，使瓶中液體呈乳白色懸濁液。

(3)將不同濃度和體積的禽流感抗原液(含1％海藻糖)v3加入制得的空脂質(zhì)體中，用高壓勻漿機(jī)在15-30kpa的高壓下均質(zhì)循環(huán)脂質(zhì)體顆粒5次，除菌過濾后即為所制備的流感疫苗，單位劑量中含流感病毒m2和/或3m2e蛋白組分的含量分別為500、80、80、40μg(詳情見表1)。并對(duì)制得的流感疫苗進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂?，使單位劑量所含含流感病毒m2和/或3m2e蛋白組分的含量均為40μg，滅菌后進(jìn)行分裝，5ml/瓶。

表1不同膜材和抗原液制備出的流感疫苗

附：抗原液160μg/ml為抗原儲(chǔ)備液稀釋6.25×所得，抗原液80μg/ml為抗原液160μg/ml稀釋2×所得。

同時(shí)制備不含禽流感抗原組分的空白脂質(zhì)體，作為陰性對(duì)照。

實(shí)施例3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

選用3周齡spf雞120只，隨機(jī)分成6組，20只/組，分別經(jīng)皮下注射自制的流感疫苗、空白脂質(zhì)體、生理鹽水(作為空白對(duì)照)，注射劑量0.3ml/羽。

于免疫后的第0天、第15天、第30天、第45天、第60天、第90天，分別采集并分離各試驗(yàn)組的血清。同時(shí)，以間接elisa法檢測(cè)血清抗m2或m2e抗體效價(jià)，具體操作步驟為：將m2或m2e蛋白儲(chǔ)備溶液用生理鹽水稀釋至1μg/ml，包被96孔板，50μl/孔，4℃包被過夜；使用含5％脫脂奶粉的封閉液進(jìn)行封閉；洗滌后，加入待檢的稀釋血清，50μl/孔，37℃反應(yīng)2h；洗滌后，加入酶標(biāo)二抗，50μl/孔，37℃孵育2h；然后，加入底物進(jìn)行顯色，使用酶標(biāo)儀讀取吸光光度值，檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

表2不同時(shí)間段各試驗(yàn)組elisa抗體效價(jià)的檢測(cè)結(jié)果匯總

由表2可知：不同抗原含量的流感疫苗免疫后的抗體滴度均于免疫后15天開始上升，并于第30天達(dá)到最大值，即流感疫苗1、2、4均達(dá)到1:2048，流感疫苗3的最高，高達(dá)1:4096；且持續(xù)至第60天左右，而空白脂質(zhì)體對(duì)照組和生理鹽水空白對(duì)照組均未產(chǎn)生特異性抗體。

實(shí)施例4攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)

免疫后第90天，將每個(gè)免疫組和對(duì)照組的20只隨機(jī)分成10只/亞組。每個(gè)免疫亞組和對(duì)照亞組分別用禽流感sz株(cctccno:v201240)及hl株(見文獻(xiàn)：禽流感病毒(h9n2亞型，hl株)與國內(nèi)部分省禽流感病毒(h9亞型)流行株相關(guān)性及交互免疫的研究，2007年畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)年會(huì)論文集，2007，35-38)進(jìn)行攻毒。

其中，禽流感病毒sz株(avianinfluenzavirus(h9subtype)strainsz)保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢·武漢大學(xué)，保藏日期為2012年9月16日，保藏編號(hào)為cctccno:v201240。

通過皮下注射攻毒，攻毒劑量為0.2ml/羽攻毒。攻毒后第5天，采集氣管與泄殖腔拭子，每個(gè)樣品分別接種于5枚10日齡的spf雞胚，37℃繼續(xù)孵育，每日照檢，死胚及時(shí)取出(24h內(nèi)死胚棄去)，并檢測(cè)雞胚液血凝價(jià)，至接種后5天，將剩余活胚全部凍死后，逐胚測(cè)定血凝價(jià)，以5枚雞胚中至少有1枚雞胚液血凝價(jià)≥1:16(微量法)判為感染。對(duì)病毒感染為陰性的雞胚，應(yīng)盲傳1次，再測(cè)定血凝價(jià)，檢測(cè)結(jié)果詳見表3。

表3可知：免疫后第90天，不同抗原含量的流感疫苗各免疫亞組可完全抵抗h9亞型禽流感病毒sz株(cctccno:v201240)和hl株毒株的攻擊，可獲得完全保護(hù)；而空白脂質(zhì)體對(duì)照各亞組病毒分離率分別為80％和90％，生理鹽水空白對(duì)照各亞組病毒分離率分別為90％和100％。

表3各亞組攻毒后的病毒分離結(jié)果

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>普萊柯生物工程股份有限公司

<120>一種禽流感疫苗組合物及其制備方法和應(yīng)用

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