同種異型抗原-反應(yīng)性調(diào)節(jié)t細(xì)胞的增殖的制作方法
【專利摘要】本公開總體涉及用于免疫療法的調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg)的制造。具體而言，本公開涉及用于同種異型抗原-反應(yīng)性Treg體外增殖的有效方法。以這種方式生產(chǎn)的同種異型抗原-反應(yīng)性Treg適用于誘導(dǎo)和/或保持同種異型移植在受體中的免疫耐受。
【專利說明】同種異型抗原-反應(yīng)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞的增殖
[0001] 政府資助的說明
[0002] 本發(fā)明是在政府的資助（美國國立衛(wèi)生研究院授予的P30DK063720)下完成的。政 府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。
[0003] 相關(guān)申請的交叉引用
[0004] 本申請要求2012年3月2日提交的美國臨時專利申請No. 61/606,329的優(yōu)先權(quán)， 該申請以引用方式全文并入本文。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005] 本公開總體涉及用于免疫療法的調(diào)節(jié)T細(xì)胞（Treg)的制造。具體而言，本公開涉 及用于同種異型抗原-反應(yīng)性Treg體外增殖的有效方法。以這種方式生產(chǎn)的同種異型抗 原-反應(yīng)性Treg適用于誘導(dǎo)和/或保持同種異型移植在受體中的免疫耐受。

【背景技術(shù)】
[0006] 不斷精化的免疫抑制方法已經(jīng)大幅減少了在實(shí)體器官移植后急性排斥的發(fā)生。但 是，長期效果部分由于與免疫抑制有關(guān)的發(fā)病率和死亡率而停滯。對免疫抑制的傳統(tǒng)方法 強(qiáng)調(diào)T細(xì)胞應(yīng)答的非特異性抑制。
[0007] 最近關(guān)于T調(diào)節(jié)細(xì)胞（Treg)及其在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中的重要性的闡 述促進(jìn)了免疫抑制方法的再構(gòu)建，以有利于Treg發(fā)展和功能、以及誘導(dǎo)移植 物耐受的最終目標(biāo)（Waldmann et al.，J. Clin Immunol, 28:716-725,2008; Kang et al. , Am J Transplant，7:1457-1463，2007 ;Walsh et al. , J Clin Invest，114:1398-1403, 2004 ;Yeung et al.，Transplant Proc，41:S21-26, 2009 ; Sanchez-Fueyo et al. ,J Immunol，176:329-334,2006 ;Sagoo et al.,Curr Opin Organ Transplant，13:645-653, 2008 ;and Long et al., Transplantation, 88:1050-1056, 2009)。多種臨床前模型顯示Treg的過繼轉(zhuǎn)移可以減輕移植物排斥，并且Treg的 過繼轉(zhuǎn)移與"Treg-支持的"免疫抑制方法相結(jié)合可以誘導(dǎo)長期耐受（Kang et al.，Am J Transplant, 7:1457-1463, 2007 ；Riley et al. , Immunity,30:656-665,2009 ； Issa et al., Expert Rev Clin Immunol, 6:155-169, 2010 ；and Nadig et al. , Nat Med, 16:809-813, 2010)。"Treg-支持的"免疫抑制方法包括供體-反應(yīng)T細(xì)胞的初始 減滅。兔抗胸腺細(xì)胞球蛋白（rATG，一種在移植中常用的T細(xì)胞消耗劑）似乎會備用 Treg(Sewgobind et al.，Nephrol Dial Transplant, 24:1635-1644,2009),因此增大了 Treg:常規(guī)T細(xì)胞（Tconv)比。此外，西羅莫司（SRL)在促進(jìn)Treg發(fā)展的同時抑制效應(yīng)器 T 細(xì)胞（Demirkiran et al. , Transplantation, 85:783-789, 2008 ；and Demirkiran et al .,Transplantation, 87:1062-1068, 2009) 〇
[0008] 大部分的方法通常是無差別地增殖所有的Treg從而生產(chǎn)出被稱為多克隆 Treg (poly Treg)的細(xì)胞。但是，由于同種異型抗原-特異性Treg (alio Treg)提 供了特異性的而非一般性的免疫抑制，所以它們在移植情況下比非特異性的Treg更 有效且更安全（Golshayan et al.，Blood, 109:827-835,2007 ;and Raimondi et al.，JImmunol，184:624-636, 2010)。特別地，供體反應(yīng)性Treg具有在不阻礙常規(guī)免疫應(yīng)答 的條件下誘導(dǎo)對移植器官耐受的潛力。因此，本領(lǐng)域需要用于增殖在促進(jìn)移植耐受中使用 的alio Treg及用于治療移植物抗宿主病的有效方法。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 本公開總體涉及用于免疫療法的調(diào)節(jié)τ細(xì)胞（Treg)的制造。具體而言，本公開涉 及用于同種異型抗原-反應(yīng)性Treg(all 〇 Treg)體外增殖的有效方法。以這種方式生產(chǎn)的 alio Treg適用于誘導(dǎo)和/或保持同種異型移植在受體中的免疫耐受。
[0011] 本公開提供了用于生產(chǎn)人類供體-反應(yīng)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞（Treg)的方法，其包括：a) 在有效生產(chǎn)刺激的B細(xì)胞（sBc)的條件下，使人類供體（第一人類受試對象）的CD19+B細(xì) 胞與經(jīng)輻射的CD40L+人類白血病飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)；以及b)在有效地選擇性地增殖人類供 體-反應(yīng)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞（Treg)的條件下，使人類受體（第二人類受試對象）的CD4+、CD25+、 CD127-/l〇T細(xì)胞與sBc共培養(yǎng)。在一些實(shí)施方案中，所述的人類供體與所述的人類受體無 關(guān)。在一些實(shí)施方案中，所述的人類供體與所述的人類受體是HLA錯配的（例如所述的供體 是所述的受體的同種異型，或者換言之，所述的移植是異源器官的移植）。在一些實(shí)施方案 中，HLA錯配包括HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-DR中的至少1個、2個、3個或4個錯配。在 一些實(shí)施方案中，所述的方法進(jìn)一步包括：步驟c)在有效生產(chǎn)再刺激的供體-反應(yīng)性Treg 的條件下，通過供體-反應(yīng)性Treg的⑶3與⑶28的交聯(lián)來再刺激供體-反應(yīng)性Treg。在 一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，供體-反應(yīng)性Treg為CD4+、Heli 〇s+和Foxp3+。在一些實(shí)施方案 中，供體-反應(yīng)性Treg為⑶27+和⑶62L+。在一些實(shí)施方案中，所述的方法進(jìn)一步包括： 在a)之前，由人類受體獲得的冷凍保藏的外周血單個核細(xì)胞（PBMC)分離細(xì)胞CD4+、CD25+、 CD127-/l〇 T細(xì)胞的步驟。在一些實(shí)施方案中，步驟a)包括在包括胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、白細(xì) 胞介素-4和環(huán)孢霉素 A的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)B細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，飼養(yǎng)細(xì) 胞為KCD40L細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，步驟b)包括在包括在sBc被輻射后，在包括白細(xì)胞 介素-2的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)sBc和⑶4+、⑶25+、⑶127-/1οΤ細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，步驟 c)在步驟b)開始后的9-12天開始。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，再刺激的alloTreg包括比 在步驟 b)的攻擊開始時超過至少 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 ，1100, 1200, 1400orl600 倍的 CD4+, CD25+, CD127-/loT 細(xì)胞。此外，本公開提供了組合物， 其包括生理學(xué)可接受的的緩沖劑（例如生理鹽水、PBS等）和使用上述方法生產(chǎn)的再刺激的 供體-反應(yīng)性Treg。本公開進(jìn)一步提供了用于治療器官移植受體的方法，其包括：向異源 器官移植的人類受體給予使用上述方法生產(chǎn)的1〇 7至1011的再刺激的供體-反應(yīng)性Treg。 此外，本公開提供了治療或預(yù)防人類受體對實(shí)體器官同種異型移植物的排斥的藥劑，該藥 劑包括：使用上述方法生產(chǎn)的1〇 7至1011的再刺激的供體-反應(yīng)性Treg。在一些實(shí)施方案 中，所述的器官移植為實(shí)體器官同種異型移植物，其選自心臟、肺、心臟/肺、腎、胰腺、腎/ 胰腺、腸和肝臟的同種異型移植物。在一些實(shí)施方案中，實(shí)體器官同種異型移植物為皮膚的 同種異型移植物。在一些實(shí)施方案中，在一些實(shí)施方案中，再刺激的供體-反應(yīng)性Treg多 于一次時機(jī)給予（重復(fù)給予）。在一些實(shí)施方案中，再刺激的供體-反應(yīng)性Treg是在受體 接受異源器官移植之后給予的。在一些實(shí)施方案中，在一些實(shí)施方案中，在刺激的供體-反 應(yīng)性Treg是在受體接受異源器官移植之前或之后給予的。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所 述的方法進(jìn)一步包括在給予再刺激的供體-反應(yīng)性Treg之后向人類受體提供Treg支持 的免疫抑制方案。在一些實(shí)施方案中，Treg支持的免疫抑制方案包括：向人類受體給予有 效地使淋巴細(xì)胞被去除的量的兔抗胸腺細(xì)胞球蛋白。在一些實(shí)施方案中，所述的方法進(jìn)一 步包括向人類受試對象給予低于護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)的單次劑量的潑尼松、霉酚酸酯（mycophenolate mofetile)和歐列姆。在一些實(shí)施方案中，所述的方法進(jìn)一步包括向人類受試對象給藥歐列 姆。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，給予再刺激的供體-反應(yīng)性Treg在降低急性和/或慢性移 植排斥的可能性中是有效的。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，給予再刺激的供體-反應(yīng)性Treg 在延長實(shí)體器官同種異型移植物的生存中是有效的。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，給予再刺 激的供體-反應(yīng)性Treg在取得以下一種或多種中是有效的：增加給予基線的Treg百分率； 增加供體-反應(yīng)性Treg頻率；增強(qiáng)供體-反應(yīng)性Treg活性；以及誘導(dǎo)耐受基因在PBMC和 /或移植組織中的表達(dá)圖譜。
[0012] 如本文所用，除非另作說明，單數(shù)形式的"a"、"an"和"the"包括復(fù)數(shù)參照。
[0013] 附圖簡述
[0014] 圖1提供了示例性供體-反應(yīng)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞（Treg)制造工藝的流程圖。
[0015] 圖2A示出了通過FACS由受體PBMC純化得到的細(xì)胞的⑶4+⑶25+⑶127-/1〇群 體。圖2B示出了使用本公開的方法可取得的供體-反應(yīng)性Treg的增殖擴(kuò)大情況。箭頭表 示Treg暴露于多克隆刺激物（例如抗CD3/CD28綴合的珠子）時。
[0016] 圖3A為增殖的供體-反應(yīng)性Treg和對照供體-反應(yīng)性T傳統(tǒng)細(xì)胞（Tconv)的流 式細(xì)胞檢測分析。圖3B示出了增殖的供體-反應(yīng)性Treg和Tconv、以及使用多克隆刺激 物（抗⑶3/抗⑶28涂敷的珠子）增殖的多克隆Treg(poly Treg)的Treg特異性去甲基 化區(qū)域（TSDR)。
[0017] 圖4A提供了供體特異性檢測的結(jié)果。如所示，供體-反應(yīng)性Treg使用CFSE標(biāo)記 并再刺激。圖4B提供了混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR)抑制檢測的結(jié)果。滴定數(shù)量的供體-反 應(yīng)性Treg和多克隆增殖的Treg與2. 5xl04同源的PBMC和1. 25x10s經(jīng)輻射的供體的PBMC 混合，并溫育6天。在后16小時中加入氚標(biāo)記的胸腺嘧啶脫氧核苷酸。通過與不具有Treg 的孔中每分鐘的計數(shù)（CPM)相比較來計算對引入的胸腺嘧啶脫氧核苷酸的抑制。
[0018] 圖5示出了供體-反應(yīng)性T細(xì)胞頻率檢測的結(jié)果。受體PBMC是使用CFSE標(biāo)記的， 并使用供體sBc刺激3. 5天。收獲培養(yǎng)物，對⑶3、⑶4、⑶8、Foxp3和Helios進(jìn)行染色，并 在流式細(xì)胞儀上分析。⑶8、⑶4+Tconv、和Treg的CFSE的圖譜用于計算各亞群中供體-反 應(yīng)性T細(xì)胞的頻率。
[0019] 圖6A和圖6B示出了由相同的供體得到的PBMC和⑶40L-sBc，其中比較了它們在 單向MLR中刺激同種異型T細(xì)胞的增殖的能力。將應(yīng)答者的PBMC在MLR之前使用CFSE標(biāo) 記，并在第4天收貨培養(yǎng)物以用于流式細(xì)胞儀分析。其中示出了 CD4+和CD8+T細(xì)胞（圖6A)、 以及⑶4+F0XP3+HELI0S+Treg (圖6B)的代表性CFSE稀釋圖譜。數(shù)據(jù)代表了至少10個獨(dú) 立的試驗(yàn)。圖6C和圖6D示出了與應(yīng)答者細(xì)胞具有不同程度的HLA錯配的同源CD40L-sBc 和同種異型CD40L-sBc，其中比較了它們刺激CD4+Tconv、CD8+T細(xì)胞和Treg細(xì)胞的增殖的 能力。每種符號代表相同的應(yīng)答者。結(jié)果為15種不同的刺激物與應(yīng)答者的組合的總結(jié)。
[0020] 圖7A示出了純化的B細(xì)胞在10天的培養(yǎng)物中的增殖。箭頭示出了再刺激的時間。 圖7B和圖7C示出了使用流式細(xì)胞儀比較的、HLA-DR、⑶80和⑶86在新分離的B細(xì)胞和第 10天時CD40L-SBC中的表達(dá)。樣品疊加柱狀圖示于圖7B中，并且概況了獨(dú)立試驗(yàn)的結(jié)果的 表示于圖7C中。數(shù)據(jù)為6個獨(dú)立試驗(yàn)的總結(jié)。
[0021] 圖8A示出了用于在第0天和第9天刺激經(jīng)FACS純化的Treg的同種異型。其中示 出了在6個獨(dú)立試驗(yàn)中，Treg在14天培養(yǎng)物中的倍數(shù)增殖。箭頭表示再刺激的時間。圖8B 示出了在使用用于增殖的相同的CD40L-sBc (粗線）、抗CD3和抗CD28涂敷的珠子（細(xì)線） 或同系的CD40L-sBc再刺激之前，通過使用CFSE標(biāo)記增殖的Treg來測定增殖的Treg的同 種異型反應(yīng)性。圖8C示出了使用CD40L-sBc刺激9天的Treg，然后將它們分開，其中的一般 使用由相同的供體得到的CD40L-sBc再刺激，而另一半使用抗CD3和抗CD28涂敷的珠子再 刺激。其中示出了 3組獨(dú)立的配對的培養(yǎng)物在第14天時的倍數(shù)增殖（p = 0. 52,雙尾配對t 檢驗(yàn)）。圖8D和圖8E示出了在初次刺激后的第9天（圖8D)和第11天（圖8E)時，Treg 培養(yǎng)物的外觀。數(shù)據(jù)代表了由至少10種獨(dú)立的培養(yǎng)物得到的結(jié)果。圖8F示出了在使用抗 ⑶3和抗⑶28涂敷的珠子再刺激之前，使用⑶40L-sBc刺激9天和11天的Treg。在再刺 激后的第5天收獲培養(yǎng)物，并比較3組配對的培養(yǎng)物中的總的倍數(shù)增殖（p = 0. 0026,雙尾 配對t檢驗(yàn)）。圖8G示出了在使用抗⑶3和抗⑶28涂敷的珠子（得自Invitrogen (空心 符號）或Miltenyi Biotec (實(shí)心符號））再刺激之前使用CD40L-sBc刺激11天時的Treg。 其中示出了在3組成對的培養(yǎng)物中細(xì)胞經(jīng)過一段時間的增殖。使用雙尾成對檢驗(yàn)來比較在 第16天時總的倍數(shù)增殖的差異（p = 0. 0258)。
[0022] 圖9A和圖9B示出了非門控的（a)和門控的（b)Treg培養(yǎng)物的流式細(xì)胞計數(shù)圖 譜。數(shù)據(jù)代表了至少14個獨(dú)立的試驗(yàn)。圖9C示出了在第11天時，使用同種異型sBc初次 刺激、再使用多克隆再刺激而增殖的Treg的同種異型反應(yīng)性，其測定方法如圖8B所示。其 中示出了疊加柱狀圖的實(shí)例。圖9D示出了如圖9C中所述分析的7種獨(dú)立培養(yǎng)物的總結(jié)。 每種符號表示一種獨(dú)立的Treg培養(yǎng)物。圖9E示出了 Treg的體外抑制的總結(jié)，其中所述 的Treg是經(jīng)過兩輪增殖的：同種異型⑶40L-sBc (實(shí)心的圓圈，Allo-a，η = 3)，同種異型 ⑶40L-sBc初次刺激之后，通過多克隆再刺激（空心的圓圈，Α11〇-ρ，η = 8);或者兩輪多克 隆刺激（空心的方形，Poly，η = 5)。應(yīng)答者為由Treg供體得到的PBMC，刺激著為由sBc供 體得到的PBMC。所示的數(shù)據(jù)為在3至8個獨(dú)立的試驗(yàn)中觀察到的平均+/-SEM抑制。具有 Bonferroni多重比較檢驗(yàn)的雙向AN0VA用于測定差異的統(tǒng)計學(xué)意義。不同組的Treg產(chǎn)生 的1:5的抑制不具有顯著的差異。當(dāng)與All〇-a Treg或與All〇-p Treg(比例為1:25時， ρ〈0· 0001 ;比例為1:125時，ρ〈(λ 001)比較時，由Poly Treg的抑制顯著較低（比例為1:25 時，p〈0. 001 ;比例為1:125時，p〈0. 01)。Allo-a與Allo-p Treg在所有比例下均不具有顯 著性差異。圖9F示出了通過Treg增殖的⑶40L-sBc的抑制，其中Treg是通過由sBc供體 (實(shí)心的圓圈）或第三方供體（空心的三角形）得到的PBMC刺激的。所示的結(jié)果代表了 2 個獨(dú)立的試驗(yàn)。
[0023] 圖10A、圖10B和圖10C示出了由BALB/c. Rag2+ γ cv_小鼠得到的數(shù)據(jù)，該小鼠移 植有人類的皮膚，并使用與皮膚供體為同種異型的PBMC再生。通過計數(shù)每種移植物每個色 斑的4至6個高功率視野來分析免疫熒光顯微照片的圖像。然后比較由4個試驗(yàn)組得到的 定量結(jié)果。使用具有Bonferroni多重比較檢驗(yàn)的單向AN0VA來測定差異的統(tǒng)計學(xué)意義。
[0024] 圖11A為試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷氖疽鈭D，并示出過程。圖11B示出了在試驗(yàn)結(jié)束時測定的PBMC 再生，證明Treg的共注入沒有顯著地改變PBMC再生的程度。圖11C示出了 4個試驗(yàn)組中 BALB/c. Rag2+ γ 小鼠的體重，評估體重以用于測定大致的健康狀態(tài)，從而證明PBMC的 注入不會誘導(dǎo)移植物抗宿主的疾病。
[0025] 圖12為示例性同種異型抗原-反應(yīng)性Treg制造過程的示意圖。
[0026] 發(fā)明詳述
[0027] 本公開總體涉及用于免疫療法的調(diào)節(jié)T細(xì)胞（Treg)的制造。具體而言，本公開涉 及用于同種異型抗原-特異性Treg(all 〇 Treg)體外增殖的有效方法。以這種方式生產(chǎn)的 同種異型抗原-特異性Treg適用于誘導(dǎo)和/或保持同種異型移植在受體中的免疫耐受。
[0028] 本公開提供了在不到20天內(nèi)將供體-反應(yīng)性Treg選擇性地增殖200至1000倍的 方法。教條認(rèn)為樹突狀細(xì)胞是增殖T細(xì)胞最有效的，與此相反，發(fā)現(xiàn)CD40配體刺激的人類B 細(xì)胞在誘導(dǎo)Treg的生殖中是特別有效的。圖1示出了供體-反應(yīng)性Treg制造的工作流程。 簡言之，所述的工藝以刺激純化的供體B細(xì)胞開始，其中所述的細(xì)胞具有致命輻射的、經(jīng)藥 品生產(chǎn)管理規(guī)范（GMP)認(rèn)證的K562-h⑶40L轉(zhuǎn)染子。刺激的供體B細(xì)胞經(jīng)經(jīng)輻射，并通過 熒光激活細(xì)胞分類用于由受體外周血分離得到的⑶4+⑶25+⑶1271〇 Treg選擇性地增殖供 體-反應(yīng)性Treg (圖2A)。經(jīng)過9至12天，培養(yǎng)物中保留的Treg實(shí)際上均是供體-反應(yīng)性 的。使用抗CD3和抗CD28綴合的珠子再刺激Treg，使細(xì)胞進(jìn)一步再增殖5天。該方法誘導(dǎo) 了 Treg有效的增殖（圖2B)，并可以由1個單位的血液生產(chǎn)超過十億的供體-反應(yīng)性Treg。 增殖的Treg為：>95% CD4+ ;>60% Foxp3+ ;>90%具有去甲基化的Foxp3啟動子；>90%供 體-反應(yīng)性的；并且在Treg:應(yīng)答者PBMC的比例為1:125時，可抑制供體刺激的T細(xì)胞的 增殖。供體 -反應(yīng)性Treg(在不發(fā)明中也稱為同種異型抗原特異性Treg或alloTreg)在 用于促進(jìn)抑制耐受和治療移植物抗宿主的疾病的方法中具有用途。
[0029] 就Treg支持性的免疫抑制方案而言，示例性的實(shí)施方案涉及供體-反應(yīng)性Treg 在誘導(dǎo)肝臟移植的耐受（Ltx)的方法中的用途。Treg療法用于增加發(fā)展耐受的可能性和/ 或加速耐受的發(fā)展。因?yàn)楣w-反應(yīng)性T細(xì)胞的頻率特別高，所以必須"壓制"宿主同種異 型反應(yīng)性的全部體系及輔助的免疫抑制，從而創(chuàng)建Treg更有利的環(huán)境，以控制同種異型免 疫性并確保長期移植物耐受（Wells et al.，Nat Med, 5:1303-1307, 1999 ;Li et al.，Curr Opin Immunol, 12:522-527, 2000 ；and Wells et al.,Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，356:617-623, 2001)。重要的是，一些免疫抑制藥品有利于Treg的發(fā)展和/或存在， 而其他一些免疫抑制藥品則是中性的或抗性的。因此，在一些實(shí)施方案中，在器官移植環(huán)境 下，給予Treg與給予Treg支持性的免疫抑制方案組合進(jìn)行。
[0030] 在過去15年中，在Treg研究中的發(fā)現(xiàn)為供體-反應(yīng)性Treg在移植中的治療用途 提供了可信的理論基礎(chǔ)。本公開提供了一期臨床試驗(yàn)，涉及將供體-反應(yīng)性Treg給予實(shí)體 器官移植受體。符合藥品生產(chǎn)管理規(guī)范（GMP)的方法在可靠地增殖人類供體-反應(yīng)性Treg 方面的發(fā)展（實(shí)施例1)使得上述努力成為可能。此外，已經(jīng)發(fā)展一套免疫監(jiān)測檢驗(yàn)以詳細(xì) 分析移植患者中的同種異型免疫應(yīng)答，與之前所述的檢驗(yàn)相比，所述的免疫監(jiān)測檢驗(yàn)具有 顯著改善的敏感性和可重復(fù)性。 實(shí)施例
[0031] 在以下實(shí)施例中更詳細(xì)地描述本公開，這無意于以任何方式限定所要求的本公開 的范圍。附圖被認(rèn)為是本公開的說明和描述的完整的部分。提供以下實(shí)施例以進(jìn)行舉例說 明，但并非限定所要求的公開。
[0032] 在以下公開的試驗(yàn)中，應(yīng)用了以下縮寫：Μ(摩爾）；mM(毫摩爾）；μΜ(微摩爾）； ηΜ(納摩爾）；mol(摩爾）；mmol(毫摩爾）；μπιο1(微摩爾）；nmol(納摩爾）；gm(克）； mg(毫克）；μ g(微克）；pg(皮克）；L(升）；ml和mL(毫升）；μ 1和μ L(微升）；cm(厘 米）；mm(毫米）；μπι(微米）；nm(納米）；U(單位）；V(伏特）；MW(分子量）；sec(秒）； min(s) (1分鐘/幾分鐘）；h(s)和hr (s) (1小時/幾小時）；°C (攝氏度）；ND(未實(shí)施）； NA(不適用）；rpm(轉(zhuǎn)/分）；H20(水）；aa(氨基酸）；bp (堿基對）；kb (千堿基對）；kD (千 道爾頓）；cDNA(復(fù)制或互補(bǔ)DNA) ;DNA(脫氧核糖核酸）；ssDNA(單鏈DNA) ;dsDNA(雙鏈 DNA) ;dNTP(脫氧核糖核酸三磷酸）；PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）；qPCR (定量PCR) ;RNA(核糖核 酸）；以及RT_PCR(逆轉(zhuǎn)錄PCR)。其他的縮寫包括：Ab(抗體）；allo(同種異型）；CFSE(羧 基熒光素二乙酸酯，琥珀酰亞胺酯）；FACS(熒光激活的細(xì)胞分類）；GMP(藥品生產(chǎn)管理規(guī) 范）；IHC (免疫組織化學(xué)）；Ltx (肝臟移植）；MELD (晚期肝病的模型）；MLR(混合淋巴細(xì)胞 反應(yīng)）；PBMC(外周血單個核細(xì)胞）；poly(多克?。?；rATG(兔抗胸腺細(xì)胞球蛋白）；sB CS (刺 激的B細(xì)胞）；S0C (護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)）；SRL(歐列姆/納巴霉素 ）：tac (他克莫司）；Tc〇nv (傳統(tǒng) 的T細(xì)胞）；Tregs (調(diào)節(jié)T細(xì)胞）；TSDR(Treg-特異性的去甲基化區(qū)域）；Tx (移植）；以及 UCSF(University of California San Francisco)。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 供體-反應(yīng)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞的生產(chǎn)
[0035] 本實(shí)施例提供了在大約2周內(nèi)由人類外周血單個核細(xì)胞（PBMC)選擇性地體外增 殖至十億（1〇 9)個同種異型抗原-特異性Treg的、示例性符合GMP的方法（參見圖1)。
[0036] 材料和方法
[0037] 受體T細(xì)胞的純化和庫存。使用ficoll密度離心，由全血或白細(xì)胞分離法產(chǎn)物純 化PBMC。將細(xì)胞洗滌2次，并以100-200萬個細(xì)胞/ml/低溫瓶再次懸浮于冰冷的CS10冷 凍保藏溶液（BioLife Solutions)中。將細(xì)胞在速率受控的冰箱中冷凍，并儲存在液氮的 汽相中直至其他用途。
[0038] 供體T細(xì)胞的純化和庫存。收集由尸體供體得到的供體脾臟或淋巴結(jié)、或者由活 體供體得到的PBMC，并運(yùn)送至GMP工廠，從而加工成單一細(xì)胞懸液。在CliniMACS儀器上， 使用CD19陽性選擇來純化B細(xì)胞。通過冷凍保藏將純化的CD19+B細(xì)胞庫存起來，直至用 于Treg增殖。
[0039] 飼養(yǎng)細(xì)胞的制備。使用慢病毒轉(zhuǎn)染人類慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞K562(ATCC No. CCL-243)，以表達(dá)人類 CD40L、CD64 和 HLA-DR0401 (K562-hCD40L 或 K40L)。這些細(xì)胞在 免疫缺陷的小鼠中并非致瘤性的。K40L飼養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)受10, 000拉德的γ輻射，并庫存起來 直至其他用途。
[0040] 庫存的供體B細(xì)胞的激活。使用經(jīng)修改的復(fù)合GMP的方法（Zand et al.，Am J Transplant, 5:76-86, 2005)來形成刺激的B細(xì)胞（sBc)。具體而言，使用庫存的符合GMP的 Y輻射的K40L細(xì)胞以1-2:1比例（B:K40L)在包括10%人類AB血清、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、 人類重組IL-4和環(huán)孢霉素 A的培養(yǎng)基中，對在CliniMACS(Miltenyi)上經(jīng)順磁抗CD19微 珠純化的?Ι-lOOxlO6供體B細(xì)胞刺激7天。在第7天，使用K40L飼養(yǎng)細(xì)胞以1-10:1比例 (B:K40L)再刺激3天。平均增殖10至20倍。sBc通過ficoll除去死細(xì)胞（包括死K40L 細(xì)胞）。對sBc進(jìn)行一組質(zhì)量保證檢驗(yàn)，其包括qPCR基的EBV再激活檢驗(yàn)（Viracor)和流 式細(xì)胞儀，以確定HLA-DR、⑶80和⑶86的純度和表達(dá)。sBc是經(jīng)γ輻射的（1000拉德）并 庫存起來，直至其他用途。
[0041] Treg增殖。將受體PBMC解凍、計數(shù)，并使用臨床級熒光綴合抗體（⑶4-PerCP Ab、 CD25-APC Ab 和 CD127-PE Ab)染色。通過 FACS 由染色的 PBMC 純化 CD4+CD127WXD25+細(xì) 胞（圖 2A)。在包括 GMP 級的 Optimizer Medium(Invitrogen)(包括補(bǔ)體、GlutaMAX-lCTS 和2%人類AB血清）的生長培養(yǎng)基中，將FACS純化的Treg與庫存的經(jīng)輻射的sBc混合 (SBc :Treg比例為4:1)。在第2天，在培養(yǎng)基的體積達(dá)到2倍時，將總濃度為300IU/ml的 人類重組IL-2加入到培養(yǎng)物中。在第5、7和9天，向培養(yǎng)物中供入包括IL-2的新鮮培養(yǎng) 基，從而將細(xì)胞濃度保持為2-3xl0 5個細(xì)胞/ml。在培養(yǎng)的第11天，在培養(yǎng)期的剩余時間， 使用與抗CD3和抗CD28單克隆抗體綴合的珠子以1:1的比例再刺激細(xì)胞。在第1天供入 培養(yǎng)物，并在第16天收獲培養(yǎng)物。在16天的培養(yǎng)期內(nèi)，Treg增殖200至1600倍。
[0042] 將Treg再次懸浮于Hypo Thermosal溶液中，并保持在4?下，同時等待釋放檢驗(yàn)、 質(zhì)量保證審查和批準(zhǔn)的結(jié)果。在產(chǎn)物釋放時，將Treg運(yùn)送至臨床以便注入。由1個單位的 受體全血純化得到超過5xl0 6個的Treg。在保守估計增殖200倍的情況下，在增殖期結(jié)束 時，預(yù)計收獲至少lxlO9供體-反應(yīng)性Treg。
[0043] 釋放檢驗(yàn)和釋放標(biāo)準(zhǔn)。在Treg釋放前，使用以下檢驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)：生活力>99%;流式 細(xì)胞儀測定 ：〇)4>90%，0)8〈5%，0)19〈5%，？(《口3>60%和了501?>80%。在培養(yǎng)的第12天， 細(xì)菌、真菌、支原體和內(nèi)毒素的微生物檢驗(yàn)為陰性。使用的TSDR檢驗(yàn)為目前用于Treg的 純度和穩(wěn)定性的最精確且可靠的檢驗(yàn)。甲基化檢驗(yàn)確認(rèn)了通過流式細(xì)胞儀測定的Foxp3+ 細(xì)胞的百分率。此外，強(qiáng)有力的證據(jù)證明Foxp3可以在激活的Tconv細(xì)胞中表達(dá)。但是， Foxp3TSDR座位在激活的Tconv細(xì)胞中是甲基化的，而在真正的Treg中是去甲基化的。
[0044] 釋放后的檢驗(yàn)。對各產(chǎn)物實(shí)施以下檢驗(yàn)，以完全證明細(xì)胞的表現(xiàn)型和功能性：1) 使用2個面板進(jìn)行增值的流式細(xì)胞計數(shù)分析，所述的2個面板由CD4/F 〇Xp3/CD27/CD62L和 CD4/F〇Xp3/CD25/Heli〇S組成；2)供體特異性抑制檢驗(yàn)；3)供體特異性檢驗(yàn)；4)長期的14 天微生物檢驗(yàn)；以及5)由供體sBc、PMA和毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞因子（IL-2、IFN- γ和IL-17)。
[0045] 最近的試驗(yàn)證據(jù)表明F〇Xp3+Treg是"塑性的"，并且可以獲得效應(yīng)器細(xì)胞因子 的表達(dá)，例如 IFN-γ 和 IL-17 (Zhou et al.，Curr Opin Immunol, 21:281-285, 2009; Zhou et al.，Immunity，30 : 646-655，2009 ;and Hori et al. , Curr Opin Immunol，22:575-582, 2010)。區(qū)分2種的塑性Treg的命運(yùn)是有用的，一種命運(yùn)導(dǎo)致Foxp3 表達(dá)及伴隨的效應(yīng)器細(xì)胞因子（exTreg)的表達(dá)喪失（Komatus et al.，Proc Natl Acad Sci USA 106:1903-1908,2009 ；Xu et al. ,J Immunol, 178:6725-6729, 2007 ；0sorio et al·，Eur J Immunol，38:3274-3281，2008 ;Yang et al·，Immunity，29:44-56, 2008 ;and Zhou et al.，Nat Immunol，10:1000-1007, 2009)，而另一種命運(yùn)則導(dǎo)致 Foxp3 和效應(yīng)器 細(xì)胞因子（效應(yīng)器 Treg)的共表達(dá)（Tartar et al.，J Immunol，184:3377-3385,2010; Beriou et al·，Blood，113:4240-4249，2009 ;Radhakrishnan et al. , J Immunol，181:3137-3147, 2008 ;01denhove et al.，Immunity，31:772-786, 2009 ; Stroopinsky et al·，Eur J Immunol，39:2703-2715,2009 ;Koch et al·，Nat Immunol，10:595-602,2009 ;and Hvhannisyan et al. , Gastroenterology, 140:957-965 ，2011)。盡管exTreg具有低的或不具有抑制活性，并且在試驗(yàn)的自體免疫環(huán)境中可以是 致病性的，但是重要的是應(yīng)該注意，exTreg在充滿淋巴的宿主中的出現(xiàn)主要是在極端試 驗(yàn)條件下發(fā)生的（Rubtsov et al.，Science，329:1667-1671，2010)。此外，在所有的條件 下，即使在使用PMA和毒素進(jìn)行體外超生理的刺激之后，大部分的exTreg均不表達(dá)效應(yīng)器 細(xì)胞因子。使用示例性的方法生產(chǎn)的供體-反應(yīng)性Treg，我們具有高水平表達(dá)的Foxp3、 TSDR和He 1 ios。這些細(xì)胞在Treg支持的免疫抑制條件下被注入到患者中，由此，注入的 供體-反應(yīng)性Treg在體內(nèi)轉(zhuǎn)變成成熟的致病性效應(yīng)器的機(jī)會較低。與exTreg相反，效 應(yīng)器Treg顯示在許多試驗(yàn)條件下都是抑制性的。具體而言，已經(jīng)顯示通過Treg生產(chǎn)的 IFN-γ對于對抗同種異型移植物排斥的抑制功能和保護(hù)是必要的（Sawitzki et al.，J Exp Med, 201:1925-1935, 2005)。因此，預(yù)計通過Foxp3+Treg生產(chǎn)的效應(yīng)器細(xì)胞因子是耐 受性的，而不是致病性的。預(yù)計在Treg支持的免疫抑制條件下，將供體-反應(yīng)性Treg(根 據(jù)TSDR檢驗(yàn)，其具有高的且穩(wěn)定的Foxp3表達(dá)）注入到患者中會阻止供體-反應(yīng)性Treg 潛在地轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏⌒詄xTreg。
[0046] 結(jié)果
[0047] 供體-反應(yīng)性Treg的增殖。上述使用⑶40L刺激的供體B細(xì)胞（sBc)作為抗原呈遞 細(xì)胞（APC)的方法適用于選擇性地增殖供體-反應(yīng)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞，其起始于由受體PBMC得 到的、FACS純化的⑶4 +CD127wTD25+Treg。大量檢驗(yàn)顯示，實(shí)際上在刺激后的第8至10天， 在培養(yǎng)物中保持的所有活細(xì)胞均是供體反應(yīng)性的。然后，使用與抗CD3和抗CD28綴合的珠 子，通過多克隆再刺激進(jìn)一步增殖細(xì)胞。按照之前所述，使用FACS，基于⑶4 +CD127wTD25+ 細(xì)胞表面表現(xiàn)型，由 PBMC 純化 Treg (Putman et al.，Diabetes, 58:652-662, 2009)。使用抗 ⑶19的CliniMACS珠子（Miltenyi)純化供體B細(xì)胞，并使用符合GMP的、經(jīng)輻射的K562細(xì) 胞（表達(dá)人類⑶40L)刺激供體B細(xì)胞。通過ficoll密度梯度離心由sBc中除去死的K540L 細(xì)胞，并使純化的sBc經(jīng)經(jīng)輻射，然后加入到純化的Treg中。使用該方法，使得Treg增殖 達(dá)?1600倍?？紤]到彡10%的Treg對全部的HLA錯配的供體具有反應(yīng)性，在16天的培養(yǎng) 期中，1600倍的總體的增殖可解釋為在供體-反應(yīng)性Treg中增高16000倍。
[0048] 建立一系列的方法來評估增殖的供體-反應(yīng)性Treg的表現(xiàn)型和功能能力。與相 似的增殖的Tconv細(xì)胞相比，增殖的Treg培養(yǎng)物為CD3+CD4+CD8-CD19-、Foxp3+、Helios+、 CD27+和CD62Lhi (圖2B)。幾乎所有的供體sBc增殖的Treg都對供體sBc的再刺激產(chǎn)生 應(yīng)答，而對同系的sBc不應(yīng)答，表明它們是刺激物-反應(yīng)性的（圖4A)。供體sBc增殖的 Treg與多克隆增殖的Treg相比，表現(xiàn)為增強(qiáng)的供體-特異性抑制活性（圖4B)。重要的 問題是供體-反應(yīng)性Treg是否是穩(wěn)定的Treg或T效應(yīng)器細(xì)胞，其可以瞬間上調(diào)節(jié)Foxp3。 Foxp3啟動子的去甲基化顯示為表達(dá)Foxp3的穩(wěn)定的Treg的有效標(biāo)志物（Wang et al.，Eur J Immunol, 37:129-138, 2007 ；and McClymont et al. , J Immunol,186:3918-3926, 2010) 〇 如通過定量Treg-特異性去甲基化區(qū)域（TSDR)檢驗(yàn)測定的那樣，大于94%的供體-反 應(yīng)性Treg,及小于1 %的dsTconv具有去甲基化的Foxp3啟動子（圖3B) (Wieczorek et al.，Cancer Res, 69:599-608, 2009)?？傊?，這些結(jié)果證明示例性的方法可靠地增殖GMP級 的供體-反應(yīng)性Treg。由典型的增殖得到的釋放檢驗(yàn)結(jié)果示于圖5中。
[0049] 實(shí)施例2
[0050] 使用供體-反應(yīng)性Treg和Treg支持的免疫抑制的肝臟移植
[0051] 本實(shí)施例描述了劑量遞增臨床試驗(yàn)，來評估同源的供體-反應(yīng)性Treg療法在肝臟 移植（Ltx)受體中的安全性。但是，本公開的方法和組合物不限于該內(nèi)容。事實(shí)上，預(yù)計本 公開的方法和組合物在其他實(shí)體器官的同種異型移植物、以及在治療或預(yù)防移植物抗宿主 的疾病中具有用途。預(yù)計供體-反應(yīng)性Treg和Treg支撐的免疫抑制適用于誘導(dǎo)或保持同 種異型移植物的耐受，其中所述的移植物選自但不限于心臟、肺、心臟/肺、腎、胰腺、腎/胰 腺、腸和肝臟的同種異型移植物。
[0052] 將劑量遞增的Treg(使用激活的供體B細(xì)胞體外增殖）與改善的免疫抑制方案 (設(shè)計以有利于Treg的發(fā)展、持續(xù)和功能）一起給予Ltx受體。該方案由兔抗胸腺細(xì)胞球 蛋白（rATG)的誘導(dǎo)；劑量減少的皮質(zhì)留類（Pred)、霉酚酸酯（MMF)和他克莫司（tac);然后 延遲地引入歐列姆（SRL)組成。該主題在移植后持續(xù)1年，在其間，收集臨床數(shù)據(jù)、以及外 周血（PBMC和血清）和肝臟活檢樣品，并進(jìn)行分析。
[0053] 主要目的。對成人評估以下結(jié)果，新發(fā)Ltx受體：一年急性排斥反應(yīng)發(fā)生率 ("Banff schema for grading liver allograft rejection:an international consensus document, " Hepatology, 25:658-663, 1997); -年慢性排斥反應(yīng)發(fā)生率（"Liver biopsy interpretation for causes of late liver allograft dysfunction,，'，Hepatology, 44: 489-501，2006);在注入Treg后3個月，彡3級感染的發(fā)生率；彡3級傷口并發(fā)癥的發(fā)生率； > 3級貧血、嗜中性白血球低下和/或血小板減少癥的發(fā)生率。
[0054] 第二目的。此外，評估以下結(jié)果：超過基線的Treg百分率的增加；供體-反應(yīng)性 Treg頻率的增加；供體-反應(yīng)性Treg活性的增加；以及PBMC和/或肝臟組織中，耐受基因 表達(dá)圖譜的檢測。
[0055] 患者群體和納入/排除標(biāo)準(zhǔn)。臨床試驗(yàn)涵蓋3個時期，每個時期都具有特定的納 入/排除方案以使參與者的安全性最大化。
[0056] 前期和Ltx期?；颊哌x自Ltx等待列表，其年齡在20-70歲，患有晚期肝病并且計 算的 MELD 得分不超過 25 分（Kamath et al·，Hepatology, 33:464-470, 2001)。試驗(yàn)特異 性地排除了急性排斥和疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險增大的Ltx受體，并限定了肝病、門靜脈高壓和/或脾 臟功能亢進(jìn)的嚴(yán)重性。在一些實(shí)施方案中，僅選擇其PBMC中存在的Treg高于10/μ 1的患 者。
[0057] 合適的患者經(jīng)白細(xì)胞分離法分理出PBMC，將其冷凍保藏以用于隨后的Treg純化 和增殖。在tx時并證明患者持續(xù)合格之后，收集供體脾臟和/或淋巴結(jié)、以及肝臟活檢組 織，并庫存起來。
[0058] Treg支持的免疫抑制時期。Ltx受體必須脫離I⑶并在tx后的3天內(nèi)開 始rATG誘導(dǎo)。他們接受總劑量為3至4. 5mg/kg的rATG，以使淋巴細(xì)胞被去除，定義 為⑶3計數(shù)<50/mm3。選擇該劑量范圍，從而形成充分的壓制（Wong et al.，Transpl Int，19:629-635, 2006)，同時減小免疫抑制。選擇給予rATG的定時和環(huán)境，以避免在醫(yī)學(xué) 不穩(wěn)定的受體中過多的免疫抑制和/或細(xì)胞因子釋放綜合癥/血液學(xué)毒性的可能。患者被 評估為合格，則轉(zhuǎn)變?yōu)闅W列姆（SRL)基的免疫抑制，并且必須具有正常的同種異型移植物 功能，以及在Ltx后的4至6周內(nèi)具有足夠的腎功能、血液學(xué)參數(shù)、傷口愈合和肝動脈開放。
[0059] 特異地設(shè)計研究受試對象的免疫抑制方案，以促進(jìn)Treg的發(fā)展，同時優(yōu)化參與者 的安全性。根據(jù)護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)（S0C)，研究參與者的免疫抑制起始于一半劑量的皮質(zhì)留類和一 半劑量的霉酚酸酯（MMF)。新加入他克莫司（Tac)，目的在于水平降低至6至8yg/L(與 S0C(10-15l·! /L)相比）。在tx后的3天內(nèi)，患者接受一個流程或rATG(總劑量為3. 0至 4.5mg/kg)以去除淋巴細(xì)胞（CD3計數(shù)〈50/mm3或者當(dāng)給與最大劑量時）。取消皮質(zhì)甾類的 參與者在tx后的4至6周轉(zhuǎn)變?yōu)镾RL基的免疫抑制，并且開始時SRL的目標(biāo)水平為6至 8 μ g/L，并將標(biāo)簽tag降低至3至5 μ g/L的低谷水平。終止MMF。在轉(zhuǎn)變?yōu)镾RL基IS后的 4周（在tx后的8至10周），參與者經(jīng)歷最終的評估，包括同種異型移植物活檢，以確保接 受Treg注入的合格性。Tx后的6個月，SRL被進(jìn)一步降低至目標(biāo)水平4至6 μ g/L。
[0060] 表2-1.肝臟移植患者的免疫抑制（IS)計劃
[0061]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于生產(chǎn)人類供體-反應(yīng)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞（Treg)的方法，包括： a) 在有效生產(chǎn)刺激的B細(xì)胞（sBc)的條件下，使人類供體與經(jīng)輻射的CD40L+人類白血 病飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)；以及 b) 在有效地選擇性地增殖人類供體-反應(yīng)性調(diào)節(jié)T細(xì)胞（Treg)的條件下，使人類受體 的CD4+、CD25+、CD127-/loT細(xì)胞與所述的sBc共培養(yǎng)。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括步驟c):在有效生產(chǎn)再刺激的供體-反應(yīng)性 Treg的條件下，通過所述的供體-反應(yīng)性Treg的⑶3與⑶28的交聯(lián)來再刺激所述的供 體-反應(yīng)性Treg。
3. 權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的步驟c)在所述的步驟b)開始后的9-12天開 始。
4. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的供體-反應(yīng)性Treg為CD4+、Helios+和Foxp3+。
5. 權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包括在所述的a)之前，由所述的人類受體獲得的 冷凍保藏的外周血單個核細(xì)胞（PBMC)分離⑶4+、⑶25+、⑶127-/1οΤ細(xì)胞的步驟。
6. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的步驟a)包括將所述的Β細(xì)胞和所述的飼養(yǎng)細(xì)胞 在包括胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、白細(xì)胞介素-4和環(huán)孢霉素 A的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)。
7. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的步驟b)包括在所述的sBc經(jīng)受輻射之后，將所 述的sBc和所述的⑶4+、⑶25+、⑶127-/1οΤ細(xì)胞在包括白細(xì)胞介素-2的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)。
8. 權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的再刺激的供體-反應(yīng)性Treg在所述的步驟b) 開始時，包括是所述的CD4+、CD25+、CD127-/loT細(xì)胞的200倍至2000倍的細(xì)胞。
9. 一種組合物，其包括使用權(quán)利要求2-8的任意一項所述的方法生產(chǎn)的再刺激的供 體-反應(yīng)性Treg、以及生理學(xué)可接受的緩沖劑。
10. -種治療或預(yù)防人類受體對實(shí)體器官同種異型移植物的排斥的藥劑，所述的藥劑 包括：使用權(quán)利要求2-8的任意一項所述的方法生產(chǎn)的10 7至1011的再刺激供體-反應(yīng)性 Treg。
11. 權(quán)利要求10所述的藥劑，其中所述的實(shí)體器官同種異型移植物選自心臟、肺、心臟 /肺、腎、胰腺、腎/胰腺、肝臟、腸和皮膚同種異型移植物。
12. 權(quán)利要求10所述的藥劑，其中所述的藥劑在降低急性和/或慢性排斥的可能性中 是有效的。
13. 權(quán)利要求10所述的藥劑，其中所述的藥劑在取得胰以下一種或多種作用中是有 效的：將Treg百分率升高至基線以上，增加供體-反應(yīng)性Treg的頻率，增加供體-反應(yīng)性 Treg活性，以及在PBMC和/或移植組織中誘導(dǎo)耐受基因表達(dá)圖譜。
14. 權(quán)利要求10所述的藥劑，其中在所述的人類受體經(jīng)歷Treg支持的免疫抑制方案之 后，將所述的藥劑給予所述的人類受體，其中所述的藥劑包括有效去除淋巴細(xì)胞的量的兔 抗胸腺細(xì)胞球蛋白。
15. 權(quán)利要求10所述的藥劑，其中將所述的藥劑給予所述的人類受體，同時給予低于 護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)的劑量的潑尼松、霉酚酸酯和他克莫司。
16. 權(quán)利要求10所述的藥劑，其中將所述的藥劑給予所述的人類受體，同時給予歐列 姆。
【文檔編號】A61P37/00GK104245923SQ201380021317
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年3月1日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月2日
【發(fā)明者】唐奇志, J·A·布盧斯通 申請人:加州大學(xué)評議會