靶向經(jīng)修飾的tnf家族成員的制作方法
【專利說明】祀向經(jīng)修飾的TNF家族成員
[0001] 本發(fā)明設及TNF超家族的一種對它的受體具有降低的活性的經(jīng)修飾的細胞因子， 其中所述經(jīng)修飾的細胞因子被特異性遞送至祀細胞。優(yōu)選地，所述經(jīng)修飾的細胞因子是TNF 超家族的成員的單鏈變體，甚至更優(yōu)選地，一個或多個鏈攜帶一種或多種突變，從而導致對 受體具有低親和力，其中所述突變細胞因子被特異性遞送至祀細胞。祀向通過使TNF超家族 的經(jīng)修飾的細胞因子融合于祀向部分，優(yōu)選是抗體或抗體樣分子來實現(xiàn)。本發(fā)明進一步設 及TNF超家族的所述祀向經(jīng)修飾的細胞因子治療疾病的用途。
[0002] TNF超家族由通過調(diào)控細胞死亡、增殖和分化而在免疫系統(tǒng)中具有至關重要功能 的促炎性細胞因子組成。此外，所述家族的成員被描述為對骨代謝、神經(jīng)系統(tǒng)、新血管系統(tǒng) 和癌發(fā)生施加作用。它含有W自我裝配性非共價結(jié)合的同=聚體形式具有生物活性的19種 配體，即n型(細胞內(nèi)N末端和細胞外C末端)跨膜蛋白。盡管大多數(shù)TNF超家族配體W膜結(jié)合 的蛋白質(zhì)形式合成，但可通過蛋白水解裂解來產(chǎn)生可溶性形式。它們?nèi)纪ㄟ^它們的C末端 TNF同源性結(jié)構(gòu)域來結(jié)合一種或多種來自TNF受體超家族的分子，所述結(jié)構(gòu)域在家族成員之 間展現(xiàn)約20-30%序列同源性。迄今為止，已在人中鑒定了 29種TNF超家族受體。運些主要是 在配體結(jié)合細胞外結(jié)構(gòu)域中具有富含半脫胺酸的基序的I型(細胞外N末端、細胞內(nèi)C末端） 跨膜糖蛋白。然而，存在一些例外，如通過共價連接的C末端糖脂連接于膜的TRAIL-R3?？扇?性受體可通過蛋白水解裂解(例如TNF-Rl和TNF-R2)或通過選擇性剪接編碼跨膜結(jié)構(gòu)域的 外顯子來產(chǎn)生。運個超家族的受體可基于它們的信號傳導性質(zhì)而被劃分在3個組中：誘導調(diào) 亡的具有細胞質(zhì)死亡結(jié)構(gòu)域的受體;誘導如^-郵、1服、938、6服和？131(的若干信號傳導路 徑的具有TRAF相互作用基序的受體;和缺乏細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域的誘巧受體。TNF通過與 TNF-Rl (p55)相互作用來誘導調(diào)亡，而與TNF-R2(p75，主要在免疫細胞上表達)結(jié)合會促進 增殖。TRAIL信號傳導更復雜，因為它可結(jié)合兩種死亡受體（TRA化-RUDR4)和TRA^-R2 (0尺5))、兩種誘巧受體（了1^化-1?3(0〔1?1)和了1?4化-1?4(0〔1?2))^及可溶性骨保護素 (OSteoprotegerin) (OPG)。與后S種受體中的一種結(jié)合抑制TRAIL介導的調(diào)亡，因為運栓系 TRAIL而遠離死亡受體（Gaul"和Aggerwal, 2003; Hehlgan巧日Pfeffer, 2005; Huang和化eiWi, 2007)O
[0003] 死亡誘導性TNF超家族成員TNF、CD9化(FasL)和TRAIL是針對表達它們的相應受體 TNF-Rl、〔095^1?4比-1?巧町1?4比-1?2的癌癥的潛在治療劑。實際上^^最初在超過25年前被 發(fā)現(xiàn)為一種通過在體內(nèi)導致某些腫瘤的出血性壞死而具有卓越抗腫瘤活性的因子。稍后， 變得明確的是歸因于TNF的對腫瘤新血管系統(tǒng)的選擇性損害也確定它的抗腫瘤潛力 化e jeune等，2006; van化rssen等，2006)。不幸的是，在癌癥治療中全身性使用TNF仍然受 阻于它的休克誘發(fā)性質(zhì)。它當前在臨床上僅與化學療法組合用于隔離肢體灌注的環(huán)境中來 治療軟組織肉瘤和處于轉(zhuǎn)變中的黑素瘤(Robeds等，2011)。此外，CD%L在全身性施用時是 有毒的，因為它導致歸因于大量肝細胞調(diào)亡的致死性肝細胞毒性(Galle等，1995)。然而，已 顯示TRAIL會誘導癌細胞的調(diào)亡，針對非轉(zhuǎn)化細胞具有少許或不具有細胞毒性，并且在各種 晚期癌癥中進行的臨床試驗報道在許多情況下疾病穩(wěn)定。然而，為獲得足夠總體治療活性， 需要組合治療，此暗示歸因于正常細胞對TRAIL誘導的調(diào)亡敏感的可能的副作用 (Ashkenaz巧日Herbst ,2008;hlschlehner等，2009)。已進行不同方法來使全身性施用死亡 誘導性TNF超家族成員后的毒性減至最小，如具有較低毒性和較高效率的突變TNF化i等， 2012)，通過腫瘤特異性部分來遞送通常呈單鏈構(gòu)建體形式的TNF或TRAIUde Bruyn等， 2013 ;Gregorc等，2009;Liu等，2006; Siegemund等，2012;Wang等，2006)，嵌合可溶性CD95L (Daburon等，2013)或激動性TRAIkRl、TRAIkR2或CD95特異性抗體（Johnstone等，2008; Ogasawara等，1993;化X等，2010)。它們中的一些可增加治療指數(shù)，但從未達到它顯著改進 臨床結(jié)果的程度。
[0004]驚人地，我們發(fā)現(xiàn)有可能制備包含TNF超家族的細胞因子的構(gòu)建體，其中所述細胞 因子被修飾W降低對受體的親和力，其中所述細胞因子被連接于祀向部分，并且其中所述 構(gòu)建體具有強烈降低的全身性毒性，并且僅對由祀向部分祀向的細胞顯示顯著生物活性。 [000引本發(fā)明的第一方面是一種構(gòu)建體，其包含（i)TNF超家族的細胞因子鏈的S個拷 貝，其中所得細胞因子被修飾(被稱為"經(jīng)修飾的細胞因子"）W使對它的受體的親和力降 低，（ii)連接子序列和(iii)祀向部分，其中所述連接子序列使細胞因子拷貝連接于所述祀 向部分。如此處所用的構(gòu)建體可為本領域技術人員已知的任何蛋白質(zhì)構(gòu)建體，包括但不限 于經(jīng)化學修飾的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)復合物和融合蛋白。在一個優(yōu)選實施方案中，使用個別自我 =聚化細胞因子鏈，其中一個或多個鏈可被連接于祀向部分。在另一優(yōu)選實施方案中，=個 拷貝呈現(xiàn)為單鏈細胞因子;在一優(yōu)選實施方案中，拷貝由連接子序列分隔W有助于W=聚 形式呈現(xiàn)細胞因子。對于本領域技術人員明確的是具有一個游離細胞因子鏈和兩個彼此連 接的細胞因子拷貝的混合形式也是可能的。所得=聚細胞因子攜帶相較于野生型細胞因子 使它的生物活性降低的修飾。所述修飾可為降低正常野生型細胞因子的活性的修飾，或它 可為增加同源性、非內(nèi)源性TNF家族細胞因子(如但不限于另一物種的不結(jié)合人TNF家族細 胞因子受體的TNF家族細胞因子)的活性的修飾。修飾可為本領域技術人員已知的降低或增 加活性的任何修飾，包括但不限于化學和/或酶修飾，如聚乙二醇化和糖基化、融合于其它 蛋白質(zhì)W及突變。在細胞因子的兩個或更多個拷貝被呈現(xiàn)為單鏈的情況下，可使連接子的 長度適合于擾亂正常=聚結(jié)構(gòu)，從而導致對受體的活性較低?；蛘撸蓪⑻厥獍被岵⑷脒B 接子中W修飾結(jié)構(gòu);所述氨基酸可進一步被修飾。作為一非限制性實例，可將賴氨酸并入連 接子中W允許達成聚乙二醇化。優(yōu)選地，所述修飾是突變，甚至更優(yōu)選地，它是降低細胞因 子對它的受體的親和力的突變。如此處所用的降低的親和力和隨之發(fā)生的降低的生物活性 意指相較于正常結(jié)合受體的野生型細胞因子，經(jīng)修飾的細胞因子具有的生物活性小于野生 型細胞因子的生物活性的70%，甚至更優(yōu)選小于野生型細胞因子的生物活性的60%，更優(yōu) 選小于野生型細胞因子的生物活性的50%，更優(yōu)選小于野生型細胞因子的生物活性的 40%，更優(yōu)選小于野生型細胞因子的生物活性的30%，更優(yōu)選小于野生型細胞因子的生物 活性的20%，最優(yōu)選小于野生型細胞因子的生物活性的10%。優(yōu)選地，TNF超家族的經(jīng)修飾 的細胞因子是TNF超家族的野生型細胞因子的突變體，并且將活性與TNF超家族的野生型細 胞因子進行比較?？赏ㄟ^為本領域技術人員所知的任何方法測量親和力和/或活性?？赏ㄟ^ Scatchard作圖分析和計算機擬合結(jié)合數(shù)據(jù)（例如Scatchard, 1949)，或通過如由Rrecht等 (1993)所述在流通條件下進行反射干設光譜法來測量相較于野生型TNF對受體的親和力的 突變TNF對受體的親和力。
[0006]優(yōu)選地，所述細胞因子選自由FasUTRAIU TNF、CD30L、CD40L、0X40L、RANKL、 T 肥AKL、LTa、L邱、LIGHT、CD2 化、41B化、G 口化、APRIL、EDA、VEG 巧郵AFF組成的組。優(yōu)選地，所 述細胞因子呈現(xiàn)為單鏈，其中各鏈由連接子序列連接。
[0007] 使經(jīng)修飾的細胞因子連接于祀向部分。如此處所用的"連接"可通過共價結(jié)合達 成，或它可通過親和力結(jié)合達成。在一非限制性實例中，所述祀向部分可為對于一種特異性 來說針對祀細胞上的結(jié)合位點，W及對于另一特異性來說針對經(jīng)修飾的細胞因子或融合于 所述細胞因子的標簽的雙特異性抗體。在另一非限制性實例中，祀向部分可被W化學方式 連接于經(jīng)修飾的細胞因子，或它可為重組融合蛋白。優(yōu)選地，所述祀向構(gòu)建體是重組融合蛋 白。優(yōu)選地，所述祀向部分使細胞因子祀向腫瘤環(huán)境，特別是祀向腫瘤血管系統(tǒng)(例如祀向 腫瘤的內(nèi)皮細胞，通常是新內(nèi)皮細胞）。甚至更優(yōu)選地，祀向部分是可通過結(jié)合位點與結(jié)合 分子之間的特異性相互作用將融合蛋白向表達TNF超家族的細胞因子的受體，優(yōu)選是能夠 與經(jīng)修飾的細胞因子相互作用的受體的細胞上的結(jié)合位點引導的結(jié)合分子。在一個優(yōu)選實 施方案中，所述結(jié)合分子是特異性結(jié)合位于細胞的外部上的分子的小化合物。在另一優(yōu)選 實施方案中，所述結(jié)合分子是針對在細胞壁上表達的凝集素（lectin)樣分子的糖結(jié)構(gòu)。在 另一優(yōu)選實施方案中，所述結(jié)合分子是祀向腫瘤環(huán)境，優(yōu)選祀向腫瘤血管系統(tǒng)的膚。所述膚 為本領域技術人員所知，并且包括但不限于NGR(祀向在腫瘤血管中表達的CD13亞型）和RGD 膚(化ng等，2011;W02005054293)。優(yōu)選地，所述膚是祀向Qv抗整聯(lián)蛋白（integrin)的RGD-4C 膚(Arap等，1998)。在另一優(yōu)選實施方案中，所述結(jié)合分子是包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。結(jié) 合結(jié)構(gòu)域為本領域技術人員所知。所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域的非限制性實例是碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu) 域(C抓）（Blake等，2006)、重鏈抗體化cAb)、單結(jié)構(gòu)域抗體(sdAb)、微抗體(Tramontane)等， 1994)、駱駝科重鏈抗體的可變結(jié)構(gòu)域（VHH)、新抗原受體的可變結(jié)構(gòu)域(VNAR)、親和體 (Nygren等，2008)、a體(alphabody) (W02010066740)、設計的錯蛋白（ankyrin)重復結(jié)構(gòu)域 (DARPin) (Stumpp等，2008)、抗運載蛋白（antical in) (Skerra等，2008)、打結(jié)素化nott in) 化0Imar等，2008)和工程改造的CH2結(jié)構(gòu)域(納米抗體;Dimitrov，2009)。優(yōu)選地，所述祀向 部分是納米抗體。
[0008] 在一優(yōu)選實施方案中，在重組融合蛋白中，使祀向部分連接于經(jīng)修飾的細胞因子。 可使祀向部分直接融合于突變細胞因子，或它可借助于連接子片段進行融合。優(yōu)選地，所述 連接子是GGS連接子。甚至更優(yōu)選地，所述連接子由至少5個GGS重復，更優(yōu)選至少10個GGS重 復，更優(yōu)選至少15個GGS重復組成，更優(yōu)選地，所述連接子是由17-23個GGS重復組成的連接 子，最優(yōu)選地，所述連接子由20個GGS重復組成。祀向部分可被融合在突變細胞因子的氨基 末端或簇基末端;優(yōu)選地，所述祀向部分被融合在突變細胞因子分子的氨基末端。除突變細 胞因子和祀向部分之外，構(gòu)建體可進一步包含其它結(jié)構(gòu)域，如但不限于標簽序列、信號序 列、另一細胞因子或抗體。
[0009] 優(yōu)選地，祀向部分針對選自由W下組成的組的祀標:CD20、CD33、CD47、CD70、PSCA、 PSMA、Her2、c-Met、EGFR、Axl、腫生蛋白C、av03整聯(lián)蛋白、纖連蛋白（f ibronectirOEDA末端 EDB結(jié)構(gòu)域、III型纖連蛋白（FNIII)重復(Al-D)、腫生蛋白-C和CD13及其腫瘤細胞特異性剪 接變體。當祀向部分祀向腫瘤血管系統(tǒng)時，具體來說，設想的祀標包括但不限于CD13、av抗整 聯(lián)蛋白、纖連蛋白邸A末端邸B結(jié)構(gòu)域、III型纖連蛋白（FNIII)重復(Al-D)和腫生蛋白-C。根 據(jù)替代性特定實施方案，所述祀向部分針對CD20。特別設想的是祀向部分是抗體(或納米抗 體），因為針對運些祀標的抗體可易于獲得和/或可易于產(chǎn)生。
[0010] 細胞因子鏈中的突變可為本領域技術人員已知的任何突變，如缺失、插入或點突 變。至少一個鏈具有至少一種突變;然而，若干種突變可被組合在一個鏈中。=個鏈可攜帶 相同突變或不同突變。優(yōu)選地，所述突變使細胞因子對它的受體或它的一種受體的親和力 降低。優(yōu)選地，所述突變是點突變。
[0011] 在一個優(yōu)選實施方案中，細胞因子是TNF，并且使構(gòu)建體祀向在TNFRl和/或TNFR2 表達細胞上表達的標志物。在另一優(yōu)選實施方案中，所述標志物是組織特異性標志物，甚至 更優(yōu)選地，所述標志物是新血管系統(tǒng)組織或癌組織特異性標志物。最優(yōu)選地，所述標志物選 自由〔020、化^、(3-]\161、66尸1?、腫生蛋白(：、曰麻整聯(lián)蛋白和〔013組成的組。
[0012] 優(yōu)選地，經(jīng)修飾的細胞因子是突變TNF，其中突變選自由在位置R32、N34、Q67、H73、 1^75^77、586、￥87、￥91、197、1'105、口106、4109、口113、￥115、6127、化37、0143、4145上的突變 組成的組。甚至更優(yōu)選地，所述突變選自由TNF R32G、N34G、Q67G、H73G、L75G、L75A、L75S、 T77A、S86G、Y87Q、Y87L、Y87A、Y87F、V91G、V91A、I97A、I97Q、I97S、T105G、P106G、A109Y、 P113G、Y115G、Y115A、E127G、N137G、D143N、A145G和A145T組成的組。甚至更優(yōu)選地，所述突 變選自由Y87X、I97X和Y115X組成的組。