WT-6XGGS-4. IO-Flag和 pMet7-SI巧-HA-hTNF I97A-6XGGS-4.10-Flag。
[0048] 在pMet7中制備在個(gè)別S聚化或單鏈人或小鼠 TNF的N末端具有NB的納米抗體-TNF 融合物表達(dá)構(gòu)建體，并且設(shè)計(jì)成使得各亞單位可通過獨(dú)特限制位點(diǎn)互換:AgeI-納米抗體-Sa 11-GGS連接子-No 11 -TNF-Xho I -Hi S -甜a I。
[0049] P化3-(IL6-kB)3-巧光蟲巧光素酶由W.Vanden Berghe(Vanden Berghe等，1998) 友情提供。
[0050] 產(chǎn)生用于體外研究的納米抗體-TNF融合蛋白
[0051] 使用標(biāo)準(zhǔn)憐酸巧沉淀方法，用蛋白質(zhì)融合構(gòu)建體轉(zhuǎn)染化kT細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染之后48小 時(shí)，收集培養(yǎng)基并儲存在-20°C下。用商業(yè)hTNF ELISA(DY210，R1D systems)測定濃度。
[0052] 產(chǎn)生用于體內(nèi)研究的納米抗體-scTNF融合蛋白
[0053] 根據(jù)制造商指南，使用陽Ipro?轉(zhuǎn)染試劑(PolyPlus，目錄號115-375)用蛋白質(zhì)融 合構(gòu)建體轉(zhuǎn)染FreeStyle?293-F細(xì)胞。所有制劑中的內(nèi)毒素含量都低于檢測限，如通過顯色 整阿米己狀細(xì)胞溶解產(chǎn)物測定化imulus Ameboc}fte Lysate AssayKLonza,目錄號50-647U)所評估。
[0054] 細(xì)胞系
[005 引 使化4、化41\胎4-11111?、]\0^7、]\0^7-11〔020、]\?：巧-1111巧郵16816-111〔020細(xì)胞在補(bǔ)充有 10%FCS的DMEM中生長。FreeStyle?293-F細(xì)胞系從Invitrogen,Life Technologies(目錄 號R790-07)獲得，并且維持在來自Gibco，Life I'echnologies的FreeStyle?293表達(dá)培養(yǎng)基 (目錄號12338)中。人乳腺癌SK-BR-3(ATCC:HTB-30)細(xì)胞系從ATCC獲得，并且維持在補(bǔ)充有 10%FCS的麥考伊氏5A培養(yǎng)基(McCoy'S 5A medium)中。
[0056] 如下產(chǎn)生化k-mLR細(xì)胞系：用含有用于獲得mEcoR和新霉素抗性的表達(dá)盒的質(zhì)粒W 及用pXP2d2-rPAPl-luci報(bào)告基因構(gòu)建體共同穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Flp-In-293細(xì)胞（Invitrogen) 化yckerman等2001)。在含有G418(400ug/ml)的培養(yǎng)基中分離穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的克隆，并且選擇具 有高LIF(lng/ml)誘導(dǎo)的巧光素酶活性的克隆。使用Flp-In重組酶反應(yīng)（Invitrogen) W及 在潮霉素（lOOμg/ml)上選擇10天之后，將含有mLR的表達(dá)載體PCDNA5/FRT穩(wěn)定整合在運(yùn)個(gè) 細(xì)胞系中。
[0057] 人乳腺癌MCF7 (ATCC: HTB-22)細(xì)胞系從ATCC獲得。如下產(chǎn)生MCF7-hCD20和MCF7-mLR細(xì)胞系：用含有用于獲得hCD20或mLR的表達(dá)盒的質(zhì)粒W及用含有新霉素抗性基因的質(zhì) 粒共同穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞。用含有G418( Img/ml)的培養(yǎng)基選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，隨后對 hCD20或mLR表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行FACS分選。
[0058] 如下產(chǎn)生B16B16-mCD20細(xì)胞系：用含有用于獲得mCD20的表達(dá)盒的質(zhì)粒W及用含 有新霉素抗性基因的質(zhì)粒共同穩(wěn)定轉(zhuǎn)染B16B16細(xì)胞。用含有G418(2mg/ml)的培養(yǎng)基選擇穩(wěn) 定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
[0059] 人乳腺癌SK-BR-3(ATCC:HTB-30)細(xì)胞系從ATCC獲得，并且維持在補(bǔ)充有10%FCS 的麥考伊氏5A培養(yǎng)基中。
[0060] 巧光素酶活性的測量
[0061] 通過定量受控于NF-KB啟動(dòng)子的巧光素酶活性來測量TNF特異性活性。在通過標(biāo)準(zhǔn) 憐酸巧沉淀方法轉(zhuǎn)染NF-KB巧光素酶報(bào)告基因（P化3-(IL6-kB)3-巧光蟲巧光素酶)之后兩 天，用祀向或?qū)φ誗C hTNF刺激細(xì)胞6小時(shí)。制備溶解產(chǎn)物(溶解緩沖液:25mM化is(pH7.8)、 2mM抓TA、2mM二硫蘇糖醇、10%甘油、1 %曲通(Triton)X-IOO)，并且每50iU溶解產(chǎn)物添加 35山巧光素酶底物緩沖液(20ml巨(徑甲基）甲基甘氨酸(Tricine)、1.07mM(MgC03)4Mg(0H) 2 ? 5H20、2.67mM MgS04 ? 7肥0、0.1mM EDTA、33.3mM二硫蘇糖醇、270yM輔酶A、470yM蟲巧光 素、530iiM ATP，最終抑7.8)。在TopCount化學(xué)發(fā)光計(jì)數(shù)器(Packard)中測量光發(fā)射5秒。
[0062] 定量 RT-PCR
[0063] 通過RT-PCR相對于HPRT定量用500ng/ml祀向或?qū)φ誗C hTNF處理6小時(shí)的SK-BR-3 細(xì)胞中的TNF誘導(dǎo)性基因化-6的表達(dá)。用RNeasy柱（Qiagen)純化總RNA，并且等量RNA(0.5y g)用于遵循制造商說明書，使用Primescript RT試劑盒(Takara Bio,Siiga,Japan)進(jìn)行逆 轉(zhuǎn)錄。添加10倍稀釋的cDNA至含有IX SYBR Green I主混合物（04 887 352 OOl ,Roche)和 InM基因特異性引物的RT-QPCR混合物中。在Li曲t切Cler 480實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)熱循環(huán)儀(Roche Applied Science)上一式S份進(jìn)行測定，并且使用A A CT方法分析結(jié)果。使用W下引物：
[006引對MC巧細(xì)胞的毒性分析
[0069] 也通過評估對MCF7細(xì)胞的細(xì)胞毒性來測量TNF特異性活性。將1000個(gè)細(xì)胞涂鋪在 黑色96孔板中，并且24小時(shí)后用不同TNF構(gòu)建體刺激。在48-72小時(shí)之后，根據(jù)制造商指南， 使用CellTiter-Glo發(fā)光細(xì)胞活力測定(Promega目錄號G7570)測定活細(xì)胞的數(shù)目。
[0070] 體內(nèi)毒性分析
[0071] 為體內(nèi)評估hTNF毒性，用500ng rhTNF或SC hTNF-納米抗體融合蛋白與IOmg D-半 乳糖胺組合(于無 LPS PBS中稀釋，W50化1的體積注射)腹膜內(nèi)注射雌性8周齡巧7BL/6J小 鼠（購自化arles River,化ance)。通過測量外周(直腸)體溫來監(jiān)測致病性。n =每種融合蛋 白 2-4。
[0072] 為評估體內(nèi)mTNF毒性，用10、35、100或20化g SC mTNF-納米抗體融合蛋白（注射體 積20化1，于無 LPS PBS中稀釋)靜脈內(nèi)注射小鼠。通過測量外周(直腸)體溫來監(jiān)測致病性。n =每種融合蛋白每種劑量2，例外之處是20化g(n = 1)。
[007引體內(nèi)抗腫瘤研究
[0074] 將8周齡的雌性巧7BL/6J小鼠剌毛，并且用6X105個(gè)B16B16-mCD20腫瘤細(xì)胞在背 部皮下接種(第0天）。當(dāng)最大垂直直徑的乘積是約50mm2時(shí)（在第10天)開始處理。通過在病 變旁邊注射(在腫瘤部位附近但在腫瘤結(jié)節(jié)外部皮下注射)來連續(xù)8天(第10-17天，W灰色 棒條指示在圖16A中）施用PBS或35yg納米抗體-SC mTNF融合蛋白。用測徑規(guī)每日測量腫瘤， 并且示出為平均值±SEM。通過每日測量體重和體溫來監(jiān)測致病性。n =每種治療5。
[007引實(shí)施例1: SC hTNF-納米抗體融合蛋白
[0076]圖1顯示在SC hTNF的N末端或C末端具有納米抗體的SC hTNF-納米抗體融合蛋白 的圖示。
[0077] 實(shí)施例2:對mLR表達(dá)Hek細(xì)胞的祀向TNF活性
[007引測試化kT細(xì)胞中W及表達(dá)鼠類瘦素受體的化k細(xì)胞化ek-mLR)中在TNF刺激后對 NF-KB巧光素酶報(bào)告基因活性的誘導(dǎo)。如圖2A中所示，WT SC hTNF誘導(dǎo)的NF-KB誘導(dǎo)作用因 Y87Q3 X或I97A3 X突變而分別被完全(>1000倍)或部分(100倍)消除。此外，在不表達(dá)mLR的 化kT細(xì)胞中，所有SC hTNF構(gòu)建體(WT、Y87Q3 X和I97A3 X )都獨(dú)立于與mLR納米抗體的融合 來誘導(dǎo)類似NF-KB活性（圖2A)。相反，偶聯(lián)于mLR納米抗體能夠在與WT SC hTNF類似的程度 上恢復(fù)表達(dá)mLR的化k細(xì)胞中SC hTNF I97A3 X的NF-KB誘導(dǎo)作用（圖2B)。我們估計(jì)表達(dá)mLR 的細(xì)胞比親本化kT細(xì)胞對納米抗體偶聯(lián)的SC hTNF I97A3 X敏感100倍。相反，相較于化kT 細(xì)胞，在化k-mLR細(xì)胞中，S重Y87Q突變不顯示對TNF應(yīng)答性的任何挽救作用（圖2B)。
[0079] 實(shí)施例3:不同突變組合和不同連接子長度的比較
[0080] 為優(yōu)化構(gòu)建體，測試在個(gè)別鏈中具有不同突變的SC hTNF構(gòu)建體W及SC hTNF與祀 向部分之間的不同連接子長度。結(jié)果概述于圖3、4和5中。SC hTNFI97A3X和SC hTNF Y87Q1 X I97A2 X不顯示對不表達(dá)瘦素受體的化k細(xì)胞的活性，但在祀向瘦素受體時(shí)具有明確劑量 依賴性活性。
[0081 ] 實(shí)施例4:對表達(dá)化r2的化k細(xì)胞的祀向TNF活性
[008引我們使用a-Her2納米抗體 1R59B和SC hTNF WT、sc hTNF Y87Q3X 或SC hTNF I97A3 X產(chǎn)生融合蛋白。納米抗體與SC hTNF之間的連接子是6 X GGS或19 XGGS。測試運(yùn)些分 子對過度表達(dá)化r2的SK-BR-3乳腺癌細(xì)胞系的IL-6TNF誘導(dǎo)性基因的誘導(dǎo)作用，如通過定量 RT-PCR相對于HPRT所測定。
[0083] 圖6顯示相較于未處理細(xì)胞和用化r2納米抗體刺激的細(xì)胞中的IL-SmRNA水平，在 SC hTNF處理（500ng/ml)后對化-6mRNA的誘導(dǎo)倍數(shù)。與對NF-KB的轉(zhuǎn)錄活化相對應(yīng)，我們觀 察到Y(jié)87Q3X突變完全阻止TNF誘導(dǎo)的IL-6產(chǎn)生，而SC hTNF I97A3X可仍然誘導(dǎo)IL-6產(chǎn)生， 但程度小于WT SC hTNF。當(dāng)使SC hTNF融合于納米抗體時(shí)，產(chǎn)生較少化-6mRNA。運(yùn)可歸因于 空間位阻，因?yàn)橄噍^于其中存在可能更大可曉性的較長19XGGS連接子，在6XGGS連接子的 情況下的影響更顯著。通過使SC hTNF I97A3X偶聯(lián)于化r2納米抗體，可在與WT SC hTNF通 過相應(yīng)連接子偶聯(lián)于納米抗體類似的程度上恢復(fù)對IL-6的誘導(dǎo)作用。相反，使更重度Y87Q3 Xsc hTNF突變體特異性祀向化r2表達(dá)細(xì)胞不能恢復(fù)SC hTNF的IL-6誘導(dǎo)性質(zhì)。
[0084] 實(shí)施例5:比較hTNF突變體對MC巧細(xì)胞的毒性
[008引由于I97A3X突變SC hTNF具有相對較高殘余活性，所W我們通過將不同個(gè)別S聚 化hTNF突變體的毒性測量為MCF7細(xì)胞中的巧光素酶活性來捜索其它突變。突變體相對于WT 個(gè)別立聚化TNF的活性顯示于圖7中。大多數(shù)突變不顯著影響TN巧舌性(〉1%的WT)，并且由于 它們的可能剩余實(shí)質(zhì)性毒性而可能具有較小前途用于開發(fā)祀向構(gòu)建體。我們更關(guān)注于(幾 乎)完全消除TNF功能的突變。使用無效突變(<0，1 %的WT)會(huì)產(chǎn)生不具有副作用，但具有在 祀向后的再活化較不易于實(shí)現(xiàn)作為可能缺點(diǎn)的祀向構(gòu)建體。具有一定殘余活性(0,02-5% 的WT，特別是的WT)的突變具有更好機(jī)會(huì)被再活化，同時(shí)不具有毒性。選擇6種涵 蓋在0,02與5%的個(gè)別S聚化WT TNF之間的活性范圍的不同突變用于開發(fā)祀向修飾的細(xì)胞 因子:￥879(0,02%)、1975和￥1154(0,2%)、￥87尸(0,5-1%)、￥1156(1-2%)和1974(2-5%)。
[0086] 實(shí)施例6:對表達(dá)mLR的MCF7細(xì)胞的祀向TNF活性
[0087] 評估m(xù)LR NB祀向TNF對MCF7和MCF7-mLR細(xì)胞的毒性。測試不同突變（I97A3X、 I97S3X 和Y115A3X)W 及SC hTNF 與 mLR NB 之間的不同連接子（6XGGS、13XGGS、19X GGS)。如圖8A中所示，毒性因 I97A3X突變而降低20倍，并且因 I97S3X和Y115A3X突變而降 低500倍，運(yùn)類似于我們對于個(gè)別立聚化TNF所觀察到的結(jié)果（圖7)。此外，在不表達(dá)mLR的 MCF7細(xì)胞中，與mLR NB融合不改變WT或突變SC hTNF的活性（圖8A)，而對于MCF7-mLR細(xì)胞， 運(yùn)種融合再活化所有SC hTNF突變體（圖8B)。我們估計(jì)表達(dá)mLR的細(xì)胞比親本MC巧細(xì)胞對NB 偶聯(lián)的I97S3 X和Y115A3 X SC hTNF敏感100倍。然而，運(yùn)些祀向經(jīng)修飾的TNF的活性仍然比 WT SC hTNF小約20倍。相反，對于MCF7-mLR細(xì)胞，I97A3X祀向經(jīng)修飾的TNF被恢復(fù)至WT活性 水平，此對應(yīng)于20倍再活化(圖8B)。
[008引實(shí)施例7:對表達(dá)hCD20的MCF7細(xì)胞的祀向TNF活性
[0089] 為評估其它祀向部分用于達(dá)成經(jīng)修飾的TNF的祀向的作用，我們用hCD20NB替換實(shí) 施例6的構(gòu)建體中的mLR NB,并且測試它們對MCF7細(xì)胞和表達(dá)hCD20的MCF7細(xì)胞(MCF7-hCD20)的毒性。結(jié)果顯示于圖9中。如所預(yù)期，mLR NB和hCD20NB祀向經(jīng)修飾的TNF對親本 MCF7細(xì)胞的行為類似(圖8A和9A)。
[0090] 實(shí)施例8:在不同hCD20NB融合物設(shè)置的情況下對hCD20表達(dá)細(xì)胞的祀向TNF活性。
[0091] 我們試圖通過將NB放置在S