C hTNF之前而非在其之后來改進(jìn)hCD20NB-TNF構(gòu)建體。 我們也測試巧巾顯著性較小的其它突變(Y87F3 X和Yl 15G3 X，圖7)。用運(yùn)些構(gòu)建體進(jìn)行的 MCF7和MCF7-hCD20毒性研究顯示于圖10中。偶聯(lián)于hCD20NB的Sc hTNF與偶聯(lián)于對照 BcIIIONB的相應(yīng)突變體對MCF7細(xì)胞施加相同毒性（圖10A)，并且活性水平類似于我們對于 個別S聚化TNF突變體所觀察到的結(jié)果（圖7)。對于MCF7-hCD20細(xì)胞，突變體的運(yùn)個毒性降 低在hCD20祀向后得W(部分)復(fù)原:相較于相應(yīng)BcIIlO對照NB偶聯(lián)的SC hTNF，hCD20NB偶聯(lián) 的經(jīng)修飾TNF獲得活性增加10倍(Y115G3 X )、15倍(Y87F3 X )、100倍（I97S3 X、Y115A3 X )或 甚至更高(Y87Q3 X )(圖10B)。在運(yùn)個實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)將hCD20NB放置在SC hTNF的簇基末端而非 氨基末端時，再活化較小（圖9B)。
[0092] 實(shí)施例9:不同突變組合的比較
[0093] 盡管存在祀向經(jīng)修飾的TNF相對于非祀向經(jīng)修飾的TNF的差異是至少100倍的事 實(shí)，但一些突變顯示低于WT活性水平的挽救活性(Y87Q3X)，此可能影響它的抗腫瘤作用。 或者，一些突變?nèi)匀痪哂幸欢堄嗷钚?I97S3X和Y115A3X)，此在體內(nèi)使用時可能導(dǎo)致一 定(全身性)毒性。為克服運(yùn)些潛在缺點(diǎn)，我們通過使SC hTNF的個別鏈中的不同殘基突變來 測試其它構(gòu)建體W觀察活性水平是否可因此被進(jìn)一步調(diào)節(jié)。如圖11中所示，在單鏈中組合 不同突變可改變對非祀向細(xì)胞的殘余活性W及在祀向后的再活化水平。
[0094] 實(shí)施例10:祀向個別S聚化TNF相對于單鏈經(jīng)修飾的hTNF的比較。
[0095] 為比較祀向個別S聚化TNF相對于單鏈TNF的效率，使WT或I97A hTNF在C末端與 mLR NB偶聯(lián)成單體。測試它們對MCF7細(xì)胞W及對表達(dá)mLR的MCF7細(xì)胞(MCF7-mLR)的毒性，并 且顯示于圖12中。此外，在個別S聚化形式中，I97A突變對MC巧細(xì)胞具有毒性，但程度小于 WT hTNF(圖8A和圖12A)。此外，當(dāng)在C末端偶聯(lián)于mLR納米抗體時，個別S聚化而非單鏈TNF 對MCF7細(xì)胞的毒性變得較小，并且運(yùn)對于WT和I97A兩者均是運(yùn)樣（圖8A和圖12A)。最可能的 是用個別S聚化TNF-mLR NB構(gòu)建體形成的hTNFS聚體中存在的3個納米抗體在空間上阻礙 hTNF結(jié)合它的受體。然而，運(yùn)種活性降低可通過祀向MCF7-mLR細(xì)胞上的mLR來復(fù)原（圖12B)。 引起關(guān)注的是，運(yùn)提供進(jìn)一步程度的活性調(diào)節(jié)：可組合不同突變W及使用空間位阻來影響 殘余活性和在祀向后的再活化水平。
[0096] 為闡明運(yùn)是否是一種一般性現(xiàn)象，我們使個別S聚化WT和Y115A hTNF在N末端偶 聯(lián)于BcII10或hCD20納米抗體，并且測試它們對MCF7和MCF7-hCD20細(xì)胞的毒性。如圖13A中 所示，運(yùn)種偶聯(lián)不影響個別立聚化WT或Y115A3XhTNF的毒性。此外，在祀向后，個別立聚化 Yl 15A3 X hTNF變得如同非祀向個別S聚化WT hTNF-樣具有活性(圖13B)。
[0097] 實(shí)施例11:評估祀向經(jīng)修飾的hTNF的體內(nèi)毒性
[0098] 為評估hTNF突變體的毒性在臨床前不明顯，因?yàn)門NF在小鼠中顯示顯著物種特異 性。不同于mTNF，hTNF僅在極高劑量下誘導(dǎo)致死性(Brouckaert等1992)。盡管運(yùn)個物種特異 性的原因長久被認(rèn)為由hTNF不與鼠類TNF-R2相互作用引起，但藥物代謝動力學(xué)研究已顯示 在小鼠中hTNF比mTNF被快得多地清除，并且隨之發(fā)生的有限hTNF暴露導(dǎo)致它缺乏致病性 (Ameloot等2002)。
[0099] 然而，當(dāng)用如D-半乳糖胺的致敏劑處理時，物種特異性被消除，并且極低劑量（< 500ng)的hTNF與mTNF具有同等致死性(Broeckaert等，1992)。為評估各種祀向經(jīng)修飾的 hTNF的體內(nèi)毒性，我們因此用500ng的重組(r化TNF、sc hTNF WT或SC突變hTNF(Y87Q3X或 Y115A3X)腹膜內(nèi)注射小鼠。使SC WT和經(jīng)修飾的hTNF在N末端偶聯(lián)于BcIIlO或hCD20NB。如 圖14中所示，SC WT hTNF至少如同riiTNF-樣具有毒性，從而在注射之后10小時內(nèi)導(dǎo)致重度 低體溫癥和致命性。祀向經(jīng)修飾的hTNF Y87Q3X和Y115A3X不導(dǎo)致任何致病性征象(豎毛、 震顫、嗜睡、理毛行為喪失或體溫下降;對于后者，參見圖14A)。
[0100] 實(shí)施例12:評估祀向經(jīng)修飾的mTNF的體內(nèi)毒性和抗腫瘤作用。
[0101] 如已提及，不能容易地在小鼠中研究hTNF的體內(nèi)毒性。因此W及由于預(yù)期在免疫 活性同基因小鼠中進(jìn)行抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，所W我們決定使mTNF的與我們對于hTNF選擇的殘基同 源的殘基突變（參見實(shí)施例5)。如圖15中所說明，當(dāng)W低至IOiig的劑量靜脈內(nèi)注射時， BcIIlONB-sc mTNF WT導(dǎo)致重度致病性（圖15A)和100%致命性（圖15B)。相反，BcIIlONB-sc mTNFY86F3X不誘導(dǎo)致命性（圖15B)，也不導(dǎo)致任何毒性征象(豎毛、震顫、嗜睡、理毛行為喪 失或體溫下降；對于后者，參見圖15A)，甚至當(dāng)W200tig的靜脈內(nèi)團(tuán)注形式注射時也不。然 而，當(dāng)^35]ig的劑量每日在病變旁邊注射于攜帶B16B16-mCD20腫瘤的小贏中時，納米抗體 偶聯(lián)的SC mTNFY86F3X可仍然降化/阻止腫瘤生長，尤其當(dāng)靴向mCD20時（圖16A)。非靴向突 變TNF對腫瘤生長的作用（圖16A)歸因于所用高劑量(35tig)，因?yàn)檩^化劑量更接近類似于 PBS處理的動物(數(shù)據(jù)未顯示）。每日用NB-SC mTNF Y86F3X處理未導(dǎo)致任何致病性或致命 性征象，而用NB-SC mTNF WT處理的攜帶腫瘤的小贏在1或2次注射之后死亡（圖16B)。
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