，5%0) 2條件下）中培養(yǎng)48±4小時。
[0118] [作業(yè)第三天] 去除在25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的A549細(xì)胞的培養(yǎng)基，更換為5mL無血清培養(yǎng)基。之后， 將25cm2培養(yǎng)瓶在二氧化碳培養(yǎng)器（37°C，5% CO2條件下）中培養(yǎng)24±4小時。
[0119] [作業(yè)第四天] 使鈣黃綠素 AM(50yg/小瓶：BD Biosciences)的小瓶恢復(fù)至室溫，添加30yL DMSO并 混合，配制出鈣黃綠素 AM溶液。在15mL管內(nèi)分注5mIXDS，對此添加6 μ L鈣黃綠素 AM溶 液并混合，配制出I X鈣黃綠素 AM溶液（被試插入皿用鈣黃綠素 AM溶液）。另一方面，在 15mL管內(nèi)分注I. 5mL⑶S，添加3. 6 μ L鈣黃綠素 AM溶液并混合，配制出2 X鈣黃綠素 AM 溶液（標(biāo)準(zhǔn)曲線用鈣黃綠素 AM溶液）。
[0120] D2)標(biāo)準(zhǔn)曲線用細(xì)胞的準(zhǔn)備 去除前一天更換培養(yǎng)基的25cm2培養(yǎng)瓶的細(xì)胞的培養(yǎng)上清，使用5mL D-PBS(-)進(jìn)行上 述洗滌操作。此外，使用3mL CDS進(jìn)行上述的細(xì)胞剝離。之后，進(jìn)行上述細(xì)胞數(shù)計數(shù)，使用 ⑶S配制出5X 105cells/mL的細(xì)胞懸浮液。然后，如表4所示，使用⑶S稀釋細(xì)胞懸浮液。 在96孔黑色板（康寧公司）的各孔內(nèi)分別注入50yL的小瓶A~H內(nèi)的細(xì)胞懸浮液。試 驗重復(fù)進(jìn)行三次。
[0122] D3)鈣黃綠素 AM染色 在新的24孔板的各孔內(nèi)分別注入0. 75mL D-PBS (-)。將各插入皿通過鑷子提起的同時 通過移液管去除插入皿內(nèi)的培養(yǎng)基，并且插入至分注了 〇.75mL D-PBS(-)的孔內(nèi)。在各插 入皿內(nèi)分注〇. 5mL D-PBS(-)，將插入皿用D-PBS(-)洗滌。
[0123] 準(zhǔn)備新的24孔板，在其各孔內(nèi)分別注入0.35mL IX鈣黃綠素 AM溶液。將用 D-PBS (-)洗凈的插入皿用鑷子提起的同時使用移液管去除插入皿內(nèi)的D-PBS (-)，并且轉(zhuǎn) 移至分注了 IX鈣黃綠素 AM溶液的孔內(nèi)（被試插入皿的細(xì)胞的熒光染色）。將轉(zhuǎn)移有插入 皿的24孔板在二氧化碳培養(yǎng)器（37°C，5% CO2條件下）中培養(yǎng)1小時。每隔30分鐘輕輕 地敲打板的側(cè)面。
[0124] 在培養(yǎng)期間，在分注了細(xì)胞懸浮液的96孔黑色板的各孔內(nèi)分別注入50yL 2X鈣 黃綠素 AM溶液，并且用鋁箱包住后在室溫靜置（標(biāo)準(zhǔn)曲線用的細(xì)胞的染色）。
[0125] D4)熒光測定 在1小時的培養(yǎng)結(jié)束后，將放入插入皿的24孔板在注意防止內(nèi)部的液體溢流的同時搖 動，而混合液體。之后，從24孔板的各孔中使用鑷子去除各插入皿。將去除了插入皿的各 孔的液體向新的96孔黑色板的各孔內(nèi)以分別為100 μ L的量轉(zhuǎn)移至三個孔（被試插入皿的 細(xì)胞用板）。
[0126] 使用酶標(biāo)儀（Molecular Device ;SpectraMax M5 或 Thermo Scientific ; Varioskan Flash)測定標(biāo)準(zhǔn)曲線用細(xì)胞以及被試插入皿的細(xì)胞用的各自的96孔黑色板的 各孔的熒光（激發(fā)光：485nm，發(fā)射光：520nm)。
[0127] D5)總侵襲細(xì)胞數(shù)的計算 將標(biāo)準(zhǔn)曲線用細(xì)胞的熒光強(qiáng)度（RLU)輸入至Excel中，根據(jù)最小二乘法求出近似曲線 (標(biāo)準(zhǔn)曲線）的數(shù)學(xué)式。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)學(xué)式，根據(jù)96孔板的每個孔的熒光強(qiáng)度算出侵 襲細(xì)胞數(shù)。將該侵襲細(xì)胞數(shù)乘以3. 5,算出24孔板的每個孔的總侵襲細(xì)胞數(shù)，此外，由于重 復(fù)進(jìn)行三次，因此算出3個孔的總侵襲細(xì)胞數(shù)的平均值。
[0128] D6)統(tǒng)計處理 對于統(tǒng)計處理，使用Excel統(tǒng)計Statcel 3在Excel文件上通過陽性對照以及化合物 3處理組的總侵襲細(xì)胞數(shù)與陰性對照（control)值的比較進(jìn)行Dunnett檢驗，以此實施。
[0129] 圖4示出表示因添加化合物3而獲得的A549細(xì)胞的基質(zhì)侵襲抑制效果的圖表。陽 性對照組（多西環(huán)素給藥組）的總侵襲細(xì)胞數(shù)為對照組的1/3以下。另一方面，化合物3在 濃度為25 ymol/L時與對照組相比總侵襲細(xì)胞數(shù)減少，但是未確認(rèn)具有顯著差異。然而，化 合物3在濃度為50 μ mol/L時，總侵襲細(xì)胞數(shù)為對照組的約一半，并且在小于1 %的危險比 下，確認(rèn)與對照組之間總侵襲細(xì)胞數(shù)有顯著差異。即，化合物3被證實在濃度為50 μ mol/L 時，顯著抑制A549細(xì)胞的基質(zhì)侵襲。
[0130] < E.甲羥戊酸對于OPN產(chǎn)生抑制作用的影響> 他汀類高膽固醇血癥治療藥（具體是瑞舒伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟 伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、匹伐他汀以及美伐他?。┦荋MG-CoA抑制劑，并且被認(rèn)為 通過該酶的抑制導(dǎo)致甲羥戊酸的降低，因伴隨于此的源自甲羥戊酸的異戊二烯量的降低導(dǎo) 致對Ras那樣的G蛋白產(chǎn)生影響，從而顯示出OPN產(chǎn)生抑制效果（非專利文獻(xiàn)8)。
[0131] 為了確認(rèn)本發(fā)明的OPN產(chǎn)生抑制劑的有效成分的盤基網(wǎng)柄菌吡喃酮衍生物或二 氫盤基網(wǎng)柄菌吡喃酮衍生物所示出的OPN產(chǎn)生抑制效果是否具有與公知的他汀類高膽固 醇血癥治療藥相同的作用機(jī)制，而將辛伐他汀或化合物3添加至A549/0PNluc細(xì)胞的培養(yǎng) 液中，研究對于OPN啟動子控制下的基因表達(dá)的效果，并觀察在甲羥戊酸的共存下是否也 能維持該效果。
[0132] El) WST 實驗 使A549/0PNluc細(xì)胞在添加了 10% FCS以及1% P/S的DMEM培養(yǎng)基中懸浮并達(dá)到 3X 104cells/mL。將該懸浮液分別注入100 μ L至96孔板的各孔內(nèi)，并且將96孔板在二氧 化碳培養(yǎng)器（37°C，5% CO2條件下）中培養(yǎng)24±4小時。
[0133] 將在一 80°C下保存的化合物3的50mmol/L DMSO溶液在室溫中靜置并融解 后，使用DMSO進(jìn)行稀釋，配制出5. Ommol/L的溶液。另一方面，使用DMSO配制辛伐他丁 (simvastatin ;SVS :SIGMA)的50mmol/L溶液，并且在一 80°C下保存。將該溶液在使用時室 溫中靜置并融解，使用DMSO進(jìn)一步稀釋，配制lmmol/L的SVS溶液。
[0134] 使用乙醇配制甲輕戊酸（mevalonic acid ;MVA :SIGMA)的0. 5mol/L溶液，在一 80°C下保存。將該溶液在使用時室溫中靜置并融解后，在37°C下靜置30分鐘，之后使用 D-PBS(-)稀釋，配制出20mmol/L以及200mmol/L的溶液。將配制的溶液在二氧化碳培養(yǎng)器 (37°C，5% CO2條件下）內(nèi)靜置20分鐘（在此期間不時地混合）。
[0135] 在分注了細(xì)胞懸浮液的孔內(nèi)分別添加兩種濃度（20mmol/L以及200mmol/L)的MVA 溶液各〇. 5yL(MVA 100ymol/L:4孔，MVA lmmol/L:4孔）。在使用渦旋混合器混合后，將 96孔板在二氧化碳培養(yǎng)器（37°C，5% CO2條件下）中培養(yǎng)4小時。
[0136] 在預(yù)先添加了 MVA以使其達(dá)到100μ mol/L或lmmol/L的四個孔內(nèi)分別添加 0. 5 μ L化合物3的5. Ommo 1/L溶液。同樣如此，在未添加 MVA的兩個孔內(nèi)也分別添加0. 5 μ L 化合物3的5. Ommol/L溶液。此外，在添加了 MVA以使其達(dá)到100 ymol/L或lmmol/L的四 個孔內(nèi)分別添加〇. 5 μ L lmmol/L的SVS溶液。同樣如此，在未添加 MVA的兩個孔內(nèi)分別添 加0. 5 μ L lmmol/L的SVS溶液。在作為對照藥物的MVA、化合物3以及SVS均未被添加的 兩個孔內(nèi)分別添加〇.5yL DMSO(對照）。表5示出各試驗組中的添加藥物以及添加量。
[0138] 在通過渦旋混合器混合后，將96孔板在二氧化碳培養(yǎng)器（37°C，5% CO2條件下） 中培養(yǎng)48±4小時。之后，在各孔內(nèi)分別添加 IOyL Premix WST-lReagent(TAKARABIO)。 在使用渦旋混合器混合后，在37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)，使用酶標(biāo)儀（Bio-Rad benchmark 或Thermo Scientific ;Varioskan Flash)測定30分鐘、90分鐘以及120分鐘后的吸光值 (450nm)〇
[0139] 將吸光值輸入至Excel文件中，將各試驗組的全部的樣品的吸光值除以對照的 吸光值的平均值，求出各個吸光值相對于對照吸光值的比值（與對照的比值（ratio to control))； 各樣品的吸光值+對照的吸光值=與對照的比值。
[0140] E2)熒光素酶實驗 去除WST實驗結(jié)束的各孔的上清，在各個孔內(nèi)分別注入100 μ L D-PBS(-)。將熒 光素酶實驗系統(tǒng)（luciferase assay systems) (Promega)中含有的焚光素酶實驗底物 (luciferase assay substrate ;LAS)用焚光素酶實驗緩沖液（Luciferase Assay Buffer ; LAB)溶解，配制出熒光素酶試劑。此外，將5 X CCLR用水稀釋5倍，配制出I X CCLR。
[0141] 完全去除各孔的D-PBS(-)，并且分別注入50yL 1XCCLR。之后，將96孔板在 室溫中靜置30分鐘。將靜置后的各孔內(nèi)的IXCCLR作為測定用試樣。在化學(xué)發(fā)光測定 用管內(nèi)分別注入熒光素酶試劑100 μ L，在該管內(nèi)添加20 μ L測定用試樣并進(jìn)行混合，使用 GloMax20/20Luminometer(Promega)測定了化學(xué)發(fā)光（相對發(fā)光強(qiáng)度：RLU)。
[0142] 將對照的RLU以及各測定用試樣的RLU分別輸入至Excel文件中。將各組的RLU 除以WST實驗中求出的與對照的比值，從而修正因添加化合物3或SVS而受到影響的細(xì)胞 增殖速度的差值所產(chǎn)生的RLU的差值。
[0143] 圖5示出表示相對于由SVS所產(chǎn)生的熒光素酶活性抑制效果的、通過添加 MVA而 產(chǎn)生的恢復(fù)效果的圖表。通過添加 SVS，被控制OPN啟動子的A549細(xì)胞的熒光素酶活性降 低。然而，如下結(jié)果得到證實：通過以100 ymol/L或lmmol/L的濃度添加 MVA，以此SVS的 熒光素酶活性抑制效果消失，A549細(xì)胞的熒光素酶活性恢復(fù)至與對照組相同的程度。
[0144] 圖6示出表示相對于由化合物3所產(chǎn)生的熒光素酶活性抑制效果的、通過添加 MVA 而產(chǎn)生的影響的圖表。通過添加化合物3而產(chǎn)生的熒光素酶活性抑制并未因 MVA添加而恢 復(fù)。
[0145] 圖5以及圖6示出SVS的熒光素酶活性抑制與化合物3的熒光素酶活性抑制在作 用機(jī)制上不同。
[0146] 工業(yè)應(yīng)用性： 本發(fā)明的以盤基網(wǎng)柄菌吡喃酮衍生物以及二氫盤基網(wǎng)柄菌吡喃酮衍生物為有效成分 的OPN產(chǎn)生抑制劑有望能夠預(yù)防如癌轉(zhuǎn)移那樣的因 OPN產(chǎn)生亢進(jìn)而引起的疾病。本發(fā)明的 以盤基網(wǎng)柄菌吡喃酮衍生物以及二氫盤基網(wǎng)柄菌吡喃酮衍生物為有效成分的OPN產(chǎn)生抑 制劑作為具有不同于以往的OPN產(chǎn)生抑制劑的作用機(jī)理的OPN產(chǎn)生抑制劑在醫(yī)藥品、生物 化學(xué)或生物技術(shù)領(lǐng)域有用。
【主權(quán)項】
1. 一種W盤基網(wǎng)柄菌化喃酬衍生物或二氨盤基網(wǎng)柄菌化喃酬衍生物為有效成分的骨 橋蛋白產(chǎn)生抑制劑。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨橋蛋白產(chǎn)生抑制劑，其特征在于， 所述盤基網(wǎng)柄菌化喃酬衍生物為化學(xué)式1或化學(xué)式2表示的化合物： [化學(xué)式1]々 [化學(xué)式2]3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的骨橋蛋白產(chǎn)生抑制劑，其特征在于， 所述二氨盤基網(wǎng)柄菌化喃酬衍生物為化學(xué)式3或化學(xué)式4表示的化合物： [化學(xué)式3][化學(xué)式4]
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供能夠預(yù)防因骨橋蛋白產(chǎn)生亢進(jìn)而引起的疾病的骨橋蛋白產(chǎn)生抑制劑。本發(fā)明的骨橋蛋白產(chǎn)生抑制劑以盤基網(wǎng)柄菌吡喃酮衍生物或二氫盤基網(wǎng)柄菌吡喃酮衍生物為有效成分。盤基網(wǎng)柄菌吡喃酮衍生物優(yōu)選的是由化學(xué)式1或化學(xué)式2表示的化合物，二氫盤基網(wǎng)柄菌吡喃酮衍生物優(yōu)選的是化學(xué)式3或化學(xué)式4表示的化合物。
【IPC分類】A61K31/366, A61P43/00, A61P35/04, A61K31/4412
【公開號】CN105209038
【申請?zhí)枴緾N201380069437
【發(fā)明人】菊地晴久, 大島吉輝, 服部俊夫, 久保原禪, 山田修, 周張菁, 松下芳久, 喜田進(jìn)也
【申請人】國立大學(xué)法人東北大學(xué), 國立大學(xué)法人群馬大學(xué), 扶桑藥品工業(yè)株式會社
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2013年11月26日
【公告號】CA2896446A1, CA2896446C, EP2965758A1, EP2965758A4, US20150366851, WO2014136161A1