l]-isoindole_l, 3-dione)溶解于6mL的甲醇中，并且添加水合肼1038mg，加熱回 流6小時?；謴偷绞覝睾?，在反應液中添加 IM氫氧化鈉水溶液30mL，用30mL的乙酸乙酯 萃取3次。將萃取的乙酸乙酯層全部合在一起，用60mL的水以及60mL的飽和食鹽水分別 洗滌后，使用無水硫酸鈉進行干燥，將減壓蒸餾溶劑。將該殘渣溶解于6mL的甲苯中，并且 添加 564mg 的 2, 2_ 二甲基 _5_ 辛醜基 _1，3_ 二惡燒 _4, 6_ 二酬（2, 2-dimethyl_5-〇ctano yl-1, 3-dioxane-4, 6-dione)，加熱回流15小時?；謴椭潦覝睾?，將反應液進行減壓蒸餾。 將殘渣進行硅膠柱層析，由被己烷-乙酸乙酯（2:1)洗脫的組分得到51mg的（S)-N-[l-甲 基-2-(2-甲基-1，3-二惡烷-2-基）乙基]-3-氧代癸酰胺（(3)4-[1116也71-2-(2116七 hyl-1, 3-dioxan-2-yl)ethyl]-3-〇xodecanamide)〇
[0057] 將47mg的⑶-N-[I-甲基-2-(2-甲基-1，3-二惡烷-2-基）乙基]-3-氧代癸 酰胺溶解于80 %醋酸水溶液3mL中，在室溫下攪拌7小時。將反應液減壓蒸餾，將殘渣進行 硅膠柱層析，由被己烷-乙酸乙酯（2:1)洗脫的組分得到38mg的（S)-N-(l-甲基-3-氧代 丁基）-3-氧代癸酰胺（（S) -N- (l-methyl-3-oxobutyl) -3-〇xodecanamide)。
[0058] 將23mg的（S) -N- (1-甲基-3-氧代丁基）-3-氧代癸酰胺溶解于2mL的N，N-二 甲基甲酰胺中，添加3mg的氫化鈉（60%，分散在礦物油中），在室溫攪拌10小時。將反應 液注入至IOmL的0. 5M鹽酸中，使用IOmL的乙酸乙酯萃取3次。將萃取的乙酸乙酯層全部 合在一起，用20mL的水以及20mL的飽和食鹽水分別洗滌后，使用無水硫酸鈉進行干燥，減 壓蒸餾溶劑。將殘渣進行硅膠柱層析，由被己烷-乙酸乙酯（2:1)洗脫的組分得到9mg的 (S) _5, 6_ 二氛 _4, 6_ 二甲基 _3_ 辛醜基-IH- P比啶 _2_ 酬（（S) _5, 6-dihydr〇-4, 6-dimethy l-3-〇ctanoyl-lH-pyridin-2-〇ne)(化學式 11 表示的化合物）。
[0059] 將產物通過基于EMS (電子轟擊質譜）法的質量分析以 及NMR進行解析。E頂S以及NMR的結果如下。1H-NmrgoomHzJDCI 3) d 5. 52 (1H, br. s), 3. 65-3. 78 (1H, m), 2. 72 (2H, t, J = 7. 6Hz), 2. 31 (1H, dd, J = 17. 2, 5. 6Hz), 2. 23 (1H, dd, J = 17. 2, 7. 2Hz), I. 92 (3H, s), I. 60 (2H, quint, J = 7. 6Hz), I. 23-1. 35 (8H, m), I. 24 (3H, d, J = 6. 8Hz), 0. 87 (3H, t, J = 7. 0Hz) ；EIMS m/z (rel. int) 251 [M]+ (33), 236 (57), 180 (100), 167 (69), 152 (76), 109 (23)。
[0060] [化合物14所示的化合物的制造方法] 將按照非專利文獻7的記載合成的IOmg的3-十二?；?5, 6-二氫-4, 6, 6-三甲 基-2H-吡喃 _2_ 酮（3-dodecanoyl_5, 6-dihydr〇-4, 6, 6_trimethyl-2H-pyran-2-〇ne)溶 解于ImL的乙酸乙酯中，添加 Img的20 %氫氧化鈀-碳，在氫氣氣氛下，在室溫中攪拌20 小時。過濾反應液而去除鈀碳，將其濾液進行減壓蒸餾。將殘渣進行硅膠柱層析，由被己 烷-乙酸乙酯（19:1)洗脫的組分得到9mg的化學式14所示的化合物。
[0061] 將產物通過基于E頂S (電子轟擊質譜）法的質量分析以及NMR進行解析。EMS 以及 NMR 的結果如下。1H-NmrGOOMHz, CDCl3) d 3. 13 (1H, d, J = 10. 8Hz)，2. 87 (1H, dt，J =14. 8, 7. 2Hz), 2. 59-2. 67(1H, m), 2. 55(1H, dt, J = 14. 8, 6. 8Hz), I. 84 (1H, dd, J = 13. 4, 4. 0Hz), I. 57-1. 66 (2H, m), L 51 (1H, t, J = 13. 4Hz), I. 43 (3H, s), L 42 (3H, s), I. 25 -1.31(16H,m),0. 95(3H, d, J = 6. 4Hz), 0. 88 (3H, t, J = 6. 6Hz) ；EIMS m/z (rel. int) 324 [M] +(3), 309(6), 84(100) 〇
[0062] [表 1]
[0063] 關于化學式1、化學式2以及化學式8所示的盤基網柄菌吡喃酮衍生物、和化學 式3、化學式4、化學式15以及化學式16所示的二氫盤基網柄菌吡喃酮衍生物，EC50濃度 為IC50濃度的1/2以下。尤其是，對于化學式1~4所示的化合物（化合物1~化合物 4)，EC50濃度小于30 μ M，在低濃度下將OPN啟動子控制下的熒光素酶（OPN Luc)表達抑制 50%〇
[0064] < B :化合物3對于人非小細胞肺癌細胞株Α549以及人肝癌細胞株!fepG2的OPN 產生的抑制效果> 如上所述證實了在盤基網柄菌吡喃酮衍生物以及二氫盤基網柄菌吡喃酮衍生物中，存 在以抑制50%細胞增殖的濃度（IC50)的1/2以下的濃度將OPN啟動子控制下的熒光素酶 表達抑制50%的化合物。因此，對于EC50濃度最低且IC50濃度示出EC50濃度的兩倍以上 的化學式3所示的化合物（化合物3)進行了是否能夠實際抑制由癌細胞株產生的OPN量 的確認試驗。
[0065] 將化合物3加入至人非小細胞肺癌細胞株A549以及人肝癌細胞株H印G2的培 養(yǎng)液中，將培養(yǎng)兩天后的培養(yǎng)上清中的OPN量使用人骨橋蛋白免疫檢測試劑盒（Human Osteopontin Immunoassay Kit) (R&D systems)進行測定，通過與化合物3無添加組（對照 組）的OPN量進行比較，以此進行確認試驗。
[0066] 化合物3還具有細胞增殖抑制效果，因此為了正確評價OPN產生量抑制效果，而 在去除培養(yǎng)上清后孔內剩余的細胞中添加在熒光素酶實驗中使用的IXCCLR液而配制出 細胞裂解液，并且將其蛋白量使用BCA蛋白定量試劑盒（BCA protein assay kit) (Thermo Scientific)進行測定。對于化合物3的添加對OPN產生量的影響，通過每Img蛋白量的 OPN量進行比較。
[0067] BI)試樣配制方法 首先，使A549細胞或H印G2細胞在分別添加了 10% FCSU % P/S的DMEM培養(yǎng)基中懸 浮并達到4X 104cellS/mL，并且向24孔板的各孔內分別注入500 μ L。由于將試驗重復實 施三次，因此將對照以及各濃度的被試化合物添加組分別準備三孔。將24孔板在二氧化碳 培養(yǎng)器（37°C，5% CO2條件下）內培養(yǎng)24±4小時。
[0068] 將作為被試化合物的化合物3使用DMSO制成50mmol/L溶液，并且保存在一 80°C。 將該化合物3溶液使用DMSO進行稀釋，分別配制成3. 75mmol/L、7. 5mmol/L以及15mmol/L 的濃度。在培養(yǎng)A549細胞的各孔內，將化合物3的7. 5mmol/L溶液或15mmol/L溶液分別 添加2 μ L。在對照孔內僅分別添加2 μ LDMS0。
[0069] 在培養(yǎng)!fepG2細胞的各孔內分別添加化合物3的3. 75mmol/L溶液或7. 5mmol/L 溶液2 μ L。在對照孔內僅分別添加2 μ LDMS0。
[0070] 將24孔板前后左右搖動，將孔內的溶液混合后，在二氧化碳培養(yǎng)器（37°C，5% CO2 條件下）中培養(yǎng)48±4小時。之后，將培養(yǎng)上清全部轉移至1.5mL管內，在留下細胞的孔內 添加 500 μ L D-PBS (-)。
[0071 ] 將24孔板輕輕地搖動后，去除D-PBS (_)，并且向各孔內分別注入200 μ L的將在熒 光素酶實驗中使用的5 X CCLR用水稀釋5倍而配制出的I X CCLR。之后，將24孔板放置于 搖擺式振蕩器（rocking shaker)中搖擺15分鐘。
[0072] 從搖擺15分鐘后的24孔板的各孔中將細胞裂解液轉移至I. 5mL管內，并且為了 去除細胞碎片等的夾雜物而通過微量高速冷卻離心機在4°C、15000rpm下離心1分鐘。將 得到的上清作為蛋白量測定用試樣。
[0073] 另一方面，為了去除如細胞碎片等的夾雜物而將轉移至I. 5mL管內的培養(yǎng)上清通 過微量高速冷卻離心機在4°C、15000rpm下離心1分鐘。將得到的上清作為ELISA用試樣。
[0074] B2) OPN蛋白量的測定： 將ELISA用試樣如下進行稀釋； A549細胞（稀釋20倍）：試樣5 μ L+培養(yǎng)基95 μ L !fepG2細胞（稀釋80倍）：試樣2 μ L+培養(yǎng)基158 μ L。
[0075] 在包含于ELISA試劑盒中的OPN標準品的小瓶（vial)中加入lmL7K，平穩(wěn)地混合， 在室溫中靜置15分鐘而配制出200ng/mL的OPN標準品。然后，如表2所示，將OPN標準品 用包含于試劑盒中的稀釋液RD5-24進行依序稀釋。
[0076] [表 2]
[0077] 準備包含于試劑盒中的所需數量的OPN微孔板（microplate)和RD1-6,向孔中分 別注入100 μ LRD1-6。將稀釋的OPN標準品（小瓶A~H)以及試樣50 μ L分別進一步添加 于已添加 RD1-6的孔內。之后，將孔上部用密封件覆蓋，在室溫下靜置2小時。在這期間， 用水稀釋包含于試劑盒中的濃縮洗滌緩沖液（wash buffer concentrate)，配制出洗滌緩 沖液（wash buffer)。
[0078] 在靜置2小時后，去除各孔內的液體。向各孔內分別注入250 μ L洗滌緩沖液后， 去除洗滌緩沖液，將孔進行洗滌。將該洗滌操作進行四次。
[0079] 在各孔中分別注入200 μ L OPN結合物（conjugate)。然后，將孔上部用密封件覆 蓋，在室溫下靜止兩個小時。在這期間，將包含于試劑盒中的顯色劑A(Color Reagent A)和 顯色劑B (Color Reagent B)進行等量混合，從而配制出底物溶液（Substrate Solution)。
[0080] 在靜置兩個小時后，去除各孔內的液體。向各孔中分別注入250 μ L洗滌緩沖液 后，去除洗滌緩沖液，將孔進行洗滌。將該洗滌操作進行了四次。
[0081] 向各孔內分別注入200 μ L底物溶液，并且在遮光下室溫中靜置30分鐘。之后， 在各孔內分別添加50yL的包含于試劑盒中的終止液（stop solution)，并且通過渦旋混 合器平穩(wěn)地混合至孔的全部液體從藍色變成黃色。在混合后，使用酶標儀（microplate Reader)(Bio-Rad !Benchmark 或 Thermo Scientific ；Varioskan Flash)測定吸光值 (450nm以及570nm)。進行從所有的測定數據的OD 450nm減去OD 570nm的值的運算，以后 的計算使用這一值。
[0082] 根據標準曲線樣品的吸光值制作標準曲線。使用標準曲線的數學式根據各樣品的 吸光值算出OPN蛋白量。
[0083] B3)細胞中的總蛋白量測定： 將蛋白量測定用試樣10 μ L和水90 μ L進行混合，稀釋10倍。如表3所示用水稀釋 BSA溶液而配制出標準曲線樣品。
[0084] [表 3]
[0085] 將包含于蛋白測定用試劑盒中的BCA試劑A和BCA試劑B(50:1)進行混合，配制 出工作試劑（Working Reagent)。向96孔板中分別注入標準曲線樣品（小瓶A~F)以及 稀釋10倍的蛋白測定用試樣各25 μ L。由于試驗重復實施兩次，因此將對照組以及各濃度 的被試化合物添加組分別準備兩個孔。
[0086] 向各孔內分別添加200 μ L工作試劑，并且通過渦旋混合器混合30秒鐘。以60°C 加熱30分鐘后，在室溫下靜置15分鐘。