反應器都可采用。生物反應器可以由玻璃、塑料或不銹鋼制成。當使用玻 璃或塑料時，生物反應器可以是不透明的以防止眼蟲的光養(yǎng)生長且保持異養(yǎng)生長條件。在 批次之間可使用蒸汽、乙醇、壓力、UV、消毒劑或它們的組合滅菌各種生物反應器。當使用高 壓蒸汽滅菌時，生物反應器可以設計成能承受至少15PSI的內部壓力。也可以使用濃縮的 乙醇溶液消毒生物反應器罐。在某些方面，至少一部分的乙醇溶液可以留在生物反應器中 以作為碳源被眼蟲利用。
[0076] 在本文所描述的方法和系統(tǒng)中使用的至少一個生物反應器可以與含有如所描述 的生長培養(yǎng)基或生長培養(yǎng)基組分的一個或多個罐流體連通?？梢杂梢粋€或多個無菌過濾器 (例如，孔徑小于約〇. 2微米）分開各種生物反應器和生長培養(yǎng)基之間的流體連通以防止不 期望的微生物進入生物反應器罐中。生物反應器可以包括機械攪拌機構，或生物反應器可 包括用于在生物反應器內混合眼蟲和生長培養(yǎng)基的氣提式裝置?？梢耘渲脵C械攪拌機構以 提供剪切應力，其小于裂解眼蟲細胞所需的剪切力。
[0077] 在放大眼蟲培養(yǎng)物和/或保持眼蟲培養(yǎng)物中，可以使用以下方面。在立即接種后 的生物反應器中的眼蟲濃度可以小于10克每升。眼蟲的收獲濃度可以大于20-60克每升， 并且在某些情況下可以大于80-120克每升。連續(xù)生物反應器階段的體積可以在大于前面 生物反應器階段的約5倍至約200倍之間。生物反應器階段中的一個可以體積在10升和 250升之間，并且可以采用反應器，如New Brunswick BioFlo 3000或4500生物反應器。
[0078] 在某一方面，新鮮的生長培養(yǎng)基可以連續(xù)地添加到眼蟲培養(yǎng)物中，而同時連續(xù)收 獲一部分眼蟲培養(yǎng)物。新鮮的生長培養(yǎng)基可以以是完全培養(yǎng)基，或可以包含單獨的組分、組 分的混合物、組分的貯存濃縮溶液，固體的、粒狀的或粉末狀的組分，水等。一些方法和系統(tǒng) 可以僅使用一個反應器，其中按連續(xù)基礎添加新鮮的生長培養(yǎng)基。例如，眼蟲可以以批次方 式生長在第一階段生物反應器和/或第二階段生物反應器中以接種后一階段生物反應器， 其中后一階段生物反應器包括較大的培養(yǎng)物體積，其連續(xù)地補充新鮮的生長培養(yǎng)基同時連 續(xù)收獲眼蟲培養(yǎng)物。實例包括其中當連續(xù)收獲階段開始時在生物反應器中眼蟲的濃度大于 20克每升，并且其中在連續(xù)收獲階段期間眼蟲的濃度保持在大于20克每升。
[0079] 其他方面包括其中以分批模式操作至少一個生物反應器階段；即，其中從部分到 基本全部的眼蟲培養(yǎng)物被收獲或用于接種另一個生物反應器。分批模式可以重復使得以重 復分批模式操作生物反應器；即，其中一部分眼蟲培養(yǎng)物被收獲并用一部分新鮮的生長培 養(yǎng)基替換并繼續(xù)生長。在某些實施方式中，重復分批模式由以下組成，去除生物反應器內眼 蟲培養(yǎng)物的10%至99. 5%之間的體積并經(jīng)常用同樣量的無菌生長培養(yǎng)基重新填充罐。重 復分批模式可以進行多次?？梢员O(jiān)測不期望的微生物的污染以確定何時應終止重復分批模 式且受污染的批次應作廢。
[0080] 可以使用許多固體-液體分尚技術將收獲的眼蟲與生長培養(yǎng)基分尚。固體-液體 分離技術的實例包括離心、過濾、使用壓帶機、噴霧干燥機，帶式干燥機等。分離的眼蟲可以 制備成粉末、顆粒、壓成丸粒、或擠出成各種形式。這些各種形式可以統(tǒng)稱為藻粉。
[0081] 在一些方面，可以從眼蟲提取副淀粉（即，β葡聚糖）。例如，可以收集且同時提取 連續(xù)收獲的眼蟲或重復分批收獲的總和，或可以以分開的批次來提取重復分批的收獲物。 在收獲時的副淀粉濃度可以占大于40%的收獲的總生物量，如以干重測量的。副淀粉提取 方法可以包括細胞裂解步驟，隨后是其中副淀粉溶解在提取溶液中的步驟和其中溶解的副 淀粉被沉淀析出提取溶液的進一步的步驟。某些實施方式使用十二烷基硫酸鈉或另一種去 垢劑裂解眼蟲細胞。其他方法包括使用物理方法如機械攪拌、高壓均化、直接加熱或微波處 理裂解眼蟲細胞。在一些情況下，使用由細胞的內部含容物和周圍培養(yǎng)基之間的滲透梯度 造成的內部或外部細胞壓力來裂解眼蟲細胞。通過利用副淀粉分子的較大密度的方法，如 通過允許副淀粉沉淀到錐形罐的底部或通過使用離心機步驟，副淀粉可以然后與眼蟲細胞 碎片分離。裂解步驟可以與固體-液體分離結合，如其中在脫水步驟如離心或干燥之前，目艮 蟲細胞在最終生物反應器罐中裂解。提取的副淀粉可以具有以干重為基礎的大于90%的 β葡聚糖濃度。
[0082] 使用本方法、系統(tǒng)和組合物所生產(chǎn)的藻粉或提取的副淀粉顯示出關于調節(jié)動物 (包括人類）免疫功能的令人驚訝和獨特的特性。具體地，存在于眼蟲中的β葡聚糖提供 在調節(jié)動物免疫功能上的令人驚訝和獨特的效果，同時在藻粉中眼蟲細胞量的其余部分進 一步提供與β葡聚糖共同地或協(xié)同地起作用的效果?？梢酝ㄟ^以在0.0001%和0.1%的 動物的總重量之間的日劑量給予藻粉觀察到這些效果。在某些方面，在藻粉中的β葡聚糖 可以被修飾以包括胺官能團、磷酸基團和/或硫酸基團。在某些方面，修飾的β葡聚糖可 以被添加到包含未修飾的β葡聚糖的藻粉中。
[0083] 根據(jù)本技術所生產(chǎn)藻粉的實例分析如以下表1和表2中提供的。
[0084] 表1藻粉分析
【主權項】
1. 一種用于生長眼蟲的方法，包括： 在生長培養(yǎng)基中異養(yǎng)生長眼蟲； 去除部分包含眼蟲的所述生長培養(yǎng)基以形成第一去除生長培養(yǎng)基，其中，所述第一去 除生長培養(yǎng)基具有至少約20克干重每升的眼蟲濃度，并且所述眼蟲具有大于30wt%的0 葡聚糖至小于70wt%的0葡聚糖；和 用新鮮的生長培養(yǎng)基補充部分所述生長培養(yǎng)基以形成第一補充生長培養(yǎng)基。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述第一去除生長培養(yǎng)基具有至少約50克干重 每升的眼蟲濃度。
3. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，在所述第一去除生長培養(yǎng)基中的所述眼蟲具有 大于約40wt%的|3葡聚糖至小于約60wt%的|3葡聚糖。
4. 根據(jù)權利要求1所述的方法，進一步包括在所述第一補充生長培養(yǎng)基中生長眼蟲到 至少約20克干重每升的眼蟲濃度。
5. 根據(jù)權利要求4所述的方法，進一步包括去除部分具有至少約20克干重每升的眼蟲 濃度的所述第一補充生長培養(yǎng)基以形成第二去除生長培養(yǎng)基。
6. 根據(jù)權利要求5所述的方法，進一步包括補充部分所述第一補充生長培養(yǎng)基以形成 第二補充生長培養(yǎng)基。
7. 根據(jù)權利要求6所述的方法，進一步包括合并所述第一去除生長培養(yǎng)基和所述第二 去除生長培養(yǎng)基以形成合并的生長培養(yǎng)基。
8. 根據(jù)權利要求7所述的方法，進一步包括下列之一： 將所述合并的生長培養(yǎng)基分離成包含眼蟲的固體部分以及液體部分，并且干燥所述固 體部分以形成藻粉；和 提取所述合并的生長培養(yǎng)基以將副淀粉與眼蟲生物量的其余部分分離。
9. 根據(jù)權利要求1所述的方法，進一步包括多次重復所述生長、去除和補充步驟。
10. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，同時進行所述去除步驟和所述補充步驟。
11. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，順序進行所述去除步驟和所述補充步驟。
12. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，在所述生長培養(yǎng)基和所述第一補充生長培養(yǎng)基 中的碳源小于30克每升。
13. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述生長培養(yǎng)基包括至少100升的體積。
14. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述生長培養(yǎng)基是過濾滅菌的。
15. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述生長步驟使用氣提式反應器或泡罩塔反應 器。
16. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述生長步驟使用不裂解大部分眼蟲的低剪切 葉片。
17. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，在所述生長步驟中眼蟲的倍增速率在10小時至 30小時之間。
18. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述生長培養(yǎng)基包含氫氧化銨作為主要氮源。
19. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述生長培養(yǎng)基包含檸檬酸鹽緩沖劑。
20. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述生長培養(yǎng)基包含乙醇作為碳源。
21. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述生長培養(yǎng)基包括在所述第一去除生長培養(yǎng) 基中對于每1克眼蟲的少于2克的碳源。
22. 根據(jù)權利要求1所述的方法，進一步包括將所述第一去除部分分離成包含眼蟲的 固體部分以及液體部分。
23. 根據(jù)權利要求22所述的方法，進一步包括干燥所述固體部分以形成藻粉。
24. 根據(jù)權利要求23所述的方法，進一步包括研磨所述藻粉至1000微米或更小的粒 徑。
25. 根據(jù)權利要求23所述的方法，進一步包括研磨所述藻粉至500微米或更小的粒徑。
26. 根據(jù)權利要求1所述的方法，進一步包括提取所述第一去除部分以將副淀粉與眼 蟲生物量的其余部分分離。
27. 由權利要求23所述的方法制成的藻粉。
28. 由權利要求26所述的方法制成的副淀粉。
【專利摘要】可以通過給予包括藻粉或β葡聚糖的組合物來調節(jié)動物的免疫功能?？梢酝ㄟ^使用具體的方法和條件生長眼蟲來制成藻粉，包括在無菌發(fā)酵罐中的某些連續(xù)的、半連續(xù)的、分批進料的和重復分批的方法。眼蟲提供與其他生物不同的β葡聚糖的形式，其中β葡聚糖主要是無支鏈的β-1,3-葡聚糖。使用由公開的方法生產(chǎn)的藻粉和β葡聚糖可以改善動物或人類的健康，并且在某些情況下可以加強或甚至替代抗生素的使用。
【IPC分類】A61K31-716
【公開號】CN104703611
【申請?zhí)枴緾N201380035496
【發(fā)明人】羅伯特·伯納德·萊文, 杰弗里·理查德·勒布倫, 杰弗里·保羅·霍斯特
【申請人】艾爾格科技公司
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2013年5月7日
【公告號】CA2873026A1, EP2858652A1, US20130303752, WO2013169768A1