專利名稱：免疫調(diào)節(jié)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種為白介素10(IL-10)激動劑的物質(zhì)的藥物用途，具體地說涉及本發(fā)明的物質(zhì)在制備用于預(yù)防和/或治療疾病的藥物組合物中用途，其中發(fā)病機(jī)理涉及免疫抑制介體(mediator)尤其是細(xì)胞因子的產(chǎn)生減少和/或功能下降，和/或涉及特定的免疫炎癥介導(dǎo)因素，尤其是細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加和/或功能增強(qiáng)。具體地說，本發(fā)明涉及本發(fā)明的物質(zhì)在用于制備預(yù)防和/或治療如下疾病藥物組合物中的應(yīng)用自身免疫疾病(I型糖尿病；胃腸道炎癥疾病，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)，痛風(fēng)性(urica)關(guān)節(jié)炎(痛風(fēng))，皮膚變態(tài)反應(yīng)；皮膚、肺和呼吸道變態(tài)反應(yīng)(包含支氣管哮喘)；由缺氧/局部缺血所造成的組織損傷(梗死，再灌注(reperfusion))；動脈粥樣硬化；牛皮癬；肉芽腫??；慢性髓性白血?。患毙运栊园籽?；癌癥；移植物抗宿主反應(yīng)和移植物排斥相關(guān)疾??；肺纖維化；肝臟纖維化；肺慢性非感染性炎癥；腎小球性腎炎；早產(chǎn)(pre-term Labour)；牙周炎；由病毒感染引起的炎癥反應(yīng)，骨質(zhì)疏松癥，敗血性休克和/或用于制備一種避孕藥。
背景技術(shù)：
最近二十年的研究表明炎癥反應(yīng)的起始，調(diào)控和結(jié)束以及哺乳動物組織的生長和分化的調(diào)控都是處在一組通常稱為細(xì)胞因子的特殊的信號多肽的嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控之下的。細(xì)胞因子是由有核細(xì)胞產(chǎn)生的并且可在細(xì)胞之間傳遞調(diào)控信號的多肽，因此在組織的相同的或不同的細(xì)胞類型之間形成了一個通信網(wǎng)。細(xì)胞因子是特別有效的介體并且可在低致10-15M的濃度下都有活性。細(xì)胞因子還是細(xì)胞免疫反應(yīng)進(jìn)展的關(guān)鍵因子，它本身形成了對由感染，變態(tài)反應(yīng)，哮喘，移植物抗宿主反應(yīng)和自身免疫疾病引起的炎病的臨床治療的基礎(chǔ)。變態(tài)反應(yīng)和自身免疫疾病一般解釋為免疫系統(tǒng)尤其是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性不正常，但一般來說這些疾病的發(fā)病機(jī)理并不清楚。體外研究，動物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)研究表明細(xì)胞因子在涉及自身免疫疾病，變態(tài)反應(yīng)，局部缺血，再灌注損傷，哮喘，感染的炎癥反應(yīng)中起到重要的病理生理學(xué)作用。并且對癌癥的發(fā)育，動脈粥樣硬化，妊娠和胚胎發(fā)育，骨穩(wěn)態(tài)是重要的。細(xì)胞因子可能與下面將要詳細(xì)描述的其它的免疫炎癥和增殖疾病。
所述疾病通常是慢性的并且治療是治標(biāo)不治本的；即針對所述疾病的所開處方中的絕大多數(shù)藥物僅僅減緩癥狀，通常不具備治療效果。其它的治療是所謂的替代治療，其中包括在患者的生活中長期供給某些如激素的由于患者內(nèi)部產(chǎn)生減少/不足而需要的物質(zhì)。所說的治療通常是不令人滿意的、產(chǎn)生了不需要的而且通常是很嚴(yán)重的副作用，并且僅僅是延遲而不是防止了疾病的發(fā)展。因此，極需要改進(jìn)的治療方法和改進(jìn)的藥物組合物。
白介素-10(IL-10)是最近描述的在小鼠和人組織中部已鑒定的天然內(nèi)源的免疫抑制細(xì)胞因子。小鼠白介素-10(mIL-10)最初被描述為一個由TH2輔助T細(xì)胞克隆釋放的細(xì)胞因子合成抑制因子，但也對各種淋巴細(xì)胞亞系具有增殖效果，包含對小鼠CD4-8+脾T細(xì)胞的克隆效率的增強(qiáng)作用(4)。人白介素10最近已被測序并被揭示在DNA序列水平以及氨基酸水平與mIL-10具有很高的同源性。而且，豚鼠IL10最近已被測序并發(fā)現(xiàn)與人IL10在DNA序列水平以及氨基酸水平見有很高的同源性(88)，還可參見圖2。還有，hIL-10同Epstein-Barr病毒基因組的一個可讀框BCRF1有很高的同源性，并且病毒性IL-10的確有一些活性與hIL-10相似，參看圖1(5)。
人IL-10由激活的T細(xì)胞克隆和不死的B細(xì)胞產(chǎn)生，除具有細(xì)胞因子合成抑制因子的活性(CSIF)，抑制因子一些促炎癥細(xì)胞因子和集落刺激因子的產(chǎn)生外，它還抑制單核細(xì)胞天然白介素-1受體拮抗劑蛋白/肽(IRAP)的產(chǎn)生，從而間接抑制了IL-1的活性。IL-10還下調(diào)單核細(xì)胞對其自身的產(chǎn)生，并抑制II型MHC的表達(dá)(12)。而且，IL-10減少了當(dāng)用單核細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞時(shí)，人T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞克隆抗原特異性的增殖。在小鼠中的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，利什曼原蟲的感染的出現(xiàn)依賴來自應(yīng)答CD4+T淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子的類型(13)。在抗利什曼原蟲感染的C57BL/6小鼠中，來自導(dǎo)管(draining)淋巴結(jié)的CD4+T細(xì)胞表現(xiàn)為IFN-γ和IL-2細(xì)胞因子的上調(diào)，而敏感的BALB/C小鼠在其導(dǎo)管淋巴結(jié)中含釋放IL-4和IL-10的CD4+應(yīng)答T細(xì)胞，它可證實(shí)與疾病的進(jìn)展相關(guān)(13)。因此，IL-10在可體內(nèi)和體外的免疫反應(yīng)中表現(xiàn)出很強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用。而且IL-10強(qiáng)烈影響化學(xué)激活(Chemokine)生物學(xué)，因?yàn)槿税捉樗?0是對CD8+T細(xì)胞特異的趨化因子，盡管IL-10抑制CD4+，而不是CD8+，T細(xì)胞由于應(yīng)答T細(xì)胞趨化細(xì)胞因子，而遷移的能力(14)。IL-10還抑制其它化學(xué)因子MCP-1/MCAF和RANTES的趨化效應(yīng)(75)。由于IL-10是一個單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞功能的去活化因子(deactivator)和Th1活性的抑制因子，含全部或部分IL-10類似活性的藥物可對以細(xì)胞因子產(chǎn)生和/或活性不平衡為特征的疾病具有治療效果。
在例如WO93/02693和WO94/04180中已建議制備含hIL-10或VIL-10的藥物組合物，并已公開了將hIL-10或rIL-10用于制備治療如敗血性或毒性休克，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，移植物抗宿主疾病，組織排斥，糖尿病、自身免疫病，白血病和癌癥的各種疾病的藥物組合物。而且，在例如EP405980和WO94/06473中已公開了例如當(dāng)IL-10特異結(jié)合的抗體的IL-10的拮抗劑，并期望這類抗體能用于對HIV感染患者的治療。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)了人白介素10之外的具有的一種或多種特征的一種物質(zhì)a)誘導(dǎo)對人單核細(xì)胞自發(fā)的IL-8的產(chǎn)生的抑制，b)誘導(dǎo)對人外周血單核細(xì)胞(PBMC)IL-Iβ誘導(dǎo)的IL-8的產(chǎn)生的抑制，c)誘導(dǎo)人單核細(xì)胞白介素-1多體拮抗劑蛋白(IRAP)的產(chǎn)生，d)誘導(dǎo)人CD8+淋巴細(xì)胞體外的趨化遷移，e)脫敏人CD8+T細(xì)胞導(dǎo)致其對rhIL-10的非應(yīng)答性，f)抑制人CD4+T淋巴細(xì)胞對IL-8的趨化應(yīng)答，g)抑制人單核細(xì)胞對MCAF/MCP-1的趨化應(yīng)答，h)不同于人IL-10，不抑制人單核細(xì)胞II型MHC分子的表達(dá)，i)誘導(dǎo)培養(yǎng)的正常人CD4+T細(xì)胞IL-4的產(chǎn)生，j)減少人混合白細(xì)胞反應(yīng)中TNFα的產(chǎn)生，這樣一種多肽，以及其衍生物可被用于預(yù)防和/或治療一些類型的炎癥過程，特別是與免疫和/或激素系統(tǒng)相關(guān)的類型；其中該多肽包含Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn的氨基酸序列或其類似物或所述序列的變異性(一種同hIL-10序列同源的九肽，稱為IT9302)。期望(正如下文對免疫機(jī)制所詳細(xì)描述的)作用機(jī)制是通過對免疫系統(tǒng)介體作用的干擾，特別是如單核因子，淋巴因子，化學(xué)因子和單核因子愛體拮抗劑等細(xì)胞因子，即本發(fā)明的物質(zhì)干擾/抑制特定細(xì)胞因子的產(chǎn)生和/或作用，由此抑制了導(dǎo)致組織損傷的病理過程，以及本發(fā)明的物質(zhì)誘導(dǎo)天然單核因子受體拮抗劑的產(chǎn)生，并由此干擾/抑制特定細(xì)胞因子的作用，因此抑制導(dǎo)致組織損傷的病理過程。
因此本發(fā)明的一個重要實(shí)施方案涉及包含本發(fā)明的一種物質(zhì)和為其活性組份的藥物組合物。本發(fā)明的其它實(shí)施方案是一種能中和上述a)到g)所提到一種或多種活性的物質(zhì)，例如一種抗體或包含該物質(zhì)的藥物組合物。
另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的物質(zhì)在制備用于基本抑制一種與細(xì)胞因子相關(guān)的生物作用的藥物組合物中的應(yīng)用，即將本發(fā)明的物質(zhì)用作一種IL-1受體拮抗劑蛋白/肽，淋巴因子，單核因子，白介素，干擾素，化學(xué)因子或集落刺激因子。另一方面涉及本發(fā)明的物質(zhì)如制備用于預(yù)防或治療與細(xì)胞因子系統(tǒng)即IL-1受體拮抗劑蛋白/肽，淋巴因子，單核因子白介素，干擾素，化學(xué)因子或集落刺激因子系統(tǒng)的失調(diào)相關(guān)的疾病的藥物組合物中的應(yīng)用。在另一方面，本發(fā)明還涉及一種治療與人細(xì)胞因子系統(tǒng)失調(diào)相關(guān)的疾病的方法，其中該方法包括給受試驗(yàn)者施用有效量的本發(fā)明的物質(zhì)。
細(xì)胞免疫系統(tǒng)在例如感染，炎癥和腫瘤疾病的疾病的發(fā)育中起作用。免疫活性細(xì)胞及其產(chǎn)物在炎癥疾病的起始，發(fā)展和可能的慢性特征的發(fā)展可起到重要作用。這些疾病通常發(fā)病機(jī)理不清楚，并包括例如糖尿病，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，胃腸道和皮膚炎疾病等常見病。除了這些例子之外，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫或促炎癥介體，也可引起許多其它的炎癥和增殖疾病(參見表2)。
表2巨噬細(xì)胞/T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)被認(rèn)為在其發(fā)病機(jī)理中重要的一些疾病皮膚病牛皮癬特應(yīng)性皮炎接觸性皮炎皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(CTCL)白細(xì)胞增多并發(fā)異型單核細(xì)胞綜合癥尋常天皰瘡大皰天皰瘡結(jié)節(jié)(nodosum)紅斑硬皮病自身免疫(包含風(fēng)濕性)疾病眼色素層炎生殖器潰瘍?nèi)鈽恿鰷I腺誕腺干燥病風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎青少年關(guān)節(jié)炎非淋病性關(guān)節(jié)炎、結(jié)膜炎、尿道炎痛風(fēng)骨關(guān)節(jié)炎系統(tǒng)性紅斑狼瘡多肌炎心肌病原發(fā)性膽汁性肝硬變節(jié)段性回腸炎潰瘍性結(jié)腸炎多發(fā)性硬化和其它脫髓鞘疾病再生障礙性貧血特發(fā)性血小板減小性紫癜多發(fā)性骨髓瘤和B細(xì)胞淋巴留垂體性全垂體機(jī)能減退突眼性甲狀腺腫和格雷夫斯眼病亞急性甲狀腺炎和慢性甲狀腺炎慢性腎上腺皮質(zhì)功能減退癥胰島素依賴的糖尿病(I型)其它疾病各種血管的臨床綜合癥(例如多動脈結(jié)節(jié)，韋氏肉芽腫，巨細(xì)胞性動脈炎發(fā)燒，不適)厭食(例如在急性和慢性炎癥和感染性疾病中)擴(kuò)散性血管內(nèi)凝血(DIC)動脈硬化(動脈粥樣硬化)休克(例如在格蘭氏陰性膿毒癥中)惡病質(zhì)(例如在癌癥，慢性感染和慢性炎癥疾病中)移植排拆和移植物抗宿主疾病細(xì)胞因子T淋巴細(xì)胞協(xié)調(diào)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)物(淋巴因子)啟始和控制免疫應(yīng)答(1，2)。由抗原呈遞細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴細(xì)胞激活介體(淋巴因子)屬于一組稱為細(xì)胞因子的多肽。細(xì)胞因子是在生理和病理?xiàng)l件下細(xì)胞-細(xì)胞間通訊的遞質(zhì)，并且可以作為激素提供免疫系統(tǒng)和其它組織和器官之間的信號。細(xì)胞因子還可由免疫系統(tǒng)之外的細(xì)胞產(chǎn)生，并且通常認(rèn)為所有的有核細(xì)胞都能產(chǎn)生一種或幾種細(xì)胞因子。因此，例如角化細(xì)胞和成纖維細(xì)胞是細(xì)胞因子的潛在的產(chǎn)生者并且在該系統(tǒng)中細(xì)胞因子可以作為不依賴于免疫系統(tǒng)的自分泌或旁分泌激素(3)。白介素-10小鼠白介素-10(mIL-10)最初被描述為由TH2輔助T細(xì)胞克隆釋放的一種細(xì)胞因子合成抑制因子(CSIF)，它還有對各種亞系的淋巴細(xì)胞的增殖效應(yīng)，包括對小鼠脾CD4-8+T細(xì)胞克隆效率的增強(qiáng)效應(yīng)。人白介素-10(hIL-10)最近已被描述(5)并且與Epstein-Barr病毒基因組的一個可讀框，BCRF1具有高度的同源性，并且病毒IL-10并不表現(xiàn)出一些當(dāng)hIL-10相似的活性。在下文中，將概括IL-10的生物化學(xué)，生物學(xué)，生理學(xué)和可能的病理生理學(xué)作用。IL-10的結(jié)構(gòu)小鼠(mIL-10)和hIL-10在貫穿其整個長度上在其一級結(jié)構(gòu)上其就高度的核苷酸序列同源性(80％)(4，5)。唯一明顯的不同是在hIL-10cDNA克隆的31非翻譯區(qū)中人Alu重復(fù)序列單元的插入。mIL-10和hIL-10cDNA編碼非常相似的178個氨基酸的可讀框(ORF)，包括親水先導(dǎo)序列并相應(yīng)于73％的氨基酸同源性。mIL-10對小鼠細(xì)胞有活性，但并不明顯地與人細(xì)胞起交叉反應(yīng)hIL-10是一個18KDa的缺乏可檢測的糖類的多肽，但mIL-10在靠近其N末端的一個位點(diǎn)被N-糖基化，其中該位點(diǎn)在hIL-10中是缺失的。mIL-10和重組hIL-10(rhIL-10)二者都以非共價(jià)的同源二聚體表達(dá)。mIL-10或hIL-10單體的生物活性程度如何尚未確定。含至少N末端8個氨基酸和(末端21個氨基酸“標(biāo)簽”多肽的mIL-10和hIL-10根據(jù)首次對hIL-10測序的Moore等人的公開不顯現(xiàn)可檢測的活性減少(b)。全長IL-10的標(biāo)簽C和N末端并不一定引起功能改變，因?yàn)闃?biāo)簽是偶然的或隨機(jī)的。如在下文中將要詳細(xì)描述的高級目的可能氨基酸的取代也可解釋為什么標(biāo)簽不能顯示功能喪失。重組mIL-10和hIL-10已在CDST細(xì)胞，N-鼠骨髓瘤細(xì)胞，中國倉鼠卵巢細(xì)胞，一種桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，和大腸桿菌中表達(dá)。這些IL-10蛋白的生物活性至今未能辨別。
mIL-10基因包含5個線性排列在約5.1kb的DNA上的外顯子。基因組克隆本身編碼一個可表達(dá)的mIL-10蛋白。mIL-10和hIL-10基因位于小鼠和人染色體1上(6，7)。
mIL-10和hIL-10表現(xiàn)出與EPstein-Barr病毒基組中的一個可讀框，BCRF1的高的DNA和氨基酸序列同源性，并且同源性限于成熟蛋白編碼序列，在信號序列或5′和3′非翻譯序列未檢測到(5)。在三個序列當(dāng)中，在DNA序列水平mIL-10和hIL-10是最相近的相關(guān)配對(81％)，而編碼成熟hIL-10和BCRF1蛋白的DNA序列具有71％的同源性。hIL-10和BCRF1之間在氨基酸水平的同源性為84％。假設(shè)認(rèn)為mIL-10和hIL-10基因由一個共同祖先進(jìn)化而來，而BCRF1代表一個被先前處理，捕獲的細(xì)胞的細(xì)胞因子基因，并且BCRF1蛋白被限制成與hIL-10類似。BCRF1在EBV的裂解循環(huán)中表達(dá)。BCRF1 ORF編碼一個17kD的與hIL-10相似的含較少的或不含糖基化位點(diǎn)的分泌多肽。BCRF1表現(xiàn)出IL-10的一些活性并且被稱為病毒IL-10(VIL-10)，盡管它只有hIL-10活性的10％。IL-10在細(xì)胞因子產(chǎn)生中的活性hIL-10抑制單核細(xì)胞/β噬細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞的多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，其中細(xì)胞因子包含干擾素-γ(IFN-γ)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-C5F)，粒細(xì)胞-CSF-(G-CSF)、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8和單核趨化多肽-1(MCP-1/MCAF)。IL-10還抑制作為單核細(xì)胞對化學(xué)因子MCP-1/MCAF的應(yīng)答的遷移能力(75)。而且，hIL-10誘導(dǎo)一種內(nèi)源的、天然的白介素-I受體拮抗劑(IRAP)的產(chǎn)生，其中該拮抗劑可通過與受體競爭結(jié)合而抑制IL-4α和IL-1β。由于IL-4α和IL-4β強(qiáng)烈誘導(dǎo)IL-8的產(chǎn)生，IL-10可通過刺激IL-1受體拮抗劑IRAP的產(chǎn)生而發(fā)揮其對IL-8產(chǎn)生的部分抑制效應(yīng)。下文描述和例證的最后一種機(jī)制對本發(fā)明來說是相當(dāng)重要的。IRAP具有抗炎癥活性(9)，并且已表明它對風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎有治療效果(10)。還有，已證明IRAP對治療膿毒源綜合癥有效并且在Fisher等人的一項(xiàng)研究中已證明一個劑量依賴的，28天的存活優(yōu)勢(benefit)與IRAP的治療相關(guān)(p＝0.015)(11)。IRAP可通過抑制如IL-8的化學(xué)因子的產(chǎn)生而發(fā)揮其部分抗炎癥效應(yīng)。IL-10和抗原表達(dá)IL-10抑制人單核細(xì)胞II型MHC的表達(dá)(8)。組成性的和IL-4或IFN-γ誘導(dǎo)的HLA-DR/DP和DQ的表達(dá)被hIL-10抑制(12)。另外，用IL-10預(yù)保溫的單核細(xì)胞抗后續(xù)的IL-4或IFN-γ誘導(dǎo)的II型MHC的表達(dá)。IL-10抑制用LPS激活后人單核細(xì)胞II型MHC的表達(dá)(12，76)。用致死劑量LPS感染的BALB/c小鼠的施用1～10mg IL-10后可免于死亡(6)。
IL-10抑制氮中間體和超氧化物陰離子。IL-10還可在IFN-γ激活之后由巨噬細(xì)胞抑制活性氮中間體(NO)以及活性氧中間體(H2O2)(13)。IL-10和T細(xì)胞活性IL-10還對T細(xì)胞的功能/活性具調(diào)節(jié)作用。因此，hIL-10對CD8+T淋巴細(xì)胞是一個有效的趨化因子，而hIL-10并不表現(xiàn)針對CD4+T細(xì)胞對β-化學(xué)因子RANTES以及α-化學(xué)因子IL-8等趨化信號的應(yīng)答能力。hIL-10還直接抑制了人外周血T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞克隆的增殖(14)。IL-10和B淋巴細(xì)胞hIL-10共刺激由表面Ig和固定化的抗IgM抗體交聯(lián)而誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖，并且當(dāng)B細(xì)胞被其CD40抗原和抗CD40抗體以及小鼠L細(xì)胞表達(dá)的人FcγRII/CD32交聯(lián)刺激時(shí)，該效應(yīng)可被增強(qiáng)(15)。IL-10對激活的人B細(xì)胞的增殖和分化效應(yīng)表明該細(xì)胞因子可能是T細(xì)胞表達(dá)hIL-10為B細(xì)胞應(yīng)答提供幫助的某些高效率的原因。作為免疫系統(tǒng)的一種穩(wěn)態(tài)因子的IL-10如上所述，IL-10功能的生理后果據(jù)信可維持免疫系統(tǒng)一定程度的穩(wěn)態(tài)。因此，IL-10明確地抑制T輔助細(xì)胞的功能并可能刺激具有抑制功能的T細(xì)胞。因此，和IL-4類似，據(jù)信IL-10可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞的Th1和Th2細(xì)胞因子類型之間的平衡。特別是，據(jù)認(rèn)為IL-10抑制了Th1細(xì)胞的分化。由于Th1細(xì)胞的特征在于產(chǎn)生有利于細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子(IFN-γ和IL-2)的產(chǎn)生，而Th2細(xì)胞產(chǎn)生有利于體液應(yīng)答并抑制細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子(IL-4、IL-5和IL-10)，IL-10可抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)如延遲型的超敏反應(yīng)，而卻有益于體液反應(yīng)。
作為上述的IL-10的特征所得到的結(jié)果，IL-10的活性已被描述為巨噬細(xì)胞和Th1細(xì)胞因子合成的抑制因子。因此已經(jīng)研究是否IL-10的產(chǎn)生和/或活性的缺乏在疾病中起了作用，據(jù)信在這些疾病如自身免疫疾病和炎癥中增強(qiáng)的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)起了作用。用抗IL-10抗體處理的小鼠對單核因子誘導(dǎo)的炎癥表現(xiàn)出較強(qiáng)的炎癥應(yīng)答，并且對LPS誘導(dǎo)的膿毒性休克，一種單核因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的死亡明顯地較為敏感(16)。而且，IL-10缺失(knock-out)小鼠自發(fā)引起類似于結(jié)腸炎潰瘍(ulcerosa)的內(nèi)臟炎癥反應(yīng)(17)。另外，已經(jīng)研究是否IL-10是否在不同的寄生蟲，分枝桿菌和病毒感染中起作用，并且已表明IL-10在與曼氏血吸蟲相關(guān)的免疫麻痹中起病理生理學(xué)作用(18)。還提示在麻風(fēng)分支桿菌感染中起作用。最近，已發(fā)現(xiàn)在預(yù)后不好的愛滋病患者的血漿中IL-10的水平較高，并提示這是由于愛滋病引起的免疫麻痹(19)。治療建議這些體內(nèi)的結(jié)果/數(shù)據(jù)明顯的提示IL-10在控制細(xì)胞介導(dǎo)的單核因子放大的免疫炎癥中的作用，并表明IL-10或IL-10類似活性的藥物在治療疾病中的廣泛的治療用途，其中疾病的特征在于IL-10產(chǎn)生和/或活性的減少/不足。由于本發(fā)明的物質(zhì)以IT9362代表通過如下方面表現(xiàn)IL-10類的活性1)誘導(dǎo)人單核細(xì)胞IRAP的產(chǎn)生，2)抑制人單核細(xì)胞自發(fā)的IL-8的產(chǎn)生，3)抑制外周血單核細(xì)胞(PBMC)IL-Iβ刺激的IL-8的產(chǎn)生；4)刺激人T淋巴細(xì)胞CD8+，但不是CD4+的趨化遷移，5)脫敏人CD8+T細(xì)胞對rhIL～10誘導(dǎo)的趨化遷移，6)抑制IL-8介導(dǎo)的人CD4+T細(xì)胞的趨化作用，和7)抑制MCP-I/MCAF介導(dǎo)的人單核細(xì)胞趨化作用，8)誘導(dǎo)培養(yǎng)的正常人CD4+T細(xì)胞IL-4的產(chǎn)生，9)減少人混合白細(xì)胞反應(yīng)中TNFα的產(chǎn)生，該多肽和其類似物可能因此具有同IL-10相同的治療可能性。表3列出了一些疾病，其中IL-10類的免疫調(diào)節(jié)劑或具有IL-10類似活性的免疫調(diào)節(jié)劑可能具有治療重要性表3其中具有IL-10類似活性的免疫調(diào)節(jié)劑可具有治療重要性的一些疾病，這是由于該免疫調(diào)節(jié)劑可誘導(dǎo)IRAP的產(chǎn)生和/或抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生和/或活性(參考文獻(xiàn)20-74)由感染或其它疾病引起的早產(chǎn)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎感染性關(guān)節(jié)炎痛風(fēng)敗血綜合癥高溫潰病性結(jié)腸炎或小腸結(jié)腸炎骨質(zhì)疏松細(xì)胞肥大病毒牙周病腎小球腎炎肺慢性，非感染性炎癥(例如，肉樣瘤病和煙(smoker’s)肺)肉芽瘤形成肝纖維化肺纖維化移植排斥移植物抗宿主病慢性髓性白血病急性髓性白血病其它腫瘤疾病支氣管哮喘I型糖尿病(胰島素依賴的)動脈硬化/動脈粥樣硬化牛皮癬慢性B細(xì)胞白血病普通變異的免疫缺陷使用其它生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(modifier)的副作用擴(kuò)散性血管內(nèi)凝血系統(tǒng)性硬化腦脊髓炎肺炎癥高IgE綜合癥小腸結(jié)腸炎癌癥轉(zhuǎn)移和生長過繼免疫療法獲得性呼吸窘迫綜合癥敗血癥再灌注(reperfution)綜合癥手術(shù)后炎癥器官移植脫發(fā)發(fā)明詳述具有IL-10類似活性的IL-10同源九肽的開發(fā)根據(jù)其序列應(yīng)該具有vIL-10和hIL-10之間的高的同源性但如與mIL-10具有盡可能低的同源性的原則，篩選了具有9個氨基酸長度的hIL的部分序列。該策略酸是基于這樣一個事實(shí)即vIL-10同hIL-10部分交叉反應(yīng)而mIL-10不與hIL-10交叉反應(yīng)(參見上文)。因此，hIL-10的在人器官中起特定活性的序列應(yīng)該位于那些在hIL-10和vIL-10之間高度同源性但卻與mIL-10相關(guān)程度較低的區(qū)域中。
hIL-10的信號多肽被推測由最初的18個氨基酸組成。成熟蛋白質(zhì)從第19位氨基酸開始(功能蛋白的第1位是一個絲氨酸)，并且整個蛋白包含160個氨基酸。通過觀察人和病毒IL-10羧基末端的序列及特定的含賴氨酸和精氨酸的157和159位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)域?qū)Σ糠謪⑴c受體的結(jié)合是有利的(圖1和2)。
在篩選通過化學(xué)合成獲得的一些代表物的IL-10類似活性之間，發(fā)現(xiàn)了合成的九肽IT9302，具有一些模擬hIL-10的免疫抑制活性，這將在下面的實(shí)施例中詳細(xì)介紹。IT9302對應(yīng)于hIL-10C末端的一個具有如下氨基酸序列的九肽NH2-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn-COOH(SEQ ID No1)IT9302當(dāng)對應(yīng)于C末端的152～160位氨基酸的hIL-10片段有100％的同源性。而且，該多肽序列在相應(yīng)區(qū)域與病毒vIL-10具有6個氨基酸相同，參見圖1和2，即意味著如本文所定義氨基酸有6/9或66％同源，而與mIL-10有4個氨基酸相同，即4/9或44％。該九肽是唯一獲自或衍生自hIL-10的序列并且具有至今檢測到的由下文實(shí)施例所證明的特征。除了本發(fā)明人研究之外，無人指出過該序列是一個功能性結(jié)構(gòu)域。
因此從最廣泛的方面來講，本發(fā)明涉及一種表現(xiàn)出hIL-10激動劑活性的物質(zhì)，即一種不同于人白介素10的具有如下一種或多種特性的物質(zhì)a)誘導(dǎo)對人單核細(xì)胞自發(fā)的IL-8產(chǎn)生的抑制，b)誘導(dǎo)對IL-Iβ誘導(dǎo)的人外周血單核細(xì)胞IL-8產(chǎn)生的抑制，c)誘導(dǎo)人單核細(xì)胞白介素-1受體拮抗劑蛋白(IRAP)的產(chǎn)生，d)誘導(dǎo)體外CD8+人T淋巴細(xì)胞的趨化遷移，e)脫敏人CD8+T細(xì)胞導(dǎo)致其對hIL-10的非應(yīng)答性，f)抑制CD4+人T淋巴細(xì)胞對IL-8的趨化應(yīng)答，g)抑制人單核細(xì)胞對MCAF/MCP-1的趨化應(yīng)答，h)與人IL-10不同，不抑制人單核細(xì)胞上II型MHC分子的表達(dá)，i)誘導(dǎo)培養(yǎng)的正常人CD4+T細(xì)胞IL-4的產(chǎn)生，j)減少人混合白細(xì)胞反應(yīng)中TNFα的產(chǎn)生。
在這些活性中，d)～g)被認(rèn)為是獨(dú)一無二的。本發(fā)明的一個重要實(shí)施酸方案是一種表現(xiàn)出如下所述的hIL-10激動劑活性的物質(zhì)，該物質(zhì)包含氨基酸序列Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn或一種類似物或所說序列的變異體。除非特別指出，該序列和所有本發(fā)明的說明書和權(quán)利要求書中的其它多肽序列，都是按常規(guī)從N末端寫向C末端的。
該九肽是非常有效的可誘導(dǎo)不同的功能并且是穩(wěn)定的。并且假設(shè)它不能被不正確地與受體結(jié)合。選擇了一個九肽是因?yàn)橥ǔＲ粋€9個氨基酸的多肽序列對于蛋白質(zhì)是獨(dú)一無二的。但是，應(yīng)該看到在hIL-10最末端的6個氨基酸是最重要的。因此在本發(fā)明的范圍之內(nèi)是一種包含氨基酸序列NH2-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn(SEQ ID No1)的物質(zhì)或多肽。
一些氨基酸取代被認(rèn)為可能不會對hIL-10的如本文所定義的激動劑活性具有不利影響，只要蘇氨酸，賴氨酸和精氨酸存在，并在其之間無一個氨基酸的插入。
在其最廣泛的方面，本發(fā)明涉及一種具有如下通式的多肽Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6(SEQ ID NO19)其中X4和X5分別選自Met，Ile，Leu和Val；并且X6選自Asp，Gln和Glu。
在另一方面，本發(fā)明涉及一種具有如下通式的多肽X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6(SEQ ID NO20)其中X3，X4和X5獨(dú)立地選自Met，Ile，Leu和Val；并且X6選自Asp，Gln和Glu。
在另外的方面，本發(fā)明涉及一種具有通式X2-X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6(SEQ ID NO21)的多肽，其中X2是Tyr或Phe，
X3，X4和X5分別選自Met，Ile，Leu和Val；并且X6選自Asp，Gln和Glu。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案是具有通式X1-X2-X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6(SEQ ID NO22)的多肽，其中X1是Ala或Gly，X2是Tyr或Phe，X3，X4和X5分別選自Met，Ile，Leu和Val；并且X6選自Asp，Gln和Glu。
如下是假設(shè)具有如上所定義的hIL-10激動劑活性的特定的多肽的實(shí)施例1. NH2-Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Met-Arg-Asn-COOH (SEQ ID NO2)2. NH2-Ala-Phe-Met-Thr-Leu-Lys-Leu-Arg-Asn-COOH (SEQ ID NO3)3. NH2-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Glu-COOH (SEQ ID NO4)4. NH2-Gly-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO5)5. NH2-Ala-Phe-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO6)6. NH2-Ala-Tyr-Ile-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO7)7. NH2-Ala-Tyr-Leu-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO8)8. NH2-Ala-Tyr-Val-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO9)9. NH2-Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO10)10.NH2-Ala-Tyr-Met-Thr-Leu-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO11)11.NH2-Ala-Tyr-Met-Thr-Val-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO12)12.NH2-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO13)13.NH2-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Met-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO14)14.NH2-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Asp-COOH (SEQ ID NO15)15.NH2-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Asp-Gln-COOH (SEQ ID NO16)16.NH2-Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Asp-Glu-COOH (SEQ ID NO17)為了比較，合成了另一個稱為IT9301的與hIL-10序列具有100％同源性的九肽。該多肽IT9301對應(yīng)于hIL-10 N末端的開始的九肽序列(氨基酸序列19～27位，即成熟蛋白的最初9個氨基酸)并具有如下氨基酸序列NH2-Ser-Pro-Gly-Gln-Gly-Thr-Gln-Ser-Glu-COOH (SEQ ID NO18)
應(yīng)用下述的技術(shù)該多肽表現(xiàn)IL-10類似的活性，僅僅是因?yàn)樗趆IL-10的另一末端而選擇了它，其主要是作為陰性結(jié)果的對照。在當(dāng)vIL-10的序列同源性，和有利于受體結(jié)合的氨基酸方面，它不具有C末端的特征。在IL-1β誘導(dǎo)的外周血單核細(xì)胞系統(tǒng)中測試了IT9301對IL-8產(chǎn)生的影響，但是并不真正誘導(dǎo)這些細(xì)胞的IL-8的產(chǎn)生的抑制。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“本發(fā)明的一種hIL-10激動劑”包括任何與IT9302相同或結(jié)構(gòu)相似的并表現(xiàn)出與IT9302相似的生物作用的有藥理活性的和藥理上可接受的化合物，包括IT9302的衍生物，特別是藥學(xué)上可接受的鹽，酯和融合物以及IT9302的結(jié)合物或包含肽模擬物(peptido-mimetics)的IT9302衍生物。IT9302在N末端當(dāng)合適的載體的如聚乙二醇或糖的共價(jià)偶聯(lián)可延長該多肽在體內(nèi)的半壽期。
在本文中采用如下的定義“細(xì)胞因子”是主要但不是僅僅由免疫系統(tǒng)的細(xì)胞群體在應(yīng)答特異的刺激原如特異的抗原或同種抗原或非特異的多克隆激活因子，如一種內(nèi)毒素或其它格蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁的成份時(shí)而釋放的蛋白組成的介體的總稱。
“淋巴因子”是致敏的淋巴細(xì)胞做為對刺激原的應(yīng)答、其中刺激原包括例如一種特異的抗原或一種同種抗原；或者由多克隆激活因子，如內(nèi)毒素或其它的格蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成份攻擊的淋巴細(xì)胞而釋放的由蛋白組成的介體的總稱。
“白介素”一類是主要由但并不僅僅是巨噬細(xì)胞，T，B或NK細(xì)胞作為對刺激原例如特異的抗原或同種抗原的應(yīng)答；或由被多克隆激活因子，如內(nèi)毒素或其它的格蘭氏陰性細(xì)胞的細(xì)胞壁的成份所攻擊的淋巴細(xì)胞所釋放的蛋白組成的介體的總稱。“單核因子”是主要但不是僅僅由單核吞噬細(xì)胞(例如單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞或枯胚氏細(xì)胞(肝)或郎格爾漢氏細(xì)胞(皮膚)作為對任意刺激原的應(yīng)答的而釋放的一類由蛋白組成的介體的總稱。“化學(xué)因子”是主要但并不僅僅由免疫系統(tǒng)的細(xì)胞群體釋放的蛋白組成的趨化和/或白細(xì)胞激活介體的總稱，這些是作為對特異的刺激原例如特異的抗原或同種抗原；或非特異的多克隆刺激因子，例如內(nèi)毒素或其它格蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁成份的應(yīng)答而釋放的并且該“化學(xué)因子”屬于特定的或者是化學(xué)因子-α基因家庭酸或化學(xué)因子β基因家族的基因家族?！案蓴_素”是主要由但不僅僅是由免疫系統(tǒng)的細(xì)胞群體作為對病毒或干擾素誘導(dǎo)因子，如多核苷酸的應(yīng)答而釋放的由蛋白組成的抗病毒和/或單核細(xì)胞激活介體；具體地說是免疫系統(tǒng)的細(xì)胞對特異的刺激原的應(yīng)答；如對特異的抗原或同種抗原；或非特異的多克隆的激活因子如內(nèi)毒素或其它的格蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁的成份的應(yīng)答?！凹浯碳ひ蜃印笔侵饕皇莾H由免疫系統(tǒng)的細(xì)胞群體釋放的由蛋白組成的造血生成集落刺激介體，這是對特異的抗原或同種抗原或?qū)Ψ翘禺惖亩嗫寺〖せ钜蜃尤鐑?nèi)毒素或其它的格蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁組份的應(yīng)答?！岸嚯摹痹诒疚闹屑戎钢辽僦挥兴醿蓚€氨基酸殘基，至多只有10個氨基酸殘基的短肽，寡肽(11～100氨基酸殘基)，和長肽(通常解釋的“多肽”，即大于100個氨基酸殘基的長度)以及蛋白(功能完整性包括至少一種肽，寡肽，或多肽，其可通過被糖基化，脂化或通過包含輔基而被化學(xué)修飾)。多肽的定義還包括天然形式的人肽/蛋白以及在轉(zhuǎn)化任何類型的宿主的任何類型的表達(dá)載體中的重組蛋白或肽，和化學(xué)合成的肽。
本發(fā)明的一種實(shí)施方案涉及一種包含人IL-10序列的一個亞序列的多肽該多肽與vIL-10有66％的同源性程度，同mIL-10有44％的同源性程度，尤其是SEQ ID NO1。術(shù)語“同源性”指當(dāng)對多肽的氨基酸的一致性和位置進(jìn)行匹配時(shí)兩個或多個氨基酸的片段中氨基酸序列的一致性。
因此本文所用的同源性是對兩個氨基酸(或核苷酸)序列之間相似性的度量。同源性被表達(dá)為在兩個序列(可能是不等長的)被校準(zhǔn)之后相匹配(matching)的(氨基酸或堿基)的分?jǐn)?shù)和或百分?jǐn)?shù)。術(shù)語排序的使用的定義如(76)中所述。粗略來講，兩個序列的校準(zhǔn)是通過對兩序列之間匹配的堿基(或氨基酸)的數(shù)目的最大化，而將最小數(shù)目的“空白”或“無義”堿基插入任一序列中以獲得最大的重疊來進(jìn)行的。
此處所用術(shù)語“同源的”特別用于說明所給多肽的氨基酸序列和IT9302的氨基酸序列之間的一致性的程度。用于同IT9302的氨基酸序列相比較的氨基酸序列可由如DNA或DNA序列等的核苷酸序列，例如下文所述通過雜交獲得的推導(dǎo)而來，或者由常規(guī)的氨基酸測序方法獲得。優(yōu)選確定成熟多肽的氨基酸序列的同源程度，即不將任何先導(dǎo)序列考慮在內(nèi)。一般說來，為了確定其內(nèi)在的同源性而比較核苷酸序列時(shí)，僅采用編碼區(qū)。
盡管hIL-10和vIL-10基本程度的同源性被期望是有益的，并不是說hIL-10序列的表現(xiàn)為與vIL-10較低程度同源性，比如說50％，55％或100％的亞序列也可表現(xiàn)出一種或多種有益的hIL-10激動劑活性。而且，如上所討論的，并不認(rèn)為與hIL-10的同源程度絕對必須是100％。在本發(fā)明的范圍之內(nèi)還包括與hIL-10具有較低同源程度如75％，80％，85％，90％或95的多肽，盡管優(yōu)選100％。
這樣的多肽可認(rèn)為同該九肽類似。因此術(shù)語“一種其類似物或變異體”指一種并不完全具有Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn(SEQ ID NO1)的氨基酸序列的多肽，但如上所說卻仍具有“hIL-10激動劑活性”。通常來說同實(shí)施例中描述的IT9302相比，這類多肽可為例如在氨基酸組成或翻譯后修飾如糖基化或磷酸化中發(fā)生一定程度的變化的多肽。
因此本上下文中所用的術(shù)語“類似物”或“變異體”指一種具有與IT9302的氨基酸序列有一定程度的不同，但卻仍相似的氨基酸序列的蛋白或多肽，允許改變氨基酸序列的輕微變異，如缺失，定點(diǎn)突變，額外氨基酸的插入，或其組合，以產(chǎn)生IT9302的多肽類似物。
定點(diǎn)突變提供了一種方便地在天然蛋白序列中進(jìn)行保守的氨基酸置換等的途徑。另外，可利用多肽序列的單獨(dú)的氨基酸的連續(xù)偶聯(lián)的已為熟知的液相或固相多肽合成方法制備類似物，或者該多肽的合成可通過偶聯(lián)單獨(dú)的氨基酸以形成多肽序列的片段，該片段后來被偶聯(lián)以形成所需的多肽。
本文所用的“保守的”指(1)改變盡可能是構(gòu)象上中性的，即，與天然蛋白相比，設(shè)計(jì)在突變蛋白的三級結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生盡可能少的改變，并且(ii)該改變在抗原性上盡可能是中性的，即與天然蛋白相比，設(shè)計(jì)在突變蛋白的抗原決定簇上產(chǎn)生盡可能少的變化。構(gòu)象上中性是保持生物活性所需的，而抗原性中性是在用本發(fā)明的物質(zhì)處理的患者或動物中避免引起免疫原性反應(yīng)所需的。盡管很難用絕對的確定性來選擇哪種改變是構(gòu)象和抗原性中性的，但存在可指導(dǎo)本領(lǐng)域的技術(shù)人員去做有最大可能性的構(gòu)象和抗原性中性的改變的準(zhǔn)則，參見例如(77)和(78)。一些較重要的準(zhǔn)則包括(1)疏水殘基的置換很小可能產(chǎn)生抗原性改變，因?yàn)樗鼈兏赡芪挥诘鞍踪|(zhì)的內(nèi)部，例如Bergofsky(上文引用)和Bowie等(上文引用)；(2)置換物理化學(xué)類似的即同義的殘基產(chǎn)生構(gòu)象改變的可能性較小，因?yàn)橹脫Q的氨基酸殘基可起到被置換的氨基酸殘基同樣的結(jié)構(gòu)作用；和(3)進(jìn)化上保守的序列的改變可能產(chǎn)生有害的構(gòu)象作用因?yàn)檫M(jìn)化上保守意味著序列在功能上是重要的。在這些篩選突變蛋白序列的基本準(zhǔn)則之外，可對所操作的分子進(jìn)行測定以確定其生物活性和構(gòu)象。對本發(fā)明的物質(zhì)的生物測定在實(shí)施例中有更全面的描述?？捎弥辽賰煞N已知的測定對其構(gòu)象變化進(jìn)行檢測微補(bǔ)體(microcomplement)固定方法，例如(79)和(80)所用的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的研究中所廣泛采用的方法；和對一系列構(gòu)象特異的單克隆抗體的親和性，例如(81)。
因此本發(fā)明的一個重要實(shí)施方案涉及一種多肽，其中至少一個氨基酸殘基被不同的氨基酸殘基置換和/或其中至少一個氨基酸殘基被缺失或增加，以便得到一種包含與下面定義的所說的氨基酸序列或氨基酸序列的亞序列不同的氨基酸序列的多肽，但如上所述，該多肽卻具有基本的hIL-10激動劑活性。
本發(fā)明的一個有趣的實(shí)施方案涉及一種多肽，該多肽是一種類似物和/或包含本發(fā)明的多肽的至少一部分，總數(shù)為10～100個氨基酸殘基，例如至少12個氨基酸，至少15個氨基酸，至少20個氨基酸或至少30個氨基酸。
在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用基本為純化形式的物質(zhì)或多肽，為得到這些，可能需要多肽的純化。用于純化多肽的方法的實(shí)施例如下(i)用抗體進(jìn)行免疫沉淀或親和層析；(ii)用合適的配基進(jìn)行親和層析，(iii)其它的層析方法如凝膠過濾，離子交換或高效液相色譜或上述任一項(xiàng)的衍生方法，(iv)電泳方法如聚丙烯酰胺凝膠電泳，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳和等電聚焦，(v)任何其它的特定的增溶溶解和/或純化技術(shù)。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)還有編碼上述多肽的核苷酸序列，具體地是一種編碼包含或者即是SEQ ID NO1的氨基酸序列的核苷酸序列，例如一種包含序列GCC TAC ATG ACA ATG AAG ATA CGA AAC(SEQID NO23)的核苷酸序列或編碼具有所述氨基酸序列的一個亞序列的一種多肽的核苷酸序列。而且，一種修飾的與上述的核苷酸序列不同的核苷酸序列中至少一個核苷酸被缺失，置換或修飾或已被插入至少一個額外的核苷酸，以便得到一個編碼一種在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的具有hIL-10激動劑活性的多肽的多核苷酸序列。
在本發(fā)明的說明書和權(quán)利要求書中，術(shù)語“亞序列”指一個優(yōu)選大小為至少18個核苷酸，更優(yōu)選21個核苷酸，最優(yōu)選24個氨基酸的序列。在本發(fā)明的幾個實(shí)施方案中，本發(fā)明的核苷酸序列的亞序列或類似物將包含至少27個核苷酸，例如至少30個核苷酸或至少45個核苷酸。由“亞序列”編碼的多肽應(yīng)該符合上述a)-g)至少一個標(biāo)準(zhǔn)和/或該核苷酸“亞序列”應(yīng)該在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包含SEQ ID NO23序列的核苷酸核苷酸序列雜交。
術(shù)語“高度嚴(yán)謹(jǐn)”，當(dāng)與雜交條件結(jié)合使用時(shí)，為如文獻(xiàn)中所定義的比熔解溫度Tm低5-10℃，參考Sambrook等，1989，11.45-11.49頁。
與本發(fā)明的DNA片段相應(yīng)的術(shù)語“類似物”包含一種核苷酸序列，它所編碼的多肽與上面DNA所編碼的多肽一致或基本一致。公知可由不同密碼子編碼相同的氨基酸，密碼子的使用，與特別是表達(dá)核苷酸的所研究的生物的優(yōu)選有關(guān)。因此，本發(fā)明的DNA片段的一個或多個核苷酸或密碼子可被其它的核苷酸或密碼子交換，它們而多被表達(dá)時(shí)，可得到與上述所表明的DNA片段所編碼的多肽一致或基本一致的多肽。
而且，術(shù)語“類似物”和“亞序列”指在允許在序列中有如一個或多個核苷酸的置換，插入(包含內(nèi)含子)，添加和重排的變化，該改變對該DNA片段或其亞序列所編碼多肽的hIL-10激動劑活性基本上不具任何的副作用。因此本發(fā)明還包含一種編碼具有氨基酸序列SEQ IDNO1的一個亞序列的多肽的核苷酸序列。
本發(fā)明的多肽可由重組DNA技術(shù)來產(chǎn)生。本發(fā)明的一個重要的實(shí)施方案涉及一種包含本發(fā)明的核苷酸序列的表達(dá)系統(tǒng)。因此在本發(fā)明的范圍內(nèi)還有一種包含本發(fā)明的核苷酸序列的表達(dá)系統(tǒng)，例如一種帶有并可介導(dǎo)上述的核苷酸序列的表達(dá)的可復(fù)制的表達(dá)載體。
用于產(chǎn)生本發(fā)明的多肽的生物體可以是高等生物例如動物或低等生物如微生物如大腸桿菌、酵母、原生動物、或來源自多細(xì)胞生物如真菌的細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞或一種細(xì)胞系，其中如上所述攜帶如上所述的表達(dá)系統(tǒng)。
不管所用生物的類型如何，本發(fā)明的DNA片段被直接或以合適的方式導(dǎo)入該生物體中。另外，通過直接或通過表達(dá)載體的方法將本發(fā)明的DNA片段或其類似物或其亞序列導(dǎo)入哺乳動物細(xì)胞系中而產(chǎn)生該多肽。如上面所討論的，本發(fā)明的多肽還可由化學(xué)合成產(chǎn)生。
本發(fā)明還涉及一種如本文所述包含編碼本發(fā)明的多肽或融合多肽的質(zhì)粒載體。在一個特別重要的實(shí)施方案中，如本文所述本發(fā)明的DNA片段或其類似物或其亞序列或本發(fā)明的融合DNA片段可被一種可在宿主生物或細(xì)胞系中復(fù)制的可復(fù)制的表達(dá)載體攜帶。
具體地該載體可以是質(zhì)粒、噬菌體、柯斯質(zhì)粒、微染色體或病毒。在本發(fā)明的一個感興趣的實(shí)施方案中，該載體可以是這樣一種載體當(dāng)其被導(dǎo)入宿主細(xì)胞中時(shí)，它與宿主細(xì)胞細(xì)胞基因組整合。
如上所述所產(chǎn)生的多肽可進(jìn)行翻譯后和合成后修飾而作為熱處理，化學(xué)處理(甲醛、戊二醛等)或酶處理(肽酶、蛋白酶和蛋白修飾酶類)的產(chǎn)物。當(dāng)與其天然產(chǎn)生環(huán)境相比，被在十個生物體中產(chǎn)生時(shí)，該多肽可不以不同的方式被處理。作為一種實(shí)施例，當(dāng)多肽由一種高等生物如酵母或優(yōu)選哺乳動物的細(xì)胞表達(dá)時(shí)常被糖基化。通常糖基化與Asn、Ser、Thr或羥基賴氨酸的氨基酸殘基有關(guān)。
因此，本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案涉及產(chǎn)生一種如上所述的多肽的方法，包括如下步驟(a)將如上所述的核苷酸序列插入一個表達(dá)載體中，(b)用步驟(a)中產(chǎn)生的載體轉(zhuǎn)化合適的宿主生物，(c)在合適的條件下培養(yǎng)步驟(a)中產(chǎn)生的宿主生物以表達(dá)該多肽，(d)收獲該多肽，并且(e)可任選地對該多肽做翻譯后修飾。
預(yù)期尤其是通過使用與九肽IT930Z特異性結(jié)合的抗體可實(shí)現(xiàn)對hIL-10或VIL-10的拮抗劑效果，并且可將此用于治療中以中和高濃度的IL-10。
另一方面，因此本發(fā)明涉及一種與本發(fā)明的多肽結(jié)合的抗體。
術(shù)語“抗體”指一種由哺乳動物產(chǎn)生的動物或更具體地由哺乳動物來源的屬于免疫系統(tǒng)的細(xì)胞在接觸本發(fā)明的多肽抗原之后做為應(yīng)答而產(chǎn)生。在本說明書和權(quán)利要求書中“一種抗體”被定義為基本由特異性結(jié)合的基本單位組成，其中基本單位由兩條重鏈和兩條輕鏈組成。但是從其最寬的方面來說，抗體概念還應(yīng)該包括如基本單位的二聚體或五聚體。
抗體的變異結(jié)構(gòu)域由可變和恒定序列組成。將結(jié)構(gòu)域的變異部分稱為抗體的獨(dú)特型?？贵w的這一部分負(fù)責(zé)與抗原相互作用，與抗原結(jié)合。在本文中，將術(shù)語“抗體”理解為完整的抗體分子或其任意片段。在產(chǎn)生過程之中和/或之后抗體可被片段化?？贵w可以在開始時(shí)以片段形式產(chǎn)生并使用其片段形式或者在將不同的片段連接之后再使用。特別感興趣的是本發(fā)明抗體的結(jié)合片段，例如Fab或Fab′片段。
抗體的獨(dú)特型(抗原結(jié)合)結(jié)構(gòu)是有抗原性的并且因此能產(chǎn)生抗獨(dú)特型結(jié)構(gòu)的特異抗體。得到的抗獨(dú)特型抗體叫抗獨(dú)特型抗體。這類抗體可模擬原始抗原的結(jié)構(gòu)并且因此可做為原始抗原使用。這類抗體可置換本發(fā)明原始多肽的原始抗原的部分或全部功能，可用性和特征。
本發(fā)明的抗體包括多克隆抗體以及單克隆抗體。
抗體或其片段可以是單特異(多克隆)類型的?？赏ㄟ^給合適的動物注射本發(fā)明的多肽的基本純化的制劑來制備單特異性抗體。可在第一次采血之后以合適的間隔接著進(jìn)行強(qiáng)化(booster)注射。在每次免疫之后5-7天對動物采血?？蛇x擇性地用標(biāo)準(zhǔn)的抗體純化技術(shù)從血清中分離抗體。
用于制備與本發(fā)明的多肽結(jié)合的抗體的動物優(yōu)選自兔、猴、綿羊、山羊、小鼠、大鼠、豬、馬和豚鼠。產(chǎn)生抗體細(xì)胞可以是脾細(xì)胞或外周血淋巴細(xì)胞。
可獲得針對該多肽的一個基本組分即一個表位的單克隆抗體或其片段?？墒褂秒s交瘤細(xì)胞系，或通過其克隆或亞克隆或通過攜帶來自雜交瘤細(xì)胞系的產(chǎn)生所說單克隆抗體的遺傳信息的細(xì)胞來用傳統(tǒng)技術(shù)制備單克隆抗體(Kohler和Milstein，1975)?？蓪a(chǎn)生所說單克隆抗體的細(xì)胞與合適的細(xì)胞系融合，并克隆得到的產(chǎn)生所說單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞而制備該單克隆抗體。另外，可通過將一個未融合的產(chǎn)生所說單克隆抗體的細(xì)胞系不死化而制得該單克隆抗體。最后從細(xì)胞生長培養(yǎng)基中收獲單克隆抗體。用于制備單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞可生長于體外或動物的體腔中。也可用重組DNA技術(shù)制備單克隆抗體或其片段(Huse等，1989)。
也可通過用本發(fā)明的多肽的未純化制劑來免疫合適的動物來制備單克隆抗體。應(yīng)該對得到的分泌單克隆抗體的雜交瘤克隆的與該多肽或其類似物的結(jié)合能力進(jìn)行篩選。
在不需要高的特異性時(shí)，該抗體可以是多克隆抗體。例如，如上文Harboe和Ingild所述可獲得多克隆抗體。更具體地說，當(dāng)想得到多克隆抗體時(shí)，優(yōu)選在加入了合適的佐劑如弗氏完全或不完佐劑之后，將本發(fā)明的多肽或其類似物注射入動物體內(nèi)。對動物定期采血，例如每周一次，并將得到的血液分離成含血清級分的抗體，并可任選地將級分進(jìn)行常規(guī)的抗體純化步驟，和/或進(jìn)行包含使用該純化多肽或其類似物的純化步驟。
該抗體還可以是一種針對抗獨(dú)特型抗體的抗-抗獨(dú)特型抗體，它是針對一種可與抗原上的表位反應(yīng)的抗體的位點(diǎn)的。可用如上所說的制備單克隆或多克隆抗體的類似方法制備抗獨(dú)特型抗體。
本發(fā)明范圍之內(nèi)的抗體是可與如上所定義的物質(zhì)或多肽結(jié)合的抗體，具體地是一種與具有氨基酸序列Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn的多肽特異結(jié)合的抗體。
因此從較大的方面說，本發(fā)明涉及一種能中和一種或多種a)到j(luò))的hIL-10活性的物質(zhì)，即具有hIL-10拮抗劑活性，如具有這些特征的一種抗體。業(yè)已知一種能與IL-10-特異結(jié)合，并能阻斷LPS刺激的單核細(xì)胞內(nèi)源性的IL-10的產(chǎn)生的單克隆抗體19F1(82)，參見表1(82)。該抗體識別天然折疊的IL-10，但并不必需是完整的功能性的結(jié)構(gòu)域；但是該抗體不與IT9302特異性地結(jié)合。
本發(fā)明的范圍內(nèi)還有一種包含這類物質(zhì)的藥用組合物以及包含本發(fā)明的物質(zhì)或多肽的藥用組合物。
本發(fā)明的一個重要方面涉及一種包含一種具有如上所述的hIL-10，激動劑或hIL-10拮抗劑活性的物質(zhì)的藥用組合物以及一種藥學(xué)上可接受的賦形劑。該組合物可包含如純化的合成蛋白質(zhì)或純化的重組多肽，單克隆或多克隆抗體或任何其它的滿足a)-j)標(biāo)準(zhǔn)的物質(zhì)，或如果具有hIL-10拮抗劑活性，能中和a)-j)的一種或多種hIL-10活性的物質(zhì)。
本發(fā)明所用的IL-10激動劑或拮抗劑可在藥學(xué)上可接受的載體中制成制劑，如鹽溶液，硫酸緩沖鹽溶液(PBS)，林格氏溶液，左旋糖/鹽溶液，Hank’s液，和葡萄糖等。該組合物可含藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)以接近生理環(huán)境，如緩沖劑，張力調(diào)節(jié)劑，濕潤劑和去污劑等。添加劑還可包括另外的活性成分如殺菌劑，或穩(wěn)定劑。給患者的給藥量將根據(jù)給藥的種類，給藥的目的如治療或預(yù)防宿主的狀態(tài)，給藥方式等而變化。
一般來說該藥用組合物是用于透皮或胃腸外給藥的，如靜脈內(nèi)、皮下、或肌內(nèi)。也需要口服給藥方式并或通過改進(jìn)該組合物以通過胃環(huán)境而提供組合物可用于預(yù)防和/或治療處理。優(yōu)選地，該藥用組合物是通過靜脈內(nèi)給藥的。因此，本發(fā)明提供了包含IL-10激動劑或拮抗劑的物質(zhì)，其中這些物質(zhì)是溶解或懸浮于可接受的載體，優(yōu)選含水載體中的。這些組合物可用常規(guī)的滅菌技術(shù)滅菌或者可過濾除菌。
得到的水溶液可被包裝以供使用，或凍干在給藥之前將凍干制品與無菌水性載體結(jié)合。IL-10激動劑或拮抗劑也可與第二種生物活性劑一起施用，如常規(guī)的化療劑、這類藥劑包括但不限于長春新堿、柔紅霉素、L-門冬酰胺酶，米托蒽酮和安吖啶。
在治療應(yīng)用中，給患者施用有效量的藥用組合物以得到所希望的效果，稱為“治療有效劑量”。IL-10激動劑或拮抗劑的治療有效劑量可根據(jù)，例如治療的特殊用途，用藥方式，患者的健康狀況，以及臨床醫(yī)生的判斷而變化。例如，對于70公斤的患者來說，連接輸注的典型劑量是約500ng～800μg/天，優(yōu)選約10～300μg。典型劑量在700ng/kg/天和10μg/kg/天之間。
藥物制劑中IL-10激動劑或拮抗劑的濃度變化很大，即從約10μg到約5mg/ml，優(yōu)選在約100μg和約2mg/ml之間。通常根據(jù)所選定的給藥方式，而根據(jù)流體體積，粘度等選擇濃度。因此，一個典型地靜脈內(nèi)輸注的藥用組合物可制成在250ml右旋糖/鹽溶液中含2.5mg IL-10激動劑或拮抗劑。
對固體組合物，可使用傳統(tǒng)的非毒性固體載體，例如包括藥用級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石粉、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。對口服給藥來說，可通過摻入通常用的賦形劑如上面列的這些載體，和通常10～95％的活性組分，即IL-10激動劑或拮抗劑物質(zhì)，優(yōu)選75～25％來形成藥學(xué)上可接受的非毒性的組合物。
對氣霧劑給藥來說，優(yōu)選提供的IL-10激動劑或拮抗劑是與表面活性劑和推進(jìn)劑(propellant)一起精確分裝的形式。IL-10激動劑或拮抗劑的典型百分比是0.01-20％(重量)，優(yōu)選1-10％。表面活性劑當(dāng)然必需是無毒性的，優(yōu)選可溶于推進(jìn)劑中。這類藥劑的代表是含6-22個碳原子的脂肪酸的酯或部分酯，如己酸、辛酸、月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、油硬脂酸(olesteric)和油酸同脂肪族多元醇或其環(huán)酐例如乙二醇，甘油、赤蘚醇、arbitol、甘露醇、山梨糖醇、由山梨糖醇衍生而來的壬醇酐的酯，以及這些酯的聚氧乙烯和聚氧丙烯衍生物?？墒褂没旌硝ト缁旌系幕蛱烊坏母视王?。
表面活性劑占組合物的0.1-20％(重量)，優(yōu)選為0.25-5％。通常用推進(jìn)劑來平衡(補(bǔ)足)組合物。通常液化的推進(jìn)劑在周圍環(huán)境下是氣體，并在一定力下被壓縮。在合適的液化推進(jìn)劑中有含至多5個碳原子低級鏈烷，例如丁烷和丙烷，并優(yōu)選氟代的或氟氯代的鏈烷。也可使用上述物質(zhì)的混合物。在生產(chǎn)氣霧劑時(shí)，在帶有合適的閥門的容器中充滿適宜的推進(jìn)劑，其中含有細(xì)碎的多肽和表面活性劑。因此將組分保持在高壓下，直到通常閥門的作用將其釋放。
為了增大血清半壽期，可將IL-10拮抗劑或激動劑囊化，導(dǎo)入脂質(zhì)體的腔中，制成膠體，或者應(yīng)用其它常規(guī)技術(shù)以延長多肽的半壽期。因此，在特定的實(shí)施方案中，IL-10的激動劑或拮抗劑可被包于脂質(zhì)體中。如例如(83)、(84)、(85)和(86)中所述，有多種方法可制備脂質(zhì)體。
因此，本發(fā)明的一個重要實(shí)施方案涉及該物質(zhì)在減少或中和hIL-10和/或VIL-10的高濃度中的應(yīng)用，例如該具有IL-10拮抗劑牲的物質(zhì)在用于治療或預(yù)防卵巢癌和/或艾滋病的藥用組合物的制備的應(yīng)用(87、19)。
在本發(fā)明的范圍之內(nèi)還有治療和/或預(yù)防卵巢癌和/或艾滋病的方法，該方法包括，如果患者需要，給其施用治療或預(yù)防有效量的hIL-10拮抗劑物質(zhì)以及一種具有hIL-10拮抗劑活性的化合物在制備用于治療或預(yù)防卵巢癌和/或艾滋病的藥用組合物中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的該物質(zhì)的應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明，如上所述已發(fā)現(xiàn)IT9303以及其類似物和變異體在抑制細(xì)胞因子的作用中有用，而已知這些因子與前述病理情況病理性地有關(guān)。
因此，期望運(yùn)用本發(fā)明的多肽或其類似物或其衍生物的治療有效性，并且應(yīng)該研究在所有期望hIL-10和/或IPAP的治療有效性中的疾病中的其治療的有效性(參見上文表3)。
本發(fā)明的非常重要的多個實(shí)施方案涉及本發(fā)明的物質(zhì)或多肽在治療或預(yù)防一種或多種上述表3中的疾病中用途，涉及根據(jù)本發(fā)明的物質(zhì)或多肽在制備用于治療或預(yù)防上述表3中的一種或多種疾病的藥用組合物中的用途，以及涉及治療和/或防治一種或多種上面表3中的疾病的方法，該方法包括給有需要的患者施用根據(jù)本發(fā)明的治療上或預(yù)防上有效量的物質(zhì)或多肽。
因此本發(fā)明的一個重要方面是IT9302或其功能性的衍生物在制備用于基本抑制中的細(xì)胞因子相關(guān)生物效應(yīng)的用于預(yù)防或治療與細(xì)胞因子系統(tǒng)的紊亂相關(guān)的疾病的藥用組合物中的應(yīng)用，細(xì)胞因子有例如，淋巴因子、白介素、單核因子、化學(xué)因子、干擾素、集落刺激因子、前列腺素和/或白三烯，其中細(xì)胞因子系統(tǒng)的紊亂有例如淋巴因子、白介素、單核因子、化學(xué)因子、干擾素或集落刺激因子系統(tǒng)的紊亂和/或前列腺素和/或白三烯系統(tǒng)的紊亂。如本文所采用的術(shù)語“藥用組合物包括上文所詳述的任何適于人用的組合物。
本發(fā)明特別涉及IT9302或其功能性衍生物的如下用途。- 基本抑制人細(xì)胞因子相關(guān)的生物效應(yīng)以預(yù)防或治療與細(xì)胞因子系統(tǒng)紊亂相關(guān)的疾病；和/或- 基本抑制人淋巴因子相關(guān)的生物效應(yīng)以預(yù)防或治療由淋巴因子系統(tǒng)紊亂相關(guān)的疾?。缓?或- 基本抑制人白介素相關(guān)的生物效應(yīng)以預(yù)防或治療與白介素系統(tǒng)紊亂相關(guān)的疾??；和/或- 基本抑制人單核因子相關(guān)的生物效應(yīng)以預(yù)防或治療與單核因子系統(tǒng)紊亂相關(guān)的疾??；和/或- 基本抑制人化學(xué)因子相關(guān)的生物效應(yīng)以預(yù)防或治療與化學(xué)因子系統(tǒng)紊亂相關(guān)的疾??；和/或- 基本抑制人淋巴因子相關(guān)的生物效應(yīng)以預(yù)防或治療與淋巴因子系統(tǒng)紊亂相關(guān)的疾病；和/或- 基本抑制人干擾素相關(guān)的生物效應(yīng)以預(yù)防或治療與干擾素系統(tǒng)紊亂相關(guān)的疾??；和/或- 基本抑制人集落刺激因子相關(guān)的生物效應(yīng)以預(yù)防或治療與集落刺激因子系統(tǒng)紊亂相關(guān)的疾病；和/或- 基本抑制人前列腺素相關(guān)的生物效應(yīng)以預(yù)防或治療與前列腺素系統(tǒng)紊亂相關(guān)的疾??；和/或- 基本抑制人白三烯相關(guān)的生物效應(yīng)以預(yù)防或治療與白三烯系統(tǒng)紊亂相關(guān)的疾病；和/或


圖1示對推測的mIL-10、hIL-10和BCRF1的氨基酸序列的比較。相一致的氨基酸序列用堅(jiān)伐標(biāo)出。
圖2示含9個氨基酸的IL-10的羧基末端多肽序列，并比較了豬，人，BCRF1和小鼠的蛋白質(zhì)。
圖3是證明IT9302通過純化的培養(yǎng)的人單核細(xì)胞抑制的IL-8的自發(fā)產(chǎn)生的圖解。
圖4是表明IT9302抑制IL-1(1ng/ml)誘導(dǎo)的人外周血單核細(xì)胞IL-8的產(chǎn)生的圖解。
圖5示IT9302刺激的人單核細(xì)胞IRAP的產(chǎn)生。
圖6示IL-10刺激的人單核細(xì)胞IRAP的產(chǎn)生。
圖7示IT9302對CD8+T細(xì)胞的趨化活性。
圖8示IT9302對DC8+T細(xì)胞的脫敏作用，結(jié)果導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞對IL-10(10ng/ml)誘導(dǎo)的趨化作用的不應(yīng)答性。
圖9示IT9302對IL-8活性的抑制。
圖10圖解表明IT9302抑制MCAF/MCP-1誘導(dǎo)的單核細(xì)胞趨化作用。
圖11用ECL-Western印跡表明CD4+T細(xì)質(zhì)部分中IL-4的產(chǎn)生。
圖12用ECL-Western印跡表明在人混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)胞質(zhì)部分中TNF-α的產(chǎn)生。TNF-α的Western印跡如在材料和方法中描述的IL-4那樣進(jìn)行，但是使用兔抗人TNF-α抗體(Pepro Tech.Inc.，London，England)和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(產(chǎn)品號P217，DakoDenmark)。
圖13示IT9302對LPS誘導(dǎo)的休克和白細(xì)胞減少癥的調(diào)節(jié)，以總白細(xì)胞計(jì)數(shù)表示。
實(shí)施例材料和方法細(xì)胞因子和化學(xué)引誘物重組hIL-10購自Pepro Tech.Inc.，NJ(目錄號200 10)。重組hIL-1β和重組hIL-8由Dainippoa pharmaceutical Company，Osaka，Japan贈送。根據(jù)鱟變形細(xì)胞溶解物試驗(yàn)(Sigma E-TOXATEKit Cat.No.210-A1)，培養(yǎng)用培養(yǎng)基是不含LPS的RPMI 1640GBCO。rhMCAF/MCP-1由Japan Kanazawa Kouji Matsushima教授贈送。
白細(xì)胞趨化作用試驗(yàn)T細(xì)胞趨化作用以表達(dá)CD4或CD8抗原為特征的CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞系純化自正常供體的肝素血。因此，通過將100ml血液與Hanks平衡鹽溶液(HBSS)1∶1稀釋，并且然后將細(xì)胞置于LmphopaeTM(NycomedPharma，Oslo，Norway)上，接著2000rpm梯度離心20分鐘以從肝素中純化外周血單核細(xì)胞(PBMC)。將單核細(xì)胞在HBSS中洗3次并將細(xì)胞沉淀稀釋在4ml含1％胎牛血清的HBSS中，并且通過使用用抗CD4或CD8抗原的單克隆抗體包被的Dynabeads(Dynabeads M-450 CD4.Cat，No.111，16，Dynabeads M-450.CD8 Cat No.111，08，DETACHa 13EHD Cat.No.125.04)在4℃分選。珠子細(xì)胞比是10∶1，溫育時(shí)間是1小時(shí)。根據(jù)生產(chǎn)商的說明用加入多克隆抗小鼠抗體將珠子解離下來。
如已前所描述的(74；參見參考文獻(xiàn)13和14)趨化作用試驗(yàn)為48孔的微室技術(shù)(Neuroprobe Rockville，MD)。用含1％過濾除菌的胎牛血清將化學(xué)引誘物稀釋在RPMI 1640中(GIBCO.Cat.No.61870-010)，并放于下面的25μl的室中。在測定T細(xì)胞趨化作用時(shí)，將T細(xì)胞(5×106/ml)懸浮在培養(yǎng)基中并取50μl放于上面的室中，該室通過一個5μm大小孔的包被有IV型膠原(Sigma.Cat.No.C0543)的不含聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯濾膜與下面的室相隔離。讓細(xì)胞在37℃5％CO2下遷移2小時(shí)。小心取出濾膜并將其固定于70％甲醇中，在考馬斯亮蘭中染色5分鐘。通過一個與一個數(shù)字分析用的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)相連的顯微鏡上的視頻相機(jī)(Video Camera)測定其面積而計(jì)數(shù)吸附到濾膜下表面上的細(xì)胞數(shù)，并且該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)由客觀確定趨化遷移的軟件支持。在12,000和13,000細(xì)胞之間有約5％T細(xì)胞自發(fā)遷移；這在冬天之間有變化，但在同一天的實(shí)驗(yàn)中變化很小。如前所述(參考文獻(xiàn)3和14，因此選擇樣品中遷移相細(xì)胞數(shù)和陰性對照中反映自發(fā)遷移的細(xì)胞的之間的比率作為報(bào)告結(jié)果。該比率稱為趨化指數(shù)(CI)。所有的樣品分析重復(fù)三次而且在估測面積的中間值之前在三個區(qū)域中測定每孔中的細(xì)胞遷移。在一些實(shí)驗(yàn)中趨化作用膜未用膠原包被，并且在本試驗(yàn)系統(tǒng)中因此遷移細(xì)胞將會掉到趨化作用室的下面的孔的底部。
在一個實(shí)驗(yàn)中，如上所述通過檢測加入到下室中的一系列稀釋的IT9302并評測趨化作用對IT9302對CD8+T細(xì)胞的趨化活性進(jìn)行了測定。
在第二個實(shí)驗(yàn)中，通過在趨化作用之前30分鐘向靶細(xì)胞中加入IT9302以研究IT9302對CD8+T細(xì)胞作為對rhIL-10(10ng/ml)的應(yīng)答遷移作用的脫敏作用。IT9302以系列濃度加入并如上所述對rhIL-10的趨化反應(yīng)進(jìn)行評測。
在第三個實(shí)驗(yàn)中，在進(jìn)行趨化作用之前30分鐘通過向靶細(xì)胞中加入IT9302而研究了其抑制CD4+T細(xì)胞對rhIL-8(10ng/ml)的趨化反應(yīng)的能力。如上所述加入系列濃度的IT9302并評測rhIL-8的趨化反應(yīng)。單核細(xì)胞趨化作用使用如上述T細(xì)胞中所描述的同樣的Boyden室設(shè)備對單核細(xì)胞的趨化作用進(jìn)行測定。將化學(xué)引誘物MCAF/MCP-1稀釋在含0.5％BSA的RPMI 1640培養(yǎng)基中并以10ng/ml的濃度加入到下室中。如上所述從正常人PBMC用常規(guī)的塑料粘附技術(shù)純化獲得的單核細(xì)胞被懸浮在含0.5％BSA的RPMI1640培養(yǎng)基中，并且然后在不同濃度的IT9302存在下溫育30分鐘。接下來，以106細(xì)胞/ml的濃度將細(xì)胞加入到上面的趨化作用室中。上面的和下面的室被一個有8μm大小的孔的不含聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯濾膜(Nucleopore，Pleasanton，CA)隔離開。將該等室在37℃溫育90分鐘。如上所述處理含遷移細(xì)胞的濾膜并根據(jù)上述的方法計(jì)算趨化指數(shù)。
正常人外周單核細(xì)胞(PBMC)IL-8的產(chǎn)生PBMC純化自肝素化的正常人供體血。接著用LymphoprepTM(Nycomed Pharma，Oslo，Norway)進(jìn)行梯度離心，單核細(xì)胞被在不含LPS的RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco.Cat.No.6187-010)中稀釋為2×106細(xì)胞/ml，其中培養(yǎng)基中含有1％的過濾除菌的熱滅活的胎牛血清和青霉素(10,000IE/ml)、鏈霉素(10mg/ml)以及慶大霉素(2.5mg/ml)。將細(xì)胞培養(yǎng)在24孔Nunc Micro板(Nunc，Oenmark)上并在不同濃度的IT9302(1，1μg，100ng，10ng，1ng，0.1ng，0.01ng/ml)的存在下培養(yǎng)24小時(shí)。在培養(yǎng)24小時(shí)后，再加入1個劑量的IT9302并在1小時(shí)后向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入r-hIL-1β(1ng/ml)。在總共培養(yǎng)48小時(shí)后收集上清，并用IL-8 ELISA試劑盒(DainipponPharmaceutical Co.Ltd.Osaka，Japan)對分泌的IL-8的濃度進(jìn)行測定。簡單地說，在20℃在一個微板振蕩器上(micro-plate shaker)將標(biāo)準(zhǔn)和細(xì)胞溫育1小時(shí)并重復(fù)一次。然后在清洗之后，加入二抗1小時(shí)，接著與過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG保溫1小時(shí)。在洗滌之后，用鄰苯二胺顯色。30分鐘后用1.6N磺酸終止反應(yīng)。在ELISA讀數(shù)儀(reader)中在490nm測定光密度(OD)。通過一個未知的對IL-8標(biāo)準(zhǔn)濃度的光吸收的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出IL-8的濃度。
IRAP濃度的測定如上所述純化PBMC。將PBMC培養(yǎng)在RPMI 1640，10％無菌的熱滅活的胎牛血清中(含青霉素10,000IE/ml，鏈霉素10mg/ml，慶大霉素2.5mg/ml)并且細(xì)胞濃度是5×106細(xì)胞/ml。然后用標(biāo)準(zhǔn)的塑料粘附技術(shù)純化單核細(xì)胞。然后在含2％FCS(2.5×106細(xì)胞/ml)和不同稀釋度的rhIL-10或IT9302 RPMI1640中培養(yǎng)單核細(xì)胞。將細(xì)胞刺激24小時(shí)并收集上清供IRAP測定之用。使用購自R&D SystemsEurope Ltd.(Cat.No.DRA00，Abingdon，Oxon，UK)的人IL-lra Quantikin免疫測試試劑盒進(jìn)行IRAP ELISA。
單核細(xì)胞上表達(dá)的II型MHC抗原的測定如上所述純化PBMC并用塑料粘附技術(shù)分離單核細(xì)胞。然后將單核細(xì)胞以3×106細(xì)胞/ml的濃度·培養(yǎng)在含10,000IE/ml青霉素，10mg/ml鏈霉素，2.5mg/ml慶大霉素的含2％FCS的RPMI1640培養(yǎng)基中。在微孔中(Nunc，Denmark)用100ng/ml rhIL-10，或IT9302，1μg/ml，100ng/ml，10ng/ml刺激40小時(shí)。刺激結(jié)束后，除去上清并在-20分選、分選是用包被HLA II型β鏈的單克隆抗體(Cat.No.210.03)的50μl/ml Dynakeads M450進(jìn)行的。在溫育20分鐘后，將細(xì)胞用含1％FCS的冷的HBSS洗3次并在一個磁性分離裝置上收集。將細(xì)胞稀釋在上述的緩沖液中并用甲烯蘭染色，并計(jì)數(shù)玫瑰樣細(xì)胞(含帶有HLAII型mAb的Dynkeads的細(xì)胞)。
CD4+T淋巴細(xì)胞IL-4產(chǎn)生的測定細(xì)胞培養(yǎng)物CD4+T淋巴細(xì)胞純化自肝素化的正常人血。在LymphoprepTM(Nycomed.pharma，Oslo，Norway)梯度離心之后，進(jìn)一步在4℃將單核細(xì)胞用包被有抗CD4的單抗的Dynabeads(Dynal As，Norway)分選。加入多克隆抗小鼠抗體將磁珠脫離下來(Dynal A，Norway)。用FACS分析所篩選的陽性細(xì)胞純度大于99％。當(dāng)檢測IL-8刺激的T細(xì)胞中IL-4的從頭產(chǎn)生時(shí)，T細(xì)胞被以5×106細(xì)胞/ml培養(yǎng)在不含UPS的RPMI1040中(Gibco.Cat.No.61870-010)，其中培養(yǎng)基含1％過濾除菌的熱滅活牛血清(FCS)，青霉素(10,000.IU/ml)，鏈霉素(10mg/ml)和慶大霉素(2.5mg/ml)。用rIL-8(100ng/ml)，rIL-10(100ng/ml)，IT9302(10ng/ml)和IFN-γ(10ng/ml)將T細(xì)胞刺激3天。重組人IL-8(rhIL-8)由Dainippon PharmaceuticalCo.Ltd.Osaka，Japan)贈送，而IFN-γ購自BoehringerIrgelheim Am.Rhein，Germary.為了獲得對IL-8刺激的特異抑制，使用了一個抗IL-8的中和單克隆抗體(WS.4)由Or.k.Matsushimn贈送。(重組IL-10購自Pepro.Teeh.Ine.(London，England))。
凝膠電泳用的細(xì)胞材料和培養(yǎng)上清的制備在2000rpm離心5分鐘分離培養(yǎng)的T細(xì)胞和培養(yǎng)基。將上清冷凍干燥并溶于100μl裂解緩沖液中。將細(xì)胞直接重懸于100μl凝膠裂解緩沖液(9)中。將該材料保存在-80℃直到再次使用。
CD4+T細(xì)胞來源的蛋白質(zhì)的ECL-Western印跡細(xì)胞或冷凍干燥的細(xì)胞培養(yǎng)上清被用于IL-4蛋白含量測定。通過印跡將來自單向15％SDS-PAGE凝膠的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到Hybond-ECL醋酸纖維素膜上(Amersham.RPN 2020D，UK)并用含0.1％Tweer-20的5％牛血清的蛋白(Sigma)的Tris緩沖鹽溶液(pH7.8)封閉。然后用多克隆水平抗人IL-4抗體(R&D.Systems，UK)溫育該印跡并接著使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(Cat.No.RPN 2106 ECL，Amersham，UK)，并，將膠片(Kodak X-OMAT-S，USA)曝光90秒鐘檢測免疫染色。
IT9302氨基酸序列的特異性對IT9302序列與其它已知蛋白的可能的同源性的檢索是在EM130蛋白數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行的，這得到了Institute for Medical Biochemistry，University of Aarnus，Denmark，Dr.Henrik.Leffers的熱情幫助。
IT9302的氨基酸序列的特異性根據(jù)1994年6月10日做的來自EMBO蛋白數(shù)據(jù)庫的信息，IT9302與人IL-10的序列有100％的同源性，并與Epstein-Barr病毒來源的與vIL-10類似的蛋白的序列有75％的同源性。其它的病毒蛋白如噬菌體T7和蕃茄黃葉卷曲病毒分別發(fā)現(xiàn)有75％和85％的一致性。結(jié)果本發(fā)明的概念產(chǎn)生于1992年10月和12月，當(dāng)時(shí)根據(jù)如上所述的策略設(shè)計(jì)了一個稱為IT9302的九肽，并且在1992年11月27日確定并訂了每個原型(IT9302)的化學(xué)合成訂單。期望該九肽能表現(xiàn)出模擬IL-10類似活性的免疫調(diào)節(jié)劑活性，并在這期間計(jì)劃了下面的對照實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例)。由發(fā)明人付費(fèi)訂貨由Carlbiotech.Ltd.A/s，Denmark用自動多肽合成內(nèi)進(jìn)行IT9302的化學(xué)合成。然后在HPLC對該蛋白進(jìn)行純化并確定純度大于95％、這就證實(shí)了合成的產(chǎn)物與發(fā)明人在1992年10和11月設(shè)計(jì)的IT9302是一致的。實(shí)施例1IT9302誘導(dǎo)的對人單核細(xì)胞自發(fā)的IL-8的產(chǎn)生的抑制測試的操作如“正常人外周血單核細(xì)胞(PBMC)IL-8的產(chǎn)生”中所述。用塑料粘附技術(shù)純化單核細(xì)胞并被以3×106細(xì)胞/ml刺激40小時(shí)。如圖3所示，IT9302抑制單核細(xì)胞IL-8的產(chǎn)生，并且0.1ng/mlIT9302抑制了體外IL-8自發(fā)產(chǎn)生的35％。在培養(yǎng)1天后細(xì)胞的存活性通常超過80％并且在本實(shí)施例和下面的實(shí)施例中加入0.1到1000ng/ml之間任意濃度的IT9302(IT9302分子量1,127道爾頓，rhIL-10推測分子量，18,4000道爾頓)不影響存活性。實(shí)施例2IT9302誘導(dǎo)的抑制IL-1β誘導(dǎo)的人外周血單核細(xì)胞(PBMC)IL-8的產(chǎn)生該測試的操作如“正常人外周血單核細(xì)胞(PBMC)IL-8的產(chǎn)生”中所述。如圖4所示，IT9302以劑量依賴的方式抑制IL-1β體外誘導(dǎo)的人外周血單核細(xì)胞IL-8的產(chǎn)生。IT9302對IL-8產(chǎn)生的抑制在濃度0.01到100ng/ml之間達(dá)到平臺期。實(shí)施例3IT9302誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞白介素-1受體拮抗劑蛋白(IRAP)的產(chǎn)生該測試的操作如“IRAP濃度的測定”中所述。如圖5所示，IT9302以劑量依賴的方式誘導(dǎo)人單核細(xì)胞IRAP的產(chǎn)生。當(dāng)IT9302濃度大于10ng/ml時(shí)產(chǎn)量急劇增加。圖6示rhIL-10對IRAP的誘導(dǎo)，并且因?yàn)閔IL-10比IT9302高大約20倍，等摩爾的10ng/mlIT9302等于200ng/mlIL-10。因此在較低的濃度時(shí)IT9302和rhIL-10的效力是相仿的并且對IRAP的誘導(dǎo)是大約相等的。當(dāng)IT9302濃度超過10ng/ml，IRAP的誘導(dǎo)急劇增加并且達(dá)到了約700ng/ml的水平。實(shí)施例4IT9302對人CD8+T淋巴細(xì)胞的趨化效應(yīng)實(shí)驗(yàn)的操作如“白細(xì)胞趨化作用測試”中所述。如圖7所示，IT9302誘導(dǎo)CD8+T淋巴細(xì)胞體外的趨化遷移，但對CD4+T細(xì)胞卻無作用(數(shù)據(jù)未出示)。而且，本實(shí)驗(yàn)中所表明的IT9302的效力與前面所示的rhIL-10的效力相仿(參考文獻(xiàn)14)。實(shí)施例5IT9302脫敏人CD8+T細(xì)胞導(dǎo)致對rhIL-10的非應(yīng)答性實(shí)驗(yàn)的操作如“白細(xì)胞趨化作用測試中所述。在測試CD8+T細(xì)胞對rhIL-10的趨化應(yīng)答之前30分鐘向其懸液中加入IT9302。如圖8中所示，用IT9302預(yù)保溫細(xì)胞導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞對rhIL-10應(yīng)答的抑制。這表明IT9302可影響IL-10與IL-10受體的結(jié)合。實(shí)施例6IT9302抑制CD4+T淋巴細(xì)胞對IL-8的趨化應(yīng)答實(shí)驗(yàn)的操作如“白細(xì)胞趨化作用測試”中所述。如圖9所示，將IT9302在加入人CD4+T淋巴細(xì)胞的懸液之后以劑量依賴的方式抑制CD4+T細(xì)胞對IL-8的應(yīng)答。實(shí)施例7IT9302抑制人單核細(xì)胞對MCAF/MCP-1的趨化應(yīng)答實(shí)驗(yàn)如“單核細(xì)胞趨化作用”中所述的操作進(jìn)行。如圖10所示，IT9302在被加入到人單核細(xì)胞的懸液中之后以劑量依賴的方式抑制單核細(xì)胞對MCAF/MCP-1的趨化應(yīng)答。實(shí)施例8IT9302不抑制人單核細(xì)胞上II型MHC分子的表達(dá)該試驗(yàn)的操作如材料和方法中所述并如下文表4所示rhIL-10抑制II型MHC的表達(dá)但I(xiàn)T9302卻不抑制。
表4刺 激 玫瑰樣單核細(xì)胞的數(shù)目0 12.0±1.0×104100ng/mlrhIL-10 4.6±1.4×1041μg/mlIT9302 11.0±3.0×104100ng/mlIT9302 14.4±2.4×10410ng/mlIT9302 11.2±3.2×104與試驗(yàn)相關(guān)的討論本數(shù)據(jù)證明了合成的九肽IT9302對反映促炎癥活性的過程；包括IL-8的產(chǎn)生以及單核細(xì)胞和/或T細(xì)胞遷移的劑量依賴的抑制效應(yīng)。因此，IT9302能抑制過夜培養(yǎng)的人單核細(xì)胞自發(fā)的IL-8的產(chǎn)生。這可解釋為對IL-8 MRNA產(chǎn)生和/或后續(xù)的蛋白產(chǎn)生和或釋放的直接的抑制效應(yīng)。另外的解釋機(jī)制可基于這樣一個事實(shí)體外培養(yǎng)的單核細(xì)胞表達(dá)并產(chǎn)生IL-1，并因此引起IL-8的產(chǎn)生。這一點(diǎn)得到已證明的IT9302強(qiáng)烈誘導(dǎo)單核細(xì)胞IRAP的產(chǎn)生的事實(shí)的支持。因此IT9302還可通過干擾IL-1的活性而抑制自發(fā)的IL-8的產(chǎn)生。IT9302誘導(dǎo)的觀察到的IRAP看來誘導(dǎo)具有生物活性的IRAP。因?yàn)榧尤氲脚囵B(yǎng)物中的IT9302可拮抗IL-1誘導(dǎo)的IL-8的產(chǎn)生，但只有在IL-1加入培養(yǎng)物之前至少16小時(shí)加入才有效。這即意味著IT9302通過誘導(dǎo)IRAP的產(chǎn)生而抑制IL-1誘導(dǎo)的IL-8的產(chǎn)生，IRAP可接著通過其受體阻斷IL-1的活性。如果IT9302直接引起IL-8的產(chǎn)生，那么可預(yù)期在加入IL-1之前1小時(shí)向培養(yǎng)物中加入IT9302應(yīng)該能抑制IL-8的產(chǎn)生，但事實(shí)不是這樣(數(shù)據(jù)未出示)。因此所觀察到的IT9302對IL-8產(chǎn)生的抑制更可能是對IRAP產(chǎn)生的誘導(dǎo)而不是對IL-8產(chǎn)生的直接抑制。hIL-10也具有IT9302的這些功能表明IT9302具有IL-10類似的活性。IT9302還通過抑制CD4+T細(xì)胞應(yīng)答IL-8的遷移的能力而模擬IL-10的活性。由于IL-8與多種不同狀態(tài)的炎癥相關(guān)，并且由于CD4+T細(xì)胞在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫炎癥如皮膚過敏反應(yīng)的侵入早期出現(xiàn)，這些特征可被證明在對T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫炎癥中有顯著的治療價(jià)值。
所證明的IT9302對CD8+T細(xì)胞趨化活性也是與IL-10的這樣的活性一致的，并且因此IT9302可通過其結(jié)束T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫炎癥的抑制子活性而激活T細(xì)胞群體。因此根據(jù)上述實(shí)施例所證明的，IT9302在IL-10和/或IRAP具有治療價(jià)值的疾病中也具有治療價(jià)值。另外IT9302可對據(jù)信其中IL-8和/或MCAF和/或IL-1病理作用的疾病中具有治療價(jià)值。實(shí)施例9IT9302和IL-10誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞中IL-4的產(chǎn)生背景和IL-10一樣，IL-4也是TH2型CD4+T細(xì)胞的產(chǎn)物。據(jù)觀察重組的人IL-10誘導(dǎo)培養(yǎng)的人CD4+T細(xì)胞IL-4的產(chǎn)生。這意味著IL-10，除了其自身的免疫抑制功能之外，還可誘導(dǎo)另一種免疫抑制細(xì)胞因子，IL-4的產(chǎn)生。因此檢測了是否IT9302也誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞IL-4的產(chǎn)生。因此，如“T細(xì)胞趨化作用方法”中所述純化，并且如“CD4+T淋巴細(xì)胞IL-4產(chǎn)生的測定”一書中所述培養(yǎng)的CD4+T細(xì)胞，被IT9302(10ng/ml)或IL-10(100ng/ml)刺激3天。收集胞質(zhì)部分并用Western印跡(圖11)和山羊抗人IL-4多克隆抗體分析其IL-4含量。
如圖11中所示，發(fā)現(xiàn)IL-10以及IT9302都誘導(dǎo)培養(yǎng)的人CD4+T細(xì)胞IL-4的產(chǎn)生。實(shí)施例10IT9302抑制混合白細(xì)胞反應(yīng)(MLR)中TNF-α的產(chǎn)生已經(jīng)證明混合白細(xì)胞反應(yīng)部分依賴反應(yīng)中TNF-α的產(chǎn)生。已證明IT9302不明顯降低MLR，但卻發(fā)現(xiàn)在MLR中，TNF-α的產(chǎn)量顯著減少。
因此，MLR的操作是純化人白細(xì)胞并將來自同源供體的一百萬細(xì)胞/ml培養(yǎng)4天。在建立培養(yǎng)物之前，將一組細(xì)胞用β射線照射2分鐘。如“CD4+T淋巴細(xì)胞IL-4產(chǎn)生的測定”一節(jié)中所述純化胞質(zhì)蛋白部分，并用兔抗人TNF-α抗體進(jìn)行Western印跡。
如圖12所示，在人混合白細(xì)胞反應(yīng)中觀察到明顯地的TNF-α產(chǎn)量的減少。實(shí)施例11IT9302對LPS誘導(dǎo)的豬休克和白細(xì)胞減少癥的調(diào)節(jié)由于發(fā)現(xiàn)IT9302調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，包括TNF-α和IL-8，并得到發(fā)表物的豬IL-10序列的支持(Blancho等，1995)(參見圖2羥基末端肽的同源性)，因此測試了IT9302是否能調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的豬白細(xì)胞減少癥(圖13)。
在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，檢測了靜脈內(nèi)注射0.1mg/kg IT9302對豬靜脈內(nèi)注射的2μg/kg LPS的效應(yīng)的調(diào)節(jié)情況(N＝3)。在注射LPS之前30分鐘注射IT9302，并如圖13所述采血樣。對總白細(xì)胞計(jì)數(shù)及不同的細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行確定，并以這些結(jié)果為基礎(chǔ)計(jì)算出總的嗜中性白細(xì)胞的數(shù)目。
如已證明的，已觀察到注射LPS引起暫時(shí)的白細(xì)胞減少癥。但如圖所示，注射IT9302可防止白細(xì)胞減少癥。實(shí)施例12抗合成多肽IT9302的抗體合成多肽IT9302購自Kem-En-Tec A/S，Copenhagen，Denmark，高純度大于95％。該多肽也由制造商將其與鑰孔_血藍(lán)素(KLH)相結(jié)合。可溶的IT9302/KLH比多肽單用更具免疫原性，并且還可被用作ELISA或Western印跡的對照蛋白。
兔的免疫將250μg與KLH偶聯(lián)的IT9302，并作為完全弗氏佐劑的乳液，用于皮內(nèi)或皮下注射。每隔兩周注射一次共重復(fù)4次并在其后8天和12天對兔采血。在間隔一個月后皮下注射后來的加強(qiáng)劑量的注射250μgIT9302/KLH與不完全弗氏佐劑被施用。和斑點(diǎn)印跡免疫分析或Western印跡檢測IT9302抗體的形成。
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序列表(1)一般的信息(i)申請人(A)姓名Nycomed DAK A/S(B)街道P.O.Box 1911，Lergraversvej 59(C)城市哥本哈根(E)國家丹麥(F)郵政編碼(郵區(qū))2300(ii)發(fā)明題目免疫調(diào)節(jié)劑(iii)序列數(shù)23(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatertIn Release #1.0，版本#1.3(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(xi)序列描述SEQ ID NO1Ala Tyr Met Thr Met Lys ILe Arg Asn1 5(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(xi)序列描述SEQ ID NO2Ala Tyr Met Thr Ile Lys Met Arg Asn1 5(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度9個(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(xi)序列描述SEQ ID NO3Ala Phe Met Thr Leu Lys Leu Arg Asn1 5(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(xi)序列描述SEQ ID NO4Ala Tyr Met Thr Met Lys Val Arg Glu1 5(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型
(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(xi)序列描述SEQ ID NO5Gly Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asp1 5(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(xi)序列描述SEQ ID NO6Ala Phe Met Thr Met Lys Ile Arg Asp1 5(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(xi)序列描述SEQ ID NO7Ala Tyr Ile Thr Met Lys Ile Arg Asp1 5(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(xi)序列描述SEQ ID NO8Ala Tyr Leu Thr Met Lys Ile Arg Asp1 5(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(xi)序列描述SEQ ID NO9Ala Tyr Val Thr Met Lys Ile Arg Asp1 5(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(xi)序列描述SEQ ID NO10Ala Tyr Met Thr Leu Lys Ile Arg Asp1 5(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(xi)序列描述SEQ ID NO11Ala Tyr Met Thr Leu Lys Ile Arg Asp1 5(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(xi)序列描述SEQ ID NO12Ala Tyr Met Thr Val Lys Ile Arg Asp1 5(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(xi)序列描述SEQ ID NO13Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asp1 5(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特征
(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(xi)序列描述SEQ ID NO14Ala Tyr Met Thr Met Lys Met Arg Asp1 5(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(xi)序列描述SEQ ID NO15Ala Tyr Met Thr Met Lys Val Arg Asp1 5(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(xi)序列描述SEQ ID NO16Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Asp Gln1 5(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(xi)序列描述SEQ ID NO17Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Asp Gln1 5(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(xi)序列描述SEQ ID NO18Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu1 5(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(xi)序列描述SEQ ID NO19Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa1 5(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(xi)序列描述SEQ ID NO20Xaa Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa1 5(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長度8個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(xi)序列描述SEQ ID NO21Xaa Xaa Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa1 5(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(iii)假設(shè)無(xi)序列描述SEQ ID NO22Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Lys Xaa Arg Xaa1 5(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設(shè)無(xi)序列描述SEQ ID NO23GCCTACATGA CAATGAAGAT ACGAAAC
權(quán)利要求
1.一種不同于人白介素10的是有至少如下特征之一的多肽a)誘導(dǎo)對人單核細(xì)胞自發(fā)的IL-8產(chǎn)生的抑制，b)誘導(dǎo)對IL-1β誘導(dǎo)的人外周血單核細(xì)胞(PBMC)IL-8的產(chǎn)生的抑制，c)誘導(dǎo)人單核細(xì)胞白介素-1受體拮抗劑蛋白(IRAP)的產(chǎn)生，d)誘導(dǎo)體外CD8+人T淋巴細(xì)胞的趨化遷移，e)脫敏人CD8+T細(xì)胞導(dǎo)致其對rhIL-10的非應(yīng)答性，f)抑制CD4+人T淋巴細(xì)胞對IL-8的趨化應(yīng)答，g)抑制人單核細(xì)胞對MCAF/MCP-1的趨化應(yīng)答，h)與人IL-10不同，不抑制人單核細(xì)胞上II型MHC分子的表達(dá)，i)誘導(dǎo)培養(yǎng)的正常人CD4+T細(xì)胞IL-4的產(chǎn)生，j)減少人混合白細(xì)胞反應(yīng)中TNFα的產(chǎn)生。
2.一種具有如下通式的多肽Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6(SEQ ID NO19)其中X4和X5分別選自Met，Ile，Leu和Val；和X6選自Asp，Gln和Glu。
3.一種具有如下通式的多肽X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6(SEQ ID NO20)其中X3，X4和X5分別選自Met，Ile，Leu和Val；和X6選自Asp，Gln和Glu。
4.一種具有如下通式的多肽X2-X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6(SEQ ID NO21)其中X2是Tyr或Phe，X3，X4和X5分別選自Met，Ile，Leu和Val；和X6選自Asp，Gln和Glu。
5.一種具有如下通式的多肽X1-X2-X3-Thr-X4-Lys-X5-Arg-X6(SEQ ID NO22)其中X1是Ala或Gly，X2是Tyr或Phe，X3，X4和X5分別選自Met，Ile，Leu和Val；和X6選自Asp，Gln和Glu。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)的多肽，其中X1是Ala。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)的多肽，其中X1是Gly。
8.根據(jù)權(quán)利要求2-7任一項(xiàng)的多肽，其中X2是Tyr。
9.根據(jù)權(quán)利要求2-7任一項(xiàng)的多肽，其中X2是Phe。
10.根據(jù)權(quán)利要求2-9任一項(xiàng)的多肽，其中X3是Met。
11.根據(jù)權(quán)利要求2-9任一項(xiàng)的多肽，其中X3是Ile。
12.根據(jù)權(quán)利要求2-9任一項(xiàng)的多肽，其中X3是Leu。
13.根據(jù)權(quán)利要求2-9任一項(xiàng)的多肽，其中X3是Val。
14.根據(jù)權(quán)利要求2-13任一項(xiàng)的多肽，其中X4是Met。
15.根據(jù)權(quán)利要求2-13任一項(xiàng)的多肽，其中X4是Ile。
16.根據(jù)權(quán)利要求2-13任一項(xiàng)的多肽，其中X4是Leu。
17.根據(jù)權(quán)利要求2-13任一項(xiàng)的多肽，其中X4是Val。
18.根據(jù)權(quán)利要求2-17任一項(xiàng)的多肽，其中X5是Met。
19.根據(jù)權(quán)利要求2-17任一項(xiàng)的多肽，其中X5是Ile。
20.根據(jù)權(quán)利要求2-17任一項(xiàng)的多肽，其中X5是Leu。
21.根據(jù)權(quán)利要求2-17任一項(xiàng)的多肽，其中X5是Val。
22.根據(jù)權(quán)利要求2-21任一項(xiàng)的多肽，其中X6是Asp。
23.根據(jù)權(quán)利要求2-21任一項(xiàng)的多肽，其中X6是Gln。
24.根據(jù)權(quán)利要求2-21任一項(xiàng)的多肽，其中X6是Glu。
25.一種包含如權(quán)利要求2-24任一項(xiàng)所定義的氨基酸序列或多肽。
26.一種多肽，它包含hIL-10序列的一個亞序列并且與vIL-10有66％的同源程度以及當(dāng)mIL-1044％的同源程度。
27.Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn。
28.一種選自如下序列的多肽Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Met-Arg-Asn (SEQ ID NO2)，Ala-Phe-Met-Thr-Leu-Lys-Leu-Arg-Asn (SEQ ID NO3)，Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Glu (SEQ ID NO4)，Gly-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID NO5)，Ala-Phe-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID NO6)，Ala-Tyr-Ile-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID NO7)，Ala-Tyr-Leu-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID NO8)，Ala-Tyr-Val-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID NO9)，Ala-Tyr-Met-Thr-Ile-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID NO10)，Ala-Tyr-Met-Thr-Leu-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID NO11)，Ala-Tyr-Met-Thr-Val-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID NO12)，Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asp (SEQ ID NO13)，Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Met-Arg-Asp (SEQ ID NO14)，Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Val-Arg-Asp (SEQ ID NO15)，Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Gln (SEQ ID NO16)，和Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Glu (SEQ ID NO17).
29.一種根據(jù)權(quán)利要求1-28任一項(xiàng)的基本純化形式的物質(zhì)或多肽。
30.一種編碼權(quán)利要求2-29任一項(xiàng)的多肽的核苷酸序列。
31.一種與權(quán)利要求2-29任一項(xiàng)的物質(zhì)或多肽結(jié)合的抗體。
32.一種與具有SEQ ID No.1的氨基酸序列的多肽特異結(jié)合的抗體。
33.一種根據(jù)權(quán)利要求31或32的為多克隆抗體的抗體。
34.一種根據(jù)權(quán)利要求31或32的為單克隆抗體的抗體。
35.一種根據(jù)權(quán)利要求31-34任一項(xiàng)的抗體，它能中和權(quán)利要求1所述的a)到g)活性中的一項(xiàng)或多項(xiàng)。
36.一種能中和權(quán)利要求1所述a)到g)活性中的一項(xiàng)或多項(xiàng)活性的單克隆19F1之外的其它物質(zhì)。
37.一種包含權(quán)利要求36的物質(zhì)的藥用組合物。
38.權(quán)利要求36的物質(zhì)在減少或中和高濃度的hIL-10和/或vIL-10中的用途。
39.權(quán)利要求36的物質(zhì)在制備用于治療或預(yù)防卵巢癌和/或艾滋病藥用組合物中的用途。
40.一種治療和/或防止卵巢癌和/或艾滋病的方法，該方法包括給有需要的患者施用治療或預(yù)防有效量的權(quán)利要求36的物質(zhì)。
41.具有hIL-10拮抗劑活性的化合物在制備用于治療或預(yù)防卵巢癌和/或艾滋病的藥用組合物中的用途。
42.一種治療和/或防止卵巢癌和/或艾滋病的方法，該方法包括給有需要的患者施用治療或預(yù)防有效量的具有hIL-10抑制劑活性的化合物。
43.一種包含權(quán)利要求1-29任一項(xiàng)的物質(zhì)或多肽的藥用組合物。
44.權(quán)利要求1-29任一項(xiàng)的物質(zhì)或多肽在治療或預(yù)防表3中所述的一種或多種疾病中的應(yīng)用。
45.權(quán)利要求1-29任一項(xiàng)的物質(zhì)或多肽在制備用于治療或預(yù)防表3中所述的一種或多種疾病的藥用組合物中的用途。
46.一種治療和/或防止表3中所述的一種或多種疾病的方法，該方法包括給有需要的患者施用治療或預(yù)防有效量的權(quán)利要求1-29任一項(xiàng)的物質(zhì)或多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及不同于人白介素(10)的具有至少如下特征之一的一種多肽a)誘導(dǎo)對人單核細(xì)胞自發(fā)的IL-8的產(chǎn)生的抑制，b)誘導(dǎo)對IL-1β誘導(dǎo)的人外周血單核細(xì)胞(PBMC)IL-8產(chǎn)生的抑制，c)誘導(dǎo)人單核細(xì)胞白介素-1受體拮抗蛋白(IRAP)的產(chǎn)生，d)誘導(dǎo)體外CD8+人T淋巴細(xì)胞的趨化遷移，e)脫敏人CD8+T細(xì)胞，導(dǎo)致其對rhIL-10的非應(yīng)答性，f)抑制人CD4+T淋巴細(xì)胞對IL-8的趨化反應(yīng)，g)抑制人單核細(xì)胞對MCAF/MCP-1的趨化反應(yīng)，h)與人IL-10不同，不抑制人單核細(xì)胞中MHC Ⅱ類分子的表達(dá)，i)誘導(dǎo)培養(yǎng)的正常人CD4+T細(xì)胞的IL-4的產(chǎn)生，j)減少人混合白細(xì)胞反應(yīng)中TNF-α的產(chǎn)生。更具體地說，本發(fā)明涉及一個九肽Ala-Tyr-Met-Thr-Met-Lys-Ile-Arg-Asn和其類似物以及其變異體。
文檔編號C07K16/24GK1159830SQ95194787
公開日1997年9月17日 申請日期1995年6月7日 優(yōu)先權(quán)日1994年7月5日
發(fā)明者C·格龍霍拉森, B·杰澤 申請人:史廷諾研究集團(tuán)有限公司