用作添加劑的全細(xì)胞眼蟲(chóng)屬微生物 的生長(zhǎng)、濃縮和干燥?？蛇x地，可使用具有優(yōu)于其他方法的某些優(yōu)點(diǎn)的物理和化學(xué)分離方法 從眼蟲(chóng)中提取副淀粉。當(dāng)各種物質(zhì)如α生育酚、葉黃素或副淀粉可從眼蟲(chóng)中提取時(shí)，本技 術(shù)提供用于全細(xì)胞眼蟲(chóng)（藻粉）生長(zhǎng)的有效的、有成本效益的平臺(tái)，該全細(xì)胞眼蟲(chóng)將用作食 品配料或作為用于進(jìn)一步提取高度純化副淀粉的原料物質(zhì)。藻粉和提取的β葡聚糖也提 供具體的特性，其包括調(diào)節(jié)動(dòng)物免疫系統(tǒng)的能力，如本文進(jìn)一步描述的。
[0036] 減少生產(chǎn)眼蟲(chóng)和眼蟲(chóng)衍生的副淀粉的成本使得眼蟲(chóng)成為用于大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)有 價(jià)值化合物的合適生物。例如，有人建議，眼蟲(chóng)可以用于生產(chǎn)買(mǎi)得起的α生育酚（有價(jià) 值形式的維生素 Ε)的天然來(lái)源（參見(jiàn)Ogbonna等人；Journal of Applied Phycology 10:67-74, 1998)。眼蟲(chóng)也是在食品、保健品、化妝品、飲料和動(dòng)物飼料應(yīng)用中β-1，3-葡聚 糖或副淀粉（具有應(yīng)用作為免疫調(diào)節(jié)劑的多糖）的來(lái)源。已知來(lái)自酵母的β_1，3-葡聚 糖加強(qiáng)動(dòng)物和人類(lèi)的先天免疫系統(tǒng)活性（例如，美國(guó)公開(kāi)號(hào)2006/0009419, Ross等人）。 存在不同形式的β -1，3-葡聚糖，其包括在分支、溶解度和分子量方面的變異體，其影響 受試者中的最終親合力和功效。當(dāng)按更大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，來(lái)自眼蟲(chóng)的β-1，3-葡聚糖可以 是β -1, 3-匍聚糖的有成本效益的來(lái)源。眼蟲(chóng)可積累β _1，3_匍聚糖作為細(xì)胞質(zhì)顆粒，其 總共是在30-90%的總細(xì)胞量之間。相反，基于酵母的葡聚糖通常包括小于15%的總生 物量且結(jié)合到細(xì)胞壁，要求另外提取以當(dāng)口服或靜脈內(nèi)給藥于動(dòng)物時(shí)達(dá)到可比的生物學(xué)活 性。其結(jié)果是，基于酵母的葡聚糖通常價(jià)格范圍可以在$50每千克至超過(guò)$300每千克之 間。同時(shí)，來(lái)自眼蟲(chóng)的高度純化副淀粉是可獲得的，但僅是少量且高價(jià)；例如，超過(guò)$50, 000 每千克（參見(jiàn) Sigma Aldrich 在線目錄，網(wǎng)址 WWW. sigmaaldrich. com/catalog/product/ sigma/89862 ? Iang = en&region = US) 〇
[0037] 嘗試生長(zhǎng)眼蟲(chóng)包括實(shí)驗(yàn)臺(tái)規(guī)模發(fā)酵方法、使用光合作用作為至少一部分生長(zhǎng)方法 的方法和優(yōu)化維生素 E或副淀粉的生產(chǎn)和提取的方法。然而，在用于生長(zhǎng)眼蟲(chóng)的放大方法 中，應(yīng)考慮某些污染問(wèn)題和氧轉(zhuǎn)移問(wèn)題，其通常不是實(shí)驗(yàn)臺(tái)規(guī)模所面對(duì)的問(wèn)題。用于減少眼 蟲(chóng)生長(zhǎng)成本的驅(qū)動(dòng)力可包括，進(jìn)一步增加生長(zhǎng)速率、增加從碳源（例如，糖）到生物量的轉(zhuǎn) 換效率、增加生長(zhǎng)密度、增加批長(zhǎng)度的持續(xù)時(shí)間和增加在其中生長(zhǎng)眼蟲(chóng)的容器的尺寸作為 減少勞動(dòng)成本的方法。
[0038] 因此，副淀粉未商業(yè)化生產(chǎn)，因?yàn)橛糜谘巯x(chóng)的有成本效益的生產(chǎn)技術(shù)還未開(kāi)發(fā)出 來(lái)。通過(guò)降低生產(chǎn)成本，對(duì)于β葡聚糖的應(yīng)用可顯著擴(kuò)大。例如，β葡聚糖可并入作為免 疫刺激食品或飲料配料，作為低成本的營(yíng)養(yǎng)食品，或作為動(dòng)物或水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料添加劑，其中 β葡聚糖甚至可用作抗生素的替代。補(bǔ)充或替代抗生素的能力是特別有趣的，因?yàn)樵趧?dòng)物 生產(chǎn)中使用抗生素作為感染預(yù)防機(jī)制（對(duì)于其在耐抗生素的"超級(jí)病菌"如MRSA的產(chǎn)生中 的角色）越來(lái)越多地受到批評(píng)。眼蟲(chóng)衍生的β-1，3-葡聚糖也可用作化妝品成分、傷口敷 料或甚至免疫刺激藥物成分，或使用以提供增強(qiáng)的先天免疫系統(tǒng)防御的藥物的前體?；罨?的免疫系統(tǒng)需要另外的卡路里消耗，并且β-1，3-葡聚糖可以因此甚至用于同時(shí)促進(jìn)先天 免疫系統(tǒng)活性同時(shí)在減肥應(yīng)用中也促進(jìn)一般的新陳代謝。存在可受益于接近比市售更便宜 的形式的β葡聚糖的許多應(yīng)用和人群。
[0039] 生長(zhǎng)眼蟲(chóng)的工作獲得范圍為在約0. 5至50克每升之間的細(xì)胞密度。例如，在美國(guó) 專(zhuān)利號(hào)US 5, 084, 386中所描述的眼蟲(chóng)生長(zhǎng)的方法要求指定為4g/L至16g/L的碳的碳源。 在說(shuō)明書(shū)中所提到的所有溶解組分的總濃度小于45g/L。因此，對(duì)于該生長(zhǎng)技術(shù)，將高度不 可能的是獲得大于45g/L的眼蟲(chóng)濃度。實(shí)際上，生長(zhǎng)的眼蟲(chóng)生物量的濃度大概少得多地給 定從碳源（葡萄糖）到眼蟲(chóng)生物量的轉(zhuǎn)換效率，其通常約0. 5至0. 9克生物量每克消耗的 葡萄糖。
[0040] 生長(zhǎng)小眼蟲(chóng)的其他工作獲得最高達(dá)70 %的β-1，3-葡聚糖濃度，如通過(guò) β-1，3-葡聚糖的干重相對(duì)于總生物量的干重的比例所測(cè)量的，以比先前描述的更高的 密度和細(xì)胞倍增時(shí)間。這是用于工業(yè)應(yīng)用的重要開(kāi)發(fā)。例如，Santek等人，通過(guò)使用含 15g/L葡萄糖作為主要碳源的合成培養(yǎng)基，在單批次中以13-14g/L的密度生產(chǎn)眼蟲(chóng)，具有 50-60 % g/L 的副淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)（Engineering Life Sci. 2009, 9, No. 1,23-28)。Santek 等人，使用具有馬鈴薯處理廢水作為主要培養(yǎng)基成分的重復(fù)分批生長(zhǎng)方法，也實(shí)現(xiàn)約20g/ L的生物量密度；獲得了約75%的副淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)（Engineering Life Sci. 2012, 12)， Rodriguez-Zavala等人，在用幾個(gè)碳源的實(shí)驗(yàn)后，在單批次中以10. 8g/L的密度生產(chǎn)眼 蟲(chóng)（Journal of Applied Microbiology 109,2160-2172)。Ogbonna 通過(guò)使用單階段罐發(fā) 酵裝置實(shí)現(xiàn)39. 5g/L的眼蟲(chóng)，雖然這不以商業(yè)規(guī)模或用多階段生物反應(yīng)器系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行的 (Journal of Applied Phycologyl0:67_74,1998)。Ogbonna 更感興趣的是由眼蟲(chóng)產(chǎn)生的 α_生育酚，并且未測(cè)量生物量中的β葡聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。然而，這些工作都不采用以商業(yè)規(guī) 模用于生長(zhǎng)眼蟲(chóng)的多階段或連續(xù)生物反應(yīng)器方法，并且都未達(dá)到大于50克每升的經(jīng)濟(jì)生 產(chǎn)密度。最后，都未使用簡(jiǎn)單且低成本的培養(yǎng)基配方，其可以是可再現(xiàn)地和始終如一地制備 的（與Santek等人所使用的馬鈴薯廢水不同）。
[0041] 進(jìn)一步工作未能以更高密度生長(zhǎng)小眼蟲(chóng)，因?yàn)樗鼈兝脝闻畏椒?，其中在接種 之前或接種立即之后，在生長(zhǎng)階段的開(kāi)始期間添加所有營(yíng)養(yǎng)物和碳源（例如，美國(guó)專(zhuān)利US 5, 084, 386)。這些工作也利用單階段生物反應(yīng)器。此外，這些工作所使用的小反應(yīng)室在體 積上小于100升，其不能夠產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)上有意義的體積的眼蟲(chóng)，并且其沒(méi)有面臨許多在擴(kuò)大 工業(yè)生物方法中最困難的問(wèn)題，如在使氧轉(zhuǎn)移速率最大化與使剪切應(yīng)力（隨著大的、敏感 的細(xì)胞如眼蟲(chóng)的機(jī)械攪拌而發(fā)生）的有害影響最小化之間權(quán)衡的優(yōu)化。最后，確定的是，這 些工作不添加足夠的碳源或營(yíng)養(yǎng)濃度以達(dá)到達(dá)超過(guò)40克每升的眼蟲(chóng)密度。
[0042] 相對(duì)于一些其他微生物，眼蟲(chóng)具有緩慢的細(xì)胞分裂時(shí)間。例如，在最佳條件下眼蟲(chóng) 的世代（generation)時(shí)間可以約為12小時(shí)。相反，在最佳條件下生長(zhǎng)的細(xì)菌的世代時(shí)間 可以快至20分鐘。沒(méi)有工業(yè)生產(chǎn)方法可以用于管理不期望的污染生物的更快生長(zhǎng)的能力， 眼蟲(chóng)未以足夠大的體積和足夠高的濃度來(lái)生長(zhǎng)以在經(jīng)濟(jì)上可行。
[0043] 藻類(lèi)通常在光養(yǎng)和異養(yǎng)條件下生長(zhǎng)。然而，異養(yǎng)生長(zhǎng)的絕大多數(shù)藻類(lèi)是富含油的 物種，并且定制環(huán)境處理的生長(zhǎng)條件以產(chǎn)生大量油，如ω3油或可作為液體生物燃料燃燒 的其他油。一些藻類(lèi)可以大于80%的數(shù)量產(chǎn)生油，如通過(guò)油對(duì)藻類(lèi)生物量的干重的比例所 測(cè)量的。相反，眼蟲(chóng)是貧油物種，具有通常小于15%的由油或其他脂質(zhì)組成的總生物量。
[0044] 雖然其他人已以非常基本的水平探索了眼蟲(chóng)的生產(chǎn)，該生產(chǎn)一直處于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模 在單階段生長(zhǎng)容器中一通常在單批次的小燒瓶或大玻璃瓶中。其結(jié)果是，眼蟲(chóng)未以更大的 數(shù)量生產(chǎn)，其將使得它可以用于商業(yè)應(yīng)用。另外，許多關(guān)于生長(zhǎng)眼蟲(chóng)的研宄使用眼蟲(chóng)作為用 于α生育酚的來(lái)源。用于生產(chǎn)這些化合物的最佳生長(zhǎng)條件不一定是用于生產(chǎn)和潛在提取 來(lái)自眼蟲(chóng)的β葡聚糖的相同的最佳條件。
[0045] 本技術(shù)包括用于生長(zhǎng)眼蟲(chóng)（例如，小眼蟲(chóng)）的方法，其使用多階段異養(yǎng)方法、在體 積上大于500升的生物反應(yīng)器中、且以大于20-60克每升并且最高達(dá)超過(guò)200克每升的密 度。通過(guò)以該規(guī)模應(yīng)用用于生長(zhǎng)眼蟲(chóng)的描述的多階段、分批進(jìn)料和重復(fù)汲取并填充處理，可 實(shí)現(xiàn)對(duì)于眼蟲(chóng)衍生的β葡聚糖的生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)，其優(yōu)于可比較的提取和純化酵母衍生的β葡 聚糖的生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)。
[0046] 本技術(shù)包括在黑暗中生長(zhǎng)眼蟲(chóng)細(xì)胞的方法，使用包含足夠碳源來(lái)以在干重基礎(chǔ)上 大于20g/L至60g/L的濃度產(chǎn)生生物量的異養(yǎng)方法。這通過(guò)隨時(shí)間推移添加碳源來(lái)實(shí)現(xiàn)， 使得在培養(yǎng)基中可用碳源的濃度始終不超過(guò)30g/L。每批可以添加碳源至少三次，并且可以 周期的或連續(xù)的方式添加。
[0047] 用于眼蟲(chóng)的其他生長(zhǎng)方法不提供用于在工業(yè)規(guī)模上防止眼蟲(chóng)污染的方法。由外來(lái) 細(xì)胞的污染在較短的生長(zhǎng)期間內(nèi)（如在實(shí)驗(yàn)臺(tái)規(guī)模燒瓶或生物反應(yīng)器中）并不總是關(guān)鍵問(wèn) 題。在其他生長(zhǎng)方法中所公開(kāi)的低PH水平在生長(zhǎng)艙（bay)很可能足以阻止一定污染。然 而，在工業(yè)規(guī)模上恰當(dāng)?shù)胤乐刮廴镜氖∈强梢宰柚菇?jīng)濟(jì)規(guī)模和批次運(yùn)行的關(guān)鍵問(wèn)題。此 外，如果不采取另外的預(yù)防措施，甚至在低PH生長(zhǎng)條件下，酵母和其他污染生物可進(jìn)化，其 生長(zhǎng)速度能夠超過(guò)眼蟲(chóng)。為了防止較快生長(zhǎng)的生物如酵母或細(xì)菌對(duì)眼蟲(chóng)種群的污染，可采 用無(wú)菌過(guò)濾器用于添加培養(yǎng)基或可用蒸汽滅菌培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基可以液體形式制備，且儲(chǔ) 存在一個(gè)或多個(gè)容器中。該培養(yǎng)基的不同組分也可儲(chǔ)存在不同的容器中以防止由外來(lái)生物 污染。該培養(yǎng)基可以在過(guò)濾和組合之前進(jìn)行熱滅菌，小心地給定不過(guò)熱含糖培養(yǎng)基以免于 焦糖化的風(fēng)險(xiǎn)。
[0048] 雖然本技術(shù)的方面可以在單生物反應(yīng)器中進(jìn)行，其至少是1000L的罐，但優(yōu)選方 法是多階段方法，其中多個(gè)生物反應(yīng)器順序地使用，并且其中每個(gè)生物反應(yīng)器比在前面步 驟中的生物反應(yīng)器具有更大的生物反應(yīng)器體積。用于生長(zhǎng)眼蟲(chóng)的某些方法的流程圖示于 圖1、圖2、圖3和圖4中，并且用于生長(zhǎng)眼蟲(chóng)的某些系統(tǒng)的示意圖示于圖5、圖6和圖7中。 例如，第一生物反應(yīng)器階段可以由厄倫美厄式或其他燒瓶組成，其通過(guò)在旋轉(zhuǎn)或回轉(zhuǎn)搖床 或磁力攪拌棒上的表面擴(kuò)散來(lái)充氧。該生物反應(yīng)器可如通過(guò)加熱床或在氣溫受控氣氛中 被加熱，通常在有蓋的生