專利名稱：免疫調(diào)節(jié)劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人CD2結(jié)合蛋白(包括其受體、受體的變體和單抗)與CD11a單克隆抗體或CTLA4可溶性片段及其變體聯(lián)合應(yīng)用，通過免疫抑制作用治療自身免疫疾病或應(yīng)用于器官移植等臨床病癥。
背景技術(shù)：
抗原提呈細(xì)胞和T細(xì)胞在細(xì)胞免疫機(jī)理方面具有重要作用，有多種蛋白分子可以介導(dǎo)二者發(fā)生相互作用，從而引起T細(xì)胞的分化和發(fā)育，最終介導(dǎo)免疫反應(yīng)。這種相互作用信號通道的三個(gè)例子示于圖1。
一、CD2LFA3途徑在CD2/LFA3途徑中，人CD2分子是一種50KD的膜蛋白，存在于大多數(shù)的胸腺細(xì)胞和所有的外周淋巴細(xì)胞表面，其成熟蛋白由332個(gè)氨基酸組成，其前體有一個(gè)19個(gè)氨基酸組成的信號肽(Genebank protein IDAAA51738.1)。該分子與LFA3專一性相互作用，介導(dǎo)T細(xì)胞對靶細(xì)胞或抗原呈遞細(xì)胞的粘附，從而起始T細(xì)胞的功能反應(yīng)。
LFA3又稱CD58，是抗原提呈細(xì)胞是一種跨膜蛋白，其前體蛋白有一個(gè)28個(gè)氨基酸的信號肽，成熟蛋白由233個(gè)氨基酸組成(Genebank protein IDNP001770.1)。LFA3廣泛分布于各種細(xì)胞表面，包括紅細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖細(xì)胞等。CD2是其配體。
CD2/LFA3相互作用是T細(xì)胞一抗原提呈細(xì)胞相互作用多種信號通道的一種，二者結(jié)合后可以增強(qiáng)T細(xì)胞與抗原提呈細(xì)胞或靶細(xì)胞之間的粘附，促進(jìn)T細(xì)胞對抗原的識別以及CD2所介導(dǎo)的信號的傳導(dǎo)。
抗CD2或者抗LFA3的抗體可以阻止CD2/LFA3的信號傳導(dǎo)，使T細(xì)胞的免疫功能受到抑制。
二.B7CD28/CTLA4途徑T-細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞表面參與產(chǎn)生共刺激作用的分子統(tǒng)稱為共刺激分子。目前公認(rèn)最重要的共刺激通道為B7-CD27通路(圖1)。B7位于抗原提呈細(xì)胞，與T細(xì)胞表面的CD28分子結(jié)合可以產(chǎn)生共刺激。當(dāng)T細(xì)胞激活后，其細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)另外一種可以與B7細(xì)胞結(jié)合的分子CTLA4(Cytotoxic TLymphocyte associate Antigen-4)。CTLA4與B7的親和力很高，該分子與B7細(xì)胞結(jié)合后可以誘導(dǎo)B7細(xì)胞的調(diào)亡。因此目前認(rèn)為它對T細(xì)胞激活有負(fù)調(diào)節(jié)作用，對于維持人體內(nèi)免疫狀態(tài)的平衡起重要作用。
CTLA4(即溶細(xì)胞性T細(xì)胞相關(guān)抗原4)，又稱CD152，是由一種跨膜糖蛋白組成的二聚體，它可以與CD80和CD86結(jié)合，其親和力比與CD28明顯高，其功能與CD28相反，對T細(xì)胞活化有負(fù)調(diào)節(jié)作用。其受體為B7-1和B7-2。該分子與B7結(jié)合后，可以誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，因此目前認(rèn)為它對T細(xì)胞激活負(fù)反饋調(diào)節(jié)，對人體內(nèi)維持免疫狀態(tài)的平衡起重要作用。
CTLA-4是表達(dá)在活化T細(xì)胞表面的標(biāo)志性分子之一。研究表明，該成分是維持體內(nèi)T細(xì)胞穩(wěn)定性的負(fù)調(diào)控因子，具有抑制活化T-細(xì)胞的增值的功能，與CD28構(gòu)成了一對十分重要的免疫調(diào)節(jié)因子。目前，它被作為免疫抑制受體進(jìn)行了廣泛的研究，在臨床上有可能作為抑制免疫排斥反應(yīng)的制劑進(jìn)行應(yīng)用。
三、CD11aICAM-1途徑CD11/CD18復(fù)合物屬于整合素家族，包括淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原即CD11a/CD18(該復(fù)合體亦稱為LFA-1)，噬細(xì)胞分化抗原即CD11b/CD18，Mac-1和糖蛋白即P150/95，CD11c/CD18。它們分別與分布在內(nèi)皮細(xì)胞，血小板和淋巴細(xì)胞上的相應(yīng)配體相結(jié)合，介導(dǎo)白細(xì)胞的識別、粘附。Mezzane發(fā)現(xiàn)不穩(wěn)定心絞痛患者冠脈竇血中的中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上CD11/CD18的表達(dá)明顯高于正常對照組，提示白細(xì)胞在經(jīng)過冠脈循環(huán)時(shí)被激活，且粘附增加。
CD11a與T細(xì)胞的發(fā)育有關(guān)，其功能的抑制可以引起T細(xì)胞免疫功能的降低。因此，它與自身免疫疾病相關(guān)。研究表明，CD11a的單抗克隆抗體可以抑制T細(xì)胞的免疫功能，其作用機(jī)理是抑制T-細(xì)胞與其他細(xì)胞類型的結(jié)合，從而下調(diào)T細(xì)胞的免疫功能。
CD11a又稱整合素aL、LFA-1a鏈、p180等，是細(xì)胞整合素中的一員。該蛋白前體有一個(gè)26個(gè)氨基酸組成的信號肽，成熟蛋白由1144個(gè)氨基酸組成。
ICAM-1又稱CD54，是一種位于APC細(xì)胞表面的跨膜分子，其前體蛋白有一個(gè)27個(gè)氨基酸組成的信號肽，成熟蛋白由505個(gè)氨基酸組成。該蛋白與CD8 CTL T細(xì)胞表面的LFA-1分子的CD11a亞基相互作用，可增強(qiáng)T細(xì)胞的功能。
T細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞之間的上述三種信號傳導(dǎo)途徑在T細(xì)胞的免疫功能調(diào)節(jié)方面具有十分重要的作用。任何一種信號傳導(dǎo)途徑的阻斷都有可能導(dǎo)致免疫功能下調(diào)?；诖嗽?，可以開發(fā)出治療免疫紊亂疾病如自身免疫疾病的治療藥物。從基因工程角度來看，開發(fā)這類藥物的策略主要有三種。一種是研制信號通道相關(guān)蛋白的單克隆抗體，一種是研制信號通道相關(guān)蛋白的受體蛋白，一種是利用信號通道相關(guān)蛋白的拮抗劑。這三種策略都是利用一種(或多種)可以與信號通道蛋白特異性結(jié)合的蛋白來阻斷信號傳導(dǎo)過程。
這種策略的原理圖示于圖2。CD11a的單克隆抗體可以與CD11a特異性結(jié)合，從而阻斷了CD11a與ICAM1的結(jié)合，使得LFA1-ICAM1信號傳導(dǎo)途徑中斷。CTLA4是B7的受體，其胞外可溶性片段可以與CD28競爭性地與B7結(jié)合，由于CTLA4比CD28與B7的結(jié)合能力高，因此，在CTLA4濃度達(dá)到一定程度時(shí)，即可阻斷CD28與B7的結(jié)合，從而使B7CD28信號傳導(dǎo)途徑中斷。在LFA3CD2途徑中，如果存在不與APC細(xì)胞結(jié)合的自由LFA3完整分子或帶有其CD2結(jié)合區(qū)的不完整分子，則這種分子也可以與CD2結(jié)合，從而阻礙了APC細(xì)胞上LFA3與T細(xì)胞上CD2分子的結(jié)合，使得APC與T細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)途徑被阻斷。
研究發(fā)現(xiàn)，采用上述三種途徑之一種或多種，可以有效阻斷APC與T細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)，使T細(xì)胞發(fā)育、分化受阻或?qū)е耇細(xì)胞的凋亡，從而使T細(xì)胞的免疫功能不能正常發(fā)揮，結(jié)果導(dǎo)致免疫功能下降。
到目前為止，已經(jīng)根據(jù)上述原理開發(fā)成功多種免疫功能抑制劑，這些免疫抑制劑可以使免疫功能顯著下調(diào)，從而使自身免疫疾病獲得顯著的治療。上述原理研制的免疫功能抑制劑還可以應(yīng)用在器官或細(xì)胞移植方面，使免疫排斥顯著降低。
然而，直到目前，國內(nèi)外還沒有一個(gè)療效明確且顯著的化學(xué)合成的或其他途徑制造的藥物用于治療自身免疫和免疫排斥。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的治療自身免疫疾病的抑制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供可用于治自身免疫疾病的抑制劑及其制法。
本發(fā)明的另一目的是提供一種含所述抑制劑的藥物組合物。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種免疫調(diào)節(jié)劑，它選自下組(a)抗人CD11a單克隆抗體，所述的抗人CD11a單克隆抗體具有SEQ ID NO1或3所示的重鏈序列，和/或SEQ ID NO2或4所示的輕鏈序列；(b)FLA3Ig融合蛋白，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO25中第1-120位所示的FLA3的CD2結(jié)合區(qū)和SEQ ID NO26中第121-347位所示的人IgG1的Fc片段；(c)CTLA4Ig融合蛋白，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO5中第37-161位所示的CTLA-4R胞外結(jié)構(gòu)域、和SEQ ID NO17所示的人IgG1的Fc片段。
在一優(yōu)選例中，所述的免疫調(diào)節(jié)劑是抗人CD11a單克隆抗體，且具有人IgG1恒定區(qū)。
在另一優(yōu)選例中，所述的免疫調(diào)節(jié)劑是FLA3Ig融合蛋白，且具有SEQ IDNO26所示的氨基酸序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的免疫調(diào)節(jié)劑是CTLA4Ig融合蛋白，且在CTLA-4R胞外結(jié)構(gòu)域和人IgG1的Fc片段之間還具有連接肽，例如SEQ ID NO35所示的連接肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供了分離編碼本發(fā)明上述的免疫調(diào)節(jié)劑的DNA分子。
在一優(yōu)選例中，所述的DNA分子具有SEQ ID NO27或28所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，它含有藥學(xué)上可接受的載體和本發(fā)明所述的免疫調(diào)節(jié)劑。
較佳地，所述的藥物組合物，含有一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑，例如(a)、(b)和(c)中的2-3種免疫調(diào)節(jié)劑。
在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物，含有以下二種免疫調(diào)節(jié)劑(a)抗人CD11a單克隆抗體，所述的抗人CD11a單克隆抗體具有SEQ ID NO1或3所示的重鏈序列，和/或SEQ ID NO2或4所示的輕鏈序列；和(b)FLA3Ig融合蛋白，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO26中第1-120位所示的FLA3的CD2結(jié)合區(qū)和SEQ ID NO26中第121-347位所示的人IgG1的Fc片段。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種本發(fā)明所述的免疫調(diào)節(jié)劑的用途，它用于制備治療自身免疫疾病和抗免疫排斥的藥物。


圖1顯示了APC細(xì)胞與T細(xì)胞相互作用的幾種信號通道。
圖2顯示了信號傳導(dǎo)途徑的阻斷途徑。
圖3是pMG18表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)圖譜，其中pA是SV40病毒的“poly A”加尾信號；hCMV pro是人巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子(含增強(qiáng)子序列)；AmpR是氨芐青霉素抗性基因。
圖4顯示了CTLA4Ig的分子結(jié)構(gòu)。
圖5顯示了表達(dá)載體pMSG的結(jié)構(gòu)圖譜。
圖6顯示了重組的人FLA3胞外區(qū)-Ig融合蛋白的分子結(jié)構(gòu)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，構(gòu)建了一類免疫調(diào)節(jié)劑，它們可通過免疫抑制作用治療自身免疫疾病或應(yīng)用于器官移植等臨床病癥。具體地，該免疫調(diào)節(jié)劑包括(a)抗人CD11a單克隆抗體；(b)FLA3Ig融合蛋白；和(c)CTLA4Ig融合蛋白。在此基礎(chǔ)上為此了本發(fā)明。
如本文所用，術(shù)語“自身免疫疾病”是指臨床上經(jīng)常遇到的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、銀屑病、紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥等。
本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)劑是多肽類物質(zhì)。除了提供免疫調(diào)節(jié)劑之外，本發(fā)明還提供了編碼免疫調(diào)節(jié)劑的DNA分子。本發(fā)明的核苷酸編碼序列通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。一種可行的方法是用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明還涉及包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體。這些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌；真菌細(xì)胞如酵母；CHO、COS7、293細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞等。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔，脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
本發(fā)明中涉及的重組細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中，可以應(yīng)用的培養(yǎng)基有許多種。其中，Ham′s101，MEM，RPMI-1640，DMEM等商品化的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基均可使用。在這些培養(yǎng)基中，可以加入適當(dāng)?shù)募に?、生長因子、核酸降解物、微量元素等輔助成分，以提高細(xì)胞的活性。如果需要的話，可以添加任何物質(zhì)，如能量因子等等。培養(yǎng)過程中pH、溶氧等的控制按照一般程序操作。
基本培養(yǎng)基以外的任何添加成分的分量均可通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)或最小二乘法來優(yōu)化。細(xì)胞培養(yǎng)的設(shè)備，可以使用滾瓶、搖瓶、動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器等進(jìn)行。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
在優(yōu)選的重組蛋白純化工藝中，由于本發(fā)明的重組蛋白的純化有一些共同特點(diǎn)。由于它們都帶有Fc片段，因此，在初級純化時(shí)，可以采用protein A填料進(jìn)行親和層析進(jìn)行捕捉。用protein A進(jìn)行的親和層析純化具有得率高、純化效果好等突出優(yōu)點(diǎn)，但是偶聯(lián)的protein A蛋白容易從載體上脫落，并且在使用過程中容易失活，填料污染后不能用NaOH等進(jìn)行清洗，很難長期使用。
本發(fā)明還提供了一種治療自身免疫疾病和抗免疫排斥的藥物組合物，它含有上述的免疫調(diào)節(jié)劑以及藥學(xué)上可接受的載體。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、或局部給藥。
本發(fā)明的藥物組合物可直接用于治療自身免疫疾病和抗免疫排斥。
本發(fā)明的藥物組合物含有安全有效量的本發(fā)明上述的免疫調(diào)節(jié)劑以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的免疫調(diào)節(jié)劑施用于哺乳動(dòng)物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1 重組人源(化)抗人CD11a單克隆抗體表達(dá)載體的構(gòu)建1.1從抗體庫中篩選CD11a的抗體基因可變區(qū)人源抗體庫的構(gòu)建過程如下1).從1125名健康成年人抽取外周血，每人5毫升，檸檬酸抗凝后混合。
2).用Trizol從上述混合外周血抽取總RNA，用Oligo-dT16進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。
3).按文獻(xiàn)Marks et al.By-passing immunizationhuman antibodiesfrom V-gene libraries displayed on phage.J.Mol.Biol.，222，581-597和Hoogenboom and Winter，By-passing immunisationhuman antibodies fromsynthetic repertoires of germline VH gene segments rearranged in vitro.J.Mol.Biol.，227，381-388所述的方法，用各引物之組合進(jìn)行PCR，分別獲得長度約為330bp的重鏈可變區(qū)和310bp左右的輕鏈可變區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR引物組合物為每條引物的終濃度為20pmol/L。擴(kuò)增條件預(yù)變性94C 1min，主循環(huán)94C 30sec，54C 30sec，72C 30sec，25循環(huán)，后延伸72C 3min。PCR產(chǎn)物1.2％瓊脂糖電泳純化后克隆到pCantab 5E載體(Pharmacia產(chǎn)品)。
4).轉(zhuǎn)化將上述克隆到噬菌體展示載體pCantabe 5E的質(zhì)粒DNA，對大腸桿菌菌株TG1(Promega公司)進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。電擊細(xì)胞制備TG1細(xì)胞凍存液100ul接種于10毫升含100ug/ml氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37度培養(yǎng)過夜。取1ml上述過夜培養(yǎng)物，接種到2L上述同樣培養(yǎng)基中，37度培養(yǎng)8小時(shí)至OD600達(dá)0.4。5000RPM離心收集菌體后用冰冷的10％甘油溶液洗滌細(xì)胞2次后將細(xì)胞重懸于10ml 10％甘油中。電擊上述細(xì)胞100ul加入到預(yù)冷至-20度的100ul電擊杯中，加入上述pCantab 5E載體2微生，充分混勻后電擊。電擊條件電阻2500歐姆，電壓10千伏。上述電擊連續(xù)進(jìn)行多次，直至將所有載體DNA用完。
上述電擊完成后，立即在電擊杯中加入LB液體培養(yǎng)基(不含氨芐青霉素)1毫升，37度培養(yǎng)10小時(shí)后加入氨芐青霉素至100ug/L，37度培養(yǎng)6小時(shí)后5000rpm收集菌體。將收集的菌體重懸于含7％甘油的LB培養(yǎng)基中，-70℃保存?zhèn)溆谩?br> 對制備的抗體庫，按以下步驟篩選抗體1).復(fù)蘇的抗體庫菌株1毫升加入新鮮LB培養(yǎng)基14毫升，于50毫升三角瓶中37度培養(yǎng)16小時(shí)。
2).12000rpm高速離心10分鐘，轉(zhuǎn)移上清至一個(gè)無菌的50毫升離心管中，保存?zhèn)溆谩Ｆ涞味葢?yīng)在2×1011以上。
3).以純化的CD11a蛋白(購自深圳晶美公司)為抗原，常規(guī)方法包被25毫升細(xì)胞培養(yǎng)瓶。
4).包被后的細(xì)胞瓶中加入不少于3×1010噬菌體顆粒，37度溫育1小時(shí)。
5).倒掉瓶中的液體，用10毫升加入了1％Tween-20的PBS洗滌培養(yǎng)瓶10次。
6).在培養(yǎng)瓶中加入1毫升對數(shù)期的TG1細(xì)胞，37度溫育震蕩培養(yǎng)16小時(shí)。
7).重復(fù)2～6步，共進(jìn)行4個(gè)重復(fù)循環(huán)。
8).將上述獲得的細(xì)胞稀釋至100000細(xì)胞/ml后在加入0.1％氨芐青霉素的1.5％瓊脂平板上進(jìn)行培養(yǎng)以獲得單克隆。
9).取上述平板上的克隆在96孔深孔板上進(jìn)行培養(yǎng)，每孔一個(gè)克隆，共作960個(gè)克隆(10塊96孔板)。
10).將上述深孔板在96孔板離心機(jī)上5000RPM離心20分鐘后，將上清轉(zhuǎn)移到新的無菌深孔板，封口后保藏于4度備用。
11).取96孔板10塊，每孔中加入CD11a(10ug/ml)10微升常規(guī)包被后，分別加入上述保存的上清10微升，37度溫育1小時(shí)后用含有1％Tween-20的PBS洗滌20次。
12).加入1微升HRP標(biāo)記的羊抗M13單抗，37度溫育30分鐘后用1％Tween-20的PBS洗滌10次。
13).加入含有0.025％DAB顯色劑的PBS 200微升和1微升1％的H2O2，37度溫育顯色20分鐘后在讀板機(jī)上讀取595納米處的光吸收。
14).根據(jù)光吸收讀數(shù)確定顯色反應(yīng)強(qiáng)的孔，這些孔相對應(yīng)的克隆即為親和力較強(qiáng)的抗體可變區(qū)克隆。
15).通過上述過程，篩選出了抗人CD11a的陽性克隆387個(gè)陽性，根據(jù)讀數(shù)確定其中5個(gè)親和力最強(qiáng)的克隆，選其中兩個(gè)最高的用于后續(xù)的研究。這兩個(gè)克隆分別命名為pCD11-1，pCD11-2.
16).測序分析，結(jié)果如下表1

1.2抗體可變區(qū)編碼序列的表達(dá)載體的克隆
1).將上述2個(gè)克隆的菌株在100ml LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增，用Promega公司的質(zhì)粒DNA抽提純化試劑盒純化質(zhì)粒DNA。
2).用XbaI和NheI酶切上述質(zhì)粒DNA后在1.5％瓊脂糖凝膠電泳上分離酶切片段，取350bp左右的帶進(jìn)行膠回收，所得片段即為重鏈可變區(qū)。
3).用HindIII和Bsi WI酶切上述質(zhì)粒DNA后在1.5％瓊脂糖凝膠電泳上分離酶切片段，取320bp左右的帶進(jìn)行膠回收，所得片段即為輕鏈可變區(qū)。然后首先將重鏈可變區(qū)插入到表達(dá)載體pMG18(圖3)的XbaI/NheI位點(diǎn)，再用HindIII和Bsi WI將抗體輕鏈可變區(qū)插入到插入了重鏈可變區(qū)的pMG18的HindIII/Bsi WI位點(diǎn)，從而構(gòu)成了人源化抗CD11a抗體基因的表達(dá)載體。
1.3 CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與重組克隆的篩選1).上述構(gòu)建的帶有抗體基因的表達(dá)載體在大腸桿菌DH5a菌株接種于100毫升LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增，用Qiagen公司的Ultrapure Plasmid DNAPurification Kit抽提純化質(zhì)粒DNA。將上述純化的質(zhì)粒DNA采用Invitrogen公司的脂質(zhì)體法試劑盒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，操作參照廠家的說明書進(jìn)行。
2).轉(zhuǎn)化的CHO細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行連續(xù)9周的選擇，最后在96孔板上進(jìn)行極度稀釋培養(yǎng)，連續(xù)進(jìn)行3次，進(jìn)行單克隆化。
3).挑出的單克隆細(xì)胞系在RPM1641培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，對上清進(jìn)行Western Blotting實(shí)驗(yàn)，根據(jù)染色反應(yīng)判斷表達(dá)強(qiáng)度，挑選出表達(dá)強(qiáng)的克隆作為候選細(xì)胞株。
4).單克隆抗體的純化上述單抗的純化采用Protein A親和層析柱從細(xì)胞培養(yǎng)上清中直接分離純化，并用SDA-PAGE電泳證明，所得產(chǎn)物純度大于90％。
5).以上親和層析的產(chǎn)物再次經(jīng)過分子篩層析，獲得了純度＞98％的樣品。這些樣品可以用于以下的進(jìn)一步分析與研究。
結(jié)果通過以上的操作，篩選出上述兩種抗人CD11a抗體基因表達(dá)強(qiáng)度較高的候選克隆13個(gè)和9個(gè)(見表2)。
1.4抗CD11a抗體基因在CHO細(xì)胞中表達(dá)強(qiáng)度的研究將上述篩選得到的高表達(dá)候選克隆(見表2)培養(yǎng)于10cm的組織培養(yǎng)皿，采用ELISA法測量抗體的表達(dá)量羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃過夜，經(jīng)2％BSA于37℃封閉2小時(shí)，加入待測的培養(yǎng)上清和標(biāo)準(zhǔn)品(人IgG1)，37℃孵育2小時(shí)，加入HRP-羊抗人IgG(κ)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，37℃孵育1小時(shí)，加入TMB于37℃作用10分鐘，最后用H2SO4終止反應(yīng)，測A450值。測得的上述候選克隆的表達(dá)量(ug/ml)如下表2所示
表2

從上表中可以看出，8C9和4D8的表達(dá)水平具有很高的表達(dá)水平。與國外已經(jīng)發(fā)表的資料(Kunkel，PNAS，82488，1995)(18.2ug/ml)相比，表達(dá)水平提高了17倍和20.7倍。
選取8C9和4D8作為進(jìn)一步研究對象，細(xì)胞株記作CD11-1和CD11-2，分別對應(yīng)pCD11-1和pCD11-2兩種載體分子結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例2重組人CTLA4-Ig的細(xì)胞株構(gòu)建和表達(dá)2.1. CTLA-4R編碼序列的基本資料根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)[GenBank Accession Number L15006]，CTLA-4R的氨基酸序列(223氨基酸)如SEQ ID NO5所示，其中第37-161位為胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域，該片段具有完全的與B7結(jié)合的能力，可以作為CD28拮抗劑。本發(fā)明中記作CTLAs。
CTLA-4R基因的cDNA序列(5′→3′，672b)如SEQ ID NO6所示，其中第109-483位為胞外結(jié)構(gòu)域CTLAs的編碼序列。
為了在CHO細(xì)胞中獲得高表達(dá)，根據(jù)上述CTLAs片段的氨基酸序列，利用DNA/蛋白質(zhì)分析軟件DNAstar和GCG對適合CHO細(xì)胞表達(dá)的編碼序列進(jìn)行了設(shè)計(jì)。
2.2. 人工設(shè)計(jì)的CTLAs基因的合成人工設(shè)計(jì)的CTLAs基因DNA序列如SEQ ID NO7所示，其中前9個(gè)堿基為添加的3個(gè)保護(hù)堿基、一個(gè)Nhe I酶切位點(diǎn)和一個(gè)加入的起始密碼。
接著，通過以下程序合成人工設(shè)計(jì)的全長CTLAs基因運(yùn)用GCG軟件將上述序列及其互補(bǔ)序列分解成長約85b的片段，共計(jì)25個(gè)多核苷酸片段，其中正鏈的的第一個(gè)片段為5′-CAGgctagcATGgccatgcacgtggcccagcccgccgtggtgctggcctcctcccgcg-3′(SEQ ID NO8)其前三位堿基是保護(hù)堿基，第4～9個(gè)堿基是插入表達(dá)載體時(shí)的酶切位點(diǎn)(Nhe I)，第一個(gè)ATG是加入的起始密碼子。該片段也是合成全長融合基因時(shí)的上游引物，本研究中記作CTLAs-M。設(shè)計(jì)原則是互補(bǔ)的相鄰品片段之間有18～20個(gè)堿基的互補(bǔ)區(qū)。參照文獻(xiàn)Chrisostomos Prodromou and Laurenee H，Pearl(1992)的方法進(jìn)行基因的合成。設(shè)計(jì)的多核苷酸片段委托上海生工生物工程有限公司代為合成并進(jìn)行PAGE純化。
合成好的片段按照2微克/微升的濃度溶于滅菌的三蒸水中，按照以下方法進(jìn)行PCR反應(yīng)體系的組成是

反應(yīng)條件如下預(yù)變性94度2分鐘主循環(huán)94度1分鐘，55度1分鐘，72度3分鐘。
循環(huán)數(shù)20后延伸72度5分鐘PCR過程在PROGENE Genium熱循環(huán)儀上進(jìn)行。
按照上述條件進(jìn)行PCR。完畢后將產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物中有唯一一條分子量350～400bp右的帶，用Promega公司的膠回收試劑盒回收該片段，操作按照廠家的說明書進(jìn)行。共得DNA約2.5微克。
上述DNA片段按照常規(guī)方法克隆到pUC18載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a細(xì)胞后在IPTG/X-gal平板上進(jìn)行篩選，取18個(gè)白色菌斑接種于含有氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增，用質(zhì)粒抽提純化試劑盒(Promega)抽提質(zhì)粒DNA并進(jìn)行酶切鑒定后選出了15個(gè)大小正確的克隆并進(jìn)行DNA序列測定。根據(jù)測序結(jié)果，確認(rèn)了1個(gè)序列完全正確的克隆，即CTLAs-M。
2.3. 天然CTLAs基因的PCR擴(kuò)增、克隆和測序(1).引物的設(shè)計(jì)根據(jù)前述CTLAs基因的DNA序列，用DNAstar軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，結(jié)果如下上游引物CTLAs-N5′-CAGgctagcATGgcaatgcacgtggcccagcc-3′(SEQ IDNO9)，其中，CAG為保護(hù)堿基，下劃線部分為表達(dá)載體pMSG(Pharmacia公司)克隆時(shí)的切點(diǎn)(Nhe I)。該片段也是構(gòu)建天然CTLAs/Fc全長基因時(shí)的上游引物，記作CTLAs-N。
下游引物5′-gtcagaatctgggcacggttc-3′(SEQ ID NO10)。
上述引物委托上海生工公司進(jìn)行合成并進(jìn)行PAGE純化后用于PCR。
(2).模板DNA的制備用GIBCO公司的Trizol試劑從人MT細(xì)胞中抽提總RNA，操作過程按照廠家的說明進(jìn)行。抽提的總RNA在1％瓊脂糖電泳上確認(rèn)完整性后用INVITROGENE公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照廠家說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。反應(yīng)完畢，經(jīng)Promega公司的反應(yīng)體系DNA抽提純化試劑盒純化后作為PCR的模板。
(3).PCR擴(kuò)增利用上述引物和模板DNA進(jìn)行PCR，其反應(yīng)體系如下

PCR過程在PROGENE GENIUS熱循環(huán)儀上進(jìn)行，循環(huán)條件如下預(yù)變性94度2分鐘。
主循環(huán)94度1分鐘，59度1分鐘，72度2分鐘，共20循環(huán)。
后延伸72度5分鐘。
(4)PCR產(chǎn)物的鑒定和膠回收按照上述條件進(jìn)行PCR。完畢后將產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物中有一條分子量在375bp左右的單一帶，與預(yù)期的375bp大小一致。用Promega公司的膠回收試劑盒回收該片段，操作按照廠家的說明書進(jìn)行。共得DNA約3.2微克。
(5).天然CTLAs基因的克隆、鑒定與測序上述DNA片段按照常規(guī)方法克隆到pUC18載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a細(xì)胞后在IPTG/X-gal平板上進(jìn)行篩選，取5個(gè)白色菌斑接種于含有氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增，用質(zhì)粒抽提純化試劑盒(Promega)抽提質(zhì)粒DNA并進(jìn)行酶切鑒定后選出了5個(gè)大小正確的克隆并進(jìn)行DNA序列測定。根據(jù)測序結(jié)果，確認(rèn)了1個(gè)序列完全正確的克隆，即CTLAs-N。
2.4. 接頭序列的設(shè)計(jì)與合成當(dāng)將兩個(gè)基因或基因片段重組成一個(gè)編碼區(qū)構(gòu)成融合蛋白的編碼序列時(shí)，兩個(gè)目標(biāo)片段之間往往需要加入一個(gè)連接序列，該連接序列的選擇有很強(qiáng)的技術(shù)性。我們根據(jù)多年的經(jīng)驗(yàn)，設(shè)計(jì)該片段時(shí)遵循的原則是1)。要使用其編碼的多肽不能具有形成二級結(jié)構(gòu)的能力；2)。其編碼的多肽不能由糖基化信號；3)。不能有過多的疏水氨基酸。據(jù)此，設(shè)計(jì)的氨基酸序列是(Ala3Ser2)5。其編碼的DNA序列是5′-ACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCA-3’(SEQ ID NO11)根據(jù)以上序列，考慮到通過PCR將CTLAs編碼區(qū)與Fc片段拼接時(shí)的需要，該片段的首尾各加上一個(gè)分別與CTLAs編碼區(qū)3’-端和Fc編碼區(qū)5’-端互補(bǔ)的序列，各約20個(gè)堿基長度。因此，人工合成CTLAs的Linker-M全序列為5’-taaccatttccatccataattaaACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAacatgcccaccgtgcccagcac-3’(SEQ ID NO12)天然CTLAs的Linker-N全序列為5’-cttattttattcccatcaattgaACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAacatgcccaccgtgcccagcac-3’(SEQ ID NO13)上述兩種Linker均由上海生工公司帶為合成并進(jìn)行純化。
2.5. 人IgG1 Fc片段編碼序列的獲得天然全長IgG1編碼區(qū)(1416bp，471氨基酸+終止密碼子，Genbank accessionnumberBC024289)的序列如SEQ ID NO14所示，其中，第1-426位為VDJ區(qū)第427-1416位為人IgG1恒區(qū)，包括CH1+絞鏈區(qū)+CH2+CH3；第718-1416位為人IgG1恒定區(qū)中絞鏈區(qū)+CH2+CH3區(qū)的編碼區(qū)。
通過以下程序反轉(zhuǎn)錄獲得人IgG1編碼序列，并克隆到載體pGEM-T上，所得載體記做pIGG-1。具體操作過程100毫升人外周血，用淋巴細(xì)胞分離液(Sigma產(chǎn)品)分離獲得白細(xì)胞，用Qiagen的mRNA抽提純化試劑盒抽提mRNA，在1.2％瓊脂糖凝膠電泳上鑒定其完整性后用GIBCO公司的RT-PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR，引物為正向引物(加酶切點(diǎn))atggaactggggctccgctg(SEQ ID NO15)反向引物(加酶切點(diǎn))tcatttacccggagacag(SEQ ID NO16)(因?yàn)槔昧薃/T克隆，此兩引物不需要加入酶切點(diǎn))PCR條件預(yù)變性94C 2分鐘；主循環(huán)94C 1分鐘，56C 45秒，72C 90秒，30循環(huán)；后延伸72C 4分鐘。
擴(kuò)增完畢，在1％瓊脂糖凝膠電泳上鑒定分離擴(kuò)增的DNA，用Qiagen公司的DNA膠回收試劑盒回收14Kb的片段后克隆到pGEM-T載體(Promega公司)上，測序驗(yàn)證序列后，獲得一個(gè)完全正確的克隆，記作pIGG-1。
用于可溶性片段融合的人IgG1 Fc(絞鏈區(qū)+CH2+CH3)片段的氨基酸序列如SEQ ID NO17所示，共232個(gè)氨基酸。
人工設(shè)計(jì)的適合CHO細(xì)胞表達(dá)的人IgG1 Fc編碼序列如SEQ ID NO18所示。
人IgG1 Fc天然編碼序列如SEQ ID NO19所示，共699bp。為了獲得IgG1 Fc片段的編碼序列，設(shè)計(jì)和合成如下引物3′-端引物Fc-35′-gcactcgagttttacccggagacagggagag-3′(SEQ ID NO20)，其中，gca為保護(hù)堿基，下劃線部分為向上述表達(dá)載體克隆時(shí)的切點(diǎn)(Xho I)。該引物也是獲得全長CTLAs/Fc融合基因的下游引物。
5′-端引物Fc-55′-gagcccaaatcttgtgacaaaac-3′(SEQ ID NO21)以上述引物和含有人IgG1全序列的質(zhì)粒pIGG-1為模板進(jìn)行PCR，獲得了長度為708堿基的產(chǎn)物。電泳鑒定、克隆和測序方法同上。結(jié)果獲得pIGG1Fc。
2.6. 全長CTLAs-Fc融合基因的獲得(1)全長CTLAs-N/Linker/Fc融合基因的獲得本實(shí)施例中設(shè)計(jì)的接頭序列(linker)其氨基酸序列為(Ala3Ser2)5(SEQ ID NO35)；其DNA序列之一為5’-ACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCA-3’(SEQ ID NO36)該序列委托上海生工公司合成后，用PCR方法與前述pIGG1Fc中的Fc片段拼接后，形成Linker-N/Fc片段。
以前述的Linker-N/Fc和CTLAs-N的DNA為模板，以CTLAs-N和IgG1Fc-3′(SEQ ID NO20)為引物進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為反應(yīng)體系如下

PCR過程在PROGENE GENIUS熱循環(huán)儀上進(jìn)行，循環(huán)條件如下預(yù)變性94度2分鐘。
主循環(huán)94度1分鐘，60度1分鐘，72度3分鐘，共20循環(huán)。
后延伸72度5分鐘。
按照上述條件進(jìn)行PCR。完畢后將產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物中有一條分子量在1500bp左右的單一帶，與預(yù)期的1540bp大小一致。用Promega公司的膠回收試劑盒回收該片段，操作按照廠家的說明書進(jìn)行。共得DNA約3微克。
上述DNA片段按照常規(guī)方法克隆到商品化的pUC18載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a細(xì)胞后在IPTG/X-gal平板上進(jìn)行篩選，取7個(gè)白色菌斑接種于含有氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增，用質(zhì)粒抽提純化試劑盒(Promega)抽提質(zhì)粒DNA并進(jìn)行酶切鑒定后選出了3個(gè)大小正確的克隆并進(jìn)行DNA序列測定。根據(jù)測序結(jié)果，確認(rèn)了1個(gè)序列完全正確的克隆，記作CTLAs-N/Linker-N/Fc。
(2)全長CTLAs-M/Linker/Fc融合基因的獲得本實(shí)施例中設(shè)計(jì)的接頭序列(linker)其氨基酸序列為(Ala3Ser2)5(SEQ ID NO35)；其DNA序列之一為5’-cttattttattcccatcaattgaACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAACCACAACCTCGTCAacatgcccaccgtgcccagcac-3’(SEQ IDNO37)該序列委托上海生工公司合成后，用PCR方法與前述pIGG1Fc中的Fc片段拼接后，形成Linker-M/Fc片段。
以前述的Linker-M/Fc和CTLAs-M(SEQ ID NO7)的DNA為模板，CTLAs-M和IgG1Fc-3′SEQ ID NO20)為引物進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系為

PCR過程在PROGENE GENIUS熱循環(huán)儀上進(jìn)行，循環(huán)條件如下
預(yù)變性94度2分鐘。
主循環(huán)94度1分鐘，60度1分鐘，72度4分鐘，共25循環(huán)。
后延伸72度5分鐘。
按照上述條件進(jìn)行PCR。完畢后將產(chǎn)物在0.8％瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物中有一條分子量在1500bp左右的單一帶，與預(yù)期的1540bp大小一致。用Promega公司的膠回收試劑盒回收該片段，操作按照廠家的說明書進(jìn)行。共得DNA約2.7微克。
上述DNA片段按照常規(guī)方法克隆到pUC18載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a細(xì)胞后在IPTG/X-gal平板上進(jìn)行篩選，取9個(gè)白色菌斑接種于含有氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增，用質(zhì)粒抽提純化試劑盒(Promega)抽提質(zhì)粒DNA并進(jìn)行酶切鑒定后選出了6個(gè)大小正確的克隆并進(jìn)行DNA序列測定。根據(jù)測序結(jié)果，確認(rèn)了1個(gè)序列完全正確的克隆，記作CTLAs-M/Linker-N/Fc。
(3)結(jié)果通過以上操作，獲得了天然CTLAs基因與Linker和Fc片段的融合基因CTLAs-N/Linker/Fc和人工設(shè)計(jì)的CTLAs基因與Linker和Fc片段的融合基因CTLAs-M/Linker/Fc。這兩種融合蛋白的區(qū)別在于前者的CTLAs編碼區(qū)是天然的，而后者的相應(yīng)區(qū)域是人工設(shè)計(jì)的。圖4顯示了全長融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)。
2.7. 全長CTLAs-Fc融合基因的獲得(1)制備全長CTLAs-Fc融合基因?yàn)榱藱z測接頭片段對提高該融合蛋白親和力的作用，在以下操作中獲得了Fc片段與CTLAs-N和CTLAs-M的直接融合片段，此種結(jié)構(gòu)中沒有Linker片段。如果對這兩種融合基因在CHO細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物和前述CTLAs-N/Linker/Fc和CTLAs-M/Linker/Fc的表達(dá)產(chǎn)物的親和力進(jìn)行比較，就可以確認(rèn)Linker片段對親和力的影響。這兩種結(jié)構(gòu)的構(gòu)建過程如下根據(jù)Fc和CTLA-M、CTLAs-N的編碼DNA序列，設(shè)計(jì)如下兩種引物Primer M5′-taaccatttccatccataattaatctgaggttgtctggaacccag-3′(SEQ ID NO22)Primer N5′-cttattttattcccatcaattgaacatgcccaccgtgcccagcac-3′(SEQ ID NO23)以前述的CTLAs-N和帶有全長IgG1基因的質(zhì)粒DNA為模板，CTLAs-N、IgG1Fc-3′和Primer N為引物進(jìn)行PCR，在瓊脂糖凝膠電泳上獲得分子量約為1049bp的單一條帶后進(jìn)行膠回收。獲得的DNA按照常規(guī)方法克隆到pUC18載體上后轉(zhuǎn)化大腸桿菌并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，通過酶切鑒定和測序確認(rèn)了一個(gè)序列完全正確的克隆，記作CTLAs-N/Fc。
重復(fù)上述程序，不同點(diǎn)在于用Primer M替換Primer N，用CTLAs-M替換CTLAs-N。結(jié)果獲得了CTLAs-M與Fc的融合基因，記作CTLAs-M/Fc。
(2)基因的克隆與序列測定首先通過下列操作對上述擴(kuò)增的天然CTLA、人工設(shè)計(jì)的CTLA片段和pUC18進(jìn)行酶切，反應(yīng)體系為

上述體系在37度反應(yīng)過夜，在0.8％瓊脂糖電泳上進(jìn)行分離鑒定，用Promega公司的膠回收試劑盒回收大小正確的片段，天然CTLA得到約3微克DNA，人工設(shè)計(jì)的CTLA約4微克，pUC18得到約3.3微克DNA。
取上述pUC18 DNA和CTLA DNA按照下述程序進(jìn)行連接反應(yīng)體系

上述體系在16度反應(yīng)過夜后，按照常規(guī)方法將上述連接好的重組DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株，并在IPTG/X-Gal平板培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。取人工設(shè)計(jì)的CTLAs-M的白斑28個(gè)、天然CTLAs-N的白色克隆6個(gè)接種于含有氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基，37度培養(yǎng)過夜后利用Promega公司的質(zhì)粒抽提純化試劑盒抽取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，發(fā)現(xiàn)其中人工CTLAs-M的克隆中有16個(gè)克隆具有正確大小，天然CTLAs的克隆中有4個(gè)大小與預(yù)期相符。這些克隆作為測序的候選克隆。
從上述人工設(shè)計(jì)CTLAs-M的16個(gè)克隆中選10個(gè)，從天然CTLAs-N克隆中選取2個(gè)進(jìn)行DNA測序，測序工作委托上?；倒具M(jìn)行。測序結(jié)果表明，獲得了序列正確的CTLAs-M/Fc和CTLAs-N/Fc克隆。
2.8. CTLA基因的表達(dá)載體克隆(1).融合基因DNA和載體DNA的準(zhǔn)備前述工作已經(jīng)構(gòu)建了CTLAs-N/Linker/Fc、CTLAs-M/Linker/Fc、CTLAs-M/Fc、CTLAs-N/Fc四種融合蛋白基因。將上述確認(rèn)的正確克隆接種于含有氨芐青霉素的20毫升液體LB培養(yǎng)基，37度培養(yǎng)過夜，用Promega公司的Midi質(zhì)粒DNA抽提純化試劑盒抽提質(zhì)粒DNA，各得質(zhì)粒DNA約30微克。
按照下述條件進(jìn)行酶切并進(jìn)行膠回收，獲得各融合基因的DNA片段和準(zhǔn)備好的pMSG載體(Pharmacia公司)(圖5)。
反應(yīng)體系

上述體系在37度反應(yīng)過夜，在0.8％瓊脂糖電泳上進(jìn)行分離鑒定，用Promega公司的膠回收試劑盒回收大小約為1500b的片段，CTLAs-N/Linker/Fc、CTLAs-M/Linker/Fc、CTLAs-M/Fc、CTLAs-N/Fc各得到約1.2微克、2.7微克、1.6微克、1.8微克DNA，pMSG得到約3.4微克。
(2).將融合基因片段重組到pMSG表達(dá)載體通過下述反應(yīng)將CTLAs-N/Linker/Fc、CTLAs-M/Linker/Fc、CTLAs-M/Fc、CTLAs-N/Fc基因連接到pMSG載體上并進(jìn)行轉(zhuǎn)化和藍(lán)白斑篩選反應(yīng)體系

上述反應(yīng)體系在16度反應(yīng)過夜(10小時(shí)以上)。
(3).細(xì)菌的轉(zhuǎn)化、克隆的鑒定與測序上述體系在16度反應(yīng)過夜后，按照常規(guī)方法將上述連接好的重組DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株，并在IPTG/X-Gal平板培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。各取白斑12個(gè)接種于LB液體培養(yǎng)基37度培養(yǎng)后抽取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，每種融合基因至少獲得4個(gè)具有正確大小的插入片段的克隆，作為候選克隆。
將上述候選克隆中的兩個(gè)進(jìn)行DNA測序，測序工作委托上?；倒具M(jìn)行。根據(jù)測序結(jié)果，分別確認(rèn)CTLAs-N/Linker/Fc、CTLAs-M/Linker/Fc、CTLAs-M/Fc、CTLAs-N/Fc分別有3個(gè)、2個(gè)、1個(gè)和1個(gè)克隆的序列與設(shè)計(jì)的完全一致。
上述研究中獲得的正確克隆分別稱之為pMSG[CTLAs-N/Linker/Fc]、pMSG[CTLAs-M/Linker/Fc]、pMSG[CTLAs-M/Fc]、pMSG[CTLAs-N/Fc]。(N代表天然的，M代表突變的)。
實(shí)施例3重組人CD2結(jié)合蛋白的細(xì)胞株構(gòu)建3.1. FLA3胞外區(qū)編碼基因的分析與設(shè)計(jì)FLA3(也稱為CD58)的天然DNA序列(GenBank Accession NumberNM_001779)如SEQ ID NO24所示，其中第10-762位為全長蛋白質(zhì)編碼區(qū)，第10-369位為CD2結(jié)合區(qū)域的編碼區(qū)。對應(yīng)的氨基酸序列SEQ ID NO25所示，全長為250個(gè)氨基酸，第1-120位為CD2結(jié)合區(qū)域。
據(jù)此，可以設(shè)計(jì)引物，利用PCR方法將該區(qū)擴(kuò)增出來，并與人IgG1 Fc片段構(gòu)成融合蛋白FLA3Ig。其氨基酸序列如SEQ ID NO26所示，其中第1-120位為CD2結(jié)合區(qū)域，第121-347為IgG1 Fc片段。
將天然的CD2結(jié)合區(qū)和IgG1的Fc編碼區(qū)重組，所形成的融合基因的DNA編碼序列如SEQ ID NO27所示，其中第1-360位CD2結(jié)合區(qū)的編碼序列。
如同前述，為了獲得在CHO細(xì)胞中的高表達(dá)，按照哺乳動(dòng)物細(xì)胞對密碼子的偏愛性，設(shè)計(jì)了適合CHO細(xì)胞表達(dá)的FLA3-Ig融合蛋白基因，如SEQ IDNO28所示，其中第1-360位CD2結(jié)合區(qū)的編碼序列。
上述構(gòu)建的融合基因的表達(dá)產(chǎn)物為FLA3-Ig，其成熟蛋白的結(jié)構(gòu)如圖6所示。
3.2 FLA3胞外區(qū)基因的獲得根據(jù)前述的FLA3胞外區(qū)的cDNA序列和人工設(shè)計(jì)的序列，分別用PCR方法進(jìn)行相應(yīng)區(qū)段DNA的擴(kuò)增和全長合成，分別得到該區(qū)的天然編碼片段和人工設(shè)計(jì)的編碼片段。操作如下天然編碼片段重組表達(dá)載體的構(gòu)建
FLA3天然編碼片段的獲得根據(jù)其cDNA的序列，合成如下引物正向引物5′-ATGGTTGCTGGGAGCGACGC-3′(SEQ ID NO29)反向引物5′-tttacccggagacagggagag-3′(SEQ ID NO30)合成的引物按照1.0OD溶于100微升無菌水的比例進(jìn)行溶解，稀釋10倍后使用。PCR條件為模板DNA(100ng/ul)1ul，10mM dNTPs 1.5ul，2ul 10X PCR，1.5ul 25mM MgCl2，引物各1ul，加水至20ul的終體積。循環(huán)條件預(yù)變性94C 2分鐘，主循環(huán)為94C30秒，56C 30秒，72C 1分鐘，30循環(huán)后進(jìn)行3分鐘后延伸。
PCR完畢，在1.2％瓊脂糖凝膠電泳上分析PCR產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)在350～400bp靠近350bp處有一條惟一的帶。此帶大小與理論大小相符，為目標(biāo)帶。用膠回收試劑盒對該帶進(jìn)行DNA回收，常規(guī)方法克隆到T-載體(購自Promega公司)上，挑選陽性克隆后進(jìn)行測序驗(yàn)證。在5個(gè)測序的克隆中有兩個(gè)序列與預(yù)期的完全一致，取其中pFLA3-N保存?zhèn)溆谩?br> 3.3 全長FLA3Ig融合蛋白基因的合成上游正向引物5′-gctagcATGGTTGCTGGGAGCGACGC-3′(SEQ IDNO31)(含酶切位點(diǎn)Nhe I)拼接正向引物5′-GAAGTTCTTTCTTTATGTCGACAAAACTCACACATGCCCA-3′(SEQ IDNO32)拼接反向引物5′-TGGGCATGTGTGAGTTTTGTCGACATAAAGAAAGAACTTC-3′(SEQ IDNO33)下游反向引物5′-TTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCctcgag-3′(SEQ IDNO34)(含酶切位點(diǎn)XhoI)以上述引物和pFLA3-N和pIGG-1為模板，用上述4種引物進(jìn)行重迭PCR，擴(kuò)增合成全長FLA3-N/Ig基因。獲得全長基因后克隆到pGEM-T載體(Promega公司產(chǎn)品)上，測序驗(yàn)證后取一個(gè)序列完全正確的克隆，保存?zhèn)溆?。該克隆記作pFLA3Ig-N。
3.4. FLA3Ig人工基因的全合成根據(jù)設(shè)計(jì)的人工基因序列，設(shè)計(jì)12個(gè)片段，每個(gè)長度約85bp。設(shè)計(jì)引物時(shí)在全序列的兩側(cè)加上酶切位點(diǎn)。委托上海生工公司合成后用PCR方法獲得該基因片段的1041bp的全長擴(kuò)增產(chǎn)物。然后，用對其進(jìn)行鑒定、克隆和測序，最終找到1個(gè)克隆具有完全正確的序列，保存?zhèn)溆?。該克隆記作pFLA3Ig-M。
3.5. 重組人CD2結(jié)合蛋白的細(xì)胞株構(gòu)建與實(shí)施例2中構(gòu)建CTLA4Ig表達(dá)載體的一樣，將上述FLA3Ig-N和FLA3Ig-M的結(jié)構(gòu)基因插入到pMSG表達(dá)載體(圖5)上，經(jīng)篩選獲得陽性克隆后進(jìn)行DNA測序以驗(yàn)證所得重組子的正確性。
實(shí)施例4重組CHO細(xì)胞的獲得1).質(zhì)粒DNA的提取與純化取實(shí)施例1-3中制備的帶有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株，分別接種于500ml加入了氨芐青霉素的2xYT液體培養(yǎng)基，37度260rpm震蕩培養(yǎng)16小時(shí)后用Qiagen公司的Ultrapure Plasmid Purification Kit抽提質(zhì)粒DNA，抽提過程按照廠家提供的說明書進(jìn)行。
2).CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與篩選采用脂質(zhì)體法對CHO細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogene公司，轉(zhuǎn)染時(shí)分別取上述純化的質(zhì)粒DNA 100微克作為樣品對CHO細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染操作程序按照廠家的說明書進(jìn)行。
轉(zhuǎn)染后的CHO細(xì)胞經(jīng)連續(xù)3個(gè)月的氨甲喋呤(MTX)篩選，其濃度從0.05uM到10uM，每兩周增加一次濃度，每次MTX的用量約為前一次的2倍，具體視細(xì)胞生長情況而定。細(xì)胞培養(yǎng)按照常規(guī)進(jìn)行，培養(yǎng)基為15％胎牛血清(Gibco)+RPM1640/DEME。于37度5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然后按照常規(guī)極度稀釋法進(jìn)行單克隆化。然后，用ELISA方法分別檢測各克隆目標(biāo)重組蛋白的表達(dá)量，并據(jù)此每種融合基因挑選若干個(gè)表達(dá)量最高的克隆，確認(rèn)其中一個(gè)表達(dá)量高而穩(wěn)定的克隆用于進(jìn)一步的研究。
結(jié)果1.CTLA4Ig融合蛋白總共得到pMSG[CTLAs-N/Linker-N/Fc]克隆110個(gè)、pMSG[CTLAs-M/Linker-N/Fc]克隆87個(gè)、pMSG[CTLAs-M/Fc]克隆93個(gè)、pMSG[CTLAs-N/Fc]克隆112個(gè)。分別得到高表達(dá)克隆5個(gè)，1個(gè)，2個(gè)，2個(gè)。
2.抗CD11a單抗得到1850個(gè)克隆，其中CD11-1 960個(gè)，CD11-2 890個(gè)。前者得到2個(gè)高表達(dá)克隆，后者得到5個(gè)高表達(dá)克隆。
3.FLA3Ig總共得到428個(gè)高表達(dá)克隆，其中FLA3Ig-N4個(gè)，F(xiàn)LA3Ig-M2個(gè)。
3)融合基因表達(dá)水平的研究用ELISA方法對上述部分克隆的CTLAs-Fc融合基因在CHO細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行了研究，具體數(shù)據(jù)如下表3

以上數(shù)據(jù)說明，CTLAs-M的表達(dá)強(qiáng)度在有Linker和沒有Linker的融合結(jié)構(gòu)中均有明顯增強(qiáng)的表達(dá)。這說明，基因的人工設(shè)計(jì)明顯提高了其表達(dá)水平，提高的幅度高達(dá)14.6倍。這說明人工設(shè)計(jì)的CTLAs-M基因在CHO細(xì)胞中有明顯提高了的表達(dá)，對該蛋白質(zhì)的規(guī)模生產(chǎn)具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
實(shí)施例5重組蛋白的純化5.1 抗人CD11a單抗的純化一種抗人CD11a單抗的純化工藝流程可以是蛋白A柱→反相柱→分子篩。在該工藝中，由于重組單抗是分泌型表達(dá)的，因此培養(yǎng)上清經(jīng)過簡單離心，除去細(xì)胞殘片后即可直接進(jìn)行親和層析。用protein A親和層析時(shí)，可以使用如下方法中的一種將protein A填料按照每100毫升上清1毫升的比例加入填料后，在4度慢速攪拌24小時(shí)。然后在100mM pH8.2的Tris-H2SO4緩沖液中漂洗4次后，用含250mM氯化鈉的同樣緩沖液洗脫后進(jìn)行硫酸銨分步沉淀，起始濃度為35％飽和度，終止?jié)舛?3％飽和度。4度處理12小時(shí)后高速離心，取沉淀，重新溶于上述不含氯化鈉的緩沖液中，并于同樣緩沖液透析過夜后濃縮10倍，待用。
上述樣品可經(jīng)SDS-PAGE或HPLC檢定純度，ACD法或Follin酚法定量蛋白質(zhì)含量。經(jīng)上述純化的重組蛋白，其純度可達(dá)90％以上，并具有顯著生物活性。
第二種方法是把protein A裝成柱子，用手動(dòng)的或自動(dòng)的上樣設(shè)備上樣后，經(jīng)過100mM Tris-HCl pH8.5的緩沖液洗滌四體積后，用含100～400mM氯化鈉的洗脫液洗脫，即可獲得經(jīng)protein A捕捉的單克隆抗體。洗脫峰在233～260mMNaCl處被洗脫，所得樣品可再經(jīng)反向?qū)游龊头肿雍Y進(jìn)一步純化，可得到純度達(dá)93％以上的重組蛋白。這種方法操作可自動(dòng)化，并連接在線監(jiān)測設(shè)備，可隨時(shí)了解操作狀況。
單克隆抗體也可以不經(jīng)過protein A親和層析，直接使用硫酸銨分步沉淀法進(jìn)行純化。其得率可達(dá)到12％，純度可達(dá)90％以上。
5.2 重組人CTLA4Ig融合蛋白的純化一種重組人CTLA4Ig融合蛋白的純化工藝流程可以是蛋白A柱→分子篩→離子交換柱→疏水層析。
與CD11a單克隆抗體一樣，CTLA4Ig也具有同樣的Fc片段，因此也可用protein A進(jìn)行親和層析。親和層析的條件與CD11a基本一致，只是在洗脫時(shí)需降低NaCl的用量，梯度洗脫時(shí)的用量降到190～210mM，批量洗脫時(shí)可用210mM。
在CTLA4Ig純化工藝中，親和層析獲得的重組蛋白需要經(jīng)過G75分子篩去除部分大分子和小分子雜質(zhì)，更換緩沖液至pH7.5的100mM磷酸緩沖液，然后上到Q-Sepharose柱上，4體積洗滌后用含250mM NH4SO4的50mM Tris-HCl溶液洗脫。洗脫液可直接上Octyle-O柱進(jìn)行疏水層析，50mM Tris pH7.5洗脫后即可保存?zhèn)溆谩?br> 該方法獲得的樣品純度可達(dá)95％以上，總得率在75％以上，是一種比較理想的純化方法。該方法容易放大，適宜工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)。
5.3 重組人FLA3Ig融合蛋白的純化一種重組人FLA3Ig融合蛋白的純化工藝流程可以是蛋白A柱→離子交換柱→疏水層析→分子篩。
FLA3Ig融合蛋白的純化與上述CTLA4Ig的純化過程一樣都包含了protein A親和層析，且上樣和洗脫條件一致。洗脫物經(jīng)過QA-柱進(jìn)行再次純化，洗脫劑為含250mM NH2SO4的Tris-HCl緩沖液，洗脫液直接上疏水層析柱，洗脫液為50mM Tris-HCl緩沖液。洗脫液經(jīng)過Sephadex G200 SF進(jìn)一步分離后，其純度可達(dá)98％，總得率為11.7％左右。
該方法具有操作簡便，容易放大的特點(diǎn)，容易進(jìn)行工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)。
實(shí)施例6免疫功能下調(diào)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證6.1. 抗人CD11a單克隆抗體生理活性和親和力研究(1)生理活性混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)對實(shí)施例1獲得的細(xì)胞株所產(chǎn)生的單克隆抗體，進(jìn)行了生物學(xué)活性檢測。具體方法和結(jié)果如下常規(guī)分離人外周血淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106cells/ml，將兩人PBMC(同種異體雙向MLR(mixed lymphocyte responses))等體積混合后以2×105cells/孔接種“U”型96孔培養(yǎng)板，加入不同體積的純化融合蛋白，設(shè)置等體積相應(yīng)空載體轉(zhuǎn)染上清或培養(yǎng)基作對照，每組3復(fù)孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)5d，終止培養(yǎng)前16h加入3H-TdR(終濃度5μCi/ml)，收集細(xì)胞于0.45μm微孔濾膜上，烘干，液體閃爍計(jì)數(shù)儀測DPM值。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果以x±s表示，MicrosoftExcel統(tǒng)計(jì)程序進(jìn)行均數(shù)差異顯著性分析。
在MLR反應(yīng)體系中，分別加入1ul、5ul和10ul Protein A純化抗CD11a單克隆抗體表達(dá)載體或空載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞上清，結(jié)果表明，即使加入1ul ProteinA純化表達(dá)得單克隆抗體能顯著抑制人外周血MLR，抑制率為66％～75％；而加入同樣體積的空載體轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞上清，則無此作用。經(jīng)單因素方差分析，其差異達(dá)到極顯著水平，結(jié)果見下表4。同樣，我們也曾用未純化的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清直接進(jìn)行MLR實(shí)驗(yàn)，未能觀察到顯著的抑制作用，這可能與未純化細(xì)胞轉(zhuǎn)染上清中異源蛋白的刺激作用與微量單抗蛋白的抑制作用相互抵消有關(guān)。
表4純化CD11a單克隆抗體對人MLR中淋巴細(xì)胞增殖的影響(DPM，n＝3)

MLR實(shí)驗(yàn)表明該純化融合蛋白具有抑制免疫應(yīng)答反應(yīng)的活性。以上結(jié)果表明，實(shí)施例1成功克隆并在CHO細(xì)胞中表達(dá)了有生物學(xué)活性的抗CD11a單克隆抗體。
上述結(jié)果還表明，CD11-2具有比CD11-1更強(qiáng)的抑制作用。
(2)親和力鑒定親和力測定采用Scatchard分析法(Munson et al，1980，Anal.BioChem.，107220)進(jìn)行。
結(jié)果表明，CD11-1和CD11-2兩種單抗的親和力分別達(dá)到3.2×10-9和8×10-6。上述結(jié)果表明，CD11-1和CD11-2兩株單克隆抗體的親和力已經(jīng)分別達(dá)到1nM和0.1nM的水平，CD11-1已經(jīng)達(dá)到國外已經(jīng)發(fā)表的水平，而CD11-2則比國外已經(jīng)發(fā)表的最好結(jié)果提高了一個(gè)數(shù)量級。
6.2 重組人CTLA4Ig融合蛋白的生物活性研究(1)CTLAs抑制淋巴細(xì)胞增殖能力的研究將上述pMSG[CTLAs-N/Linker/Fc]、pMSG[CTLAs-M/Linker/Fc]、pMSG[CTLAs-M/Fc]、pMSG[CTLAs-N/Fc]的表達(dá)細(xì)胞株培養(yǎng)后用Protein A-Sepharose進(jìn)行親和層析，獲得純度達(dá)90％以上的融合蛋白。
常規(guī)分離人外周血淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106cells/ml，將兩人PBMC(同種異體雙向MLR)等體積混合后以2×105cells/孔接種“U”型96孔培養(yǎng)板，加入不同量的純化融合蛋白，設(shè)置等體積相應(yīng)空載體轉(zhuǎn)染上清或培養(yǎng)基作對照，每組3復(fù)孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)5d，終止培養(yǎng)前16h加入3H-TdR(終濃度5μCi/ml)，收集細(xì)胞于0.45μm微孔濾膜上，烘干，液體閃爍計(jì)數(shù)儀測DPM值。結(jié)果以x±s表示，Microsoft Excel統(tǒng)計(jì)程序進(jìn)行均數(shù)差異顯著性分析。
在MLR反應(yīng)體系中，分別加入1微克、5微克和10微克Protein A純化純化的CTLAs-N/Linker/Fc、CTLAs-M/Linker/Fc、CTLAs-M/Fc、CTLAs-N/Fc或空載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞上清，結(jié)果表明，即使加入1微克Protein A純化的融合蛋白，也能顯著抑制人外周血MLR，抑制率為60％～70％；而加入同樣體積的空載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞上清，則無此作用，經(jīng)單因素方差分析，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表5)。同樣，也曾用未純化的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清直接進(jìn)行MLR實(shí)驗(yàn)，未能觀察到顯著的抑制作用，這可能與未純化細(xì)胞轉(zhuǎn)染上清中異源蛋白的刺激作用與微量融合蛋白的抑制作用相互抵消有關(guān)。
表5純化CTLA-4/Ig對人MLR中淋巴細(xì)胞增殖的影響(DPM，n＝3) *P＜0.01 vs control；△P＜0.01 vs 0從以上數(shù)據(jù)可以看出，加入Linker的融合蛋白比沒有Linker的融合蛋白對人外周血MLR的抑制作用提高了大約1.5倍。這說明，Linker的加入可以明顯提高融合蛋白對淋巴細(xì)胞的抑制能力。
6.3 重組人FLA3Ig融合蛋白的生物活性研究(1)Jurkat細(xì)胞結(jié)合試驗(yàn)Jurkat細(xì)胞表面有CD2，以培養(yǎng)的此種細(xì)胞，用含有10％胎牛血清的RPMI洗滌三次后制備成5×106細(xì)胞/ml的懸液，在一個(gè)6孔細(xì)胞板每個(gè)孔中加入1ml細(xì)胞懸液。在3個(gè)孔中分別加入10微克純化的FLA3Ig，3個(gè)孔中分別介入TNFRIg(陰性對照)。0C溫育4小時(shí)后，用RPMI培養(yǎng)基輕輕洗滌2次后，加入HRP標(biāo)記的羊抗人IgG單克隆抗體，RPMI洗滌4次后加入DAB顯色劑和H2O2，37度溫育10分鐘。在40X和100X相差顯微鏡下觀察細(xì)胞顏色反應(yīng)和細(xì)胞相互結(jié)合的情況。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陰性對照無顯色反應(yīng)，而FLA3Ig孔中的細(xì)胞呈棕色顯色反應(yīng)。顯微鏡觀察表明，Jurkat細(xì)胞有明顯的凝集現(xiàn)象。這種現(xiàn)象是由于FLA3Ig是一個(gè)二價(jià)分子，部分分子的兩個(gè)臂分別結(jié)合了一個(gè)細(xì)胞，從而導(dǎo)致了細(xì)胞的凝集。此種反應(yīng)與凝集素凝集血紅細(xì)胞的情況十分相似。
(2)FACS測定在Eppendorf管中加入1×105Jurkat細(xì)胞，1000RPM離心收集細(xì)胞，重懸浮于100ul濃度為10ug/ml的LFA3Ig溶液中，緩沖液成分為含0.5％BSA的PBS，pH7.2.混合充分后冰浴30分鐘，用上述緩沖液洗滌2次后與100ul 1∶50稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗人IgG單克隆抗體冰浴30分鐘后用PBS洗滌兩次，再重懸于300ul PBS中。上述試驗(yàn)以TNFRIg為陰性對照。上述重懸的細(xì)胞在FACS儀器上進(jìn)行分析。
結(jié)果如圖7所示。陰性對照TNFRIg進(jìn)行FACS時(shí)未出現(xiàn)熒光。從圖7中可以看出，F(xiàn)LA3Ig具有明顯的與Jurkat細(xì)胞結(jié)合的能力。
(3)MLR反應(yīng)從兩個(gè)無親緣關(guān)系的供者各抽取20毫升新鮮血液，F(xiàn)icoll梯度分離白細(xì)胞。其中之一種細(xì)胞用2000RADs進(jìn)行r射線處理。上述兩種細(xì)胞均調(diào)至3×106細(xì)胞/ml。
將兩人PBMC(同種異體雙向MLR)等體積混合后以2×105cells/孔接種“U”型96孔培養(yǎng)板，加入不同量的純化融合蛋白，設(shè)置等體積相應(yīng)空載體轉(zhuǎn)染上清或培養(yǎng)基作對照，每組3復(fù)孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)5d，終止培養(yǎng)前16h加入3H-TdR(終濃度5uCi/ml)，收集細(xì)胞于0.45um微孔濾膜上，烘干，液體閃爍計(jì)數(shù)儀測DPM值。結(jié)果以x±s表示，Microsoft Excel統(tǒng)計(jì)程序進(jìn)行均數(shù)差異顯著性分析。
在MLR反應(yīng)體系中，分別加入1微克、5微克和10微克Protein A純化的FLA3Ig-N，F(xiàn)LA3Ig-M或空載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞上清(陰性對照)，結(jié)果表明，即使加入1微克Protein A純化的融合蛋白，也能顯著抑制人外周血MLR，抑制率為60％～70％；而加入同樣體積的空載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞上清，則無此作用，經(jīng)單因素方差分析，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表6)。同樣，也曾用未純化的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清直接進(jìn)行MLR實(shí)驗(yàn)，未能觀察到顯著的抑制作用，這可能與未純化細(xì)胞轉(zhuǎn)染上清中異源蛋白的刺激作用與微量融合蛋白的抑制作用相互抵消有關(guān)。
表6純化FLA3Ig對人MLR中淋巴細(xì)胞增殖的影響(DPM，n＝3) *P＜0.01 vs control；△P＜0.01 vs 0從上述數(shù)據(jù)可以看出，F(xiàn)LA3Ig-M的相對活性明顯比FLA3Ig-N高?？紤]到二者蛋白質(zhì)的氨基酸序列完全相同，顯然這種差別是由于表達(dá)量不同引起的。這也說明，F(xiàn)LA3Ig-M的DNA編碼序列比FLA3Ig-N的DNA序列更適合CHO細(xì)胞中表達(dá)。
實(shí)施例7臨床應(yīng)用的動(dòng)物模型驗(yàn)證對上述三類6種其中抗體2種(CD11-1和CD11-2)，F(xiàn)LA3Ig 2種(FLA3Ig-N和FLA3Ig-M)，CTLA4/Fc 2種(CTLAs-M/Fc和CTLAs-M/Fc)物質(zhì)的功能進(jìn)行了動(dòng)物模型試驗(yàn)，主要研究結(jié)果如下7.1. 對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型的治療作用(1)單藥的治療功能上述6種物質(zhì)各自單獨(dú)使用，進(jìn)行了如下研究。
100.mu.gII型膠原(CII)加入完全弗氏佐劑，皮內(nèi)注射B10.RIII小鼠，14天后再重復(fù)一次，這時(shí)小鼠體內(nèi)出現(xiàn)膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(CIA)癥狀，28天后92％小鼠顯示嚴(yán)重的CIA癥狀。對小鼠腹膜注射本發(fā)明的抗CD11a單克隆抗體，觀測其在小鼠體內(nèi)對CIA的癥狀的影響作用。12周后進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)組小鼠每周3次，每次注射10.mu.g前述制備的6種物質(zhì)，從第1天到35天；給對照組小鼠注射PBS作為陰性對照。
觀察發(fā)現(xiàn)，對照組小鼠均發(fā)生關(guān)節(jié)紅腫、關(guān)節(jié)僵硬等癥狀，在給藥組則只有輕微的腫脹，但未發(fā)生關(guān)節(jié)僵硬等嚴(yán)重癥狀。這表明6種物質(zhì)與對照組相比，均能夠顯著降低類風(fēng)濕的嚴(yán)重程度。因此，本發(fā)明的單抗有可能開發(fā)成為治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或其他自身免疫疾病的藥物。
(2).組合用藥的治療功能從前述3類6種藥物中各選1種(CD11-1，F(xiàn)LA3Ig-N和CTLAs-N/Fc)，兩兩組合，進(jìn)行了上述同樣的模型進(jìn)行抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究，結(jié)果如下表7所示。
表7

從上述結(jié)果可以看出，當(dāng)兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，比單獨(dú)應(yīng)用治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的效果要好。
7.2 抗免疫排斥試驗(yàn)—小鼠器官移植試驗(yàn)(1).單藥的抗排斥試驗(yàn)上述抗體用于小鼠心臟抑制試驗(yàn)時(shí)，可以明顯提高受試動(dòng)物的存活率和平均存活天數(shù)。下表8顯示了該試驗(yàn)的結(jié)果。供試藥物為抗人CD11a單克隆抗體、FLA3Ig和CTLA4Ig。
正常昆明種小白鼠，雌雄各半，每組12只。其中6只為受體，6只為供體進(jìn)行心臟移植。
表8

O＝陰性對照空白上清；A＝CD11-1，B＝CTLAs-N/Fc，C＝FLA3Ig，D＝CD11-1+FLA3Ig-N，E＝CD11-1+CTLAs-N/Fc，F(xiàn)＝FLA3Ig-N+CTLAs-N/Fc。
從上述實(shí)驗(yàn)中可以看出，鼠源和人源化的抗人CD11a單克隆抗體、FLA3Ig和CTLA4Ig都能顯著提高器官移植受體的30日存活率和平均存活天數(shù)。顯示這些免疫功能下調(diào)的藥物具有一定的克服免疫抑制效應(yīng)的功能，有可能用于抗免疫排斥的藥物開發(fā)。
(2)組合用藥的抗排斥試驗(yàn)上表中的組合藥物試驗(yàn)中，也顯示了三種藥物具有明顯的抗免疫排斥的作用，其中CD11的效果明顯優(yōu)于其他藥物。組合藥物的情況下，同樣顯示了含有CD11-1組份時(shí)效果明顯提高，且常常表現(xiàn)藥物間明顯的加性效應(yīng)。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>馬，菁<120>免疫調(diào)節(jié)劑及其應(yīng)用<130>027424<160>37<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>121<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(121)<223>抗CD11抗體重鏈<400>1Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His20 25 30Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Ile Tyr Phe Tyr Gly Thr Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>2<211>108<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(108)<223>抗CD11抗體輕鏈<400>2Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Thr Ile Ser Lys Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Leu85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105<210>3<211>120<212>PRT
<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(120)<223>抗CD11抗體重鏈<400>3Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Ile Ser Cys Ala Ser Ser Gly Tyr Ser Thr Thr Gly His20 25 30Trp Ser Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Gly Ile Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60Lys Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Thr Cys Ala85 90 95Arg Gly Ile Tyr Phe Tyr Gly Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Glu100 105 110Gly Tyr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210>4<211>109<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(109)<223>抗CDll抗體輕鏈<400>4Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Met Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Lys Thr Ile Ser Lys Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Pro Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80Gln Asp Phe Ala Thr Tyr Thr Cys Gln Gln His Asn Glu Thr Pro Pro85 90 95Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105<210>5<211>223<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>5Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala1 5 10 15Ala Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro20 25 30Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala35 40 45Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly50 55 60Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln65 70 75 80Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Thr Gly Asn Glu Leu Thr85 90 95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val100 105 110Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile115 120 125Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly130 135 140Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser145 150 155 160Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe165 170 175Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys180 185 190Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu195 200 205Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn210 215 220<210>6<211>672<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>misc_feature<222>(109)..(483)<223>胞外結(jié)構(gòu)域編碼序列<400>6atggcttgcc ttggatttca gcggcacaag gctcagctga acctggctgc caggacctgg60ccctgcactc tcctgttttt tcttctcttc atccctgtct tctgcaaagc aatgcacgtg 120gcccagcctg ctgtggtact ggccagcagc cgaggcatcg ccagctttgt gtgtgagtat 180gcatctccag gcaaagccac tgaggtccgg gtgacagtgc ttcggcaggc tgacagccag 240gtgactgaag tctgtgcggc aacctacatg acggggaatg agttgacctt cctagatgat 300tccatctgca cgggcacctc cagtggaaat caagtgaacc tcactatcca aggactgagg 360gccatggaca cgggactcta catctgcaag gtggagctca tgtacccacc gccatactac 420ctgggcatag gcaacggaac ccagatttat gtaattgatc cagaaccgtg cccagattct 480gacttcctcc tctggatcct tgcagcagtt agttcggggt tgttttttta tagctttctc 540ctcacagctg tttctttgag caaaatgcta aagaaaagaa gccctcttac aacaggggtc 600tatgtgaaaa tgcccccaac agagccagaa tgtgaaaagc aatttcagcc ttattttatt 660cccatcaatt ga 672<210>7<211>387<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(387)<223>人工設(shè)計(jì)CTLA DNA序列<400>7caggctagca tggccatgca cgtggcccag cccgccgtgg tgctggcctc ctcccgcggc60atcgcctcct tcgtgtgcga gtacgcctcc cccggcaagg ccaccgaggt gcgcgtgacc 120gtgctgcgcc aggccgactc ccaggtgacc gaggtgtgcg ccgccaccta catgaccggc 180aacgagctga ccttcctgga cgactccatc tgcaccggca cctcctccgg caaccaggtg 240aacctgacca tccagggcct gcgcgccatg gacaccggcc tgtacatctg caaggtggag 300ctgatgtacc ccccccccta ctacctgggc atcggcaacg gcacccagat ctacgtgatc 360gaccccgagc cctgccccga ctccgac 387<210>8<211>58<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(58)<223>引物
<400>8caggctagca tggccatgca cgtggcccag cccgccgtgg tgctggcctc ctcccgcg 58<210>9<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(32)<223>引物<400>9caggctagca tggcaatgca cgtggcccag cc 32<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<222>(1)..(75)<223>接頭序列<400>11accacaacct cgtcaaccac aacctcgtca accacaacct cgtcaaccac aacctcgtca60accacaacct cgtca 75<210>12<211>120<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<222>(1)..(120)<223>接頭序列<400>13
cttattttat tcccatcaat tgaaccacaa cctcgtcaac cacaacctcg tcaaccacaa60cctcgtcaac cacaacctcg tcaaccacaa cctcgtcaac atgcccaccg tgcccagcac 120<210>14<211>1416<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>14atggaactgg ggctccgctg ggttttcctt gttgctattt tagaaggtgt ccagtgtgag 60gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcctg gtcaagcctg gggggtccct gagactctcc120tgtgcagcct ctggattcac cttcagtagc tatagcatga actgggtccg ccaggctcca180gggaaggggc tggagtgggt ctcatcgatg agtagtagta gtagttacat atactacgca240gactcagtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaactc actgtatctg300caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag agatctccgc360cagctaactt cctactggta cttcgatctc tggggccgtg gcaccctggt cactgtctcc420tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct480gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg540tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc600tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag660acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag720cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg780ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc840cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac900tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac960aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 1020aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1080tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1140gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1200atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1260gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1320tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1380acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga 1416<210>15<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(19)<223>引物<400>15atggaactgg ggctccgct 19<210>16<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(18)<223>引物<400>16tcatttaccc ggagacag 18<210>17<211>232<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(232)<223>人IgG1 Fc(絞鏈區(qū)+CH2+CH3)片段的氨基酸序列
<400>17Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala1 5 10 15Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro20 25 30Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val35 40 45Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val50 55 60Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln65 70 75 80Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln85 90 95Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala100 105 110Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro115 120 125Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr130 135 140Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser145 150 155 160Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr165 170 175Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr180 185 190Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe195 200 205Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys210 215 220Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys225 230<210>18<211>696<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(696)<223>適合CHO細(xì)胞表達(dá)的人IgG1 Fc編碼序列<400>18gagcccaagt cctgcgacaa gacccacacc tgccccccct gccccgcccc cgagctgctg60ggcggcccct ccgtgttcct gttccccccc aagcccaagg acaccctgat gatctcccgc 120acccccgagg tgacctgcgt ggtggtggac gtgtcccacg aggaccccga ggtgaagttc 180aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagccccg cgaggagcag 240tacaactcca cctaccgcgt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 300ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgtccaac aaggccctgc ccgcccccat cgagaagacc 360atctccaagg ccaagggcca gccccgcgag ccccaggtgt acaccctgcc cccctcccgc 420gacgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgcctgg tgaagggctt ctacccctcc 480gacatcgccg tggagtggga gtccaacggc cagcccgaga acaactacaa gaccaccccc 540cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctgtactcca agctgaccgt ggacaagtcc 600cgctggcagc agggcaacgt gttctcctgc tccgtgatgc acgaggccct gcacaaccac 660tacacccaga agtccctgtc cctgtccccc ggcaag 696<210>19<211>699<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>19gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg60gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg420gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc480gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct540cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc600aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac660tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaatga 699<210>20<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(31)<223>引物<400>20gcactcgagt tttacccgga gacagggaga g 31<210>21<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(23)<223>引物<400>21gagcccaaat cttgtgacaa aac23<210>22<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(45)<223>引物<400>22taaccatttc catccataat taatctgagg ttgtctggaa cccag45<210>23<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(45)<223>引物<400>23cttattttat tcccatcaat tgaacatgcc caccgtgccc agcac45<210>24<211>900<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>24cgacgagcca tggttgctgg gagcgacgcg gggcgggccc tgggggtcct cagcgtggtc 60tgcctgctgc actgctttgg tttcatcagc tgtttttccc aacaaatata tggtgttgtg120tatgggaatg taactttcca tgtaccaagc aatgtgcctt taaaagaggt cctatggaaa180aaacaaaagg ataaagttgc agaactggaa aattctgaat tcagagcttt ctcatctttt240
aaaaataggg tttatttaga cactgtgtca ggtagcctca ctatctacaa cttaacatca300tcagatgaag atgagtatga aatggaatcg ccaaatatta ctgataccat gaagttcttt360ctttatgtgc ttgagtctct tccatctccc acactaactt gtgcattgac taatggaagc420attgaagtcc aatgcatgat accagagcat tacaacagcc atcgaggact tataatgtac480tcatgggatt gtcctatgga gcaatgtaaa cgtaactcaa ccagtatata ttttaagatg540gaaaatgatc ttccacaaaa aatacagtgt actcttagca atccattatt taatacaaca600tcatcaatca ttttgacaac ctgtatccca agcagcggtc attcaagaca cagatatgca660cttataccca taccattagc agtaattaca acatgtattg tgctgtatat gaatggtatt720ctgaaatgtg acagaaaacc agacagaacc aactccaatt gattggtaac agaagatgaa780gacaacagca taactaaatt attttaaaaa ctaaaaagcc atctgatttc tcatttgagt840attacaattt ttgaacaact gttggaaatg taacttgaag cagctgcttt aagaagaaat900<210>25<211>250<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>25Met Val Ala Gly Ser Asp Ala Gly Arg Ala Leu Gly Val Leu Ser Val1 5 10 15Val Cys Leu Leu His Cys Phe Gly Phe Ile Ser Cys Phe Ser Gln Gln20 25 30Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val Pro Ser Asn35 40 45Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys Asp Lys Val Ala50 55 60Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser Phe Lys Asn Arg65 70 75 80Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Leu Thr85 90 95Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro Asn Ile Thr Asp100 105 110Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Leu Glu Ser Leu Pro Ser Pro Thr115 120 125Leu Thr Cys Ala Leu Thr Asn Gly Ser Ile Glu Val Gln Cys Met Ile130 135 140Pro Glu His Tyr Asn Ser His Arg Gly Leu Ile Met Tyr Ser Trp Asp145 150 155 160Cys Pro Met Glu Gln Cys Lys Arg Asn Ser Thr Ser Ile Tyr Phe Lys165 170 175Met Glu Asn Asp Leu Pro Gln Lys Ile Gln Cys Thr Leu Ser Asn Pro180 185 190Leu Phe Asn Thr Thr Ser Ser Ile Ile Leu Thr Thr Cys Ile Pro Ser195 200 205Ser Gly His Ser Arg His Arg Tyr Ala Leu Ile Pro Ile Pro Leu Ala210 215 220Val Ile Thr Thr Cys Ile Val Leu Tyr Met Asn Gly Ile Leu Lys Cys225 230 235 240Asp Arg Lys Pro Asp Arg Thr Asn Ser Asn245 250<210>26<211>347<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(347)<223>融合蛋白FLA3Ig<400>26Met Val Ala Gly Ser Asp Ala Gly Arg Ala Leu Gly Val Leu Ser Val1 5 10 15Val Cys Leu Leu His Cys Phe Gly Phe Ile Ser Cys Phe Ser Gln Gln20 25 30Ile Tyr Gly Val Val Tyr Gly Asn Val Thr Phe His Val Pro Ser Asn35 40 45Val Pro Leu Lys Glu Val Leu Trp Lys Lys Gln Lys Asp Lys Val Ala
50 55 60Glu Leu Glu Asn Ser Glu Phe Arg Ala Phe Ser Ser Phe Lys Asn Arg65 70 75 80Val Tyr Leu Asp Thr Val Ser Gly Ser Leu Thr Ile Tyr Asn Leu Thr85 90 95Ser Ser Asp Glu Asp Glu Tyr Glu Met Glu Ser Pro Asn Ile Thr Asp100 105 110Thr Met Lys Phe Phe Leu Tyr Val Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro115 120 125Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro130 135 140Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr145 150 155 160Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn165 170 175Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg180 185 190Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val195 200 205Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser210 215 220Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys225 230 235 240Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp245 250 255Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe260 265 270Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu275 280 285Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe290 295 300Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly305 310 315 320Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr325 330 335Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys340 345<210>27<211>1041<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1041)<223>融合蛋白FLA3Ig的編碼序列<400>27atggttgctg ggagcgacgc ggggcgggcc ctgggggtcc tcagcgtggt ctgcctgctg 60cactgctttg gtttcatcag ctgtttttcc caacaaatat atggtgttgt gtatgggaat120gtaactttcc atgtaccaag caatgtgcct ttaaaagagg tcctatggaa aaaacaaaag180gataaagttg cagaactgga aaattctgaa ttcagagctt tctcatcttt taaaaatagg240gtttatttag acactgtgtc aggtagcctc actatctaca acttaacatc atcagatgaa300gatgagtatg aaatggaatc gccaaatatt actgatacca tgaagttctt tctttatgtc360gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc420ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca480tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac540ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac600cgggtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag660tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa720gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag780aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag840tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc900gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg960aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1020ctctccctgt ctccgggtaa a 1041<210>28
<211>1041<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1041)<223>密碼子優(yōu)化的FLA3-Ig融合蛋白基因<400>28atggtggccg gctccgacgc cggccgcgcc ctgggcgtgc tgtccgtggt gtgcctgctg 60cactgcttcg gcttcatctc ctgcttctcc cagcagatct acggcgtggt gtacggcaac120gtgaccttcc acgtgccctc caacgtgccc ctgaaggagg tgctgtggaa gaagcagaag180gacaaggtgg ccgagctgga gaactccgag ttccgcgcct tctcctcctt caagaaccgc240gtgtacctgg acaccgtgtc cggctccctg accatctaca acctgacctc ctccgacgag300gacgagtacg agatggagtc ccccaacatc accgacacca tgaagttctt cctgtacgtg360gacaagaccc acacctgccc cccctgcccc gcccccgagc tgctgggcgg cccctccgtg420ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc ctgatgatct cccgcacccc cgaggtgacc480tgcgtggtgg tggacgtgtc ccacgaggac cccgaggtga agttcaactg gtacgtggac540ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag ccccgcgagg agcagtacaa ctccacctac600cgcgtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag660tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgcccgcc cccatcgaga agaccatctc caaggccaag720ggccagcccc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcccccct cccgcgacga gctgaccaag780aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaag ggcttctacc cctccgacat cgccgtggag840tgggagtcca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccccgt gctggactcc900gacggctcct tcttcctgta ctccaagctg accgtggaca agtcccgctg gcagcagggc960aacgtgttct cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1020ctgtccctgt cccccggcaa g 1041<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(20)<223>引物<400>29atggttgctg ggagcgacgc20<210>30<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>引物<400>30tttacccgga gacagggaga g 21<210>31<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(26)<223>引物<400>31gctagcatgg ttgctgggag cgacgc 26<210>32
<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(40)<223>引物<400>32gaagttcttt ctttatgtcg acaaaactca cacatgccca 40<210>33<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(40)<223>引物<400>33tgggcatgtg tgagttttgt cgacataaag aaagaacttc 40<210>34<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(29)<223>引物<400>34tttacccgga gacagggaga ggcctcgag 29<210>35<211>25<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(25)<223>接頭序列<400>35Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ala1 5 10 15Ala Ala Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser20 25<210>36<211>75<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(75)<223>接頭序列的編碼序列<400>36accacaacct cgtcaaccac aacctcgtca accacaacct cgtcaaccac aacctcgtca60accacaacct cgtca 75<210>37
<211>120<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(120)<223>接頭肽的編碼序列及兩側(cè)序列<400>37cttattttat tcccatcaat tgaaccacaa cctcgtcaac cacaacctcg tcaaccacaa60cctcgtcaac cacaacctcg tcaaccacaa cctcgtcaac atgcccaccg tgcccagcac 120
權(quán)利要求
1.一種免疫調(diào)節(jié)劑，其特征在于，所述的免疫調(diào)節(jié)劑是CTLA4Ig融合蛋白，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO5中第37-161位所示的CTLA-4R胞外結(jié)構(gòu)域、和SEQ ID NO17所示的人IgG1的Fc片段。
2.如權(quán)利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)劑，其特征在于，所述的CTLA4Ig融合蛋白在CTLA-4R胞外結(jié)構(gòu)域和人IgG1的Fc片段之間還具有連接肽。
3.如權(quán)利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)劑，其特征在于，所述的CTLA4Ig融合蛋白的CTLA-4R胞外結(jié)構(gòu)域由SEQ ID NO6或7所示的核酸序列所編碼。
4.如權(quán)利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)劑，其特征在于，所述的CTLA4Ig融合蛋白在CTLA-4R胞外結(jié)構(gòu)域和人IgG1的Fc片段之間還具有SEQ ID NO35所示的連接肽。
5.一種分離編碼權(quán)利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)劑的DNA分子。
6.如權(quán)利要求5所述的DNA分子，其特征在于，編碼所述CTLA-4R胞外結(jié)構(gòu)域的部分具有SEQ ID NO6中109-483位的核苷酸序列或SEQ ID NO7所示的核苷酸序列，而編碼所述的人IgG1的Fc片段的部分具有SEQ ID NO14中718-1416位所示的核苷酸序列。
7.一種藥物組合物，其特征在于，它含有藥學(xué)上可接受的載體和權(quán)利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)劑。
8.如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，其特征在于，它還含有選自下組的免疫調(diào)節(jié)劑(a)抗人CD11a單克隆抗體，所述的抗人CD11a單克隆抗體具有SEQ ID NO1或3所示的重鏈序列，和/或SEQ ID NO2或4所示的輕鏈序列；或(b)FLA3Ig融合蛋白，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO25中第1-120位所示的FLA3的CD2結(jié)合區(qū)和SEQ ID NO26中第121-347位所示的人IgG1的Fc片段。
9.如權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其特征在于，所述的CTLA4Ig融合蛋白在CTLA-4R胞外結(jié)構(gòu)域和人IgG1的Fc片段之間還具有SEQ ID NO35所示的連接肽，或者所述的藥物組合物還同時(shí)含有以下二種免疫調(diào)節(jié)劑(a)抗人CD11a單克隆抗體，所述的抗人CD11a單克隆抗體具有SEQ ID NO1或3所示的重鏈序列，和/或SEQ ID NO2或4所示的輕鏈序列；和(b)FLA3Ig融合蛋白，所述的融合蛋白具有SEQ ID NO26中第1-120位所示的FLA3的CD2結(jié)合區(qū)和SEQ ID NO26中第121-347位所示的人IgG1的Fc片段。
10.如權(quán)利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)劑的用途，其特征在于，用于制備治療自身免疫疾病和抗免疫排斥的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一類免疫調(diào)節(jié)劑，這些免疫調(diào)節(jié)劑可通過免疫抑制作用治療自身免疫疾病或應(yīng)用于器官移植等臨床病癥。
文檔編號A61P37/00GK1840191SQ20061000460
公開日2006年10月4日 申請日期2003年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月14日
發(fā)明者馬菁 申請人:馬菁