本發(fā)明涉及基因工程
技術(shù)領域：
，尤其涉及一種基于mettl3的小干擾rna及其藥物和應用，具體為以特異靶序列mettl3為基礎的小干擾rna及相關(guān)藥物和應用。
背景技術(shù)：
：炎癥反應是臨床上非常常見的一種病理反應，他是指具有血管系統(tǒng)的活體組織對各種損傷因子的刺激所發(fā)生的一種以防御反應為主的基本病理過程。炎癥往往表現(xiàn)為紅、腫、熱、痛和功能障礙，也伴有發(fā)熱、末梢血白細胞計數(shù)改變等全身反應。然而，人們的研究發(fā)現(xiàn)炎癥的過度活化跟多種疾病的發(fā)生，發(fā)展息息相關(guān)。例如炎癥的過度活化會引發(fā)癌癥，阿爾茲海默癥，以及動脈粥樣硬化等嚴重威脅人類健康的疾病。越來越多的實驗證據(jù)表明炎癥的發(fā)生跟nf-κb信號通路的活化有著密切的關(guān)系，nf-κb信號通路的活性會激活其下游很多致炎因子的表達，從而進一步推動炎癥反應的發(fā)生。近年來研究發(fā)現(xiàn)nf-κb在炎癥性基本如類風濕性關(guān)節(jié)炎、炎性手腕疾病和哮喘，危重疾病如肺炎、ards等，還有腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程起著重要的作用。nf-κb信號通路的調(diào)控機制，能夠改善病情和提高預后，甚至將為治療這些疾病提供新的分子生物學手段。nf-κb是促炎癥基因表達的樞紐之一，很多炎癥介質(zhì)基因的啟動子和增強子存在一個或多個κb序列，如tnfα、il-1、il-2、il-6、il-8、gcsf、gm-csf、icam-1、vcam-1、elam-1等。nf-κb活化后參與這些基因的表達，而這些介質(zhì)在一些疾病的發(fā)病中起著重要的作用。nf-κb抗凋亡、促細胞增殖和免疫激活功能是導致正常細胞惡變的潛在因素。rna干擾(rnainterference,rnai)技術(shù)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈rna(double-strandedrna，dsrna)誘發(fā)的、同源mrna高效特異性降解的現(xiàn)象，rna分子通過破壞特定的mrna，以抑制某種基因表達的生物學過程。它是一種在動植物種廣泛存在的序列特異性轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默過程，是生物基因組抵抗病毒之類的外來遺傳原件入侵的一種生物保護機制。由于使用rnai技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達，該技術(shù)迅速成為基因功能研究和基因治療研究領域最受關(guān)注的研究工具之一，已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療領域。因此，探尋能夠抑制炎癥反應特別針對nf-κb信號通路的有效分子藥物靶點，將對于這些疾病的治療帶來新的希望。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種基于mettl3的小干擾rna及其藥物和應用，本發(fā)明小干擾rna及其藥物可以作為一個抑制炎癥的有效抑制劑用于治療炎癥引發(fā)的相關(guān)疾病。為達此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：第一方面，本發(fā)明提供一種抑制炎癥的藥物，所述藥物是以mettl3作為靶基因。本發(fā)明中，所述mettl3是一個甲基轉(zhuǎn)移酶，它可以通過對腺苷酸進行甲基化修飾來調(diào)控rna的穩(wěn)定性，從而影響rna的穩(wěn)定性或蛋白翻譯水平。第二方面，本發(fā)明提供一種用于調(diào)控nf-κb信號通路的藥物，所述藥物是以mettl3作為靶基因。本發(fā)明中，發(fā)明人通過大量的實驗發(fā)現(xiàn)，所述mettl3可以作為一個調(diào)控炎癥反應的關(guān)鍵蛋白，通過將mettl3當作靶基因制備藥物，可以用于調(diào)控炎癥反應，所述藥物可以是根據(jù)mettl3為靶基因制備的抑制劑、沉默子或小干擾rna等藥物，本領域技術(shù)人員可以根據(jù)mettl3為靶基因進行設計。第三方面，本發(fā)明提供一種小干擾rna，所述小干擾rna是根據(jù)mettl3的mrna序列進行設計。所述mettl3的mrna序列(seqidno.4)如下：aaatgacttttctgtcttgctcagctccaggggtcattttccggttagccttcggggtgtccgcgtgagaattggctatatcctggagcgagtgctgggaggtgctagtccgccgcgccttattcgagaggtgtcagggctgggagactaggatgtcggacacgtggagctctatccaggcccacaagaagcagctggactctctgcgggagaggctgcagcggaggcggaagcaggactcggggcacttggatctacggaatccagaggcagcattgtctccaaccttccgtagtgacagcccagtgcctactgcacccacctctggtggccctaagcccagcacagcttcagcagttcctgaattagctacagatcctgagttagagaagaagttgctacaccacctctctgatctggccttaacattgcccactgatgctgtgtccatctgtcttgccatctccacgccagatgctcctgccactcaagatggggtagaaagcctcctgcagaagtttgcagctcaggagttgattgaggtaaagcgaggtctcctacaagatgatgcacatcctactcttgtaacctatgctgaccattccaagctctctgccatgatgggtgctgtggcagaaaagaagggccctggggaggtagcagggactgtcacagggcagaagcggcgtgcagaacaggactcgactacagtagctgcctttgccagttcgttagtctctggtctgaactcttcagcatcggaaccagcaaaggagccagccaagaaatcaaggaaacatgctgcctcagatgttgatctggagatagagagccttctgaaccaacagtccactaaggaacaacagagcaagaaggtcagtcaggagatcctagagctattaaatactacaacagccaaggaacaatccattgttgaaaaatttcgctctcgaggtcgggcccaagtgcaagaattctgtgactatggaaccaaggaggagtgcatgaaagccagtgatgctgatcgaccctgtcgcaagctgcacttcagacgaattatcaataaacacactgatgagtctttaggtgactgctctttccttaatacatgtttccacatggatacctgcaagtatgttcactatgaaattgatgcttgcatggattctgaggcccctggcagcaaagaccacacgccaagccaggagcttgctcttacacagagtgtcggaggtgattccagtgcagaccgactcttcccacctcagtggatctgttgtgatatccgctacctggacgtcagtatcttgggcaagtttgcagttgtgatggctgacccaccctgggatattcacatggaactgccctatgggaccctgacagatgatgagatgcgcaggctcaacatacccgtactacaggatgatggctttctcttcctctgggtcacaggcagggccatggagttggggagagaatgtctaaacctctgggggtatgaacgggtagatgaaattatttgggtgaagacaaatcaactgcaacgcatcattcggacaggccgtacaggtcactggttgaaccatgggaaggaacactgcttggttggtgtcaaaggaaatccccaaggcttcaaccagggtctggattgtgatgtgatcgtagctgaggttcgttccaccagtcataaaccagatgaaatctatggcatgattgaaagactatctcctggcactcgcaagattgagttatttggacgaccacacaatgtgcaacccaactggatcacccttggaaaccaactggatgggatccacctactagacccagatgtggttgcacggttcaagcaaaggtacccagatggtatcatctctaaacctaagaatttatagaagcacttccttacagagctaagaatccatagccatggctctgtaagctaaacctgaagagtgatatttgtacaatagctttcttctttatttaaataaacatttgtattgtagttgggattctgaaaaaaaaaaaaaaaaaa.本發(fā)明中，通過根據(jù)mettl3基因序列進行設計小干擾rna，所述具體的靶序列可以根據(jù)mettl3基因選擇其中一段長度為18-25nt的序列，本發(fā)明優(yōu)選采用其中一段21nt的序列，所述小干擾rna作用于mettl3的靶序列如seqidno.1所示，所述seqidno.1所示的核酸序列如下：cgtcagtatcttgggcaagtt.根據(jù)本發(fā)明，所述小干擾rna的正義鏈的核酸序列如seqidno.2所示，所述小干擾rna的反義鏈的核酸序列如seqidno.3所示。所述seqidno.2-3所示的核苷酸序列如下：正義鏈(seqidno.2)：5’-cgucaguaucuugggcaaguu-3’；反義鏈(seqidno.3)：5’-aacuugcccaagauacugacg-3’.第四方面，本發(fā)明提供一種dna序列，編碼如第三方面所述的小干擾rna的dna序列。第五方面，本發(fā)明提供一種表達載體，包含如第四方面所述的dna序列。第六方面，本發(fā)明提供如第三方面所述的小干擾rna、如第四方面所述的dna序列或如第五方面所述的表達載體用于制備調(diào)節(jié)細胞或生物體中mettl3基因表達的藥物。第七方面，本發(fā)明提供如第三方面所述的小干擾rna、如第四方面所述的dna序列或如第五方面所述的表達載體用于制備調(diào)控nf-κb信號通路的藥物。第八方面，本發(fā)明提供一種治療疾病的藥物，包含如第三方面所述的小干擾rna、如第四方面所述的dna序列或如第五方面所述的表達載體。根據(jù)本發(fā)明，所述疾病為腫瘤疾病和/或心血管疾??；優(yōu)選地，所述腫瘤疾病選自但不限于胃癌、肝癌或肺癌中的任意一種或至少兩種的組合。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：(1)本發(fā)明中的mettl3作為抑制炎癥的靶標，具有調(diào)控nf-κb信號通路的功能；(2)本發(fā)明根據(jù)mettl3制備的sirna，易合成，成本低，對mettl3特異性好，可以特異性的抑制mettl3的表達，從而調(diào)控nf-κb信號通路，達到抑制炎癥的效果；(3)本發(fā)明sirna和藥物能夠有效抑制腫瘤疾病和心血管病，對于開發(fā)新的抗腫瘤基因藥物和腫瘤藥物具有重要指導作用，將會取得巨大的社會效益和經(jīng)濟價值。附圖說明圖1為mettl3以及nf-κb下游所調(diào)控的基因的mrna表達水平，其中，圖1(a)為熒光定量pcr檢測mrna結(jié)果，圖1(b)為westernblot檢測蛋白的結(jié)果；圖2為熒光顯微鏡觀察的huvecs細胞上粘附的thp-1的數(shù)目，其中，圖2(a)為陰性對照組sigfp的結(jié)果，圖2(b)為陰性對照組sigfp用tnfα處理了1小時后的結(jié)果，圖2(c)為本發(fā)明simettl3(小干擾rna)的結(jié)果，圖2(d)為本發(fā)明simettl3(sirna)用tnfα處理了1小時后的結(jié)果。具體實施方式為更進一步闡述本發(fā)明所采取的技術(shù)手段及其效果，以下結(jié)合附圖并通過具體實施方式來進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明并非局限在實施例范圍內(nèi)。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過正規(guī)渠道商購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1：特異性靶向mettl3基因的sirna的設計合成在公共的sirna設計網(wǎng)站(網(wǎng)址為：http://www.broadinstitute.org/rnai/public/seq/search)上輸入mettl3的mrna序列，按照網(wǎng)站指示預測可以敲低mettl3mrna表達的sirna序列。根據(jù)網(wǎng)站的預測結(jié)果，所述小干擾rna根據(jù)mettl3的靶序列進行設計，所述seqidno.1所示的核酸序列如下：cgtcagtatcttgggcaagtt.比對多個網(wǎng)站的給出的預測結(jié)果，選擇在至少同時在兩個網(wǎng)站均被預測到的的序列合成了sirna。所述sirna的正義鏈和反義鏈序列分別為：正義鏈(seqidno.2)：5’-cgucaguaucuugggcaaguu-3’；反義鏈(seqidno.3)：5’-aacuugcccaagauacugacg-3’.設置陰性對照，所述陰性對照的序列如下：sigfp正義鏈：gcaagcugacccugaaguuca；sigfp反義鏈：ugaacuucagggucagcuugc.將得到的sirna及陰性對照序列交由上海生工生物有限公司合成。實施例2：sirna轉(zhuǎn)染后的mrna表達水平采用實時定量pcr(q-pcr)鑒定轉(zhuǎn)染了實施例1中的sirna后的mrna表達水平，主要檢測的基因包括：mettl3、vcam1、sele、mcp1、il2、il6和il-8具體方法如下：1)rna的提取(1)往六孔板中各加入500μl的trizol細胞裂解液(視細胞量而定)，用槍吹吸至不再粘稠后，吸入1.5ml的ep管中；(2)往各ep管中加100μl氯仿(trizol體積的1/5)，充分劇烈震蕩后(變渾濁)靜置5min，12000rpm，10min離心(離心后分三層，rna在最上層，中間層為蛋白，最下層為有機相)；(3)取上清于新的ep管中，加入等體積的異丙醇，震蕩混勻，于-20℃放置10min，使rna沉淀完全，12000rpm，10min離心；(4)去上清留沉淀，加500μl75％的乙醇洗滌，12000rpm，5min離心，去上清，重復洗滌一次；(5)去上清，室溫下放置5-10min晾干，加20μldepc水，室溫下溶解30min。2)測rna濃度(1)取2μlrna+198uldepc水，混勻，于分光光度計中測od230、od260和od280；(2)rna濃度(單位ug/ul)計算：od260×40ng/μl×100÷1000ng/ug。3)消化dna具體20μl體系如下：(例如消化5μg)試劑用量(μl)rnsin0.4dnase110×rq緩沖液2rna5μg/rna濃度depc水補足到20放入pcr儀中，具體條件如下：(1)37℃，30min，dnase消化dna；(2)68℃，10min，使dnase失活。4)逆轉(zhuǎn)錄具體20μl體系：(逆轉(zhuǎn)1μg)先加12μl體系，具體如下：試劑用量(μl)rna4隨機引物(25μm)210×rq緩沖液2depc水6混勻后放入pcr儀，具體條如下：70℃，10min，打開復雜的rna結(jié)構(gòu)；然后立即放冰上3-5min，用于結(jié)合隨機引物；在以上體系中再加8μl體系，具體如下：試劑用量(μl)dntp(10mm)15×rt緩沖液4m-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶0.5depc水2.5混勻后放入pcr儀中，具體條件如下：(1)30℃，10min；(2)42℃，1h；(3)70℃，15min。5)qrt-pcr將逆轉(zhuǎn)完的cdna加20μldepc水，進行反應，具體qrtpcr20μl反應體系如下：試劑用量(μl)2×pcrdna聚合酶1040×緩沖液0.5上游引物(2.5μm)2下游引物(2.5μm)2模板(25ng/μl)4depc水1.5具體引物如下：具體pcr條件如下：結(jié)果如圖1(a)所示，可以看出，sirna抑制作用下的mettl3、vcam1、sele、mcp1、il2、il6和il-8的mrna表達情況明顯低于sigfp抑制作用下的mettl3、vcam1、sele、mcp1、il2、il6和il-8的mrna表達情況，可以看出，通過檢測mettl3、vcam1、sele、mcp1、il2、il6和il-8基因的mrna表達情況，可見，通路nf-κb及其下游所調(diào)控的跟炎癥發(fā)生相關(guān)的致炎因子的表達都被顯著的抑制了。實施例3：sirna轉(zhuǎn)染后鑒定蛋白表達水平采用westernblot鑒定蛋白的表達水平，具體步驟如下：(1)收集蛋白樣品：將六孔板中的細胞每孔用200μl的1x蛋白上樣緩沖液裂解，然后收集到1.5ml的離心管中；(2)電泳：將事先配置好的8％的聚丙烯酰胺凝膠放到電泳槽中，進行55ma大概一個小時的電泳；(3)轉(zhuǎn)膜：將跑好的膠從玻璃板上取下來跟實現(xiàn)準備好的pvdf膜緊密貼合在一塊后，用上下個六張濾紙將膠和pvdf膜夾在中間，然后放到半干轉(zhuǎn)膜儀上進行大概一個小時的轉(zhuǎn)膜；(4)封閉：將剛轉(zhuǎn)完的pvdf膜，放到1％的脫脂奶粉中進行一個小時的封閉；(5)一抗孵育：將pvdf膜跟我們需要檢測的蛋白的相應抗體進行4℃過夜的孵育；(6)二抗孵育：將一抗孵育完的膜進行洗滌之后，加入二抗進行一個小時的室溫孵育；(7)顯影：二抗孵育的膜經(jīng)過洗滌之后，利用二抗上所帶的辣根過氧化酶跟ecl反應可以化學發(fā)光的原理進行顯影，觀察蛋白表達水平的變化。結(jié)果如圖1(b)所示，可以看出，sirna抑制作用下的mettl3、vcam1、sele、mcp1、il2、il6和il-8蛋白表達情況明顯低于sigfp抑制作用下的mettl3、vcam1、sele、mcp1、il2、il6和il-8蛋白表達情況，可見，通路nf-κb及其下游所調(diào)控的跟炎癥發(fā)生相關(guān)的致炎因子的表達都被顯著的抑制了。實施例4：驗證單核細胞粘附情況炎癥被活化后會促使內(nèi)皮細胞分泌一些相關(guān)的粘附因子從而促進單核細胞和內(nèi)皮細胞之間的粘附作用，所以通過驗證細胞之間的粘附作用來驗證炎癥的抑制，具體步驟如下：(1)將內(nèi)皮細胞huvecs種到6孔板上，過夜，待密度達到80％時，利用lipofectaminetmrnaimax(invitrogen公司)轉(zhuǎn)染試劑按照標準步驟將對照組sigfp和敲低mettl3的sirna分別轉(zhuǎn)染到huvecs中，3小時后換成新鮮的培養(yǎng)基；(2)轉(zhuǎn)染8小時后，對細胞進行tnfα的處理，同時將單核細胞thp-1用cmfda進行熒光基團的標記，1小時后給huvecs換成新鮮的培養(yǎng)基，同時用rpmi培養(yǎng)基洗滌thp-1細胞3次；(3)將thp-1細胞分別加入到對照組和敲低mettl3的huvecs中，放到培養(yǎng)箱孵育1小時；(4)用培養(yǎng)huvecs細胞的ecm培養(yǎng)基洗滌未粘附到huvecs上的thp-1細胞3次；(5)在熒光顯微鏡下對粘附到huvecs上的thp-1細胞進行計數(shù)。結(jié)果如圖2(a)-圖2(d)所示，從圖中可以看出，跟對照組sigfp相比，mettl3的sirna(simettl3)抑制劑可以顯著的抑制thp-1和huvecs細胞之間的粘附作用，進一步證明了simettl3對炎癥反應的抑制效應。申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細方法才能實施。所屬
技術(shù)領域：
的技術(shù)人員應該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>深圳大學<120>一種基于mettl3的小干擾rna及其藥物和應用<130>2017<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>21<212>dna<213>人工合成序列<400>1cgtcagtatcttgggcaagtt21<210>2<211>21<212>dna<213>人工合成序列<400>2cgucaguaucuugggcaaguu21<210>3<211>21<212>rna<213>人工合成序列<400>3aacuugcccaagauacugacg21<210>4<211>2038<212>dna<213>人工合成序列<400>4aaatgacttttctgtcttgctcagctccaggggtcattttccggttagccttcggggtgt60ccgcgtgagaattggctatatcctggagcgagtgctgggaggtgctagtccgccgcgcct120tattcgagaggtgtcagggctgggagactaggatgtcggacacgtggagctctatccagg180cccacaagaagcagctggactctctgcgggagaggctgcagcggaggcggaagcaggact240cggggcacttggatctacggaatccagaggcagcattgtctccaaccttccgtagtgaca300gcccagtgcctactgcacccacctctggtggccctaagcccagcacagcttcagcagttc360ctgaattagctacagatcctgagttagagaagaagttgctacaccacctctctgatctgg420ccttaacattgcccactgatgctgtgtccatctgtcttgccatctccacgccagatgctc480ctgccactcaagatggggtagaaagcctcctgcagaagtttgcagctcaggagttgattg540aggtaaagcgaggtctcctacaagatgatgcacatcctactcttgtaacctatgctgacc600attccaagctctctgccatgatgggtgctgtggcagaaaagaagggccctggggaggtag660cagggactgtcacagggcagaagcggcgtgcagaacaggactcgactacagtagctgcct720ttgccagttcgttagtctctggtctgaactcttcagcatcggaaccagcaaaggagccag780ccaagaaatcaaggaaacatgctgcctcagatgttgatctggagatagagagccttctga840accaacagtccactaaggaacaacagagcaagaaggtcagtcaggagatcctagagctat900taaatactacaacagccaaggaacaatccattgttgaaaaatttcgctctcgaggtcggg960cccaagtgcaagaattctgtgactatggaaccaaggaggagtgcatgaaagccagtgatg1020ctgatcgaccctgtcgcaagctgcacttcagacgaattatcaataaacacactgatgagt1080ctttaggtgactgctctttccttaatacatgtttccacatggatacctgcaagtatgttc1140actatgaaattgatgcttgcatggattctgaggcccctggcagcaaagaccacacgccaa1200gccaggagcttgctcttacacagagtgtcggaggtgattccagtgcagaccgactcttcc1260cacctcagtggatctgttgtgatatccgctacctggacgtcagtatcttgggcaagtttg1320cagttgtgatggctgacccaccctgggatattcacatggaactgccctatgggaccctga1380cagatgatgagatgcgcaggctcaacatacccgtactacaggatgatggctttctcttcc1440tctgggtcacaggcagggccatggagttggggagagaatgtctaaacctctgggggtatg1500aacgggtagatgaaattatttgggtgaagacaaatcaactgcaacgcatcattcggacag1560gccgtacaggtcactggttgaaccatgggaaggaacactgcttggttggtgtcaaaggaa1620atccccaaggcttcaaccagggtctggattgtgatgtgatcgtagctgaggttcgttcca1680ccagtcataaaccagatgaaatctatggcatgattgaaagactatctcctggcactcgca1740agattgagttatttggacgaccacacaatgtgcaacccaactggatcacccttggaaacc1800aactggatgggatccacctactagacccagatgtggttgcacggttcaagcaaaggtacc1860cagatggtatcatctctaaacctaagaatttatagaagcacttccttacagagctaagaa1920tccatagccatggctctgtaagctaaacctgaagagtgatatttgtacaatagctttctt1980ctttatttaaataaacatttgtattgtagttgggattctgaaaaaaaaaaaaaaaaaa2038當前第1頁12