本發(fā)明涉及一種改善精子質(zhì)量的藥物，具體涉及4-羥基-2,2,6,6-四甲基哌啶氧的應用。

背景技術：

目前，不孕不育率約占到育齡夫婦的十分之一，其中男性因素不育約占一半，但是不育男性中超過85％均能夠產(chǎn)生精子。男性不育臨床上的兩種重要表現(xiàn)是無精子癥和極少精子癥，即無精子或有少量精子但畸形且無運動能力，導致男性不育，提高精子的質(zhì)量是治療該類型男性不育的一種重要方法。這也說明了改善精子發(fā)生從而提高精子質(zhì)量發(fā)揮精子正常功能的重要性。

治療不孕不育有多種輔助生殖手段，如人工授精(IUI)、體外受精—胚胎移植(IVF)和卵漿內(nèi)單精子注射(ICSI)等。這些治療的前體是獲得男性不育患者的精子或精子細胞，對于無精子癥患者臨床采用輔助生殖技術需要通過有創(chuàng)手段獲得精子或精子細胞，如睪丸切開活檢等。針對該類無精子癥患者，倘若能夠正常產(chǎn)生部分精子，可為無精子癥患者以及極少精子癥患者治療提供無創(chuàng)治療的可能。

技術實現(xiàn)要素：

解決的技術問題：本發(fā)明提供一種4-羥基-2,2,6,6-四甲基哌啶氧的應用，對無精極少精的小鼠模型進行Rescue實驗結果表明，睪丸形態(tài)有明顯改善，精子數(shù)量與質(zhì)量顯著提高。

技術方案：4-羥基-2,2,6,6-四甲基哌啶氧在制備改善精子發(fā)生的抗氧化產(chǎn)品中的應用。

改善精子發(fā)生的抗氧化產(chǎn)品，該產(chǎn)品含有4-羥基-2,2,6,6-四甲基哌啶氧。

優(yōu)選的，每毫升注射針劑含有以下組分：0.0100g 4-羥基-2,2,6,6-四甲基哌啶氧(Tempol)、1mL生理鹽水。

有益效果：1、本發(fā)明改善精子數(shù)量與質(zhì)量，對無精子癥或者極少精子癥小鼠模型進行45天的連續(xù)服藥，服藥結束后取材實驗發(fā)現(xiàn)精子數(shù)量較未給藥組有所增多，且精子畸形率下降至正常范圍，充分說明Tempol有改善精子發(fā)生的作用，也為無精子癥患者進行輔助生殖提供了有意義的參考。2、本發(fā)明中的溶劑為醫(yī)用生理鹽水，不涉及乙醇或者DMSO等有機溶劑，避免了乙醇或者DMSO對精子的毒害作用。

附圖說明

圖1 Tempol對小鼠睪丸生精細胞的作用圖；

圖示說明：A為睪丸切片PAS染色，B橫坐標為組別，縱坐標為各級生精細胞(細偶線期精母細胞(Z)、粗線期精母細胞(P)、雙線期精母細胞(D)、圓形精子(RS)、長形精子(ES))與支持細胞(Ser)的比值。

圖2 Tempol對小鼠精子數(shù)量改善作用圖；

圖示說明：A為附睪切片及精子涂片HE染色，B為精子總數(shù)統(tǒng)計，橫坐標為組別，縱坐標為精子數(shù)。

圖3 Tempol對小鼠氧化應激水平的降低作用圖；

圖示說明：A為MDA水平統(tǒng)計，橫坐標為組別，縱坐標為MDA比值。B為DHE熒光強度統(tǒng)計，橫坐標為組別，縱坐標為DHE熒光強度比。

具體實施方式

以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。以下實施例中所使用的試劑和材料均為市售產(chǎn)品，例如，實驗中所使用的生理鹽水可從SIGMA-ALDRICH，MO，USA購買。

實施例1

1.給藥階段：

給藥動物——6月齡無精子癥小鼠(來源于生殖醫(yī)學國家重點實驗室的PEX3基因缺

陷導致的遺傳性無精子癥小鼠模型)；

給藥周期——45天(小鼠一個完整生精周期)；

給藥方式——將Tempol(顆粒)溶于生理鹽水腹腔注射；

給藥量——0.0025g/天(小鼠體重以25g計算)。

2.取材

1)取材：一側睪丸、附睪MDF固定，另一側睪丸冰凍切片、提取睪丸組織蛋白，附睪擠精子測活力、做精子涂片；

MDF固定液：甲醛30mL、乙醇15mL、冰醋酸5mL、ddH₂O 50mL；

2)組織脫水包埋(睪丸，附睪)，按以下步驟處理：

→80wt.％酒精1h；

→80wt.％酒精1h；

→90wt.％酒精1h；

→90wt.％酒精1h；

→100wt.％酒精(一)30min；

→100wt.％酒精(二)30min；

→酒精：二甲苯(1：1)25min；

→二甲苯25min；

→石蠟(一)45min；

→石蠟(二)45min；

→包埋，蠟塊于4℃保存。

3)組織切片

切片：切3-5μm厚度，切片于65℃烤箱中過夜(48h后移至37℃烤箱)，過夜后置于

37℃烤箱中2h，再放入室溫中冷卻。

3.HE、PAS染色、精子總數(shù)和畸形率統(tǒng)計，按以下步驟處理：

→37℃烤箱二甲苯(一)15min；

→37℃烤箱二甲苯(二)15min；

→100wt.％酒精(一)2min；

→100wt.％酒精(二)2min；

→90wt.％酒精2min；

→80wt.％酒精2min；

→70wt.％酒精2min；

→三蒸水5min×3次。

4.MDA、DHE測定

1)提取蛋白并測濃度

a.取各睪丸組織一小塊放入EP管，于各管中加入ripa裂解液(1mL ripa+10μL cooktail)；

組織:裂解液＝100mg:2000μL；

b.剪碎組織，并超聲，3s×2，放冰上降溫，3s×2，冰上進行操作；

c.冰上靜置1h，每15min渦旋一次；

d.離心4度，14000g，30-60min，吸取上清至新的EP管；

e.BCA測蛋白濃度:

●取10μL樣本，將其用裂解液稀釋為一半，配制BCA工作液(試劑a:試劑b＝50:1，碧云天BCA測蛋白濃度試劑盒)

·取BSA(小牛血清蛋白)蛋白標準液5μg/μL，稀釋10倍。將標準品按照0、1、2、4、8、12、16、20μL分別加入96孔酶標儀板的孔中(A1-A8)---用來繪制標準曲線；

●加裂解液將每個小孔內(nèi)的液體體積補足20μL；

●在樣品孔中加1μL樣品，平行3孔，結果取平均值，加裂解液19μL；

●各孔加200μL顯色液，封口37度孵育30min，打開酶標儀預熱；

●檢查是否有氣泡，用針挑破；

●根據(jù)標準曲線計算出樣品中蛋白濃度。

2)MDA檢測(碧云天試劑盒)

3)DHE檢測

準備：取小鼠睪丸冰凍切片，冰凍后不固定，風干，放-80℃保存?zhèn)溆?，解凍后PBS(0.01M)洗2次×2min，組畫筆畫圈。

染色：a.配制DHE染液：0.01M PBS:原液＝2500:1(體積比)，將5mmol/L稀釋為2μmol/L用PBS每個組織加100μL(避光處理)，37℃或室溫避光孵育30min；

b.孵育結束后用PBS清洗；

c.拍攝熒光，綠光激發(fā)，ROS陽性在整個核區(qū)被染成紅色；

d.對熒光強度進行統(tǒng)計。

實驗結果表明：無精極少精模型小鼠在注射Tempol 45天后精子發(fā)生得到了明顯改善。與未服用Tempol的Pex3KO小鼠相比較，注射Tempol后小鼠睪丸中合胞體大量減少，各級生精細胞數(shù)量增多，且有長形精子出現(xiàn)(P<0.1)，詳細實驗數(shù)據(jù)見圖1。附睪尾可見精子數(shù)量明顯增多，且精子畸形率降低(P<0.001)，詳細實驗數(shù)據(jù)見圖2。注射Tempol后ROS水平較未注射Tempol明顯降低P<0.01)，詳細實驗數(shù)據(jù)見圖3。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明的基礎上，可以對之作一些修改或改進，包括Tempol的衍生物、給藥方式改變、以及溶劑改動等，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改活改進，均屬本發(fā)明要求保護的內(nèi)容。