本發(fā)明涉及多甲氧基黃酮的制藥應(yīng)用,具體涉及一種多甲氧基黃酮在制備預(yù)防心血管炎癥藥物上的應(yīng)用。
背景技術(shù):
:近年來(lái),無(wú)論是西方發(fā)達(dá)國(guó)家還是我國(guó),心腦血管異常、肥胖和糖尿病等代謝綜合癥發(fā)生率顯著增加,已經(jīng)成為嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題。研究結(jié)果顯示,除了遺傳因素外,更主要的原因是隨著人們生活水平提高和飲食西方化的影響,多肉高脂類飲食逐步取代了我們傳統(tǒng)的以蔬果為主的東方飲食,在攝入紅肉(左旋肉堿)、雞蛋和大豆(磷脂酰膽堿和膽堿)或其它含有三甲胺取代物的食品。雖然傳統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)學(xué)認(rèn)為紅肉、蛋黃、肝臟、大豆等富含的左旋肉堿、卵磷脂(磷脂酰膽堿)、膽堿等有益于人體健康的食品功能因子,而且食品工業(yè)中已經(jīng)大量地使用這三種物質(zhì)作為功能性食品添加劑。但是,2011-2013年發(fā)表于《newenglandjournalofmedicine》、《nature》和《naturemedicine》等的研究,首次通過(guò)動(dòng)物和人體實(shí)驗(yàn),證實(shí)食用左旋肉堿、磷脂酰膽堿和膽堿顯著地促進(jìn)了心血管疾病的發(fā)生[wangz,klipfelle,bennettbj,koethr,levisonbs,dugarb,feldsteinae,britteb,fux,chungym,wuy,schauerp,smithjd,allayeeh,tangwh,didonatoja,lusisaj,hazensl.gutflorametabolismofphosphatidylcholinepromotescardivasculardisease.nature,2011,472(7341):57-63.]。腸道菌群將左旋肉堿、磷脂酰膽堿和膽堿等轉(zhuǎn)化為三甲胺(trimethylamine,tma)。在肝臟中,tma被肝黃素單加氧酶(fmos)氧化生成氧化三甲胺(tmao)。大量研究已證實(shí),tmao是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的重要獨(dú)立因素,在動(dòng)脈粥樣硬化人群血液中,tmao的水平顯著高于常人。tmao是心血管疾病病人血液中最典型的一種生物標(biāo)志物,它具有攻擊心血管細(xì)胞、誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的毒害作用。動(dòng)脈粥樣硬化一旦發(fā)生,將誘發(fā)冠心病、心絞痛、心肌梗死以及腦梗塞等諸多心腦血管疾病[tangwh,hazensl.thecontributoryroleofgutmicrobiotaincardiovasculardisease.jclininvest.2014,124(10):4204-4211.]。多肉高脂類飲食是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖、高血糖、高血脂等的重要因素。心腦血管疾病是一種嚴(yán)重威脅人類健康的常見(jiàn)病,它具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高、復(fù)發(fā)率高、并發(fā)癥多的特點(diǎn)。我國(guó)心腦血管疾病患者已經(jīng)超過(guò)2.7億人,全世界每年死于心腦血管疾病的人數(shù)居各種死因的首位。在陳皮中含有豐富的多甲氧基黃酮,作為陳皮的最主要活性成分之一,川陳皮素可以抑制血脂對(duì)靶細(xì)胞的攻擊;具有抗增生、抗轉(zhuǎn)移和抗血管新生等抗癌功效,也具有預(yù)防老年癡呆癥、防止血栓生成、降血脂及抑制動(dòng)脈粥樣硬化等功能[chenghl,hsiehmj,yangjs,lincw,luekh,lukh,yangsf.nobiletininhibitshumanosteosarcomacellsmetastasisbyblockingerkandjnk-mediatedmmpsexpression.oncotarget.2016,doi:10.18632/oncotarget.9106.]。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:由于在紅肉、蛋黃、肝臟、大豆等常規(guī)飲食中富含的左旋肉堿、卵磷脂(磷脂酰膽堿)、膽堿等成份,而且食品工業(yè)中已經(jīng)大量地使用這三種物質(zhì)作為功能性食品添加劑,而這些物質(zhì)經(jīng)過(guò)吸收,在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為tmao,誘導(dǎo)心血管炎癥反應(yīng),最終發(fā)展成為動(dòng)脈粥樣硬化,將誘發(fā)冠心病、心絞痛、心肌梗死以及腦梗塞等諸多心腦血管疾病。本發(fā)明的目的在于提供一種多甲氧基黃酮類化合物在制備預(yù)防心血管炎癥藥物上的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):本發(fā)明通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)多甲氧基黃酮類化合物對(duì)心血管炎癥的預(yù)防效果明顯。因此,多甲氧基黃酮可用于制備預(yù)防心血管炎癥的藥物。所述的多甲氧基黃酮包括所有兩個(gè)或兩個(gè)以上甲氧基取代的黃酮,其中一個(gè)或一個(gè)以上的甲氧基被羥基取代。優(yōu)選的,所述的多甲氧基黃酮為3,5,6,7,8,3'-六甲氧基黃酮、5,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮(川陳皮素,nobiletin,nob)、3,5,6,7,3',4'-六甲氧基黃酮、5,6,7,8,4'-五甲氧基黃酮(桔黃酮,tangeretin,tan)、5,6,7,3',4'-五甲氧基黃酮(甜橙黃酮,sinensetin,sin)、5,7,8,3',4'-五甲氧基黃酮、3,5,6,7,4'-五甲氧基黃酮、5,7,8,4'-四甲氧基黃酮(tetra-o-methylisoscutellarein)、5,6,7,4'-四甲氧基黃酮(黃芩素,scutellarein,scu)、5,7,3',4'-四甲氧基黃酮、3-羥基-5,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮(柚皮黃素,natsudaidai,nat)、3-羥基-5,6,7,8,4'-五甲氧基黃酮(3-羥基-桔黃酮)、3-羥基-5,6,7,4'-四甲氧基黃酮、5-羥基-3,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮、5-羥基-3,7,8,3',4'-五甲氧基黃酮、5-羥基-6,7,8,3',4'-五甲氧基黃酮(5-去甲基川陳皮素)、5-羥基-6,7,8,4'-四甲氧基黃酮(5-去甲基桔黃酮)、5-羥基-3,7,3',4'-四甲氧基黃酮、5-羥基-7,8,3',4'-四甲氧基黃酮、5-羥基-6,7,3',4'-四甲氧基黃酮、7-羥基-3,5,6,8,3',4'-六甲氧基黃酮、7-羥基-3,5,6,3',4'-五甲氧基黃酮、5,7-羥基-3,6,8,3',4'-五甲氧基黃酮、5-羥基-6,7,8,3',4'-五甲氧基環(huán)黃酮、5,6,7,4'-四甲氧基黃酮、3'-羥基-5,6,7,8,4'-五甲氧基黃酮(3'-去甲基川陳皮素)、4'-羥基-5,6,7,8,3'-五甲氧基黃酮(4'-去甲基川陳皮素)、3',4'-羥基-5,6,7,8-四甲氧基黃酮(3',4'-去甲基川陳皮素)中的任意一種、兩種或多種。更優(yōu)選的,所述的多甲氧基黃酮為5,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮。5,6,7,8,3',4'-六甲氧基黃酮的使用劑量?jī)?yōu)選為每千克體重每日20mg-1000mg。本發(fā)明具有的有益效果:我國(guó)是柑橘生產(chǎn)大國(guó),年產(chǎn)柑橘1495.8萬(wàn)噸,年加工處理柑橘750萬(wàn)噸左右,大量的柑橘果皮被當(dāng)作垃圾直接填埋。蕓香科等植物的果皮中含有豐富的多甲氧基黃酮類化合物,川陳皮素和其它多甲氧基黃酮類化合物能夠有效預(yù)防tmao誘導(dǎo)產(chǎn)生的心血管炎癥,減少心血管炎癥的發(fā)生。本發(fā)明可指導(dǎo)新的預(yù)防心血管炎癥方法的開(kāi)發(fā),為未來(lái)研究川陳皮素和相關(guān)的多甲氧基黃酮類化合物的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供了新的方向和策略。附圖說(shuō)明圖1是不同處理組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞huvecs的生長(zhǎng)狀態(tài)圖。圖2是川陳皮素對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞huvecs凋亡的影響結(jié)果圖。圖3是川陳皮素對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞huvecs細(xì)胞周期分布的影響結(jié)果圖。圖4是川陳皮素對(duì)氯化膽堿誘導(dǎo)sd大鼠心血管炎癥抑制的he染色結(jié)果圖。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明,但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。若未特別指明,實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1川陳皮素對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞huvecs的生長(zhǎng)和細(xì)胞周期分布的影響所培養(yǎng)的細(xì)胞為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞huvecs,培養(yǎng)基為dmem培養(yǎng)基(含有100u/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素、10%胎牛血清),培養(yǎng)溫度為37℃,二氧化碳濃度為5%。在每升dmem培養(yǎng)基中加入100μl分別含0.2mmol、0.4mmol、0.6mmol、0.8mmol、1.0mmol、1.2mmol、1.4mmol、1.6mmol、1.8mmol、2.0mmol川陳皮素的2%dmso溶液。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞huvecs在含不同濃度川陳皮素的dmem培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后,收集細(xì)胞,用mtt法檢測(cè)不同處理的吸光值,計(jì)算半致死濃度。經(jīng)計(jì)算,川陳皮素對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞huvecs的半致死濃度為13.658mmol/l。為了進(jìn)一步弄清楚川陳皮素對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞huvecs生長(zhǎng)的影響,將濃度為2×104個(gè)細(xì)胞/ml的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞huvecs接種在不同細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到占培養(yǎng)瓶瓶底面積的70-80%后,設(shè)置下列不同處理:1升含人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞huvecs的培養(yǎng)基(正常組),1升含人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞huvecs的培養(yǎng)基中加入0.4mmol/ltmao(tmao處理組),1升含人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞huvecs的培養(yǎng)基中加入0.4mmol/ltmao和0.6mmol/l川陳皮素(低濃度川陳皮素處理組),1升含人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞huvecs的培養(yǎng)基中加入0.4mmol/ltmao和1.0mmol/l川陳皮素(中濃度川陳皮素處理組),1升含人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞huvecs的培養(yǎng)基中加入0.4mmol/ltmao和1.4mmol/l川陳皮素(高濃度川陳皮素處理組)(圖1)。將上述不同處理培養(yǎng)24h后,收集細(xì)胞至離心管中,用4℃預(yù)冷的pbs洗細(xì)胞后,加入-20℃預(yù)冷的70%乙醇并混勻,4℃放置過(guò)夜固定細(xì)胞后,1000rpm離心棄掉乙醇,加入適量的pbs溶液,調(diào)整細(xì)胞密度為(1-2)×106個(gè)細(xì)胞/ml,加入終濃度為50μg/ml的pi和終濃度為50g/ml無(wú)dna酶污染的rna酶,室溫避光染色30min后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞huvecs的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況,所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3次,取平均值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2、3,表1、2)表明,tmao能夠減少g1期細(xì)胞所占的百分比、增加s期細(xì)胞所占百分比,壞死細(xì)胞和凋亡中晚期細(xì)胞百分比顯著增加;和只添加tmao的細(xì)胞相比,添加川陳皮素后,所培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞huvecs中,g1期細(xì)胞所占百分比增加,s期所占比例減少,減少細(xì)胞凋亡比例,結(jié)合mtt實(shí)驗(yàn)結(jié)果,說(shuō)明tmao能夠?qū)е氯四氺o脈內(nèi)皮細(xì)胞huvecs在s期的阻滯并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,而川陳皮素能夠降低tmao所導(dǎo)致的細(xì)胞周期的影響,降低tmao對(duì)細(xì)胞的凋亡作用。表1川陳皮素處理對(duì)huvecs細(xì)胞凋亡的影響組別壞死細(xì)胞/%凋亡中晚期細(xì)胞/%正常細(xì)胞/%凋亡早期細(xì)胞/%正常組2.64±0.66a2.67±0.80a92.55±1.80a2.13±0.45atmao處理組7.59±2.26b29.40±2.96b57.14±1.61b5.87±2.33b低濃度川陳皮素處理組5.27±1.96ab21.00±1.89c66.65±0.97c6.41±1.35b中濃度川陳皮素處理組5.31±0.6ab12.99±1.28d75.24±0.75d6.47±1.29b高濃度川陳皮素處理組5.34±0.96ab7.33±0.68a83.58±0.86e3.75±0.54ab備注:同一列不同小寫(xiě)字母,表示p=0.01水平上有顯著性差異;同一列不同大寫(xiě)字母,表示p=0.05水平上有顯著性差異。表2川陳皮素處理對(duì)huvecs細(xì)胞周期的影響組別g1/%s/%g2/%正常組80.00±1.27a8.5±0.09a11.49±1.37abbtmao處理組58.89±1.15b18.71±0.28b22.41±1.41a低濃度川陳皮素處理組63.29±0.44c16.20±0.15c20.51±0.51a中濃度川陳皮素處理組72.31±0.40d18.46±0.11b9.23±0.29ab高濃度川陳皮素處理組77.18±0.63e9.46±0.16d13.36±0.51b實(shí)施例2川陳皮素對(duì)氯化膽堿誘導(dǎo)sd大鼠心血管炎癥的影響將實(shí)驗(yàn)sd大鼠分為5組,空白組、對(duì)照處理組、低劑量川陳皮素處理組、中劑量川陳皮素處理組、高劑量川陳皮素處理組,每組8只。在對(duì)照處理組、低劑量川陳皮素處理組、中劑量川陳皮素處理組、高劑量川陳皮素處理組的飲水中加入質(zhì)量濃度3%的氯化膽堿(空白組的飲水中不加氯化膽堿),并于每天同一時(shí)間,分別灌胃0.4ml玉米油(空白組、對(duì)照處理組)、0.4ml含每千克體重100mg川陳皮素的玉米油(低劑量川陳皮素處理組)、0.4ml含每千克體重200mg川陳皮素的玉米油(中劑量川陳皮素處理組)、0.4ml含每千克體重400mg川陳皮素的玉米油(高劑量川陳皮素處理組),連續(xù)灌胃6星期,最后一次灌胃結(jié)束后,停止飲食12h后處死大鼠,心臟取血、并收集肝臟、脾臟、腎臟和主動(dòng)脈。以gapdh為內(nèi)參,熒光定量pcr法檢測(cè)各組大鼠血清中的炎癥因子tnf-α、il-1β、il-6和mcp-1的表達(dá)量,對(duì)主動(dòng)脈和肝臟進(jìn)行he染色檢測(cè)。熒光定量pcr檢測(cè)結(jié)果(表3)表明,在氯化膽堿的誘導(dǎo)下,炎癥因子tnf-α、il-1β、il-6和mcp-1的表達(dá)下調(diào),而川陳皮素處理能夠減輕這些炎癥因子表達(dá)的下調(diào)程度。主動(dòng)脈的he染色檢測(cè)結(jié)果(圖4)表明,氯化膽堿處理后大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜輕度增厚,局部隆起,主動(dòng)脈內(nèi)皮層有輕微脫落,主動(dòng)脈壁平滑肌增厚,中膜彈力纖維增生,內(nèi)膜下層及中膜可見(jiàn)空泡樣變性,外膜未見(jiàn)異常;經(jīng)川陳皮素處理后,主動(dòng)脈內(nèi)膜完整,中膜平滑肌細(xì)胞排列整齊,未見(jiàn)平滑肌細(xì)胞增生,外膜未見(jiàn)異常。說(shuō)明川陳皮素能夠抑制氯化膽堿所導(dǎo)致的心血管組織的炎癥反應(yīng)。肝臟組織的檢測(cè)結(jié)果表明,氯化膽堿能夠?qū)е赂闻K部分表層肝細(xì)胞形成空泡,肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死,肝細(xì)胞核圓形、卵圓形,部分核增大,匯管區(qū)及靜脈周圍可見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);而川陳皮素處理后,肝臟組織的病理學(xué)癥狀得到緩解。以上結(jié)果表明,川陳皮素具有抑制氯化膽堿所導(dǎo)致的心血管炎癥反應(yīng)。表3川陳皮素處理對(duì)心血管部位炎癥因子表達(dá)的rt-pcr檢測(cè)結(jié)果tnf-ail1-bil-6mcp-1對(duì)照組0.32±0.11a0.83±0.03a0.41±0.14a0.59±0.13a高劑量組1.23±0.12b0.94±0.10b1.060.03b1.35±0.14b中劑量組1.14±0.06b0.79±0.25a0.62±0.02c0.69±0.21a低劑量組0.34±0.09a0.67±0.02a0.38±0.01a0.45±0.11a實(shí)施例3川陳皮素對(duì)sd大鼠生物毒性評(píng)價(jià)稱量實(shí)施例2中所處死大鼠的肝、脾、腎重量,分別計(jì)算臟器體重比。將實(shí)施例2中所采集的血液,室溫放置1h后,4℃3000rpm離心10min,收集血清,以全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)肝功能生化指數(shù):天門(mén)冬酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartateaminotransferase,ast)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanineaminotransferase,alt)、三酸甘油脂(triglyceride,tg)及總膽固醇(totalcholesterol,t-cho),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,各組數(shù)據(jù)間不存在顯著性差異,川陳皮素對(duì)sd大鼠沒(méi)有表現(xiàn)出生物毒性。表4川陳皮素對(duì)sd大鼠的生物毒性評(píng)價(jià)上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式,但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制,其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化,均應(yīng)為等效的置換方式,都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12