本發(fā)明涉及包含特定的甲氧基黃酮的NOX抑制劑以及NFκB抑制劑及其利用。

背景技術(shù)：

NADPH氧化酶(NOX)是已知存在于嗜中性粒細(xì)胞等且生成O^2-的酶。因此，認(rèn)為NOX的抑制對(duì)與生物體內(nèi)氧化有關(guān)的各種疾病的預(yù)防或治療有用。

NFκB是調(diào)節(jié)編碼促炎因子(例如，TNFα、IL-1β、IL-6)、化學(xué)趨化因子(例如，IL-8、MIP1α)、誘導(dǎo)性效應(yīng)酶(iNOS及COX-2)等分子的基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的功能。顯示出NFκB經(jīng)路的活化有可能發(fā)展為各種炎癥性疾病。

據(jù)報(bào)道植物的提取物所包含的幾種甲氧基黃酮具有抗氧化作用。這樣的甲氧基黃酮中的大多數(shù)具有羥基(非專利文獻(xiàn)1～3)。

黑姜(Kaemp feria parviflora)是屬于姜科的植物的一種，在日本也稱作黑郁金。黑姜在泰國是也被稱作Kra chai dahm的傳統(tǒng)藥草的一種。已知黑姜不僅包含具有羥基的甲氧基黃酮，還包含不具有羥基的甲氧基黃酮(非專利文獻(xiàn)4)。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1 Biochem Pharmacol.，2012，84(2)，182-191

非專利文獻(xiàn)2 Free Radic Biol Med.，1999，27(1-2)，95-99

非專利文獻(xiàn)3 Biochem Pharmacol.，1987，36(5)，717-720

非專利文獻(xiàn)4 大阪市立大學(xué)生活科學(xué)研究科東銳明氏博士論文“姜科植物Kaemp feria parviflora所包含的成分的結(jié)構(gòu)與α-葡萄糖苷酶抑制活性及抗誘變性”

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的課題在于提供具有優(yōu)異作用的NOX抑制劑及NFκB抑制劑，以及起因于NOX、NFκB的疾病的預(yù)防或治療劑。

本發(fā)明者對(duì)這樣的課題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從黑姜所得到的特定的甲氧基黃酮具有優(yōu)異的NOX抑制作用及/或NFκB抑制作用。

即，本發(fā)明涉及以下內(nèi)容，但不限定于此。

[1]一種NOX抑制劑，其特征在于，包含具有以下式(I)所示結(jié)構(gòu)的至少1種的甲氧基黃酮，

(式中，R₁、R₄以及R₅各自獨(dú)立地為氫或甲氧基，R₂以及R₃為甲氧基。)

[2]根據(jù)[1]所述的NOX抑制劑，其特征在于，所述至少1種的甲氧基黃酮選自由5，7，3’，4’-四甲氧基黃酮、3，5，7，3’，4’-五甲氧基黃酮、5，7-二甲氧基黃酮以及5，7，4’-三甲氧基黃酮構(gòu)成的組A。

[3]根據(jù)[2]所述的NOX抑制劑，其特征在于，相對(duì)于組A的甲氧基黃酮與由3，5，7-三甲氧基黃酮、3，5，7，4’-四甲氧基黃酮、5-羥基-3，7，3’，4’-四甲氧基黃酮、5-羥基-7-甲氧基黃酮、5-羥基-7，4’-二甲氧基黃酮、5-羥基-3，7-二甲氧基黃酮以及5-羥基-3，7，4’-三甲氧基黃酮構(gòu)成的組B的甲氧基黃酮的總含量，組A的甲氧基黃酮的總含量的比例(A/(A+B))以摩爾基準(zhǔn)計(jì)超過0.65。

[4]一種起因于NOX的疾病的預(yù)防或治療劑，其特征在于，包含所述[1]或[2]所述的至少1種的甲氧基黃酮。

[5]根據(jù)[4]所述的預(yù)防或治療劑，其特征在于，所述疾病選自過敏性疾病、帕金森病、腦梗塞、白內(nèi)障、癲癇、脊髓損傷、動(dòng)脈硬化、未成熟兒視網(wǎng)膜癥、腎障礙、消化性潰瘍、胰腺炎、潰瘍性大腸炎、心肌梗塞、成人呼吸窘迫綜合癥、肺氣腫、慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的膠原病、血管炎、浮腫、糖尿病并發(fā)癥、紫外線損傷、低氣壓病、卟啉血癥、燒燙傷、凍傷、接觸性皮炎、休克、多臟器功能不全、DIC、癌、老化、疲勞、肌少癥(肌力降低)、線粒體功能障礙、認(rèn)知障礙癥以及阿爾茨海默病。

[6]根據(jù)[4]或[5]所述的預(yù)防或治療劑，其特征在于，相對(duì)于[2]所述的組A的甲氧基黃酮與[3]所述的組B的甲氧基黃酮的總含量，組A的甲氧基黃酮的總含量的比例(A/(A+B))以摩爾基準(zhǔn)計(jì)超過0.65。

[7]一種NFκB抑制劑，其特征在于，包含具有以下式(I)所示結(jié)構(gòu)的至少1種的甲氧基黃酮，

(式中，R₁、R₄以及R₅各自獨(dú)立地為氫或甲氧基，R₂以及R₃為甲氧基。)

[8]根據(jù)[7]所述的NFκB抑制劑，其特征在于，所述至少1種的甲氧基黃酮選自由5，7，3’，4’-四甲氧基黃酮、5，7-二甲氧基黃酮以及5，7，4’-三甲氧基黃酮構(gòu)成的組A’。

[9]根據(jù)[8]所述的NFκB抑制劑，其特征在于，相對(duì)于組A’的甲氧基黃酮與由3，5，7，3’，4’-五甲氧基黃酮、3，5，7-三甲氧基黃酮、3，5，7，4’-四甲氧基黃酮、5-羥基-3，7，3’，4’-四甲氧基黃酮、5-羥基-7-甲氧基黃酮、5-羥基-7，4’-二甲氧基黃酮、5-羥基-3，7-二甲氧基黃酮以及5-羥基-3，7，4’-三甲氧基黃酮構(gòu)成的組B’的甲氧基黃酮的總含量，組A’的甲氧基黃酮的總含量的比例(A’/(A’+B’))以摩爾基準(zhǔn)計(jì)超過0.48。

[10]一種起因于NFκB的疾病的預(yù)防或治療劑，其特征在于，包含所述[7]或[8]所述的至少1種的甲氧基黃酮。

[11]根據(jù)[10]所述的預(yù)防或治療劑，其特征在于，所述疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性大腸炎、變形性關(guān)節(jié)病、骨溶解癥、腱炎、坐骨神經(jīng)痛、椎間盤突出、狹窄癥、脊髄病、腰痛、椎間關(guān)節(jié)痛、腕管綜合癥、踝管綜合癥、腰椎術(shù)后疼痛綜合癥、艾滋病、動(dòng)脈硬化、哮喘、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、炎癥性大腸炎、肝炎、中風(fēng)、認(rèn)知障礙癥、肌肉消耗、病毒感染、包括光老化的皮膚老化、癌以及老化。

[12]根據(jù)[10]或[11]所述的預(yù)防或治療劑，其特征在于，相對(duì)于所述[8]所述的組A’的甲氧基黃酮與[9]所述的組B’的甲氧基黃酮的總含量，組A’的甲氧基黃酮的總含量的比例(A’/(A’+B’))以摩爾基準(zhǔn)計(jì)超過0.48。

[13]一種NOX抑制劑，其特征在于，包含3’，4’-二甲氧基黃酮。

[14]一種起因于NOX的疾病的預(yù)防或治療劑，其特征在于，包含3’，4’-二甲氧基黃酮。

[15]根據(jù)[14]所述的預(yù)防或治療劑，其特征在于，所述疾病選自過敏性疾病、帕金森病、腦梗塞、白內(nèi)障、癲癇、脊髓損傷、動(dòng)脈硬化、未成熟兒視網(wǎng)膜癥、腎障礙、消化性潰瘍、胰腺炎、潰瘍性大腸炎、心肌梗塞、成人呼吸窘迫綜合癥、肺氣腫、慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的膠原病、血管炎、浮腫、糖尿病并發(fā)癥、紫外線損傷、低氣壓病、卟啉血癥、燒燙傷、凍傷、接觸性皮炎、休克、多臟器功能不全、DIC、癌、老化、疲勞、肌少癥(肌力降低)、線粒體功能障礙、認(rèn)知障礙癥以及阿爾茨海默病。

本發(fā)明可提供具有優(yōu)異作用的NOX抑制劑以及NFκB抑制劑。另外，還可利用NOX抑制劑以及NFκB抑制劑提供起因于NOX、NFκB的疾病的預(yù)防或治療劑。

本發(fā)明中所使用的甲氧基黃酮與現(xiàn)有被發(fā)現(xiàn)具有抗氧化作用等的甲氧基黃酮不同，盡管不具有羥基，但顯示優(yōu)異的NOX抑制等的作用。

具體實(shí)施方式

(甲氧基黃酮)

本發(fā)明中，使用具有以下式(I)

(式中，R₁、R₄以及R₅各自獨(dú)立地為氫或甲氧基，R₂以及R₃為甲氧基)所示結(jié)構(gòu)的至少1種、優(yōu)選至少2種、更優(yōu)選至少3種、更優(yōu)選至少4種、更優(yōu)選至少5種、更優(yōu)選至少6種、更優(yōu)選至少7種、更優(yōu)選至少8種的甲氧基黃酮。

在本發(fā)明的NOX抑制或起因于NOX的疾病的治療或預(yù)防中，優(yōu)選所述至少1種的甲氧基黃酮選自由5，7，3’，4’-四甲氧基黃酮、3，5，7，3’，4’-五甲氧基黃酮、5，7-二甲氧基黃酮以及5，7，4’-三甲氧基黃酮構(gòu)成的組A。NOX抑制劑或起因于NOX的疾病的治療或預(yù)防劑不僅包含組A的甲氧基黃酮，還可包含其他的化合物，例如包含來自黑姜的選自由3，5，7-三甲氧基黃酮、3，5，7，4’-四甲氧基黃酮、5-羥基-3，7，3’，4’-四甲氧基黃酮、5-羥基-7-甲氧基黃酮、5-羥基-7，4’-二甲氧基黃酮、5-羥基-3，7-二甲氧基黃酮以及5-羥基-3，7，4’-三甲氧基黃酮構(gòu)成的組B的至少1種的甲氧基黃酮。然而，組A的甲氧基黃酮顯示出高于組B的甲氧基黃酮的NOX抑制作用。因此，組A的甲氧基黃酮的含有率高的為佳。例如，相對(duì)于組A以及組B的甲氧基黃酮的總含量，組A的甲氧基黃酮的總含量的比例(A/(A+B))以摩爾基準(zhǔn)(或重量基準(zhǔn))計(jì)優(yōu)選超過0.65、更優(yōu)選0.66以上、更優(yōu)選0.67以上、更優(yōu)選0.68以上、更優(yōu)選0.69以上、更優(yōu)選0.70以上、更優(yōu)選0.71以上。該比例沒有上限值，該比例也可為1.00以下。

在本發(fā)明的NFκB抑制或起因于NFκB的疾病的治療或預(yù)防中，優(yōu)選所述至少1種的甲氧基黃酮選自由5，7，3’，4’-四甲氧基黃酮、5，7-二甲氧基黃酮以及5，7，4’-三甲氧基黃酮構(gòu)成的組A’。NFκB抑制劑或起因于NFκB的治療或預(yù)防劑不僅包含組A’的甲氧基黃酮，還可包含其他的化合物，例如，還可包含來自黑姜的選自由3，5，7，3’，4’-五甲氧基黃酮、3，5，7-三甲氧基黃酮、3，5，7，4’-四甲氧基黃酮、5-羥基-3，7，3’，4’-四甲氧基黃酮、5-羥基-7-甲氧基黃酮、5-羥基-7，4’-二甲氧基黃酮、5-羥基-3，7-二甲氧基黃酮以及5-羥基-3，7，4’-三甲氧基黃酮構(gòu)成的組B’中的至少1種的甲氧基黃酮。然而，組A’的甲氧基黃酮顯示出高于組B’的甲氧基黃酮的NFκB抑制作用。因此，組A’的甲氧基黃酮的含有率高的為佳。例如，相對(duì)于組A’以及組B’的甲氧基黃酮的總含量，組A’的甲氧基黃酮的總含量的比例(A’/(A’+B’))以摩爾基準(zhǔn)(或重量基準(zhǔn))計(jì)，優(yōu)選超過0.48、更優(yōu)選0.49以上、更優(yōu)選0.50以上、更優(yōu)選0.51以上、更優(yōu)選0.52以上、更優(yōu)選0.53以上、更優(yōu)選0.54以上、更優(yōu)選0.55以上、更優(yōu)選0.60以上。該比例沒有上限值，該比例也可為1.00以下。

或者，甲氧基黃酮為3’，4’-二甲氧基黃酮。

上述甲氧基黃酮的大部分例如可根據(jù)非專利文獻(xiàn)4所述的方法從黑姜(Kaemp feria parviflora)中得到?；蛘撸邕€可根據(jù)本說明書的實(shí)施例1所詳述的方法得到。黑姜是屬于姜科的植物的一種，由于以東南亞為中心自生，故而可容易獲得。已知3’，4’-二甲氧基黃酮例如可使用溶劑從指甲花(Lawsonia alba)進(jìn)行提取。例如，可參考Phytochemistry Letters，2011，4，454-458。

所述抑制劑以及治療或預(yù)防劑所包含的甲氧基黃酮的種類以及量可根據(jù)需要基于公知的方法進(jìn)行調(diào)整。例如，還可使用公知的純化方法將特定的甲氧基黃酮除去，還可將特定的經(jīng)純化的甲氧基黃酮添加到所述抑制劑，或治療或預(yù)防劑中。

另外，在本發(fā)明中，還可從黑姜得到包含式(I)的甲氧基黃酮的油脂提取物來利用。該油脂提取物為從黑姜經(jīng)油脂提取所得到的提取物。該提取物含有甲氧基黃酮，而且黑姜提取物特有的黑紫色的強(qiáng)度降低。該提取物還可進(jìn)一步包含油脂，尤其是用于提取的油脂。

認(rèn)為該油脂提取物與不是從黑姜得到的物質(zhì)、雖然以黑姜為原料但不是經(jīng)油脂提取得到的物質(zhì)相比，在所含有的成分的種類以及比率等方面不同。例如，認(rèn)為從除黑姜以外的植物所得到的提取物也可包含甲氧基黃酮，但其種類、比率與該油脂提取物不同。另外，雖然黑姜為原料，但從其通過除油脂提取以外的方法，例如通過含水醇提取所得到的提取物中的甲氧基黃酮的種類、比率與該油脂提取物不同。另一方面，油脂提取可直接對(duì)黑姜進(jìn)行，也可間接地例如對(duì)從黑姜使用除油脂以外的溶劑，例如水、親水性溶劑或它們的混合物所得到的提取液進(jìn)行。

該油脂提取物含有至少1種的式(I)的甲氧基黃酮。該甲氧基黃酮優(yōu)選選自組A。該提取物還可進(jìn)一步含有選自組B的甲氧基黃酮。該油脂提取物優(yōu)選包含選自組A以及B的11種甲氧基黃酮中的至少1種、更優(yōu)選至少2種、更優(yōu)選至少3種、更優(yōu)選至少4種、更優(yōu)選至少5種、更優(yōu)選至少6種、更優(yōu)選至少7種、更優(yōu)選至少8種、更優(yōu)選至少9種、更優(yōu)選至少10種、更優(yōu)選11種。

可用于該油脂提取物的制造且可包含于該提取物的油脂，只要可溶解甲氧基黃酮就沒有特別限定。典型而言，該油脂選自中鏈甘油三酯、甘油二酯、芝麻色拉油、橄欖油、大豆油、菜籽油、玉米油、大米胚芽油、葵花籽油、紫蘇油、白蘇油中的至少1種。涉及中鏈甘油三酯所使用的“中鏈脂肪酸”意味著碳原子數(shù)8～12的脂肪酸。構(gòu)成該甘油三酯的脂肪酸部分內(nèi)的至少一個(gè)、優(yōu)選二個(gè)、更優(yōu)選三個(gè)是中鏈脂肪酸。

在該油脂提取物中，黑紫色的強(qiáng)度得到降低。為了對(duì)其進(jìn)行確認(rèn)，測(cè)定該提取物的吸光度有效。

具體而言，從該提取物制備組A以及B的11種甲氧基黃酮的總含量為5.0mg/ml的溶液，并測(cè)定該溶液在波長660nm處的吸光度。在該油脂提取物中，這樣所測(cè)定的吸光度為0.10以下。該吸光度優(yōu)選0.07以下、更優(yōu)選0.05以下。只要沒有特別聲明，本說明書中的吸光度意味著比色池長度(光路長)為10mm時(shí)的吸光度。用于測(cè)定的裝置的比色池長度不為10mm時(shí)，將所得到的吸光度的值換算為比色池長度為10mm時(shí)的值。另外，為了測(cè)定吸光度，使用適當(dāng)?shù)目瞻住?/p>

以下，說明該油脂提取物的制造方法。

例如，該制造方法包含使油脂接觸黑姜的植物體從而提取1種以上的甲氧基黃酮。該方法的典型例如以下的記載。

首先，準(zhǔn)備黑姜的植物體。將該植物體或其部位根據(jù)需要進(jìn)行干燥并粉碎。接著，使該植物體或其部位與油脂接觸來進(jìn)行提取。提取條件只要能夠提取甲氧基黃酮就沒有特別限定。典型的提取溫度為50～180℃、70～170℃、70～150℃、100～150℃或120～150℃。典型而言，提取時(shí)間為1分鐘～1天、10分鐘～10小時(shí)或15分鐘～5小時(shí)。另外，典型而言，所使用的油脂的容量為黑姜重量的0.1～30倍或0.5～15倍。所使用的油脂的例子如上所述。

雖然不拘泥于理論，但認(rèn)為在該提取中甲氧基黃酮轉(zhuǎn)移到油脂中，黑姜的生成黑紫色的成分留在黑姜的植物體中。另外，認(rèn)為生成黑姜特有的香味的成分也沒有轉(zhuǎn)移到油脂而留在該植物體中。

接著，進(jìn)行提取后，根據(jù)需要從通過該提取所得到的含油脂提取物中通過過濾或離心分離除去不溶性固體成分。

或者，油脂提取物的制造包含使水、親水性溶劑或它們的混合物接觸黑姜的植物體，提取1種以上的甲氧基黃酮，其次使油脂接觸通過該提取所得到的中間提取物從而提取該甲氧基黃酮。該方法的典型例如以下的記載。

首先，與上述同樣地準(zhǔn)備黑姜的植物體。接著，使水、親水性溶劑或它們的混合物接觸該植物體或其部位來進(jìn)行提取。提取條件只要能夠提取甲氧基黃酮就沒有特別限定。典型的提取溫度為室溫～回流溫度、40℃～回流溫度、50℃～回流溫度、回流溫度，優(yōu)選50℃～回流溫度、或回流溫度。典型而言，提取時(shí)間為1分鐘～1天、10分鐘～10小時(shí)、或15分鐘～5小時(shí)。另外，典型而言，所使用的水、親水性溶劑或它們的混合物的容量為黑姜重量的0.1～30倍、或0.5～15倍。所使用的親水性溶劑優(yōu)選為C_1-3醇以及/或丙酮、更優(yōu)選乙醇。例如，使用50～100v/v％乙醇進(jìn)行提取。將通過該提取工序所得到的中間提取物交付于油脂提取工序。

在油脂提取工序中，使該中間提取物與油脂接觸進(jìn)行提取。提取條件為只要能夠提取甲氧基黃酮就沒有特別限定。提取溫度沒有特別限定，例如，在5℃以上、10℃以上、20℃以上、30℃以上、40℃或50℃以上進(jìn)行。提取溫度的上限值沒有特別限制，只要在水、親水性溶劑或它們的混合物的回流溫度以下即可。典型而言，提取時(shí)間為1分鐘～1天、10分鐘～10小時(shí)或15分鐘～5小時(shí)。另外，典型而言，所使用的油脂的容量為黑姜重量的0.01～30倍或0.1～15倍。所使用的油脂的例子如上述那樣。

進(jìn)而，根據(jù)情況，在使油脂接觸該中間提取物前以及/或在它們接觸期間，使水、親水性溶劑或它們的混合物從該中間提取物蒸發(fā)。蒸發(fā)可在常壓下進(jìn)行，也可在減壓下進(jìn)行。在這樣進(jìn)行積極的蒸發(fā)時(shí)，提取時(shí)間并不太重要。認(rèn)為若隨著蒸發(fā)的進(jìn)行，水、親水性溶劑或它們的混合物的量降低，則甲氧基黃酮根據(jù)情況與該親水性溶劑等一起轉(zhuǎn)移到油脂中。

雖然不拘泥于理論，但認(rèn)為在油脂提取中甲氧基黃酮轉(zhuǎn)移到油脂中，黑姜的生成黑紫色的成分不轉(zhuǎn)移到油脂中。

接著，進(jìn)行提取后，根據(jù)需要，從通過該提取所得到的含油脂提取物通過過濾或離心分離除去不溶性固體成分。這與中間提取物也相同。

根據(jù)所述的2種方法時(shí)，可得到含油脂提取物。其可不進(jìn)行進(jìn)一步純化來使用，也可根據(jù)需要進(jìn)行純化。例如，也可將該含油脂提取物交付于進(jìn)一步的提取工序來除去油脂。具體而言，使水、親水性溶劑或它們的混合物接觸該含油脂提取物，提取1種以上的甲氧基黃酮。此時(shí)，若有必要還可在該含油脂提取物中添加低極性的溶劑，例如正己烷這樣的C_1-8的烴。

使用的親水性溶劑或親水性溶劑與水的混合物的例子如上所述。提取溫度沒有特別限定，例如，在5℃以上、10℃以上、20℃以上、30℃以上、40℃或50℃以上進(jìn)行。提取溫度的上限值沒有特別限制，但只要在水、親水性溶劑或它們的混合物的回流溫度以下即可。典型而言，提取時(shí)間為1分鐘～1天、10分鐘～10小時(shí)、或15分鐘～5小時(shí)。另外，典型而言，所使用的水、親水性溶劑或它們的混合物的容量為油脂提取物的重量的0.01～30倍或0.1～15倍。

進(jìn)而，在甲氧基黃酮的提取中，可得到來自該含油脂提取物的油脂相與來自該水、親水性溶劑或它們的混合物的相的2相混合物，將該混合物進(jìn)行液-液分離。作為結(jié)果，可將該水、親水性溶劑或它們的混合物的相(其為包含甲氧基黃酮與溶劑的提取物)從油脂相分離。為了進(jìn)行液-液分離，例如可僅將該2相混合物靜置，也可進(jìn)行離心分離。接著，得到所分離的提取物。

所分離的提取物包含甲氧基黃酮，而且成為包含溶劑的液體的形態(tài)?？芍苯永迷撘后w，也可除去溶劑(水、親水性溶劑或其混合物)，從而得到包含甲氧基黃酮的粉末形態(tài)的提取物。除去溶劑的方法沒有特別限定，可列舉在常壓或減壓下的蒸餾、冷凍干燥等。

這樣除去了油脂的提取物以相對(duì)較高的濃度含有黑姜所特有的甲氧基黃酮。該提取物也可根據(jù)需要進(jìn)一步純化。

在油脂提取物中，與使用乙醇等的親水性溶劑所得到的提取物相比，上述的A/(A+B)以及A’/(A’+B’)的比例相對(duì)較高。油脂提取物中的該比例的優(yōu)選范圍如上述那樣。

(NOX抑制劑)

本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)式(I)的甲氧基黃酮作為NADPH氧化酶(NOX)抑制劑有效。因此，從一個(gè)側(cè)面來看，本發(fā)明為包含式(I)的甲氧基黃酮的至少一種的NOX抑制劑或用于抑制NOX的組合物(在本說明書中，“NOX抑制劑”與“用于抑制NOX的組合物”相互代替地使用，只要沒有特別聲明，使用其中一個(gè)的時(shí)候還意味著另一個(gè))。在其他方式中，該發(fā)明還可為包含將式(I)的甲氧基黃酮的至少一種給予對(duì)象的用于抑制NOX的方法?；蛘撸€可使用3’，4’-二甲氧基黃酮來代替式(I)的甲氧基黃酮或在其基礎(chǔ)上追加。

NOX的抑制牽涉到起因于NOX的疾病的預(yù)防或治療。因此，從其他側(cè)面來看，本發(fā)明為包含式(I)的甲氧基黃酮的至少1種的起因于NOX的疾病的預(yù)防或治療劑或用于該預(yù)防或治療的組合物(在本說明書中，“起因于NOX的疾病的預(yù)防或治療劑”與“用于起因于NOX的疾病的預(yù)防或治療的組合物”相互代替地使用，只要沒有特別聲明，使用其中一個(gè)的時(shí)候還意味著另一個(gè))。在其他方式中，該發(fā)明還可為包含將該甲氧基黃酮的至少一種給予對(duì)象的用于該疾病的預(yù)防或治療的方法。這樣的疾病包括特應(yīng)性皮炎、過敏性鼻炎(花粉癥)、過敏性結(jié)膜炎、過敏性腸胃炎、支氣管哮喘、兒童哮喘、食物過敏、藥物過敏、蕁麻疹等的過敏性疾病、帕金森病、腦梗塞、白內(nèi)障、癲癇、脊髓損傷、動(dòng)脈硬化、未成熟兒視網(wǎng)膜癥、腎障礙、消化性潰瘍、胰腺炎、潰瘍性大腸炎、心肌梗塞、成人呼吸窘迫綜合癥、肺氣腫、慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的膠原病、血管炎、浮腫、糖尿病并發(fā)癥、紫外線損傷、低氣壓病、卟啉血癥、燒燙傷、凍傷、接觸性皮炎、休克、多臟器功能不全、DIC、癌、老化、疲勞、肌少癥(Sarcopenia)(肌力降低)、線粒體功能障礙、認(rèn)知障礙癥以及阿爾茨海默病。或者，還可使用3’，4’-二甲氧基黃酮來代替式(I)的甲氧基黃酮或在其基礎(chǔ)上追加。

從其他側(cè)面來看，本發(fā)明為包含式(I)的甲氧基黃酮的至少一種的抗氧化劑(更具體而言，生物體內(nèi)氧化的防止、抑制或降低劑)或用于防止、抑制或降低生物體內(nèi)氧化的組合物(在本說明書中，“抗氧化劑”、“生物體內(nèi)氧化的防止、抑制或降低劑”、“用于防止、抑制或降低生物體內(nèi)氧化的組合物”相互代替地使用，只要沒有特別聲明，記載上述三者之一的時(shí)候還意味著剩余兩個(gè))。在其他方式中，該發(fā)明還可為包含將式(I)的甲氧基黃酮的至少一種給予對(duì)象的用于防止、抑制或降低生物體內(nèi)氧化的方法。在本說明書中，生物體內(nèi)氧化是指在生物體內(nèi)因活性氧而產(chǎn)生的各種氧化反應(yīng)?；蛘?，還可使用3’，4’-二甲氧基黃酮來代替式(I)的甲氧基黃酮或在其基礎(chǔ)上追加。

只要可得到所期望的效果，本發(fā)明的NOX抑制劑、起因于NOX的疾病的預(yù)防或治療劑、抗氧化劑中的式(I)的甲氧基黃酮的總含量就沒有特別限定，優(yōu)選0.01～50w/w％、更優(yōu)選0.1～40w/w％、更優(yōu)選0.5～30w/w％。

為了發(fā)揮NOX抑制作用、起因于NOX的疾病的預(yù)防或治療、抗氧化等前述的所期望的效果，成人每1天的式(I)的甲氧基黃酮的總攝取量優(yōu)選1～500mg、更優(yōu)選3～200mg、進(jìn)一步優(yōu)選5～100mg。

上述的量也可應(yīng)用于3’，4’-二甲氧基黃酮。

(NFκB抑制劑)

本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)式(I)的甲氧基黃酮作為NFκB抑制劑有效。因此，從其他側(cè)面來看，本發(fā)明為包含式(I)的甲氧基黃酮中的至少一種的NFκB抑制劑或用于抑制NFκB的組合物(在本說明書中，“NFκB抑制劑”與“用于抑制NFκB的組合物”相互代替地使用，只要沒有特別聲明，使用其中一個(gè)的時(shí)候還意味著另一個(gè))。在其他方式中，該發(fā)明還可為包含將式(I)的甲氧基黃酮的至少一種給予對(duì)象的用于抑制NFκB的方法?；蛘?，還可使用3’，4’-二甲氧基黃酮來代替式(I)的甲氧基黃酮或在其基礎(chǔ)上追加。

NFκB的抑制牽涉到起因于NFκB的疾病的預(yù)防或治療。因此，從其他側(cè)面來看，本發(fā)明為包含式(I)的甲氧基黃酮的至少1種的起因于NFκB的疾病的預(yù)防或治療劑或用于該預(yù)防或治療的組合物(在本說明書中，“起因于NFκB的疾病的預(yù)防或治療劑”與“用于起因于NFκB的疾病的預(yù)防或治療的組合物”相互代替地使用，只要沒有特別聲明，使用其中一個(gè)的時(shí)候還意味著另一個(gè))。在其他方式中，該發(fā)明涉及包含將該甲氧基黃酮的至少一種給予對(duì)象的用于該疾病的預(yù)防或治療的方法。這樣的疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性大腸炎、變形性關(guān)節(jié)病、骨溶解癥、腱炎、坐骨神經(jīng)痛、椎間盤突出、狹窄癥、脊髄病、腰痛、椎間關(guān)節(jié)痛、腕管綜合癥、踝管綜合癥、腰椎術(shù)后疼痛綜合癥、艾滋病、動(dòng)脈硬化、哮喘、關(guān)節(jié)炎、糖尿病、炎癥性大腸炎、肝炎、中風(fēng)、認(rèn)知障礙癥、肌肉消耗、病毒感染、包含光老化的皮膚老化、癌以及老化?；蛘?，還可使用3’，4’-二甲氧基黃酮來代替式(I)的甲氧基黃酮或在其基礎(chǔ)上追加。

只要可得到所期望的效果，本發(fā)明的NFκB抑制劑、起因于NFκB的疾病的預(yù)防或治療劑中的式(I)的甲氧基黃酮的總含量就沒有特別限定，優(yōu)選0.01～50w/w％、更優(yōu)選0.1～40w/w％、更優(yōu)選0.5～30w/w％。

為了發(fā)揮NFκB抑制作用、起因于NFκB的疾病的預(yù)防或治療等前述的所期望的效果，成人每1天的式(I)的甲氧基黃酮的總攝取量優(yōu)選1～500mg、更優(yōu)選3～200mg、進(jìn)一步優(yōu)選5～100mg。

上述的量還可應(yīng)用于3’，4’-二甲氧基黃酮。

(其他成分)

只要不有損于其效果，則除式(I)的甲氧基黃酮以外，本發(fā)明的NOX或NFκB抑制劑、起因于NOX或NFκB的疾病的預(yù)防或治療劑、抗氧化劑還可配合任意的成分。例如，除維生素E、維生素C等的維生素類、礦物質(zhì)類、激素、營養(yǎng)成分、香料等的生理活性成分以外，還可適當(dāng)配合制劑化中所配合的乳化劑、等張劑(等滲劑)、緩沖劑、助溶劑、防腐劑、穩(wěn)定化劑等。

(應(yīng)用)

本發(fā)明的NOX或NFκB抑制劑、起因于NOX或NFκB的疾病的預(yù)防或治療劑、抗氧化劑還可作為飲食品(功能性食品、健康輔助食品、營養(yǎng)機(jī)能食品、特殊用途食品、特定保健用食品、營養(yǎng)輔助食品、食療用食品、健康食品、營養(yǎng)強(qiáng)化劑等)、醫(yī)藥品或香妝品，或作為其原料使用。飲食品以及醫(yī)藥品還可以是作為寵物的餌料而加工的寵物食品、動(dòng)物飼料等，以及動(dòng)物用醫(yī)藥品。

該飲食品的形態(tài)沒有特別限定，例如，為清涼飲料水(例如，運(yùn)動(dòng)飲料、碳酸飲料、果汁飲料)、糕點(diǎn)類(例如，蛋糕、餅干、面包、糖果)、面類(例如，烏冬面、蕎麥面、拉面、意大利面)、豆醬、醬油、醋、色拉油、芝麻油、豆?jié){、牛奶?；蛘撸部蔀槠瑒?、顆粒劑、散劑、膠囊劑(也包含軟膠囊)等的形態(tài)。

該醫(yī)藥品的形態(tài)沒有特別限定，例如，為外用劑(例如，洗液、乳液劑、貼劑、軟膏劑)、口服劑(片劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑(還包含軟膠囊)、溶液劑、混懸液劑)、注射劑、輸注劑。

該香妝品的形態(tài)沒有特別限定，例如，為化妝水、凝膠、洗液、霜、面膜劑、乳液、粉底、口紅、粉、洗面奶、生發(fā)液。

(數(shù)值范圍)

為了明確化而進(jìn)行記載，在本說明書中通過下限值與上限值所表示的數(shù)值范圍，即“下限值～上限值”包含它們的下限值以及上限值。例如，“1～2”所表示的范圍包含1以及2。

實(shí)施例

[實(shí)施例1]

(甲氧基黃酮的單離純化)

在黑姜150g中加入50％乙醇水溶液1500ml，進(jìn)行2小時(shí)加熱回流提取。將冷卻后所得到的提取液過濾，在減壓下濃縮并進(jìn)行冷凍干燥，從而得到黑姜提取物25.7g。將所得到的提取物中的9g交付于使用Diaion HP20(三菱化學(xué)株式會(huì)社制)的柱色譜，分級(jí)分離為4個(gè)組分(30％乙醇洗脫部、50％乙醇洗脫部、70％乙醇洗脫部、100％乙醇洗脫部)。其中，將50％乙醇洗脫部交付于高效液相色譜，單離出5,7,3',4'-四甲氧基黃酮(64mg)、3,5,7,3',4'-五甲氧基黃酮(464mg)、5,7-二甲氧基黃酮(145mg)、5,7,4'-三甲氧基黃酮(188mg)、3,5,7-三甲氧基黃酮(35mg)、3,5,7,4'-四甲氧基黃酮(96mg)。接著，對(duì)100％乙醇洗脫部也同樣地進(jìn)行通過液相色譜的分離純化，單離出5-羥基-3,7,3',4'-四甲氧基黃酮(15mg)、5-羥基-7-甲氧基黃酮(84mg)、5-羥基-7,4'-二甲氧基黃酮(56mg)、5-羥基-3,7-二甲氧基黃酮(100mg)、5-羥基-3,7,4'-三甲氧基黃酮(110mg)。在將單離的化合物的圖譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(大阪市立大學(xué)生活科學(xué)研究科東銳明氏博士論文“姜科植物Kaemp feria parviflora所包含的成分的結(jié)構(gòu)與α-葡萄糖苷酶抑制活性及抗誘變性”)所記載的各種圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比的基礎(chǔ)上進(jìn)行鑒定。

[實(shí)施例2]

(油脂提取物的制造)

在3g以及15g的黑姜中分別加入橄欖油30mL，于120℃進(jìn)行30分鐘提取后，冷卻后進(jìn)行過濾，得到2個(gè)淡黃色的黑姜油脂提取物。按照以下的分析條件，對(duì)所得到的2個(gè)油脂提取物中的實(shí)施例1所記載的11種甲氧基黃酮的總含量進(jìn)行定量時(shí)，其值為6.2mg/mL(從3g的黑姜中)、22.4mg/mL(從15g的黑姜中)。且，上述提取物中的任一個(gè)都包含實(shí)施例1所記載的11種甲氧基黃酮的全部。

(甲氧基黃酮的分析定量)

在黑姜油脂提取物1.0mL中加入正己烷1.0mL稀釋后，用2.0mL的80％甲醇水溶液進(jìn)行3次甲氧基黃酮的提取。使所得到的80％甲醇提取液通過Mega Bond Elute C18(安捷倫科技有限公司制)后，以將吸附于Mega Bond Elute C18的甲氧基黃酮洗脫為目的，使80％甲醇2.0mL過柱。合并所得到的液體后，最終定量為10mL，并作為HPLC用的分析試樣。

(HPLC分析條件)

色譜柱：Develosil C30UG5(4.6×150mm、5μm、野村化學(xué)株式會(huì)社制)

檢測(cè)：280nm(PDA為200～600nm)

柱溫：40℃

流動(dòng)相A：0.05％三氟乙酸水溶液

流動(dòng)相B：90％乙腈水溶液中的三氟乙酸0.05％溶液

梯度：流動(dòng)相B 50％-50％-70％-70％(0分鐘-7.5分鐘-20分鐘-25分鐘)

流速：1.0mL/分鐘

進(jìn)樣量：10μL

[實(shí)施例3]

(NOX抑制活性測(cè)定方法)

分化的HL-60細(xì)胞的制備：

已知人骨髄性白血病細(xì)胞HL-60細(xì)胞在未分化狀態(tài)下重復(fù)増殖，通過添加DMSO(dimethyl sulfoxide)、維甲酸等分化為成熟粒細(xì)胞，并失去增殖能力，同時(shí)成為分化的指標(biāo)的NOX(NADPH oxidase)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，該NOX可作為用于評(píng)價(jià)NOX抑制活性的酶源來利用。

為了分化成表達(dá)NOX的粒細(xì)胞，將用含10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的未分化HL-60細(xì)胞混懸于含有1％DMSO的含10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，使成為5×10⁵細(xì)胞/ml，將該混懸液在內(nèi)徑10cm的培養(yǎng)皿中各分注15ml，在CO₂孵育箱(37℃)中培養(yǎng)3天后，將10ml含有1％DMSO的含10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基追加到各培養(yǎng)皿中，進(jìn)一步培養(yǎng)3天，從而可得到表達(dá)了NOX的分化的HL-60細(xì)胞。如下所述，使用分化的HL-60細(xì)胞的細(xì)胞破碎液或直接使用者活細(xì)胞來測(cè)定NOX活性。

由使用了細(xì)胞破碎液的cell-free系統(tǒng)進(jìn)行的NOX活性測(cè)定：

將通過DMSO處理而分化的HL-60細(xì)胞通過離心處理進(jìn)行收集，用PBS(磷酸緩沖生理鹽水)進(jìn)行一次清洗后，使用細(xì)胞破碎用的緩沖液(含有131mM NaCl及340mM蔗糖的8mM磷酸緩沖液pH7.0)進(jìn)行混懸，以便成為1×10⁸細(xì)胞/mL。冰浴冷卻后，使用超聲波破碎機(jī)(Bioruptor UCD-250HSA、Cosmo Bio制)，在4℃以下的條件下重復(fù)3次“以最大輸出功率破碎20秒/間隔冷卻30秒”的程序，從而得到細(xì)胞破碎液。將破碎液通過1000g、4分鐘的離心處理來除去殘?jiān)?，在所得到的上清中加?倍容量的反應(yīng)用的緩沖液(含有1mM EGTA、10μMFAD及170mM蔗糖的65mM磷酸緩沖液pH7.0)，制備NOX測(cè)定用的細(xì)胞破碎上清液(相當(dāng)于1×10⁷細(xì)胞/ml)。

NOX的反應(yīng)如下：在96孔板的每孔中注入50μl的上述細(xì)胞破碎液，進(jìn)一步添加25μl作為NOX活化劑的0.5mM SDS溶液、25μl作為基質(zhì)的0.4mMNADPH溶液，于25℃進(jìn)行30～90分鐘。NOX活性通過將NADPH的消耗率進(jìn)行熒光測(cè)定(Ex：355nm/Em：460nm)來求得。

受試樣品的NOX抑制活性如下進(jìn)行：制備樣品的DMSO溶液(試劑的情況通常為10mM)，通過DMSO制備3倍稀釋系列的溶液，將其以1μl/孔分別添加到上述的反應(yīng)液中進(jìn)行酶反應(yīng)，所得到的抑制活性用IC₅₀值(μM、提取物的情況為μg/ml)表示。

使用分化的HL-60活細(xì)胞的NOX活性測(cè)定：

將通過DMSO處理而分化的HL-60細(xì)胞進(jìn)行離心處理來收集，使其混懸于不包含F(xiàn)BS及酚紅的D-MEM培養(yǎng)基中，從而成為5×10⁶細(xì)胞/ml。NOX的反應(yīng)如下：在96孔板的每孔中注入25μl的上述細(xì)胞混懸液，進(jìn)一步分別添加25μl使用上述的D-MEM所制備的0.8mg/ml WST-1溶液、制備成規(guī)定濃度的受試樣品溶解液(制備樣品的DMSO溶液(試劑的情況通常為10mM)，從其使用DMSO制備3倍稀釋系列的溶液，將其溶解于上述的D-MEM成為1v/v％以下，從而制備該受試樣品溶解液)進(jìn)行攪拌后，添加25μl的4μM PMA(12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇(Phorbol 12-Myristate 13-acetate)、終濃度為1μM)D-MEM溶液來進(jìn)行NOX的活化，于37℃進(jìn)行45分鐘的反應(yīng)，測(cè)定作為NOX酶生成物的超氧與反應(yīng)液中的WST-1反應(yīng)所生成的黃色甲臜在450nm處的吸光度。且，在該NOX活性測(cè)定系統(tǒng)中，已確認(rèn)只要不添加PMA則NOX不活化。

所得到的抑制活性用IC₅₀值(μM、提取物時(shí)為μg/ml)表示。

[實(shí)施例4]

(甲氧基類黃酮的NOX抑制活性的對(duì)比)

根據(jù)實(shí)施例3，根據(jù)通過使用了細(xì)胞破碎液的cell-free系統(tǒng)進(jìn)行的NOX活性測(cè)定，將幾種甲氧基類黃酮的NOX抑制活性進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果如表1所示。

如表1所示，發(fā)現(xiàn)作為木犀草素的甲氧基體的5，7，3’，4’-四甲氧基黃酮、作為槲皮素的甲氧基體的3，5，7，3’，4’-五甲氧基黃酮等具有強(qiáng)的NOX抑制活性。上述5，7-二甲氧基類黃酮類包含于黑姜等中。另一方面，沒有發(fā)現(xiàn)已知存在于柑橘類的川陳皮素等的六甲氧基黃酮具有強(qiáng)的NOX抑制活性。且，作為NOX抑制劑的VAS2870在使用該細(xì)胞破碎液的cell-free系統(tǒng)中的IC₅₀值為3.3μM。

表1

[實(shí)施例5]

(來自黑姜化合物的NOX抑制活性)

根據(jù)實(shí)施例3，根據(jù)通過使用了細(xì)胞破碎液的cell-free系統(tǒng)進(jìn)行的NOX活性測(cè)定，將從黑姜提取·分級(jí)分離的甲氧基類黃酮的NOX抑制活性進(jìn)行對(duì)比。從黑姜所得到的類黃酮中的任一種均存在具有甲氧基的特征。其中，在A環(huán)的5位與7位具有甲氧基的黃酮中發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)的NOX抑制活性，在5位具有羥基的類黃酮中沒有發(fā)現(xiàn)NOX抑制活性。3位的甲氧基并不是致命的，但發(fā)現(xiàn)了使活性減弱的趨勢(shì)。因此，認(rèn)為式(I)所示的甲氧基黃酮具有優(yōu)異的NOX抑制活性。另外，該系統(tǒng)中的VAS2870(NOX抑制劑)的IC₅₀為6.3μM。

表2

[實(shí)施例6]

為了確認(rèn)因黑姜的批次引起的油脂提取物的組成的不同而準(zhǔn)備2批黑姜200g，關(guān)于各批黑姜分別加入乙醇1000mL，進(jìn)行1小時(shí)加熱回流提取。將所得到的液體冷卻后進(jìn)行抽濾，分為殘?jiān)c提取液。再次在殘?jiān)屑尤胍掖?000mL，進(jìn)行1小時(shí)加熱回流提取并過濾，與先前所得到的提取液合并。接著，在提取液中加入中鏈甘油三酯100mL，通過減壓濃縮餾去乙醇后，抽濾析出的不溶物并除去，從而得到2個(gè)黑姜油脂提取物。按照實(shí)施例2分析上述提取物中的甲氧基黃酮的含量時(shí)，甲氧基黃酮的總量為90.4mg/mL(以下，將該提取物稱作“提取物A”)、54.9mg/mL(以下，將該提取物稱作“提取物B”)。另外，將上述2個(gè)提取物中的甲氧基黃酮總量用橄欖油調(diào)節(jié)為5mg/ml，從而得到2個(gè)溶液，測(cè)定該溶液在660nm處的吸光度時(shí)，分別為0.036(提取物A)、0.030(提取物B)(作為空白，使用甲醇)。且，上述提取物中的任一個(gè)都包含實(shí)施例1所記載的11種甲氧基黃酮的全部。

[實(shí)施例7]

(用于NOX抑制活性測(cè)定的樣品制備：黑姜乙醇提取物的制造)

在黑姜干燥物200g中加入50％乙醇水溶液1000mL，進(jìn)行1小時(shí)加熱回流提取。將所得到的液體冷卻后進(jìn)行抽濾，分為殘?jiān)c提取液。再次在殘?jiān)屑尤?0％乙醇水溶液1000mL，進(jìn)行1小時(shí)加熱回流提取并過濾，與先前所得到的提取液合并。冷卻至室溫后，進(jìn)行減壓濃縮后冷凍干燥，得到49g黑姜乙醇提取物-1(收率24.5％)。以確認(rèn)黑姜的批次間引起的差別為目的，用與上述同樣的方法進(jìn)行操作時(shí)，得到23g黑姜乙醇提取物-2(收率15.2％)。接著，該提取物中的11種甲氧基黃酮總含量按照實(shí)施例2的方法進(jìn)行測(cè)定時(shí)，分別為264mg/g、267mg/g。將黑姜乙醇提取物-1中的甲氧基黃酮總量用甲醇調(diào)節(jié)為5mg/ml從而得到溶液，測(cè)定該溶液在660nm處的吸光度時(shí)，為0.95(空白為甲醇)。且，上述提取物中的任一種都包含實(shí)施例1所記載的11種甲氧基黃酮的全部。

[實(shí)施例8]

(用于NOX抑制活性測(cè)定的樣品制備：黑姜油脂提取物的制造)

在黑姜10g、20g、30g、40g中分別加入10倍量的乙醇，進(jìn)行1小時(shí)加熱回流提取。將所得到的液體冷卻后進(jìn)行抽濾，在該提取液中加入中鏈甘油三酯15mL，通過減壓濃縮餾去乙醇后，以除去不溶物為目的再次進(jìn)行抽濾，分別得到黑姜油脂提取物。關(guān)于所得到的4個(gè)黑姜油脂提取物，按照實(shí)施例2分析11種甲氧基黃酮的總含量時(shí)，其值分別為23.9mg/mL、46.3mg/mL、69.4mg/mL、78.1mg/mL。另外，確認(rèn)了包含總甲氧基黃酮量為46.3mg/mL以上的油脂提取物，在室溫放置時(shí)可確認(rèn)甲氧基黃酮類的析出。且，上述提取物中的任一個(gè)都包含實(shí)施例1所記載的11種甲氧基黃酮的全部。

[實(shí)施例9]

(以NOX抑制活性為指標(biāo)的黑姜提取法的對(duì)比)

根據(jù)實(shí)施例3，測(cè)定總甲氧基黃酮量22.4mg/ml的黑姜油脂提取物-1(實(shí)施例2所得到的物質(zhì))、總甲氧基黃酮量69.4mg/ml的黑姜油脂提取物-2(實(shí)施例8所得到的物質(zhì))、乙醇提取物(實(shí)施例7所得到的黑姜乙醇提取物-1及2)的NOX抑制活性(使用分化的HL-60活細(xì)胞的NOX抑制活性測(cè)定)。為了觀察黑姜的批次間的活性強(qiáng)度的不同而對(duì)2種黑姜進(jìn)行研究。另外，由于無法直接測(cè)定油脂提取物的活性，故而進(jìn)行脫脂處理。具體而言，在油脂提取物0.5mL中加入相同量的正己烷0.5mL而稀釋后，用0.5mL的80％甲醇水溶液進(jìn)行3次甲氧基黃酮的提取。使所得到的提取液吸附于Sep-Pak PLUS C8Catrtriges(Waters公司制)，使80％甲醇3.0mL過柱從而除去油分。其后，將Sep-Pak PLUS C8Catrtriges用溶劑進(jìn)行清洗，并將所得到的液體進(jìn)行減壓濃縮、冷凍干燥來制備評(píng)價(jià)試樣。將所測(cè)定的IC₅₀值用以下的表3表示。

以下所示的IC₅₀值表示基于總甲氧基黃酮量的NOX抑制活性。將上述值進(jìn)行對(duì)比時(shí)，任一個(gè)均顯示油脂提取物的作用(低的IC₅₀)高于乙醇提取物。由此提示像本發(fā)明這樣通過油脂進(jìn)行提取，能夠有效地提取對(duì)NOX的抑制作用更高的甲氧基黃酮。

表3

[實(shí)施例10]

(NFκB抑制作用)

已知將巨噬細(xì)胞樣的RAW264.7細(xì)胞通過LPS(脂多糖)進(jìn)行刺激時(shí)，NFκB被活化，據(jù)此iNOS(誘導(dǎo)型NO合成酶)的表達(dá)亢進(jìn)，培養(yǎng)液中起因于iNOS酶活性的亞硝酸積累，通過測(cè)定培養(yǎng)液中的亞硝酸量而能夠評(píng)價(jià)NFκB活化。

RAW264.7細(xì)胞使用在含10％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)的細(xì)胞。使所得到的細(xì)胞混懸于上述培養(yǎng)液，從而成為4×10⁵細(xì)胞/ml，在96孔板的每孔中各分注100μl，預(yù)培養(yǎng)(CO₂孵育箱)24hr。通過在其中每孔分別添加25μl的6μg/ml含LPS培養(yǎng)液(LPS來自大腸桿菌、終濃度為1μg/ml)及25μl的規(guī)定濃度的受試標(biāo)品溶液，進(jìn)一步培養(yǎng)24hr后，分別分取75μl的細(xì)胞培養(yǎng)液，并添加等量的Griess試劑(Fluka制)進(jìn)行呈色反應(yīng)，基于540nm的吸光度來測(cè)定亞硝酸的生成。受試樣品的NFκB抑制活性的測(cè)定如下進(jìn)行：使用使樣品的DMSO溶液溶解于上述的培養(yǎng)液從而作為DMSO濃度成為1％以下的3倍稀釋系列的溶液，測(cè)定作為刺激劑的LPS無添加/添加條件下的吸光度。將50％抑制起因于LPS刺激的亞硝酸生成的濃度即IC₅₀值(μM)示于表4。如表4所示，式(I)的甲氧基黃酮顯示優(yōu)異的NFκB抑制作用。

表4

[實(shí)施例11]

(提取方法與組成的關(guān)系)

鑒于實(shí)施例9的結(jié)果，將來自黑姜的油脂提取物與親水性溶劑提取物的組成進(jìn)行對(duì)比。具體而言，按照實(shí)施例2、6以及8進(jìn)行油脂提取(僅通過油脂的提取、或乙醇提取及其后進(jìn)行的油脂提取)，按照實(shí)施例7進(jìn)行乙醇提取。在油脂提取中，作為油脂，使用橄欖油、或橄欖油與中鏈脂肪酸甘油酯(在本實(shí)施例，使用中鏈甘油三酯，將其也表示為“MCT”)的混合物。所得到的提取物基于實(shí)施例2所述的方法通過HPLC進(jìn)行分析，所得到的HPLC面積值如下所示。在以下的表中，方便起見將油脂也僅用“油脂”表示。

表5A

表5B

*表中的％表示提取油脂中所包含的MCT的含有率。

如表5A以及5B所示，油脂提取物中的NOX抑制活性、NFκB抑制活性強(qiáng)的甲氧基黃酮的比例，即A/(A+B)以及A’/(A’+B’)高于乙醇提取物。這樣的組成的不同會(huì)影響NOX抑制活性、NFκB抑制活性。