本發(fā)明涉及納米藥物領域，具體涉及一種抗腫瘤的納米顆粒藥物及其制備方法。

背景技術：

惡性腫瘤是目前危害人類健康的幾個主要慢性病之一，早期發(fā)現(xiàn)，早期診斷和早期治療仍是防控腫瘤的最有效手段，遺憾的是目前臨床接診的多為中晚期患者。由于其病因病理及發(fā)病機制等各方面情況尚未完全闡明，故現(xiàn)今治療惡性腫瘤的三大手段(放療、化療及手術)對絕大多數(shù)腫瘤還不能治愈，因此各種新型治療手段層出不窮，如介入微創(chuàng)治療、生物靶向治療、生物免疫治療等等，但都未能取得突破性的進展。因此不斷探索新的治療方法是臨床和科研工作者的目標和責任。

實現(xiàn)這一目標目前最熱的研究路徑之一是基于精準醫(yī)學的靶向治療，但癌細胞具有非常顯著的基因不穩(wěn)定性，因此在包括化療及靶向治療過程中，癌細胞可以通過不斷的“進化”，獲得耐藥性或者抗藥性，最終導致治療的失??；另一個研發(fā)熱點是免疫靶向治療如針對PD-1及PD-L1靶點，但由于腫瘤微環(huán)境的免疫抑制屏障在阻礙療效的發(fā)揮，實現(xiàn)這一目標的另一個可能途徑是通過破壞腫瘤生存生長及侵潤轉移的腫瘤微環(huán)境達到控制腫瘤的進展甚至治愈腫瘤成為可能。

腫瘤的癌巢及癌周有大量的炎癥細胞侵潤，是一個慢性炎癥微環(huán)境，且此種炎癥持久而不會消退，因此腫瘤可稱得上是機體“一道永不愈合的傷口”。這些炎癥細胞包括巨噬細胞、髓系來源抑制細胞、調節(jié)性樹突狀細胞、Treg細胞、淋巴細胞等，巨噬細胞是浸潤的炎細胞的主要和關鍵成分，有些情況下占到實體腫瘤細胞的50％～80％，在幾乎所有的原發(fā)和轉移腫瘤中，不論是腫瘤發(fā)生的早期還是晚期，都有巨噬細胞的浸潤，巨噬細胞來源于骨髓CD34的祖細胞，祖細胞不斷分裂增殖、分化成前單核細胞釋放到外周血進一步分化成單核細胞，單核細胞受腫瘤細胞釋放的催化因子(如CC趨化因子配體(CCL)、血管內皮生長因子(VEGF)、集落刺激因子(CSF)和胎盤來源的生長因子(PIGF)、H₂O₂等)作用，穿越血管壁，到達局部組織，在腫瘤局部特殊的微環(huán)境(缺氧、高乳酸、IL-10等)作用下發(fā)育成為功能與正常巨噬細胞不同的特殊類型巨噬細胞，我們現(xiàn)在又稱之為M2巨噬細胞，臨床觀察屢屢證明腫瘤組織中，M2巨噬細胞密度與腫瘤患者的淋巴結轉移、臨床預后等有密切的關系為獨立的預后因素體。

M2巨噬細胞對腫瘤的發(fā)展、侵襲和轉移等多個關鍵環(huán)節(jié)都有極其重要的作用，表現(xiàn)在：1、其通過促進新生血管生成；2、促進腫瘤細胞淋巴管轉移；3、高表達吲哚胺加雙氧酶消耗腫瘤微環(huán)境中的色氨酸，抑制T細胞的激活；4、上調并分泌基質金屬蛋白酶及分泌IL-4，誘導組織蛋白酶的活化，破壞基底膜，從而增強腫瘤的侵襲能力參與免疫抑制；5、通過分泌TNF-α、IL-10等免疫抑制因子，不僅誘導Treg細胞的形成，促使Th1向Th2“漂移”誘導，而且誘導抗原特異性免疫抑制因子B7-H4的表達，從而抑制T細胞功能等。

綜上情況，不斷有學者提出可從抑制腫瘤組織巨噬細胞的募集和生存、抑制巨噬細胞的促血管生成和組織重塑作用、殺滅腫瘤中定植的巨噬細胞等方面探索腫瘤治療的新方法，形成針對腫瘤相關巨噬細胞的抗腫瘤新策略。

遺憾的是迄今為止，尚未有成熟的藥物或者專利產(chǎn)品(或技術)面試，采用納米技術，攜帶治療元素，靶向到癌巢的巨噬細胞，一方面殺滅M2巨噬細胞從而破壞癌細胞賴以生存的微環(huán)境，另一方面將治療元素引入到腫瘤部位殺滅癌細胞，將是一個新的思路和方法。但目前納米技術存在有，制備的納米材料靶向性不佳，納米粒在體內不能較好的到達腫瘤部位發(fā)揮作用；納米粒需要攜帶治療藥物(如化學藥品)才能發(fā)揮抗腫瘤治療效果，但納米粒負載的藥物量有一定的限度，負載之后納米性狀也會發(fā)生較大變化；納米粒攜帶的藥物在實際應用的各個環(huán)節(jié)(如體外溶解、體內循環(huán))有不斷脫落丟失的情況等問題。

M2巨噬細胞上有豐富的甘露糖受體(MR)表達，在正常細胞表達極少，國外研究證實，甘露糖化的聚乙烯亞胺(PEI)、聚賴氨酸(PLL)及脂質體可將基因成功遞送至樹突狀細胞和巨噬細胞用于治療炎癥和腫瘤，取得一定效果。

咪唑基團具有抑制腫瘤作用，機制在于其可抑制了甲羥戊酸生物合成途徑中的關鍵酶法尼基焦磷酸合酶，抑制該途徑的中間產(chǎn)物的產(chǎn)生，影響了GTP結合酶的異戊烯化，進而影響下游的信號傳導，抑制細胞存活、黏附和轉移、血管形成，促使M2巨噬細胞轉化為抑制腫瘤的M1巨噬細胞。雙磷酸鹽如依替磷酸的基本分子結構為“C-P-C”，這一類化合物在自然界中并不存在，其在細胞內能夠三齒螯合Zn²⁺離子從而抑制基質金屬蛋白酶降低腫瘤的侵襲力；同時該結構在細胞內由于不能降解而形成“AppCp”，導致細胞凋亡。但是雙磷酸鹽類藥物盡管在體外實驗中發(fā)現(xiàn)有明顯的抗腫瘤作用，但在體內經(jīng)靜脈輸注后24h內，很快聚集到骨骼，其余部分(44±18％)經(jīng)腎臟排泄至尿中，因此難以發(fā)揮對實體腫瘤的治療效果。

本項目研發(fā)的納米粒藥物在構思和設計上采取通過化學修飾，將能靶向到M2巨噬細胞和具有細胞凋亡作用的基團，既甘露糖、咪唑和依替磷酸，引入到納米粒的核殼及核心，在不需要另外負載藥物的情況下，既通過破壞腫瘤細胞賴以生存的微環(huán)境，又使具有細胞凋亡作用的藥物在腫瘤局部形成高濃度，達到治療效果，通過國內外的文獻檢索和查新，未見到類似報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種以依替膦酸為核心，由依替膦酸與經(jīng)咪唑和甘露糖兩個基團修飾后的羧甲基殼聚糖通過離子交聯(lián)法制備納米粒的方法，通過靶向到腫瘤病灶部位大量存在的M2巨噬細胞，并使其凋亡而干預腫瘤賴以生存的微環(huán)境，發(fā)揮抗惡性腫瘤的治療效果，以解決了納米在治療惡性腫瘤上的靶向性，和避免了納米粒的藥物包封率，并簡化抗腫瘤納米粒藥物制備的步驟；由于本發(fā)明不是采用化療藥物發(fā)揮抗腫瘤作用，因此在治療惡性腫瘤的同時不會產(chǎn)生類似化療藥物的毒副作用。

本發(fā)明實現(xiàn)其發(fā)明目的采用的技術方案為：

一種抗腫瘤的納米顆粒藥物的制備方法，包括以下步驟：

1、合成咪唑及甘露糖修飾的羧甲基殼聚糖

(1)：配置嗎啉乙磺酸(MES)緩沖液：將MES溶于蒸餾水，配置成濃

度5～50mg/ml，用NaOH將pH值調至4～7；

(2)：配置O-CMC溶液：取羧甲基殼聚糖(O-CMC)加入到步驟1配濃度為1～10mg/ml O-CMC溶液；

(3)：取α-D-吡喃甘露糖-4-氨基苯基苷(MAN)加入到步驟1配置的MES緩沖液中，攪拌至清澈透明，得到濃度1～10mg/ml的MAN溶液；

(4)：將步驟2配置的溶液100ml與步驟3配置的溶液10～100ml混合，并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)70.4～704mg及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)7～70mg混合攪拌，溫度15～95℃，攪拌至液體完全蒸發(fā)，得到白色粉末；

(5)：將步驟1配置的MES緩沖液100ml加入到步驟4得到的白色粉末中，室溫攪拌至完全溶解；

(6)：取1-(3-氨基丙基)咪唑加入到步驟1配置的MES緩沖液中，攪拌至清澈透明，得到濃度為1～10mg/ml的1-(3-氨基丙基)咪唑溶液；

(7)：將步驟5所得溶液100ml與步驟6所得溶液10～100ml混合并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)152.8～1528mg及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)15.3～153mg混合攪拌溫度30℃，攪拌至液體完全蒸發(fā)，得到白色粉末；

(8)：將步驟7所得的白色粉末加入到蒸餾水中，室溫攪拌至完全溶解，經(jīng)濾紙過濾，并清洗留下的沉淀3次，收集液體放入分子截留量800的透析袋中，雙蒸水透析7天后，將透析袋內液體冷凍干燥，得到白色粉末即咪唑及甘露糖修飾的羧甲基殼聚糖(I，M-OCMC)；

(9)：將步驟8所得的I，M-OCMC取100mg溶于25～100ml蒸餾水中，

在室溫下，以400轉/分的速度，攪拌30min，配置成1～4mg/ml的I，M-OCMC

溶液，將攪拌后的溶液，滴入冰乙酸將pH值調至6，得到I，M-OCMC溶液；

2、反應產(chǎn)生納米粒：

(10)取依替膦酸二鈉溶于蒸餾水中蒸餾水，配置濃度1～4mg/ml的依替磷酸二鈉溶液，室溫攪拌至清澈透明，取步驟9制備好的I，M-OCMC溶液在室溫下，以200～800轉/分的速度進行攪拌，在攪拌的過程中，按I，M-OCMC：依替膦酸二鈉質量比1：1～4：1的不同比值，恒速滴入制備好的依替膦酸二鈉溶液，并繼續(xù)在室溫下，以200～800轉/分的速度攪拌15～30分鐘；

(11)將攪拌后的產(chǎn)物放入透析袋中，并放入已加入100ml雙蒸餾水的燒杯中，以100轉/分的速度進行攪拌透析，每隔4小時換一次雙蒸餾水溶液，透析24～48小時后，將所得產(chǎn)物在-80℃的環(huán)境下經(jīng)行冷凍真空干燥，獲得納米顆粒粉末，將粉末溶于50ml雙蒸水中，采用儀器AKTApurifier蛋白純化系統(tǒng)，柱子為QXL1ML，進行過柱，取過柱的液體冷凍干燥，得到咪唑及甘露糖修飾的羧甲基殼聚糖依替磷酸復合物納米顆粒藥物。

本發(fā)明的原理為：

利用α-D-吡喃甘露糖-4-氨基苯基苷(CAS：34213-86-0)的-NH₂與羧甲基殼聚糖的-COOH通過酰胺化反應發(fā)生枝接，從而使甘露糖穩(wěn)定的鍵合在羧甲基殼聚糖分子上；利用1-(3氨基丙基)咪唑的-NH₂與羧甲基殼聚糖的-COOH通過酰胺化反應發(fā)生枝接，從而使甘露糖穩(wěn)定的鍵合在羧甲基殼聚糖分子上，枝接后的羧甲基殼聚糖分子由于含有大量的-NH₂，在酸性溶液中質子化形成帶正電的氨基(-NH3⁺)，依替膦酸分子上有多個羥基(-OH)，堿化后形成負電基團(-O^-)，與殼聚糖分子內大量的-NH3⁺形成分子間的交聯(lián)，通過控制反應條件(濃度比、質量比和pH值等)形成納米粒。該納米粒抗腫瘤的可能機理為：

由于M2巨噬細胞大量表達甘露糖受體，機體正常細胞沒有表達或者很少表達，而在腫瘤患者體內M2巨噬細胞主要分布在癌周和癌巢，是多種腫瘤病灶區(qū)域的主要細胞，可保證納米粒的有效靶向。而且該細胞通過①促進新生血管生成和腫瘤淋巴管轉移、②誘導組織蛋白酶活化增強腫瘤的侵襲能力、③誘導Treg細胞的形成、分泌多種免疫抑制因子、誘導抗原特異性免疫抑制因子B7-H4的表達和使Th1向Th2“漂移”，從而抑制T細胞的激活和參與腫瘤的免疫抑制等，在多個關鍵環(huán)節(jié)參與和主導了腫瘤的發(fā)展、侵襲與轉移。該納米粒在設計上采用咪唑基團和依替磷酸為治療效應分子，能夠：①抑制法尼基焦磷酸合酶導致異戊烯焦磷酸大量蓄積致使細胞凋亡；②三齒螯合Zn²⁺離子抑制基質金屬蛋白酶降低腫瘤的侵襲力；③在細胞內形成ATP類似物“AppCp”導致細胞凋亡。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：

與現(xiàn)有的通過殼聚糖與三聚磷酸鈉或者采用羧甲基殼聚糖與氯化鈣等通過離子交聯(lián)法結合制備納米，再負載藥物發(fā)揮抗腫瘤治療作用相比，本發(fā)明采用經(jīng)咪唑基團和甘露糖基團修飾后的羧甲基殼聚糖與依替膦酸，通過離子交聯(lián)法制得納米，該納米本身帶有的咪唑基團和依替膦酸能夠引發(fā)細胞凋亡，因此不用再負載藥物既可發(fā)揮抗腫瘤作用，同時簡化了制備流程，避免了納米粒攜帶藥物后存在的包封率問題，制得的納米粒粒徑可控，在幾十到1000納米之間，甘露糖作為靶向材料可引導納米粒到達腫瘤部位，被腫瘤相關性巨噬細胞(包括M2巨噬細胞、未成熟樹突狀細胞)吞噬后，在局部及以胞內釋放出依替膦酸和咪唑，發(fā)揮細胞殺滅作用，從而實現(xiàn)靶向性的抗癌效果。通過動物實驗可以觀察到該納米粒具有腫瘤靶向性和有抗腫瘤和抑制轉移作用。

附圖說明

圖1：咪唑及甘露糖修飾的殼聚糖MRI圖譜；

圖2：本發(fā)明實施例1制備的納米顆粒藥物；

圖3：本發(fā)明實施例2制備的納米顆粒藥物；

圖4：本發(fā)明實施例3制備的納米顆粒藥物；

圖5：本發(fā)明實施例4制備的納米顆粒藥物。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發(fā)明進行進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不限定于本發(fā)明。

實施例1

1、合成咪唑及甘露糖修飾的羧甲基殼聚糖

步驟1：配置嗎啉乙磺酸(MES)緩沖液：取MES6g，蒸餾水300ml，配置濃度為5mg/ml，用NaOH將pH值調至4，

步驟2：取羧甲基殼聚糖(O-CMC)100mg加入到步驟1配置的MES緩沖液100ml中，攪拌至清澈透明，得到濃度為1mg/ml O-CMC溶液，

步驟3：取α-D-吡喃甘露糖-4-氨基苯基苷(MAN)加入到步驟1配置的MES緩沖液中，攪拌至清澈透明，得到濃度1mg/ml的MAN溶液，

步驟4：將步驟2配置的溶液100ml與步驟3配置的溶液10ml混合并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)70.4mg及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)7mg混合攪拌，溫度15℃，攪拌至液體完全蒸發(fā)，得到白色粉末，

步驟5：將步驟1配置的MES緩沖液100ml加入到步驟4得到的粉末中，室溫攪拌至完全溶解，

步驟6：取1-(3-氨基丙基)咪唑100mg加入到步驟1配置的MES緩沖液100ml中，攪拌至清澈透明，得到濃度為1mg/ml的1-(3-氨基丙基)咪唑溶液，

步驟7：將步驟5所得溶液100ml與步驟6所得溶液10ml混合并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)152.8mg及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)15.3mg混合攪拌溫度30℃，攪拌至液體完全蒸發(fā)，得到白色粉末，

步驟8：將20ml蒸餾水加入步驟7中的白色粉末中，室溫攪拌至完全溶解，經(jīng)濾紙過濾，并清洗留下的沉淀3次，收集液體放入分子截留量800的透析袋中，雙蒸水透析7天后，將透析袋內液體冷凍干燥，得到白色粉末即咪唑及甘露糖修飾的羧甲基殼聚糖(I，M-OCMC)，

步驟9：將步驟8所得的I，M-OCMC取100mg溶于25ml蒸餾水中，在室溫下，以400轉/分的速度，攪拌30min，配置成1mg/ml的I，M-OCMC溶液，將攪拌后的溶液滴入冰乙酸將pH值調至6，得到I，M-OCMC溶液。

2、反應產(chǎn)生納米粒

取依替膦酸二鈉溶于蒸餾水中，配置濃度為1mg/ml的依替膦酸二鈉溶液，室溫攪拌至清澈透明，取步驟9制備好的I，M-OCMC溶液20ml在室溫下，以400轉/分的速度進行攪拌。在攪拌的過程中，按I，M-OCMC：依替膦酸二鈉質量比1:1的比值，恒速滴入制備好的依替膦酸二鈉溶液，并繼續(xù)在室溫下，以200轉/分的速度攪拌15分鐘，將攪拌后的產(chǎn)物放入透析袋中，并放入已加入100ml雙蒸餾水的燒杯中，

以100轉/分的速度進行攪拌透析，每隔4小時換一次雙蒸餾水溶液，透析24小時后，將所得產(chǎn)物在-80℃的環(huán)境下經(jīng)行冷凍真空干燥，獲得納米顆粒粉末，將粉末溶于50ml雙蒸水中，采用儀器AKTApurifier蛋白純化系統(tǒng)，柱子為QXL1ML，進行過柱，取過柱的液體冷凍干燥，得到咪唑及甘露糖修飾的羧甲基殼聚糖依替磷酸復合物納米顆粒。

實施例2

1、合成咪唑及甘露糖修飾的羧甲基殼聚糖

步驟1：配置嗎啉乙磺酸(MES)緩沖液：取MES溶于蒸餾水中，配置濃度為50mg/ml，用NaOH將pH值調至7，

步驟2：取羧甲基殼聚糖(O-CMC)加入到步驟1配置的MES緩沖液中，攪拌至清澈透明，配置得到濃度為10mg/ml O-CMC溶液，

步驟3：取α-D-吡喃甘露糖-4-氨基苯基苷(MAN)加入到步驟1配置的MES緩沖液中，攪拌至清澈透明，配置得到濃度10mg/ml的MAN溶液，

步驟4：將步驟2配置的溶液100ml與步驟3配置的溶液100ml混合并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)704mg及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)70mg混合攪拌，溫度95℃，攪拌至液體完全蒸發(fā)，得到白色粉末，

步驟5：將步驟1配置的MES緩沖液100ml加入到步驟4得到的粉末中，室溫攪拌至完全溶解，

步驟6：取1-(3-氨基丙基)咪唑加入到步驟1配置的MES緩沖液中，攪拌至清澈透明，得濃度為10mg/ml的1-(3-氨基丙基)咪唑溶液，

步驟7：將步驟5所得溶液100ml與步驟6所得溶液100ml混合并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)1528mg及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)153mg混合攪拌溫度30℃，攪拌至液體完全蒸發(fā)，得到白色粉末，

步驟8：將100ml蒸餾水加入步驟7中的白色粉末中，室溫攪拌至完全溶解，經(jīng)濾紙過濾，并清洗留下的沉淀3次，收集液體放入分子截留量800的透析袋中，雙蒸水透析7天后，將透析袋內液體冷凍干燥，得到白色粉末即咪唑及甘露糖修飾的羧甲基殼聚糖(I，M-OCMC)，

步驟9：將步驟8所得的I，M-OCMC取100mg溶于25ml蒸餾水中，在室溫下，以400轉/分的速度，攪拌30min，配置成4mg/ml的I，M-OCMC溶液。將攪拌后的溶液，滴入冰乙酸將PH值調至6，得到I，M-OCMC溶液；

2、反應產(chǎn)生納米粒

取依替膦酸二鈉溶于蒸餾水中，配置濃度4mg/ml的依替磷酸二鈉溶液，室溫攪拌至清澈透明。取步驟9制備好的I，M-OCMC溶液100ml在室溫下，以200轉/分的速度進行攪拌。在攪拌的過程中，按I，M-OCMC：依替膦酸二鈉質量比4：1的比值，恒速滴入制備好的依替膦酸二鈉溶液，并繼續(xù)在室溫下，以800轉/分的速度攪拌15分鐘，

將攪拌后的產(chǎn)物放入透析袋中，并放入已加入100ml雙蒸餾水的燒杯中，以100轉/分的速度進行攪拌透析，每隔4小時換一次雙蒸餾水溶液。透析48小時后，將所得產(chǎn)物在-80℃的環(huán)境下經(jīng)行冷凍真空干燥，獲得納米顆粒粉末，將粉末溶于50ml雙蒸水中，采用儀器AKTApurifier蛋白純化系統(tǒng)，柱子為QXL1ML，進行過柱，取過柱的液體冷凍干燥，得到咪唑及甘露糖修飾的羧甲基殼聚糖依替磷酸復合物納米顆粒。

實施例3

1、合成咪唑及甘露糖修飾的羧甲基殼聚糖

步驟1：配置嗎啉乙磺酸(MES)緩沖液：取MES用蒸餾水配置成濃度25mg/ml，用NaOH將pH值調至6，

步驟2：取羧甲基殼聚糖(O-CMC)加入到步驟1配置的MES緩沖液中，攪拌至清澈透明，得到濃度為5mg/ml O-CMC溶液，

步驟3：取α-D-吡喃甘露糖-4-氨基苯基苷(MAN)加入到步驟1配置的MES緩沖液中，攪拌至清澈透明，得到濃度5mg/ml的MAN溶液，

步驟4：將步驟2配置的溶液100ml與步驟3配置的溶液50ml混合并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)704mg及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)70mg混合攪拌，溫度15℃，攪拌至液體完全蒸發(fā)，得到白色粉末，

步驟5：將步驟1配置的MES緩沖液100ml加入到步驟4得到的粉末中，室溫攪拌至完全溶解，

步驟6：取1-(3-氨基丙基)咪唑加入到步驟1配置的MES緩沖液中，攪拌至清澈透明，得到濃度為5mg/ml的1-(3-氨基丙基)咪唑溶液，

步驟7：將步驟5所得溶液100ml與步驟6所得溶液50ml混合并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)764mg及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)76.4mg混合攪拌溫度30℃，攪拌至液體完全蒸發(fā)，得到白色粉末，

步驟8：將50ml蒸餾水加入步驟7中的白色粉末中，室溫攪拌至完全溶解，經(jīng)濾紙過濾，并清洗留下的沉淀3次，收集液體放入分子截留量800的透析袋中，雙蒸水透析7天后，將透析袋內液體冷凍干燥，得到白色粉末即咪唑及甘露糖修飾的羧甲基殼聚糖(I，M-OCMC)，

步驟9：將步驟8所得的I，M-OCMC取100mg溶于50ml蒸餾水中，在室溫下，以400轉/分的速度，攪拌30min，配置成2.5mg/ml的I，M-OCMC溶液，將攪拌后的溶液，滴入冰乙酸將pH值調至6，得到I，M-OCMC溶液；

2、反應產(chǎn)生納米粒

取依替膦酸二鈉溶于蒸餾水中蒸餾水，配置濃度2.5mg/ml的依替磷酸二鈉溶液，室溫攪拌至清澈透明，取步驟9制備好的I，M-OCMC溶液100ml在室溫下，以600轉/分的速度進行攪拌，在攪拌的過程中，按I，M-OCMC：依替膦酸二鈉質量比3：1的比值，恒速滴入制備好的依替膦酸二鈉溶液，并繼續(xù)在室溫下，以500轉/分的速度攪拌20分鐘；

將攪拌后的產(chǎn)物放入透析袋中，并放入已加入100ml雙蒸餾水的燒杯中，以100轉/分的速度進行攪拌透析，每隔4小時換一次雙蒸餾水溶液，透析30小時后，將所得產(chǎn)物在-80攝氏度的環(huán)境下經(jīng)行冷凍真空干燥，獲得納米顆粒粉末。將粉末溶于50ml雙蒸水中，采用儀器AKTApurifier蛋白純化系統(tǒng)，柱子為QXL1ML，進行過柱，取過柱的液體冷凍干燥，得到咪唑及甘露糖修飾的羧甲基殼聚糖依替磷酸復合物納米顆粒。

實施例4

1、合成咪唑及甘露糖修飾的羧甲基殼聚糖

步驟1：配置嗎啉乙磺酸(MES)緩沖液：取MES6g，蒸餾水300ml，配置濃度20mg/ml，用NaOH將pH值調至5.2，

步驟2：取羧甲基殼聚糖(O-CMC)100mg加入到步驟1配置的MES緩沖液100ml中，攪拌至清澈透明，得到濃度為3mg/ml O-CMC溶液，

步驟3：取α-D-吡喃甘露糖-4-氨基苯基苷(MAN)100mg加入到步驟1配置的MES緩沖液100ml中，攪拌至清澈透明，得到濃度4mg/ml的MAN溶液，

步驟4：將步驟2配置的溶液100ml與步驟3配置的溶液20ml混合并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)140.8mg及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)14mg混合攪拌，溫度30℃，攪拌至液體完全蒸發(fā)，得到白色粉末，

步驟5：將步驟1配置的MES緩沖液100ml加入到步驟4得到的粉末中，室溫攪拌至完全溶解，

步驟6：取1-(3-氨基丙基)咪唑加入到步驟1配置的MES緩沖液100ml中，攪拌至清澈透明，配置濃度為6mg/ml的1-(3-氨基丙基)咪唑溶液，

步驟7：將步驟5所得溶液100ml與步驟6所得溶液30ml混合并加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)457mg及N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)45.7mg混合攪拌溫度75℃，攪拌至液體完全蒸發(fā)，得到白色粉末，

步驟8：將20ml蒸餾水加入步驟7中的白色粉末中，室溫攪拌至完全溶解，經(jīng)濾紙過濾，并清洗留下的沉淀3次，收集液體放入分子截留量800的透析袋中，雙蒸水透析7天后，將透析袋內液體冷凍干燥，得到白色粉末即咪唑及甘露糖修飾的羧甲基殼聚糖(I，M-OCMC)，

步驟9：將步驟8所得的I，M-OCMC取90mg溶于45ml蒸餾水中，在室溫下，以400轉/分的速度，攪拌30min，配置成3mg/ml的I，M-OCMC溶液。將攪拌后的溶液，滴入冰乙酸將pH值調至6，得到I，M-OCMC溶液；

2、反應產(chǎn)生納米粒

取依替膦酸二鈉30mg溶于75ml蒸餾水中蒸餾水，配置濃度2.5mg/ml的依替磷酸二鈉溶液，室溫攪拌至清澈透明，取步驟9制備好的I，M-OCMC溶液20ml在室溫下，以300轉/分的速度進行攪拌。在攪拌的過程中，按I，M-OCMC：依替膦酸二鈉質量比3：1的不同比值，恒速滴入制備好的依替膦酸二鈉溶液，并繼續(xù)在室溫下，以600轉/分的速度攪拌25分鐘，

將攪拌后的產(chǎn)物放入透析袋中，并放入已加入100ml雙蒸餾水的燒杯中，以100轉/分的速度進行攪拌透析，每隔4小時換一次雙蒸餾水溶液，透析30小時后，將所得產(chǎn)物在-80℃的環(huán)境下經(jīng)行冷凍真空干燥，獲得納米顆粒粉末，將粉末溶于50ml雙蒸水中，采用儀器AKTApurifier蛋白純化系統(tǒng)，柱子為QXL1ML，進行過柱，取過柱的液體冷凍干燥，得到咪唑及甘露糖修飾的羧甲基殼聚糖依替磷酸復合物納米顆粒。

動物實驗

1、將Lewis肺癌1×10⁶個/mL懸液0.2mL接種于Babl/c小鼠股內側皮下，共30只，建立動物腫瘤模型，待腫瘤生長至100mm³～300mm³分為3組(A組、B組、C組)，每組10只，進行實驗。

A組：每周經(jīng)尾靜脈注射咪唑及甘露糖修飾的羧甲基殼聚糖溶液0.1ml(0.1mg)，共4次；

B組：每周經(jīng)尾靜脈注射依替膦酸溶液0.1ml(0.1mg)，共4次。

C組：每周經(jīng)尾靜脈注射本項目制備的納米顆粒溶液0.1ml(0.1mg)，共4次。

接種癌細胞6周后的死亡率，A組為70％，B組90％，C組為30％，與A、B兩組相比，C組死亡率明顯更低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。