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一種Ⅰ群4型禽腺病毒基因工程亞單位疫苗及其制備方法與流程

文檔序號(hào):12731002閱讀:來(lái)源:國(guó)知局

技術(shù)特征:

1.一種Ⅰ群4型禽腺病毒基因工程亞單位疫苗,其特征在于該疫苗以氨基酸序列為SEQ ID No:1的蛋白為抗原。

2.一種權(quán)利要求1所述Ⅰ群4型禽腺病毒基因工程亞單位疫苗的制備方法,其特征在于包括以下步驟:

1)制備序列為SEQ ID No:1的蛋白的表達(dá)基因;

2)將步驟1)所得的基因克隆到表達(dá)載體pET-32a上,得到重組質(zhì)粒;

3)將步驟2)所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中,得到重組菌;

4)誘導(dǎo)表達(dá)步驟1)所述蛋白;

5)裂解所述重組菌,而后收集并純化驟1)所述蛋白;

6)利用步驟5)所得的蛋白制備疫苗。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法,其特征在于步驟1)中所述表達(dá)基因是利用PCR方法制備的,所述PCR的模板為FAV-4病毒,所述PCR的上、下游引物分別是序列為SEQ ID No:3的DNA和序列為SEQ ID No:4的DNA。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法,其特征在于所述PCR的反應(yīng)條件為:94℃變性45s,56℃退火45s,72℃延伸1min,共進(jìn)行30循環(huán)。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法,其特征在于步驟2)所述的克隆到表達(dá)載體pET-32a上,是先將步驟1)所得的PCR產(chǎn)物克隆至pMD-18T載體上,得到重組載體,而后利用雙酶切的方法將所述重組載體與pET-32a質(zhì)粒相連接,即得到所述重組質(zhì)粒。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法,其特征在于所述雙酶切所用酶分別為EcoR I和Hind III,酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,分別回收目的片段和pET-32a,然后16℃連接過(guò)夜。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法,其特征在于步驟4)所述的誘導(dǎo)表達(dá),是利用終濃度為0.5mM的IPTG實(shí)現(xiàn)的。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法,其特征在于步驟5)所述的裂解包括以下操作:以8000rpm的轉(zhuǎn)速離心20min,收集沉淀加入結(jié)合緩沖液100ml懸浮菌體,而后進(jìn)行750W超聲波破碎,而后于4℃條件下以8000rpm的轉(zhuǎn)速離心30min,收集沉淀,即得到包涵體;其中所述結(jié)合緩沖液包含20mmol/L Tris.HCl,0.5mol/L NaCl,5mmol/L咪唑;所述結(jié)合緩沖液的pH為8.0;所述超聲破碎每次工作時(shí)間10s,間隔時(shí)間20s,共破碎120次。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法,其特征在于步驟5)所述純化包括以下操作:將所得的包涵體溶解于尿素溶液中,而后過(guò)8mol/L尿素平衡的Ni敖合樹(shù)脂柱,而后用30mL洗脫緩沖溶液配制的8mol/L尿素洗脫目的蛋白,收集流出液,于4℃透析過(guò)夜后,冷凍干燥;其中所述洗脫緩沖溶液包含20mmol/L Tris.HCl,0.5mol/LNaCl,300mmol/L咪唑;所述洗脫緩沖溶液的pH為8.0。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法,其特征在于所述將所得的包涵體溶解于尿素溶液中,包括以下操作:將5g包含體中加入120ml的2%(W/V)TritonX-100,用攪拌器攪拌30min,超聲破碎40次,攪拌器繼續(xù)攪拌30min,然后低溫冷凍離心8000rpm,30min。再分別用2%,2.2%,2.4%,2.5%(W/V)的TritonX-100各120ml按上述方法洗滌,共洗滌4次,向最后洗滌的包含體沉淀中加入100ml濃度為8mol/L的尿素溶液,用磁力攪拌器攪拌40min,冷凍離心8000rpm,30min,保留上清。

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