本發(fā)明屬于疫苗技術(shù)領(lǐng)域，同時涉及重組菌的制備及重組蛋白的表達(dá)，具體涉及一種Ⅰ群4型禽腺病毒基因工程亞單位疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
Ⅰ群禽腺病毒組成了腺病毒科的禽腺病毒屬。Ⅱ群(火雞出血性腸炎和相關(guān)病毒)和Ⅲ群(減蛋綜合征)腺病毒與疾病的關(guān)系明確，相比之下，大多數(shù)Ⅰ群的禽腺病毒對禽類的致病作用還未完全確定。但FAdV-1和FAdV-4明顯屬于例外，其中FAdV-1能引起鵪鶉支氣管炎，F(xiàn)AdV-4是心包積水肝炎綜合征的主要病因。當(dāng)雞的健康受到損害時，如并發(fā)感染雞傳染性貧血病毒(CIAV)和傳染性法氏囊病病毒(IBDV)等其他病原，其他的腺病毒毒株可使條件性致病原發(fā)生快速感染。Ⅰ群禽腺病毒已鑒定了5個禽腺病毒，其名稱用字母A～E表示。每個種內(nèi)的病毒主要根據(jù)交叉中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步分為不同的血清型。病毒顆粒直徑為70～90nm，無囊膜，呈20面體對稱結(jié)構(gòu)。病毒核酸為雙股DNA，占整個病毒粒子的11.3％～13.5％，其余部分為蛋白質(zhì)。病毒六鄰體是主要的衣殼蛋白，含有型、群和群特異性抗原決定簇，因而感染后可產(chǎn)生相應(yīng)的型、群和群的特異性抗體。
Ⅰ群禽腺病毒呈世界性分布，各年齡段家禽均易感?？梢酝ㄟ^水平和垂直兩種途徑傳播。雖然感染雞的12個血清型之間及血清型內(nèi)部的毒力各有不同，但12個血清型均能誘發(fā)包涵體肝炎(IBH)。FAdV-4引起的心包積水肝炎綜合征(HHS)的主要臨床癥狀為產(chǎn)蛋下降和引起死亡(死亡率在20％～80％)，主要病理變化是心包腔中有淡黃色清亮的積液，肝臟腫大、蒼白，腎臟腫大，心臟和肝臟出現(xiàn)多發(fā)性局灶性壞死，肝細(xì)胞中見核內(nèi)包涵體。FAV-4具有明顯的致病年齡段，對雛雞的致病力最強(qiáng)，可通過接觸水平傳播及垂直傳播。1987年在巴基斯坦臨近卡拉奇的安哥拉首先報道本病，1989年在墨西哥，其后在伊拉克、印度的幾個邦、厄瓜多爾、秘魯、智利、中南美洲、俄羅斯和孟加拉國等國相繼發(fā)現(xiàn)該病。如今，世界各地都有HHS的蹤影，遍及拉丁美洲-中東和亞洲的一些國家。
通過對Ⅰ群禽腺病毒的流行病學(xué)調(diào)查，該病在我國雞群中發(fā)病率較高，且呈逐年上升趨勢。發(fā)病的宿主范圍越來越廣，白羽肉雞、肉種雞、蛋雞、黃羽雞均可感染發(fā)病。特別是2010年以后發(fā)病呈現(xiàn)增加趨勢，在全國范圍內(nèi)均有流行。臨床表現(xiàn)包涵體肝炎(IBH)、心包積水肝炎綜合征(HHS)。隨著我國養(yǎng)雞業(yè)的迅速發(fā)展，Ⅰ群禽腺病毒的發(fā)病率給飼養(yǎng)業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。關(guān)于該病的防治，國外已有預(yù)防Ⅰ群禽腺病毒的商品化疫苗，至今國內(nèi)尚無疫苗可用，導(dǎo)致Ⅰ群禽腺病毒防控存在漏洞。
目前，F(xiàn)AV-4接種雞胚或原代雞腎臟細(xì)胞肝細(xì)胞來接種制備疫苗。雞胚繁殖病毒毒價低，病毒需要高倍濃縮，成本高昂；而原代肝腎細(xì)胞制備繁瑣、易污染、不易轉(zhuǎn)染，且在制備細(xì)胞過程中易混入雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，不利于實(shí)驗(yàn)操作。所以急需新的抗原制備途徑。
Ⅰ群禽腺病毒具有典型的腺病毒粒子形態(tài)，毒粒直徑為70-90nm，無囊膜，呈球形，二十面體對稱結(jié)構(gòu)。病毒粒子具有252個殼粒，240個非頂角殼粒為六鄰體，12個頂角殼粒為五鄰體，每個五鄰體有2條纖維突起。研究表明纖維突起具有良好的免役原型。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種Ⅰ群4型禽腺病毒基因工程亞單位疫苗及其制備方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中Ⅰ群4型禽腺病毒滅活疫苗制備困難的技術(shù)問題。
本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中缺乏一種針對Ⅰ群4型禽腺病毒的亞單位疫苗。
本發(fā)明要解決的再一技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中Ⅰ群4型禽腺病毒的亞單位疫苗由于抗原選擇不合理而導(dǎo)致免疫效果較差。
本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問題是當(dāng)采用本發(fā)明所提供的蛋白作為抗原時，該蛋白的獲取效率較低。
為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
一種Ⅰ群4型禽腺病毒基因工程亞單位疫苗，該疫苗以氨基酸序列為SEQ ID No:1的蛋白為抗原。
一種上述Ⅰ群4型禽腺病毒基因工程亞單位疫苗的制備方法，包括以下步驟：
1)制備序列為SEQ ID No:1的蛋白的表達(dá)基因；
2)將步驟1)所得的基因克隆到表達(dá)載體pET-32a上，得到重組質(zhì)粒；
3)將步驟2)所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，得到重組菌；
4)誘導(dǎo)表達(dá)步驟1)所述蛋白；
5)裂解所述重組菌，而后收集并純化驟1)所述蛋白；
6)利用步驟5)所得的蛋白制備疫苗。
作為優(yōu)選，步驟1)中所述表達(dá)基因是利用PCR方法制備的，所述PCR的模板為FAV-4病毒，所述PCR的上、下游引物分別是序列為SEQ ID No:3的DNA和序列為SEQ ID No:4的DNA。
作為優(yōu)選，所述PCR的反應(yīng)條件為：94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共進(jìn)行30循環(huán)。
作為優(yōu)選，步驟2)所述的克隆到表達(dá)載體pET-32a上，是先將步驟1)所得的PCR產(chǎn)物克隆至pMD-18T載體上，得到重組載體，而后利用雙酶切的方法將所述重組載體與pET-32a質(zhì)粒相連接，即得到所述重組質(zhì)粒。
作為優(yōu)選，所述雙酶切所用酶分別為EcoR I和Hind III，酶切產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，分別回收目的片段和pET-32a，然后16℃連接過夜。
作為優(yōu)選，步驟4)所述的誘導(dǎo)表達(dá)，是利用終濃度為0.5mM的IPTG實(shí)現(xiàn)的。
作為優(yōu)選，步驟5)所述的裂解包括以下操作：以8000rpm的轉(zhuǎn)速離心20min，收集沉淀加入結(jié)合緩沖液100ml懸浮菌體，而后進(jìn)行750W超聲波破碎，而后于4℃條件下以8000rpm的轉(zhuǎn)速離心30min，收集沉淀，即得到包涵體；其中所述結(jié)合緩沖液包含20mmol/L Tris.HCl，0.5mol/L NaCl，5mmol/L咪唑；所述結(jié)合緩沖液的pH為8.0；所述超聲破碎每次工作時間10s，間隔時間20s，共破碎120次。
作為優(yōu)選，步驟5)所述純化包括以下操作：將所得的包涵體溶解于尿素溶液中，而后過8mol/L尿素平衡的Ni敖合樹脂柱，而后用30mL洗脫緩沖溶液配制的8mol/L尿素洗脫目的蛋白，收集流出液，于4℃透析過夜后，冷凍干燥；其中所述洗脫緩沖溶液包含20mmol/L Tris.HCl，0.5mol/LNaCl，300mmol/L咪唑；所述洗脫緩沖溶液的pH為8.0。
作為優(yōu)選，所述將所得的包涵體溶解于尿素溶液中，包括以下操作：將5g包含體中加入120ml的2％(W/V)TritonX-100，用攪拌器攪拌30min，超聲破碎40次，攪拌器繼續(xù)攪拌30min，然后低溫冷凍離心8000rpm，30min。再分別用2％，2.2％，2.4％，2.5％(W/V)的TritonX-100各120ml按上述方法洗滌，共洗滌4次，向最后洗滌的包含體沉淀中加入100ml濃度為8mol/L的尿素溶液，用磁力攪拌器攪拌40min，冷凍離心8000rpm，30min，保留上清。
本發(fā)明所述的疫苗可用于預(yù)防雞心包積水肝炎綜合征。
在以上技術(shù)方案中，步驟6)所述制備疫苗，是以步驟5)所得的蛋白為抗原制備疫苗，具體操作方法可以按照本領(lǐng)域常規(guī)的疫苗制備方法執(zhí)行，也就是說，在以步驟1)～5)所制備的蛋白為抗原的基礎(chǔ)上，利用本領(lǐng)域任一種常規(guī)的疫苗制備方法均可達(dá)到本發(fā)明所預(yù)期的效果，而具體采用何種疫苗制備工藝，可以依照具體的工藝要求進(jìn)行適應(yīng)性選擇。
本發(fā)明提供了一種Ⅰ群4型禽腺病毒基因工程亞單位疫苗及其制備方法，該技術(shù)方案首先利用PCR技術(shù)從Ⅰ群4型禽腺病毒基因組中克隆纖維蛋白C-末端的編碼基因并進(jìn)行序列分析；然后將該基因克隆到表達(dá)載體pET-32a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后構(gòu)建工程菌，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)工程菌表達(dá)纖維蛋白C-末端；最后裂解工程菌細(xì)胞，離心分離其中的包含體，尿素溶解后，稀釋復(fù)性；再按常規(guī)礦物油佐劑滅活疫苗制備方法制備成疫苗。本發(fā)明研究的禽腺病毒基因工程亞單位疫苗疫苗采用了基因工程發(fā)酵的方法制備抗原，成本低，抗原純凈，使用安全，且具有良好的免疫效果。本發(fā)明制備的Ⅰ群4型禽腺病毒亞單位疫苗，利用血清學(xué)方法和免疫攻毒法評估疫苗的免疫效果，結(jié)果顯示，本發(fā)明中制備的禽腺病毒滅活疫苗對禽能夠提供有效的免疫保護(hù)，具有很好的商品化開發(fā)前景。
具體實(shí)施方式
以下將對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過多不必要的細(xì)節(jié)，在以下實(shí)施例中對屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。
以下實(shí)施例中所使用的近似性語言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情況下可允許數(shù)量有一定的變動。因此，用“大約”、“左右”等語言所修正的數(shù)值不限于該準(zhǔn)確數(shù)值本身。在一些實(shí)施例中，“大約”表示允許其修正的數(shù)值在正負(fù)百分之十(10％)的范圍內(nèi)變化，比如，“大約100”表示的可以是90到110之間的任何數(shù)值。此外，在“大約第一數(shù)值到第二數(shù)值”的表述中，大約同時修正第一和第二數(shù)值兩個數(shù)值。在某些情況下，近似性語言可能與測量儀器的精度有關(guān)。
除有定義外，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。以下實(shí)施例中所用的術(shù)語“第一”、“第二”等并不表示任何順序、數(shù)量或重要性，而僅用于區(qū)別一種物質(zhì)和另一種物質(zhì)。
實(shí)施例1(纖維蛋白C-末端基因克隆與序列分析)
設(shè)計(jì)合成一對引物：
引物1：5’-GCGAATTCATGGCTATGCTACAGAT-3’；
引物2：5’-GGAAGCTTTTACGGGAGGGAGCC-3’。
FAV-4種毒購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。
以FAV-4病毒為模板，按照94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，共進(jìn)行30循環(huán)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將PCR產(chǎn)物直接克隆到pMD-18T載體(TaKaRa公司)上，構(gòu)建pMD-18T-HHS；利用雙脫氧鏈終止法進(jìn)行序列測定，結(jié)果顯示，從FAV-4基因組中克隆纖維蛋白C-末端的編碼基因具有SEQ ID No:2所示的核苷酸序列，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。
實(shí)施例2(表達(dá)載體與工程菌的構(gòu)建)
將pMD-18T-HHS與pET-32a用EcoR I和Hind III雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，分別回收目的片段和pET-32a，然后16℃連接過夜；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種到2ml含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12h，提取質(zhì)粒后用雙酶切進(jìn)行鑒定，獲得表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-HHS。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)，挑取單菌落，接種到200mL含100μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12h，后轉(zhuǎn)接到4L相同培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)3h后，加入IPTG至終濃度為0.5mM，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后SDS-PAGE電泳分析。
實(shí)施例3(重組Ⅰ群4型禽腺病毒纖維蛋白C-末端的純化)
挑取工程菌單菌落于200ml LB液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素濃度0.1g/L)，37℃恒溫振蕩過夜培養(yǎng)；將過夜培養(yǎng)物按體積比為1∶20的比例倒入總計(jì)4L的LB液體培養(yǎng)基(氨芐青霉素濃度0.1g/L)，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)3h；然后加入IPTG使其終濃度為5mM，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)4h。
將培養(yǎng)物用大型低溫冷凍離心機(jī)離心，8000rpm，20min；棄上清，加入結(jié)合緩沖液100ml(20mmol/LTris.HCl，pH 8.0，0.5mol/L NaCl，5mmol/L咪唑)懸浮菌體，然后進(jìn)行750W超聲波破碎(工作時間10s，間隔時間20s，破碎120次)。然后4℃，8000rpm，30min，保留沉淀(包含體)。
將5g包含體中加入120ml的2％(W/V)TritonX-100，用攪拌器攪拌30min，超聲破碎40次，攪拌器繼續(xù)攪拌30min，然后低溫冷凍離心8000rpm，30min。再分別用2％，2.2％，2.4％，2.5％(W/V)的TritonX-100各120ml按上述方法洗滌，共洗滌4次，向最后洗滌的包含體沉淀中加入100ml濃度為8mol/L的尿素(結(jié)合緩沖溶液配制)，用磁力攪拌器攪拌40min，冷凍離心8000rpm，30min，保留上清。
將尿素溶解包含體的上清上8mol/L尿素(結(jié)合緩沖溶液配制)平衡的Ni敖合樹脂柱(2×10cm)，先用10倍柱床體積的8mol/L尿素(結(jié)合緩沖溶液配制)沖洗層析柱，再用2倍柱床體積的洗滌緩沖溶液(20mmol/L Tris.HCl，pH8.0，0.5mol/L NaCl，100mmol/L咪唑)配制的8mol/L尿素洗滌層析柱，最后用30mL洗脫緩沖溶液(20mmol/L Tris.HCl，pH8.0，0.5mol/LNaCl，300mmol/L咪唑)配制的8mol/L尿素洗脫目的蛋白，收集流出液。流出液于4℃對1L蒸餾水透析過夜后，冷凍干燥。
實(shí)施例4(重組Ⅰ群4型禽腺病毒纖維蛋白C-末端抗原性分析)
將0.1μg純化的重組的EDSV纖維蛋白C-末端經(jīng)SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF(聚偏氟乙烯)膜上，用5％的脫脂奶粉封閉2h，PBS振洗3次，分別加入一抗(雞抗血清)1∶250作用2h，振洗3次，再加入二抗1∶1000(HRP標(biāo)記的兔抗雞IgG)作用2h，振洗后于顯色液中顯色(20mmol/LTris.HCl，pH8.0，50mmol/LNaCl，0.03％NiCl2，0.01％二氨基聯(lián)苯胺，0.3％H2O2)。結(jié)果表明重組纖維蛋白C-末端具有良好的抗原性。
實(shí)施例5(Ⅰ群4型禽腺病毒基因工程亞單位疫苗的制備)
油相：Marcol 52進(jìn)口白油(體積比)，Span-80(體積比)，硬脂酸鋁。將各種物質(zhì)配比后，混勻，高壓滅菌后冷卻備用。
水相：pET32a-HHS復(fù)性蛋白，蛋白濃度為0.4mg/mL，加適量的Tween-80。
取油相2份導(dǎo)入乳化罐中，開動電機(jī)低速攪拌，同時徐徐加入水相1份后，3600r/min，乳化30分鐘。取疫苗10ml加入離心管中，3000r/min離心15分鐘，觀察管底有無水相析出，如有水相析出，計(jì)量析出水相的體積。
定量分裝，加蓋密封，2～8℃保存。
實(shí)施例6(疫苗安全效果檢測)
用21日齡SPF雞10只，每只頸部皮下分點(diǎn)注射疫苗1.0ml(頸后部兩側(cè)皮下各注射0.5ml)，觀察14日，觀察是否由疫苗引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。結(jié)果顯示，疫苗免疫的所有試驗(yàn)雞精神、采食及飲水均未見異常，注射部位均無紅腫反應(yīng)。
實(shí)施例7(疫苗免疫效果檢測)
1血清學(xué)方法取21日齡SPF雞20只，10只各頸部皮下或肌肉注射疫苗0.3ml，另10只作對照。接種后7日至5個月，每只雞分別采血，分離血清，用瓊擴(kuò)試驗(yàn)檢測免疫雞和對照雞的Ⅰ群4型禽腺病毒抗體，記錄抗體結(jié)果。
2免疫攻毒法取21日齡SPF雞20只，10只各頸部皮下或肌肉注射疫苗0.3ml，另10只作對照。免疫后21～28日，所有免疫雞和對照雞，肌肉注射Ⅰ群4型禽腺病毒病毒液(約含105.5TCID50/0.1ml)，每只0.2ml。觀察并詳細(xì)記錄免疫雞和對照雞的發(fā)病情況。
結(jié)果顯示：2疫苗免疫組21日及以后瓊擴(kuò)抗體均≥8/10陽性，對照組雞全部為陰性；攻毒保護(hù)結(jié)果，2批疫苗免疫雞攻毒后觀察14日，保護(hù)數(shù)均不少于9只；對照雞攻毒7日內(nèi)全部發(fā)病，死亡8只，死亡雞(死亡后剖檢)及發(fā)病雞(攻毒后7日剖檢)剖檢病理變化：均出現(xiàn)典型的心包積水、肝臟腫大病變。
以上對本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。