本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領域，具體涉及一種靶向光熱治療聯(lián)合免疫治療抗腫瘤復合制劑及其制備方法與應用。

背景技術：

癌癥對于人類的威脅與日俱增，且癌癥的復發(fā)和轉移仍是傳統(tǒng)治療手段仍需面對的問題，因此，尋找更新、更加全面的治療手段是十分必要的。傳統(tǒng)的手術治療、放射療法和化學療法存在可能損傷機體正常組織及其他副作用的缺點，從而限制了其對癌癥的治療效果。近年來，以利用近紅外光熱轉換的光熱治療（photothermal therapy, PTT）迅速發(fā)展為繼傳統(tǒng)化療、放療、手術治療之后又一新型腫瘤治療技術。光熱治療的基本原理是利用在腫瘤部位聚集的光熱材料，通過激光照射，光熱轉換產(chǎn)生的高熱量，可使腫瘤局部溫度升高（42℃以上），從而造成腫瘤細胞損傷，甚至熱消融消除腫瘤細胞，達到治療癌癥的目的。由于，光熱治療是基于將光熱材料靶向傳輸?shù)侥[瘤部位，然后選擇性對腫瘤部位進行激光照射，從而極大地降低了對機體其他正常組織毒副作用使得全身系統(tǒng)毒性極大降低，因此，光熱治療是一種極具發(fā)展情景的腫瘤治療技術。其中，光熱材料能否成功靶向腫瘤部位且在腫瘤部位細胞位點上有較強近紅外光吸收，并能高效率的實現(xiàn)光熱轉換是成功實施PTT的關鍵。

目前，被廣泛研究的光熱材料主要包括無機材料和有機材料。其中，包括主要集中于以金、銀、鈀等為基礎的新型金屬納米粒、以銅為基礎的半導體納米粒材料以及以碳為基礎的石墨烯、碳管的無機材料運用于光熱治療時存在很多不可忽略的問題，如金屬納米離子的生物代謝差、在機體內(nèi)不易消除而可能還存在長期毒性以及碳納米材料的生物毒性等。而與其相比，含有發(fā)色團并且在經(jīng)紅外區(qū)域有較強的光吸收的有機光熱分子因其良好的生物相容性、光學穩(wěn)定性、較高的光熱轉換效率等優(yōu)勢而備受研究者關注。但是，單純的有機小分子應用于光熱治療仍然存在著一些不可避免的問題，比如化學穩(wěn)定性差、易發(fā)生光漂白以及在體內(nèi)靶向性差，不能在腫瘤部位較長時間滯留，通過靜脈給藥后藥物很快被代謝清除，不能達到有效的PTT濃度。因此，研究發(fā)現(xiàn)將有機光熱小分子與其他高分子通過聚集體的形式形成膠束或者泡囊時，可以有效地提高有機小分子的穩(wěn)定性，以及對腫瘤部位的靶向性。

屬于碳菁類染料一類的吲哚菁綠（ICG）是由美國食品和藥物管理局批準可以用于臨床近紅外成像的有機光熱分子，但由于ICG水溶性差，且穩(wěn)定性較差，亦會在血中與蛋白結合而降低進入癌細胞的量，從而限制了ICG在光熱治療中的應用。針對ICG的這些缺陷，有研究者設計了一種采用非共價鍵形成的磷脂聚乙二醇-吲哚菁綠的膠束，可延長吲哚菁綠在腫瘤局部滯留時間，使吲哚菁綠在腫瘤內(nèi)的富集量明顯提高，從而使光熱效果更加顯著（X Zheng，D Xing，F(xiàn) Zhou et al.Mol.Pharm,2011,8:447~456）。此外，有報道一種由卟啉-磷脂雙分子層自組裝形成的納米顆粒（Porphysome），這種納米顆粒具有廣泛可調(diào)性吸光系數(shù)、結構依賴性的熒光自淬滅特性和獨特的光熱及光聲特性。研究人員利用該納米粒實現(xiàn)了對淋巴系統(tǒng)的感光成像，并生成了低背景的熒光圖像。通過靜脈給藥的方式在小鼠體內(nèi)該納米顆粒具有極好的酶生物降解性，急性毒性極低，有好的生物安全性。進一步的動物試驗也表明這種納米顆粒具有良好的腫瘤靶向性，在激光照射誘導下，可使小鼠的腫瘤因產(chǎn)生光熱效應而被清除。

Cypate分子中擁有兩個羧基，可以同時連接多肽兩端形成對酶穩(wěn)定的環(huán)狀結構，因此，可有效避免光熱試劑在到達靶位之前脫落，提高了穩(wěn)定性，而且Cypate在近紅外區(qū)能產(chǎn)生熒光并具有光熱效應，故在研究中受到重視。但Cypate的疏水性強，靶向性差，在腫瘤部位滯留時間短，易在體內(nèi)清除。因此，開發(fā)生物相容性好、靶向性好、光熱轉換效率高的包載光熱試劑Cypate脂質(zhì)體在腫瘤光熱治療上更具應用價值。

此外，免疫治療是近年來備受關注的另一種新型治療手段。與其他治療手段不同，免疫治療的原理是通過激發(fā)機體的免疫功能，增強對腫瘤細胞的免疫識別功能來從根本上清除腫瘤細胞。盡管許多研究表明機體中的細胞免疫和體液免疫均對腫瘤細胞產(chǎn)生免疫應答，但由于免疫治療發(fā)揮作用周期長，需要花時間等待才能啟動對腫瘤細胞的生長抑制作用，故抑制惡性腫瘤生長和發(fā)展的效果不理想。因此，免疫治療需要聯(lián)合其他治療手段來達到抗腫瘤的目的。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種靶向光熱治療聯(lián)合免疫治療抗腫瘤復合制劑的制備、表征以及聯(lián)合應用。該復合制劑能利用光熱效應治療實體瘤，并通過啟動自身免疫，進一步清除殘余的腫瘤細胞，提高抗腫瘤效果，達到預防腫瘤復發(fā)和轉移的效果。

本發(fā)明主要是一方面通過包載光熱材料的脂質(zhì)體，通過EPR效應，以被動靶向作用傳輸?shù)侥[瘤部位，在近紅外光的照射下產(chǎn)生的光熱效應，對腫瘤產(chǎn)生實質(zhì)性損傷，另一方面利用免疫原阿霉素-牛血清白蛋白（ADM-BSA）非特異地激活機體的免疫功能，產(chǎn)生抗ADM多克隆抗體，再應用分子橋透明質(zhì)酸-阿霉素（HA-ADM），由于HA可特異性地于腫瘤細胞表面的特異性受體結合，可形成“腫瘤細胞—HA-ADM—抗ADM多克隆抗體”復合物，從而增強免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的免疫識別能力，同時未結合的HA-ADM還可以發(fā)揮主動靶向化療作用，從而達到更好的抗腫瘤效果。故本發(fā)明基于EPR效應、配體-受體、抗原-抗體特異性靶向作用，具有被動靶向、主動靶向和免疫治療的三重靶向治療作用的特點，腫瘤復發(fā)抑制率從低濃度的20%，提高至高濃度的60%，能夠更為高效地治療癌癥。

為達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術方案：一種靶向光熱治療聯(lián)合免疫治療抗腫瘤復合制劑，由Cypate脂質(zhì)體、ADM-BSA以及HA-ADM組成；Cypate脂質(zhì)體是一種具有良好近紅外光熱效應和光熱治療效果的包載光熱試劑的脂質(zhì)體，利用脂質(zhì)成分形成穩(wěn)定的類似細胞膜的脂質(zhì)體結構，包載疏水性有機光熱材料Cypate于脂質(zhì)雙分子層中，其粒徑為80～200nm，優(yōu)選100～120nm，包封率高且化學穩(wěn)定性好，具有良好的光熱效應。脂質(zhì)體可以為磷脂、膽固醇自組裝產(chǎn)物形成的給藥系統(tǒng)，與Cypate協(xié)同性好，能有效提高被包裹藥物的穩(wěn)定性及其靶向性，改善藥物的溶解度或延長血液循環(huán)時間，通過EPR效應，發(fā)揮被動靶向作用，增加藥物在腫瘤部位的蓄積，降低對正常組織毒副作用。

上述技術方案中，所述ADM-BSA的結構式為：

所述HA-ADM的結構式為：

。

上述靶向光熱治療聯(lián)合免疫治療抗腫瘤復合制劑的制備方法，包括以下步驟：

(1) 將磷脂、膽固醇和Cypate置于反應器中，加入有機溶劑，密閉攪拌，得到混合物；水浴下，混合物在攪拌后，超聲處理；然后在攪拌條件下加入純化水，繼續(xù)水浴攪拌3～8 min后，超聲處理；再繼續(xù)攪拌10～20min；然后去除有機溶劑，即得Cypate脂質(zhì)體；

(2) 將PBS溶液加入BSA中，得到BSA溶液；將ADM.HCl溶解于PBS和DMF混合溶液中，得到ADM溶液；混合BSA溶液與ADM溶液，然后以3～5滴/min的滴速滴加戊二醛溶液，室溫下避光反應；反應完成后于4℃下離心處理，取上清，于4℃下，透析；透析完成后，取出透析袋內(nèi)液，凍干即為ADM-BSA；

(3)將HA加入純水中，然后加入EDC與NHS，攪拌下，室溫避光反應7.5～8.5小時，然后離心處理得到上清；將ADM^.HCl溶解于純化水得到ADM溶液；然后將ADM溶液滴加入上清中，攪拌下，避光反應10～14小時，然后離心處理，取上清進行純水透析；透析完成后，取出透析袋內(nèi)液，凍干即為HA-ADM；

所述靶向光熱治療聯(lián)合免疫治療抗腫瘤復合制劑由Cypate脂質(zhì)體、ADM-BSA以及HA-ADM組成。

上述技術方案中，將磷脂、膽固醇和Cypate置于反應器中，加入無水乙醇和乙酸乙酯，密閉攪拌，得到混合物；水浴加熱，混合物在攪拌溶解后超聲處理；然后在攪拌條件下，開蓋加入純化水，迅速密閉，繼續(xù)水浴攪拌3～8 min乳化后，超聲處理；再繼續(xù)攪拌10～20min至徹底乳化；然后開蓋，水浴繼續(xù)攪拌去除有機溶劑，即得Cypate脂質(zhì)體；所述Cypate脂質(zhì)體為顆粒物，粒徑為80～200nm，優(yōu)選100～120 nm；所述Cypate脂質(zhì)體中，Cypate位于脂質(zhì)體雙分子層中。

上述技術方案中，將脂質(zhì)成分及Cypate按質(zhì)量比25:2加入有機溶劑中。密閉攪拌，待全部溶解后，水浴攪拌下，加入純化水，仍密閉攪拌，超聲乳化后，開蓋繼續(xù)攪拌揮發(fā)有機溶劑至直至揮發(fā)完全。磷脂可以是大豆磷脂，也可以是其他脂質(zhì)比如卵磷脂。Cypate能高效的被包裹在脂質(zhì)體雙分子中，且脂質(zhì)成分在水相中維持在一定的濃度，使得形成的脂質(zhì)體較為穩(wěn)定。

本發(fā)明公開的Cypate脂質(zhì)體的制備方法中，加入的有機溶劑可以是無水乙醇和乙酸乙酯，也可以是其他單一有機溶劑或混合溶劑，選擇溶劑為能溶解脂質(zhì)和Cypate且揮發(fā)性較好的有機試劑。

優(yōu)選的，處方和工藝制備去除有機溶劑，然后進行超濾處理即得光熱試劑Cypate脂質(zhì)體；超濾處理時截留分子量為100 kD，轉速為4000~6000，反復超濾3次以上，對上述Cypate脂質(zhì)體進行濃縮。

上述技術方案中，步驟（1）中，磷脂、膽固醇的質(zhì)量和與疏水性有機光熱材料的質(zhì)量比為25∶2；有機溶劑為無水乙醇和乙酸乙酯混合液等；所述混合物中，磷脂的濃度為2mg/mL，膽固醇的濃度為0.5mg/mL，采用揮發(fā)的方式或純化水透析的方式去除有機溶劑，水浴的溫度為45℃～50℃，攪拌轉速為1250 r·min^-1；步驟（2）中，PBS和DMF混合溶液中，PBS與DMF等體積；所述戊二醛溶液中戊二醛的質(zhì)量濃度為22～28%；所述BSA、ADM^.HCl、戊二醛的質(zhì)量比為1∶（50～90）∶（6～8）；透析至紫外檢測至透析外液在480 nm處吸收峰消失即完成透析；步驟（3）中，HA、EDC、NHS的摩爾比為1∶20∶20；攪拌速率為120 r·min^-1；離心處理工藝為8000 r·min^-1離心10 min，純水透析至接收液在480nm處無紫外吸收后即完成透析。

優(yōu)選的，步驟(1)中，磷脂、膽固醇和疏水性有機光熱材料的質(zhì)量比為4∶1∶0.4；無水乙醇和乙酸乙酯混合液中，無水乙醇和乙酸乙酯的體積比為3∶1；磷脂、膽固醇和疏水性有機光熱材料的質(zhì)量和與純化水的質(zhì)量比為3∶100；于37℃下，在750 r·min^-1的攪拌速度下采用揮發(fā)的方式去除有機溶劑；超聲處理時間為1分鐘；步驟(2)中，所述戊二醛溶液中戊二醛的質(zhì)量濃度為25%；以4滴/min的滴速滴加戊二醛溶液；室溫下避光反應時間為6小時；4℃下離心處理時的轉速為3000 r·min^-1，時間為10 min；步驟(3)中，將HA加入純水中，然后加入EDC與NHS，攪拌下，室溫避光反應8小時，然后離心處理得到上清；純水透析時，24小時換一次接收液。

上述技術方案中，步驟(2)中，戊二醛的稀釋度和滴加速度和攪拌速率尤為重要，稀釋度過小、滴加過快以及攪拌過快均會導致大量沉淀產(chǎn)生；步驟(3)中HA的活化時間和反應溫度對HA-ADM產(chǎn)率影響較大，在本發(fā)明公開的活化時間以及反應溫度下，HA-ADM產(chǎn)率最高，重復單元根據(jù)透明質(zhì)酸而定。

上述技術方案中，制備光熱試劑時，乳化時水浴溫度為45℃～50℃，揮發(fā)有機溶劑時水浴溫度為37℃；乳化時，攪拌速度為1250 r·min^-1，揮發(fā)去除溶劑時的攪拌速度為750 r·min^-1。制備工藝較為簡單且可控，將脂質(zhì)成分與藥物Cypate溶解于少量有機溶劑中，然后按3:100比例加入水相，通過攪拌（轉速為1250 r·min^-1），超聲的方式進行乳化，使得制得脂質(zhì)體的批間差異小，重復性好；乳化時水浴溫度可增加脂質(zhì)在有機相中的溶解度，但溫度過高則可能引起脂質(zhì)氧化和光熱試劑Cypate變性；反應溫度以及攪拌速率的不同對于脂質(zhì)體的形成以及包裹的穩(wěn)定性有影響，本發(fā)明方法使Cypate經(jīng)脂質(zhì)體包裹后化學穩(wěn)定性良好，在pH 5.0、pH 7.4、細胞培養(yǎng)基及血清中，Cypate在48 h內(nèi)紫外吸收變化均小于10 %，明顯改善了游離Cypate的化學穩(wěn)定性。以Cypate為計，濃度在1.0～25.0 μg·mL^-1范圍內(nèi)，相同濃度下，Cypate脂質(zhì)體在1.5 W/cm²激光照射（785 nm）下，5分鐘內(nèi)升溫效果明顯優(yōu)于游離Cypate，如在2.0 μg·mL^-1時，Cypate脂質(zhì)體比游離Cypate升溫更好，可增加升溫15℃，光熱轉換效率明顯提高；取得了意想不到的技術效果。

本發(fā)明的Cypate脂質(zhì)體有良好的化學穩(wěn)定性、生物相容性、腫瘤被動靶向性，可對荷瘤小鼠進行高效光熱治療，產(chǎn)生顯著的腫瘤細胞消除效果；本發(fā)明研發(fā)了生物相容性好，化學穩(wěn)定性良好的納米級微粒給藥系統(tǒng)脂質(zhì)體，將Cypate包載在脂質(zhì)雙分子層中，從而能夠被動靶向腫瘤部位，并在近紅外光激發(fā)下產(chǎn)生顯著光熱效應，從而抑制腫瘤細胞生長，甚至達到消除腫瘤細胞的治療效果。因此本發(fā)明還公開了光熱試劑Cypate脂質(zhì)體在制備抗腫瘤藥物中的應用。

本發(fā)明公開的包載疏水性有機光熱材料的脂質(zhì)體均一性好，其粒徑為80～200nm，化學穩(wěn)定性好，有良好生物相容性，且在體內(nèi)具有良好腫瘤被動靶向性；比如Cypate脂質(zhì)體可采用785nm激光器激發(fā)產(chǎn)生光熱效應明顯強于相同濃度下游離組Cypate產(chǎn)生的光熱效應，其原因可能是由于疏水性有機光熱小分子能在脂質(zhì)雙分子層中有序排列，而不同于游離Cypate（水溶性不好）在水溶液中的聚集狀態(tài)；Cypate經(jīng)脂質(zhì)體包載后化學穩(wěn)定性良好，尤其改善了游離Cypate在微酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性，亦即改善了Cypate在腫瘤局部微環(huán)境下的穩(wěn)定性，有利于發(fā)揮PTT作用，達到抗腫瘤效果；脂質(zhì)體是一種研究較為成熟且安全性高的納米微粒給藥系統(tǒng)，從而使得Cypate脂質(zhì)體具有廣泛運用于臨床的潛力；Cypate脂質(zhì)體粒徑<200 nm，具有顯著的EPR效應，從而有良好的腫瘤被動靶向性，并能在近紅外光激發(fā)下高效發(fā)揮光熱效應治療腫瘤，在靜脈注射（5mg·kg^-1）后24 h進行光熱治療（785 nm, 1.5W·cm^-2, 3 min），產(chǎn)生的光熱效應可完全熱消融腫瘤細胞，且無復發(fā)現(xiàn)象。

本發(fā)明的多靶向抗腫瘤復合制劑基于EPR效應、配體-受體、抗原-抗體特異性靶向作用，具有被動靶向、主動靶向和免疫治療的三重靶向治療作用特點，能夠更為高效地治療癌癥。其中制備Cypate脂質(zhì)體具有良好的抗腫瘤優(yōu)勢；并且，阿霉素作為半抗原，用牛血清白蛋白你 阿霉素-牛血清白蛋白具有免疫原性，可促使癌癥機體產(chǎn)生抗阿霉素多抗；透明質(zhì)酸-阿霉素同時具有以下兩方面的作用：A.免疫治療的連接橋作用，特異性地作用于癌細胞表面的CD44受體，在癌細胞表面形成“CD44受體—透明質(zhì)酸-阿霉素—抗阿霉素抗體”復合物；B.主動靶向化療作用，未形成復合物的HA-ADM，可利用CD44受體受體介導，使抗癌藥阿霉素進入癌細胞，并發(fā)揮抗癌作用。Cypate脂質(zhì)體介入并光照，以光熱效應明顯遏制小鼠腫瘤的生長，為抗體的產(chǎn)生及分子橋的作用發(fā)揮爭取時間；此外光熱治療也能夠協(xié)同增強機體的非特異免疫能力，可提高免疫治療的效果。

本發(fā)明首先利用光熱治療高效地抑制實體瘤生長，進一步利用小分子免疫原非特異地激發(fā)機體的免疫系統(tǒng)，并介入基于配體-受體、抗原-抗體的相互作用的分子橋，將免疫細胞靶向腫瘤細胞，從而達到光熱治療協(xié)同聯(lián)合免疫治療有效抗腫瘤的目的。首次公開的Cypate脂質(zhì)體、ADM-BSA和HA-ADM組成的被動靶向光熱治療、主動靶向化療和免疫治療的三效合一的抗癌制劑，實現(xiàn)了在免疫治療發(fā)揮作用的前期引入光熱治療，不僅遏制了腫瘤的增長、改善了小鼠生存狀態(tài)，而且保證了免疫治療及分子橋的主動靶向化療發(fā)揮作用所需的時間，并協(xié)同增強了免疫治療效果，發(fā)揮顯著的治療作用；取得意想不到的技術效果。

由于上述技術方案的應用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點：

（1）本發(fā)明公開的免疫治療制劑中的小分子化療藥物阿霉素ADM偶聯(lián)大分子牛血清蛋白BSA為免疫原(ADM-BSA)，可刺激機體產(chǎn)生抗ADM抗體；同時將透明質(zhì)酸HA通過EDC、NHS將羧基活化后與阿霉素ADM相連合成的分子橋HA-ADM，將機體的免疫效應靶向腫瘤細胞，得到一種可增強腫瘤細胞免疫原性的廉價復合物大分子，達到長期自身清除腫瘤細胞的目的。

（2）與游離光熱分子Cypate相比，本發(fā)明設計的Cypate脂質(zhì)體，其顯著的優(yōu)勢在于化學穩(wěn)定性高、生物相容性良好、光熱轉換效率高、體內(nèi)腫瘤靶向性優(yōu)異，由于疏水性有機光熱小分子能在脂質(zhì)雙分子層中有序排列，用激光器在785nm波長激發(fā)下產(chǎn)生的光熱效應明顯強于同濃度游離組Cypate產(chǎn)生的光熱效應，為高效的腫瘤光熱治療的成功實施奠定了基礎。

（3）Cypate經(jīng)脂質(zhì)體包載后化學穩(wěn)定性良好，尤其改善了游離Cypate在酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性，從而能進一步改善Cypate在腫瘤局部微環(huán)境下的穩(wěn)定性，發(fā)揮PTT效果，得到的Cypate脂質(zhì)體是一種安全性高的納米微粒給藥系統(tǒng)；Cypate脂質(zhì)體粒徑<200 nm，具有顯著的EPR效應，從而有良好的腫瘤被動靶向性，并能在近紅外光激發(fā)下高效發(fā)揮腫瘤光熱治療效果，在靜脈注射（5mg·kg^-1）后24 h進行光熱治療（785 nm, 1.5W·cm^-2, 3 min），產(chǎn)生的光熱效應可完全熱消融腫瘤細胞，且在考察的21天內(nèi)無復發(fā)現(xiàn)象；從而使得Cypate脂質(zhì)體具有廣泛運用于臨床的潛力。

（4）本發(fā)明中，以小分子化療藥物阿霉素ADM偶聯(lián)大分子牛血清蛋白BSA得到的免疫原(ADM-BSA)，可刺激機體產(chǎn)生抗ADM抗體；將透明質(zhì)酸HA通過EDC、NHS將羧基活化后與阿霉素ADM相連合成的分子橋HA-ADM，將機體的免疫效應靶向腫瘤細胞，得到一種可增強腫瘤細胞免疫原性的廉價復合物大分子，達到長期清除腫瘤細胞的目的；特別是Cypate脂質(zhì)體結合HA-ADM+ADM-BSA組成復合制劑，對于深部殘余以及轉移的腫瘤細胞治療效果好，整合了光熱治療和免疫治療的優(yōu)勢，避免它們各自治療上的缺陷，同時，光熱治療也可非特異地激活機體的免疫功能，達到協(xié)同治療的目的；取得了意想不到的技術效果。

附圖說明

圖1為實施例一中Cypate脂質(zhì)體透射電鏡圖；

圖2為實施例一中Cypate脂質(zhì)體化學穩(wěn)定性圖，A、游離Cypate，B、Cypate脂質(zhì)體；

圖3為實施例一中Cypate脂質(zhì)體升溫曲線圖，A、游離Cypate，B、Cypate脂質(zhì)體；

圖4為實施例一中Cypate脂質(zhì)體的細胞毒性試驗圖，A、非激光照射，B、激光照射；

圖5為實施例一中Cypate脂質(zhì)體的細胞攝取試驗圖；

圖6為實施例一中Cypate脂質(zhì)體的細胞亞定位試驗圖，A、非激光照射，B、激光照射；

圖7為實施例一中Cypate脂質(zhì)體的近紅外活體成像試驗圖，A為小動物成像照片，B為數(shù)據(jù)圖；

圖8為實施例一中Cypate脂質(zhì)體的組織分布結果圖，A為組織成像照片，B為數(shù)據(jù)圖；

圖9為實施例一中Cypate脂質(zhì)體的抑瘤曲線（A）和腫瘤組織（B）圖；

圖10為實施例二中免疫原ADM-BSA的紫外吸收圖（A）和紅外圖譜（B）；

圖11為實施例二中免疫原ADM-BSA在正常小鼠和荷瘤小鼠ELISA結果圖；

圖12為實施例三中HA-ADM的核磁鑒定圖；

圖13為實施例三中HA-ADM以及HA+ADM的DSC鑒定圖；

圖14為實施例三中連接橋在癌細胞表面連接抗體的紫外吸光圖；

圖15為實施例三中細胞流式結果圖；

圖16為實施例三中體外細胞毒性試驗結果圖；

圖17為實施例四中聯(lián)合治療的腫瘤生長曲線（A）和腫瘤組織（B）圖。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不限于本發(fā)明的范圍。本發(fā)明實施例從Cypate脂質(zhì)體的制備及表征、Cypate脂質(zhì)體體內(nèi)外藥效學評價、ADM-BSA的制備及其在荷瘤鼠體內(nèi)產(chǎn)生抗阿霉素多克隆抗體、HA-ADM的制備及連接橋作用印證以及產(chǎn)生多抗的荷瘤鼠使用聯(lián)合治療方法治療等方面詳述本發(fā)明技術方案帶來的意想不到的技術效果。

實施例一 Cypate脂質(zhì)體的制備及理化性質(zhì)的考察

稱取10g磷脂，2.5g膽固醇及0.5gCypate置于西林瓶中加入3.75mL無水乙醇和1.25mL乙酸乙酯，密閉，50℃水浴1250 r·min^-1攪拌5min并超聲1 min，使其充分溶解。在攪拌條件下快速均勻加入430g純化水，50℃水浴1250 r·min^-1攪拌5min乳化后，超聲1min,再繼續(xù)攪拌15min使其乳化完全，開蓋以37℃水浴750 r·min^-1攪拌5小時，徹底揮發(fā)有機溶劑，即得Cypate脂質(zhì)體混懸液。

制得的Cypate脂質(zhì)體均一性較好，形狀為規(guī)整球形，用透射電鏡（TEM）觀察Cypate脂質(zhì)體表觀形態(tài)為球形，且分布均勻，見圖1，用激光粒度儀測得Cypate脂質(zhì)體的平均粒徑為（111.9±5.94）nm（n=3）。取1.0 mLCypate脂質(zhì)體溶液置于超濾管（截留分子量100000）中，4℃5000 r·min^-1離心15 min分離液相后，加入1.0 mL水于超濾管中洗滌，重復上述操作3次，合并超濾管內(nèi)液，用甲醇破壞脂質(zhì)體并定容，至吸光度為0.3-1.0之間，測定并計算藥物含量A；另取同體積Cypate脂質(zhì)體溶液，加入甲醇破壞脂質(zhì)體并定容后測定，算得相應藥物含量A₀，計算包封率（%）=（A₀-A）/A₀×100%；結果泡囊包封率為（98.11 ± 1.13）%（n=3）。

對上述Cypate脂質(zhì)體體外化學穩(wěn)定性分別進行考察。實驗分為Cypate脂質(zhì)體和游離Cypate兩組，分別在pH 5.0、pH 7.4、細胞培養(yǎng)基（medium）及血清（serum）中考察它們的穩(wěn)定性。以Cypate濃度計算，用以上介質(zhì)分別配制Cypate脂質(zhì)體和游離Cypate的5μg·mL^-1的溶液（n=3），確定在0、2、4、8、24、48 h6個時間點測定Cypate的紫外吸收光譜。圖2結果顯示，游離Cypate僅在血清中具有較好的穩(wěn)定性，在pH 7.4和培養(yǎng)基中穩(wěn)定性較差，在pH5.0環(huán)境下極不穩(wěn)定，48h后紫外吸收下降了60%左右。然而，Cypate脂質(zhì)體的Cypate在pH 5.0、pH 7.4及血清中均能較穩(wěn)定存在，且在pH5.0環(huán)境下48h后紫外吸收的下降＜5%，表明Cypate經(jīng)脂質(zhì)體包載后化學穩(wěn)定性明顯提高，為后期的光熱治療奠定基礎。

對上述Cypate脂質(zhì)體體外升溫效應進行考察，以Cypate濃度計算，配制1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50.0μg·mL^-1的水溶液，采用785 nm激發(fā)的激光，1.5 W·cm^-2 條件下照射5 min，每隔25s對溶液溫度進行記錄。圖3表明，785nm激光照射下純水的幾乎沒有升溫效果，游離Cypate及脂質(zhì)體的光熱效應均顯示濃度依賴性，而且相同濃度下，制備的Cypate脂質(zhì)體（Cy-Liposome）比游離Cypate（Free Cypate）表現(xiàn)出更強的升溫效果，當濃度為5 μg·mL^-1時，Cy-Liposome溫度可升高37.6 ℃，而Free Cypate則僅升高15.3 ℃，兩者相差22.3 ℃，表明與Free Cypate相比，Cy-Liposome具有良好的升溫效應，其原因可能由于疏水性的Cypate經(jīng)脂質(zhì)體包載后可均勻分布在脂質(zhì)雙分子中，減少了Cypate的聚集，從而在激光照射下增強非輻射躍遷，從而能產(chǎn)生更多熱量，說明有利于后期的PTT治療。對上述Cypate脂質(zhì)體進行細胞毒性考察。取對數(shù)生長期4T1細胞，以5000個細胞每孔接種于96孔細胞板，在37℃、5％CO₂孵箱中培養(yǎng)24 h使其貼壁后，用完全培養(yǎng)基分別配制不同濃度的Cypate脂質(zhì)體溶液和游離Cypate溶液（以Cypate計算，濃度分別為1.0，2.0，5.0，10.0，25.0 μg·mL^-1）每個濃度4個復孔。培養(yǎng)24 h棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌3次后，更換培養(yǎng)基，非光照組放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，光照組用785nm激光器對每孔進行激光照射（1.5 W·cm^-2，3 min）后，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入5 mg·mL^-1 MTT溶液10 μL和完全培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去液體，每孔加入100 μL DMSO，避光震蕩10 min，用酶標儀于490 nm測定吸光度，計算得到細胞生長存活率。結果，從圖4A中可以看出，Cypate脂質(zhì)體和游離Cypate溶液在非光照條件下，25μg·mL^-1以內(nèi)均沒有表現(xiàn)出明顯的細胞毒性，而從圖4B中可以看出，在激光照射條件下Cypate脂質(zhì)體組和游離Cypate均對腫瘤細胞的生長均有抑制作用，且Cypate脂質(zhì)體的IC₅₀為5.03 μg·mL^-1，而游離Cypate在濃度25.0 μg·mL^-1以內(nèi)未表現(xiàn)出明顯的細胞毒性，細胞致死量＜50%，顯示脂質(zhì)體比游離組擁有更加有效的PTT治療作用，其原因可能是由于脂質(zhì)體用較好的細胞相容性，使得細胞對其的攝取量增加，且具有更強的光熱效果。而作為對照的非光照組細胞生長狀態(tài)良好，提示Cy-Liposome作為光熱治療制劑在后續(xù)光熱治療中將體現(xiàn)對治療部位的針對性和可控性。

對上述Cypate脂質(zhì)體傳輸藥物進入細胞的能力進行細胞攝取試驗。取對數(shù)生長期的4T1細胞鋪6孔板，接種密度為1×10⁵/mL，每孔3 mL，放入細胞培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)12 h，細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液。以Cypate計，分別加入10 μgmL^-1用培養(yǎng)基配制好的游離Cypate溶液和Cypate脂質(zhì)體溶液，每孔1 mL，每組3個復孔。分別在給藥后培養(yǎng)6 h、24 h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，每孔加入500 μL 胰酶消化液，消化5 min后，再用500 μL培養(yǎng)基終止消化，然后用500 μL的PBS清洗合并轉移至1.5 mL離心管，1200 rmin^-1離心10 min，用1mL PBS重新溶解，吹散均勻后，用細胞計數(shù)板對細胞進行計數(shù)。然后將細胞混懸液用細胞粉碎機粉碎，強度為200 W，1秒/次，間隔1秒，超聲25次粉碎細胞，往1.0mL細胞粉碎液中加入3 mL甲醇，紫外分光光光度計測定吸光度，并通過細胞個數(shù)換算10⁶個細胞對Cypate的攝取量。結果，從圖5可知，4T1細胞對Cypate經(jīng)脂質(zhì)體包載后的攝取量明顯高于游離Cypate，且隨著時間的延長差距加大。在6 h時，Cypate脂質(zhì)體中的Cypate攝取量是游離組的3.17倍，24 h時則增加到5.89倍；而游離組Cypate的攝取量隨時間變化改變不大，從6 h到24 h，攝取量只增加了19 %。因此，可見Cypate脂質(zhì)體的光熱治療效果好，與其具有良好的細胞相容性，促使包載的Cypate更多地進入細胞有關。

考察上述Cypate脂質(zhì)體在激光照射后在細胞中的定位情況，進行亞細胞定位試驗。為取對數(shù)生長期4T1細胞接種于玻璃底培養(yǎng)皿中，接種密度為2×10⁵個·mL ^-1，加入1 mL，在37℃、5％CO₂孵箱中培養(yǎng)24 h使其貼壁后，進行以下實驗：1）非光照組，加入用完全培養(yǎng)基配制的Cypate脂質(zhì)體溶液，以Cypate計算30.0 μg·mL^-1，培養(yǎng)2 h后，吸出培養(yǎng)基，并用PBS清洗3遍，在避光條件下染色：加入Lysotracker Green DND 26（100.0 nM）100 μL染溶酶體，在37℃培養(yǎng)箱中染色3 min，然后吸出染液，用PBS清洗3遍后，再加入Hochest 33342（1.0 μM）100 μL染細胞核，在37℃培養(yǎng)箱中染色15 min后，再用PBS清洗3遍，加入4%多聚甲醛對細胞固定20 min；2）光照組，在給藥（30.0 μg·mL^-1）培養(yǎng)2h后，吸出培養(yǎng)基并用PBS清洗3遍等操作相同。但在染色前，加入新鮮完全培養(yǎng)基，785 nm,1.5 W/cm²條件下，光照1 min后，放入繼續(xù)培養(yǎng)30 min后照射，其余同非光照組相同步驟進行染色并固定細胞。將光照與非光照組通過激光共聚焦顯微鏡（LSM 710）進行拍攝。圖6A顯示，非激光照射組，Cypate標記的紅色熒光與溶酶體的綠色熒光發(fā)生重疊而產(chǎn)生了橘黃色熒光，結果表明Cypate脂質(zhì)體在進入細胞后主要定位于溶酶體中。但經(jīng)過激光照射后，由于產(chǎn)生的PTT作用及PDT作用使得原來定位的溶酶體被破壞，所以由Lysotracker Green DND 26染色的溶酶體熒光強度較弱（圖6B）。

為考察本發(fā)明Cypate脂質(zhì)體在體內(nèi)對腫瘤部位的靶向性，構建4T1皮下腫瘤模型裸鼠，進行近紅外熒光活體成像試驗。將50 μL含有2×10⁶個4T1細胞混懸液皮下注射接種于裸鼠的右后肢，待腫瘤體積長至60-100 mm³時 (腫瘤體積公式：腫瘤體積=長×寬²/2)，進行實驗：以Cypate計算濃度為5 mg·kg^-1，分別從尾靜脈注射Cypate脂質(zhì)體溶液和游離Cypate。配制4%的水合氯醛溶液，腹腔注射麻醉裸鼠后，用小動物活體成像系統(tǒng)掃描成像，分別記錄給藥后0 h、24 h、48 h、72 h、96 h的小動物成像照片和數(shù)據(jù)。圖7A顯示，對照組游離Cypate組給藥后24 h，Cypate熒光信號主要分布于肝臟部位，信號強、面積大，且代謝快，而腫瘤部位熒光弱；但實驗組Cypate脂質(zhì)體的肝區(qū)藥物分布量的強度和面積均顯著降低，ROI圈出的富集在腫瘤部位的熒光信號強度和持續(xù)時間顯著提高，在96 h仍有較強滯留，腫瘤部位成像效果明顯，如圖7B，表明Cypate脂質(zhì)體在體內(nèi)具有良好的被動靶向性。

對上述Cypate脂質(zhì)體在體內(nèi)組織分布進行考察。

（1）培養(yǎng)4T1腫瘤細胞，將其消化制備成2×10⁷個/mL細胞混懸液，保證細胞分散均勻，在小鼠右后肢近腹部上側種瘤，每只小鼠皮下注射500 μL，待腫瘤體積長至60-100 mm³時（腫瘤體積公式：腫瘤體積=長×寬²/2）繼續(xù)以下實驗。

（2）以Cypate計算濃度為7.5mg·kg^-1，分別由尾靜脈注射Cypate脂質(zhì)體溶液和游離Cypate。28 h后，頸椎脫臼處死小白鼠取出心、肝、脾、肺、腎、腫瘤組織，置于小動物成像系統(tǒng)進行熒光成像，記錄成像圖。并通過軟件ROI圈出各組織的Cypate熒光信號強度（n=3）。圖8A是游離Cypate在各組織的近紅外熒光成像圖，可見在腫瘤部位熒光弱，而在肝臟部位熒光較強；而Cypate經(jīng)脂質(zhì)體包載后，在腫瘤部位的熒光極大增強，在肝臟組織熒光明顯減弱。圖8B是通過軟件ROI圈出各組織的Cypate熒光信號強度，結果Cypate脂質(zhì)體的腫瘤部位熒光信號強度是游離Cypate的1.58倍，而在肝臟組織的熒光信號強度下降了77.9%，因此，Cypate脂質(zhì)體具有良好的被動靶向性，且降低了肝臟的蓄積，可降低肝毒性。

對上述Cypate脂質(zhì)體體內(nèi)抑瘤效果進行考察。采用上述建立腫瘤模型的方法構建小白鼠荷瘤模型，待腫瘤體積至70 mm³時，設計以下6組（每組5只鼠）給藥：PBS組2組、游離Cypate2組、Cypate脂質(zhì)體組2組（以Cypate計算濃度為5.0 mg·kg^-1），分為一類用激光照射，另一類未照激光，并且，以第0天給藥，第1天用激光照射，光熱治療（785 nm，1.5W/cm²，3分鐘）。分別在第0、1、2、4、5、7、9、11、13、15、17、19、21天測量小鼠的體重和腫瘤體積。以第0天的腫瘤體積作為對照，得到腫瘤的生長曲線圖9，可知，注射PBS組，光照或未光照對腫瘤的生長均無影響，說明單獨光照不能對腫瘤產(chǎn)生抑制效果。而在相同濃度下，游離Cypate組及Cypate脂質(zhì)體組，未光照均不影響腫瘤生長。游離Cypate組光照對腫瘤的生長有一定抑制，但Cypate脂質(zhì)體組（Cypate濃度大于等于3.0 mg·kg^-1）光照可在腫瘤部位迅速產(chǎn)生熱損傷作用使腫瘤消融，且在觀察的21天時間內(nèi)未出現(xiàn)復發(fā)現(xiàn)象，說明脂質(zhì)體的包載，使得Cypate在激光照射條件下能對腫瘤產(chǎn)生很好的PTT效果，其脂質(zhì)體是一種具有良好發(fā)展前景的光熱治療納米給藥系統(tǒng)。

實施例二 免疫原BSA-ADM的合成和抗體的制備

阿霉素是小分子，只有免疫反應性而無免疫原性，不能直接免疫動物產(chǎn)生抗體，需要與異體蛋白（多用牛血清白蛋白，BSA）偶聯(lián)制備免疫原。另外，在酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)方法中，將抗體結合在酶標板上的包被抗原，常將阿霉素與另一異體蛋白（多用卵清蛋白，OVA）結合。

通過戊二醛交聯(lián)法制備合成免疫原ADM-BSA和包被原ADM-OVA。制備過程如下：稱取100 mg BSA于25 mL圓底燒瓶中，加入5 mL 0.1 mol^.L^-1 PBS溶液，充分溶解，攪拌速率為10 r^.min^-1，另取40.0 mg ADM^.HCl溶解于3.0 mL DMF和 PBS混合溶液中(DME:PBS=1:1)，將ADM逐滴加入BSA溶液中，待ADM與BSA充分混勻后，逐滴加入稀釋25倍的戊二醛3.68 mL，滴速為3滴/min，室溫下避光反應6 h，于4 ℃、3000 r^.min^-1離心10 min取上清，用0.01 mol^.L^-1 PBS溶液 4 ℃連續(xù)透析4天，根據(jù)透析外液透析出來紅色（未結合的ADM）的顏色情況不時更換透析液。透析完成后，取出透析袋內(nèi)液體，凍干得橙紅色固體粉末，于-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

包被原的合成過程與免疫原ADM-BSA的類似，保持蛋白質(zhì)OVA與阿霉素的摩爾比為1:90；阿霉素與戊二醛的摩爾比為1:4，其余實驗條件均不變。

免疫原在凍干過稱中，另取相同體積的透析介質(zhì)，同樣經(jīng)凍干并稱量，將凍干的免疫原的質(zhì)量減去凍干的鹽成分的質(zhì)量，即為所需的免疫原的質(zhì)量。實驗中發(fā)現(xiàn)，凍干所得產(chǎn)物中鹽含量高達70%左右。

合成的免疫原主要通過紫外-可見分光光度法和傅里葉轉換紅外法表征結果如圖10。圖10-A為ADM、BSA、ADM+BSA及ADM-BSA水溶液通過紫外-可見光分光光度計，在200 nm~900 nm進行掃描測得相應的紫外-可見圖譜。由圖可知， BSA的紫外特征峰在280 nm左右處；ADM則在233 nm、253 nm、290 nm、485 nm處有不同吸收強度的吸收峰，產(chǎn)物ADM-BSA在485 nm左右出現(xiàn)了ADM的特征峰，并且在255 nm左右出現(xiàn)一個肩峰，推斷是ADM的吸收峰與BSA吸收峰加和的結果，推斷ADM與BSA交聯(lián)成功，得到了阿霉素-牛血清白蛋白偶聯(lián)物（ADM-BSA）。而圖10-B為ADM、BSA、ADM+BSA混合物、產(chǎn)物ADM-BSA在500~4000 cm^-1的紅外吸收圖譜； ADM-BSA在1500-1700 cm^-1 左右出現(xiàn)了BSA上的酰胺I帶吸收峰，以及亞胺的吸收峰（1635 cm^-1）。2800-3500 cm^-1左右的強峰歸屬于BSA上游離的-COOH和-NH₂以及ADM上的同類基團疊加，推斷目標產(chǎn)物合成成功。

分別選取健康Balb/c雌性小鼠（3-5周齡）和荷瘤小鼠（對數(shù)生長期4T1細胞，用完全培養(yǎng)基配制成2×10⁵個細胞/mL，每只小鼠皮下注射50 μL，構建皮下瘤小鼠模型）作為模型動物,考察免疫原ADM-BSA產(chǎn)生多克隆抗體的情況。共免疫3次（首次免疫和第2、3次加強免疫）。首次免疫時，先稱取1～2mg免疫原ADM-BSA粉末（扣除其中鹽成分），將其溶解在1 mL的生理鹽水中，加入1～1.5 mL福氏完全佐劑，充分混合成W/O型乳濁液，在小鼠上肢腋窩或腹股溝（淋巴結較豐富區(qū)）進行皮下注射0.1 mL/只。在首次免疫2周后，進行加強免疫二免，僅需要將福氏完全佐劑替換為福氏不完全佐劑，其余與首次免疫相同。并且分別在二免5～7天后眼眶取血0.1～0.5 mL，于-4 ℃放置過夜，吸取上層清液（抗血清），備用。

通過酶聯(lián)免疫吸附分析方法（ELISA）間接競爭法檢測分別檢測正常小鼠和荷瘤小鼠血清中抗ADM抗體活性，將抗血清用0.1mol/L PBS（pH7.4）稀釋10倍的溶液，得到的抗血清1:500稀釋液，基本實驗流程如下：

（1）以一定比例稀釋包被抗原（ADM-OVA）, 按200 μL/孔加入于96孔酶標板中， 4 ℃包被酶標板12～24 h；

（2）通過洗板機用PBST 緩沖液清洗3次；

（3）按 280 μL/孔，加入0.01 mg. mL^-1酪蛋白溶液，室溫放置1 h，封阻酶標板上空余處；

（4）同（2）相同操作；

（5）在酶標板的每孔中依次分別加入 100 μL 標準阿霉素溶液和 100 μL 一定稀釋度的抗血清，室溫低速振搖 1 h；

（6）同（2）相同操作；

（7）按200 μL/孔加入稀釋的山羊抗小鼠IgG-辣根過氧化物酶（GaRIgG-HRP）（1:5000），室溫放置1 h；

（8）同（2）相同操作；

（9）按200 μL /孔加入底物溶液（醋酸鈉緩沖液+TMB+H₂O₂），室溫避光條件下在微量振蕩器上振搖約 20~30 min,進行顯色；

（10）當深藍色出現(xiàn)，可按80 μL/孔加入5 % H₂SO₄溶液終止反應，轉為黃色；

（11）用酶標儀測定其490 nm處吸光度。

如圖11，可知，正常小鼠二免血清中當抗ADM多克隆抗體稀釋500倍時，PBS組的吸光度值（0.802）為標準溶液組（0.113）的7.10倍；而荷瘤小鼠二免血清稀釋500倍時，PBS組的吸光度值（0.763）為標準溶液組（0.311）的2.45倍。結果表明，合成的免疫原ADM-BSA在正常小鼠和荷瘤小鼠中具有較好的免疫原性，雖然小鼠荷瘤后免疫系統(tǒng)功能較低，但仍然能產(chǎn)生特異性多克隆抗體。

實施例三 HA-ADM的合成

合成路線如下：

（1）透明質(zhì)酸的活化：稱取42.07 mg 透明質(zhì)酸（HA）于10 mL圓底燒瓶中，加入2.0 mL 純化水，充分溶解后，攪拌速率為120 r·min^-1，另取38.3 mg EDC和22.9mg NHS依次加入，避光條件下反應8h，8000 r·min^-1離心10 min后收取上清液，即為活化HA溶液。

（2）HA-ADM的合成：取10.8 mg ADM^.HCl溶解于1.3 mL純化水后，逐滴加入到上述活化HA溶液中，120 r·min^-1，25 ℃避光反應12 h。8000 r·min^-1離心10 min取上清，與分子截留量為8000-14000透析袋中，以1000 mL純化水作為接收液，透析，每隔24h更換一次接收液，透析完全后（接收液在480nm處無紫外吸收），透析袋內(nèi)溶液經(jīng)冷凍干燥得紅色粉末，-20 ℃避光保存，即為HA-ADM，備用。

HA-ADM的結構表征

（1）¹H-NMR譜表征：圖12為從分子橋HA-ADM和HA在重水中的核磁圖譜，由圖的¹HNMR可以看出，其HA-ADM特征峰有：δ（ppm）：1.94（s,CH₃ in HA），而3.76~3.26（m，- CH₃ in HA），5.35（s，CH₃ in ADM）。但由于重水的活潑氫交換作用的影響，不能觀察到明顯的酰胺峰。故根據(jù)上述核磁圖譜特征峰可以看出HA-ADM合成成功。

（2）DSC表征：圖13為DSC鑒定圖，上圖為自制HA-ADM測定結果；下圖為HA與ADM的混合物測定結果，由圖13可以看出，合成產(chǎn)物HA-ADM在224.7℃出現(xiàn)吸熱峰；而HA和ADM的混合物則無明顯的吸熱峰。由于產(chǎn)物和原料的物理混合物，曲線顯著不同，表明產(chǎn)物是新生成的物質(zhì)，證明分子橋HA-ADM可成功合成。

故，以上兩種方法均證實HA-ADM合成成功。

HA-ADM連接橋作用考察

考察分子橋HA-ADM，既能與抗ADM抗體結合，又能與腫瘤細胞表面過度表達受體結合，通過形成“CD44-HA-ADM-抗ADM抗體”復合物，即通過考察：CD44受體-透明質(zhì)酸-阿霉素-抗阿霉素抗體的形成，證實HA-ADM具有將抗體靶向到腫瘤細胞的能力。采用細胞酶聯(lián)免疫吸附分析法來進行驗證，其原理與細酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）原理一致，只是用細胞板中貼壁生長的細胞代替了在酶標板上包被抗原，在操作上略有不同，其基本過程如下：

（1）分別取對數(shù)生長期4T1細胞接種于96孔細胞板，接種密度為1×10⁵個·mL^-1，每孔100 μL，在37 ℃、5％CO₂孵箱中培養(yǎng)24 h使其貼壁；

（2）每孔加入100 μL PBS，洗滌3次；

（3）分別加入以下樣品溶液各100μL（n=6），細胞培養(yǎng)箱恒溫孵育1 h。樣品溶液使用完全培養(yǎng)基分別配制：1）抗血清+HA-ADM溶液（即：antiserum+HA-ADM）；2）抗血清+ADM溶液(即：antiserum+ ADM）；3）正常血清+ HA-ADM溶液（即：normal serum+HA-ADM）；4）PBS+HA-ADM溶液（即：PBS+HA-ADM）。以 ADM為計，濃度均為5.0 μg·mL^-1，抗血清及陰性血清的稀釋倍數(shù)均為200倍；37 ℃條件下恒溫震蕩30 min；

（4）每孔加入100 μL PBST，洗滌3次，然后每孔100 μL加入PBS稀釋的山羊抗小鼠IgG-辣根過氧化物酶（GaRIgG-HRP，標記二抗），37 ℃恒溫孵育1 h；

（5）細胞板以PBST洗滌，每次100 μL，共3次；每孔加入100 μL底物溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配：20mL純水、1 mL pH 5.8的磷酸鹽緩沖溶液、200 μl 1 %四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、20 μL 5 %過氧化氫），室溫避光條件下，在微量振蕩器上震搖20 min左右，進行顯色；

（6）當細胞板上有些孔已顯深藍色時，按40 μL/孔加入5% H₂SO₄溶液終止顯色反應；

（7）用酶標儀測定其490nm處吸光度，結果見圖14。

由于HA-ADM，一端的HA可與癌細胞表面高表達的CD44結合，另一端的ADM可與小鼠抗血清（抗ADM多抗）結合，而小鼠抗血清可與標記二抗作用，最終使細胞顯色，故在細胞ELISA測定結果圖14中，具體吸光度大小為：抗血清+HA-ADM >抗血清+ADM >正常血清+ HA-ADM > PBS+HA-ADM組，其中，“抗血清+HA-ADM”的吸光度值最高，分別依次為各對照組的1.47、2.58、3.95倍（均為p<0.05）。可見“抗血清+HA-ADM”組的吸光度值大，它使留在細胞板上的標記二抗越多，說明多抗被引導致腫瘤細胞的效率越高，即證明分子橋HA-ADM使癌細胞表面形成了“CD44-HA-ADM-抗ADM抗體（CD44受體-透明質(zhì)酸-阿霉素-抗阿霉素抗體）”復合物，為刺激機體自身免疫，對癌細胞發(fā)起免疫殺傷作用的奠定了基礎。

HA-ADM主動靶向抗癌作用考察

（1）4T1細胞對HA-ADM的攝取情況

取對數(shù)生長期的4T1細胞，制成10⁶ 個/mL細胞的混懸液，每孔3 mL 接種于6孔板，在37 ℃、5％CO₂孵箱中培養(yǎng)24 h使其貼壁后，分別加入用完全培養(yǎng)基配制的溶液3 mL：1）HA-ADM溶液；2）ADM溶液，使各組溶液的ADM終濃度均為10 μgmL^-1。分別培養(yǎng)1h、4h后，PBS洗滌3次，加適量胰酶消化后在1 mL 4℃預凍的PBS溶液中重懸，1 h內(nèi)進入流式細胞儀檢測，結果見圖15。由流式結果圖15可知，在1h和4 h，HA-ADM組的攝取量分別為ADM組的2.04倍和2.44倍，說明因HA介導顯著提高了攝取量，即HA-ADM具有主動靶向性。

（2）體外細胞毒性試驗，考察HA-ADM主動靶向抗癌作用

采用MTT法，通過對鼠乳腺癌（4T1）細胞的細胞毒性，考察HA-ADM主動靶向抗癌作用。

通過4T1細胞生長抑制試驗HA-ADM、ADM、HA-ADM+HA及HA的細胞毒性。取對數(shù)生長期的4T1細胞，制成5×10³個/mL細胞的混懸液，每孔100 μL 接種于96孔板，在37 ℃、5％ CO₂孵箱中培養(yǎng)24 h使其貼壁后，分別加入用無葉酸的完全培養(yǎng)基配制的溶液：①HA- ADM溶液；②HA-ADM+ADM溶液; ③ADM溶液；④HA溶液。其中各樣品溶液的ADM終濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 μgmL^-1，實驗組②中每孔加入4mgmL^-1游離HA。給藥24h后，吸取含藥培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次后每孔加入5 mg·mL^-1 MTT溶液10 μL和完全培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去液體，每孔加入100 μL DMSO，避光震蕩20 min，用酶標儀于490 nm測定吸光度，計算得到細胞生長存活率。不同藥物濃度作用不同時間的細胞存活率。

計算公式為：“存活率=（A_藥物-A_{調(diào)零孔}/A_對照-A_{調(diào)零孔}）×100%）”。分別以濃度（各組ADM濃度一致）為橫坐標，存活率為縱坐標，得到不同濃度藥物對癌細胞作用24h后的生長抑制曲線，并計算半數(shù)致死量IC₅₀值。結果見圖16，可知，在24 h，當ADM濃度一致時，HA-ADM 、HA-ADM+HA、ADM對4T1的細胞生長抑制IC₅₀（μg·mL^-1）依次為：0.14、1.60、1.05，而HA對細胞幾乎無毒性，表明分子橋對腫瘤細胞的殺傷作用較ADM（p<0.05）大，即HA-ADM分子橋對腫瘤細胞具有主動靶向性。

實施例四

將4T1細胞在37℃、5% CO₂孵箱內(nèi)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞，用含10%胎牛血清無葉酸的1640培養(yǎng)基配制成5×10⁵個細胞/mL，每只鼠皮下注射50μL（含1×10⁴個細胞），構建皮下瘤小鼠模型（荷瘤鼠模型）。經(jīng)觀察，4T1荷瘤Balb/c鼠模型動物構建成功，用于Cypate脂質(zhì)體靶向光熱治療聯(lián)合ADM-BSA及HA-ADM免疫治療組成的多靶向抗腫瘤復合制劑的療效考察試驗。

實驗動物分組為：

實驗組①：免疫+HA-ADM +PTT(1.5 mg·kg^-1)（分子橋促進免疫治療+主動靶向化療+1.5 mg·kg-1靶向光熱治療）；

實驗組②：免疫+HA-ADM + PTT(0.5 mg·kg^-1)（分子橋促進免疫治療+主動靶向化療+0.5 mg·kg^-1靶向光熱治療）；

免疫治療聯(lián)合分子橋組：免疫+HA-ADM（分子橋促進免疫治療+主動靶向化療）；

分子橋功能驗證組：免疫+ ADM（體內(nèi)有抗體，普通化療+被動靶向化療）；

單純免疫治療組：免疫+PBS（體內(nèi)有抗體，但無分子橋介入）；

靶向光熱治療聯(lián)合主動靶向化療組：非免疫+HA-ADM +PTT(1.5 mg·kg^-1)(體內(nèi)無抗體，分子橋主動靶向化療+1.5 mg·kg^-1靶向光熱治療）；

主動靶向化療組：非免疫+HA-ADM（體內(nèi)無抗體，分子橋主動靶向化療）；

化療藥對照組：非免疫+ ADM（體內(nèi)無抗體，普通化療）；

陰性對照組：非免疫+PBS（體內(nèi)無抗體，不治療）。

具體步驟如下：1）免疫周期：接種腫瘤第1天開始第1次免疫，免疫間隔時間及取血間隔時間與健康鼠一致，均為兩周；2）光熱治療組：在第0天尾靜脈注射Cypate脂質(zhì)體（以Cypate為計，給藥劑量為0.5或1.5 mg·kg^-1），給藥24 h后，采用785 nm激光器1.5 W·cm^-2條件下對腫瘤部位照射3 min；3）分子橋介入：待免疫的荷瘤鼠血清檢測出相應抗體后，為接種腫瘤后第22天，即光熱治療介入后第1天，尾靜脈注射分子橋，并以此為起點其后的第2、3、5、7、9天給予相應藥物；介入分子橋HA-ADM或ADM時，濃度以ADM為計，給藥劑量均為0.33 mg·kg^-1。其后，觀察并測量各組小鼠腫瘤體積，以第0天測量體積V₀設為初始體積，計算各組瘤體積增長倍數(shù)做為指標，測量第i天的腫瘤體積增長倍數(shù)=（V_i -V₀）/ V₀。治療24天后，對照組小鼠出現(xiàn)死亡，將全部小鼠處死，取出其腫瘤組織，并拍攝照片。

由圖17A可知，組1A（陰性對照組1，非免疫+PBS）腫瘤生長速度明顯最快，組2A（陰性對照組2，單純免疫，免疫+PBS）腫瘤生長速度則稍低于陰性對照組，而且組2B（免疫及單純化療，免疫+ ADM）、組2C（分子橋引導免疫治療組，免疫+HA-ADM）、組1B(化療藥對照組，非免疫+ ADM）、組1C（主動靶向化療組、非免疫+HA-ADM）的腫瘤生長速度，均較為接近。但是，以下各組的瘤體顯著減小或不復發(fā)：組2E（實驗組1，免疫/HA-ADM/PTT,1.5mg·kg^-1，組2D（實驗組2，免疫/HA-ADM/PTT,0.5mg·kg^-1，以及組1D（陽性對照組，非免疫/HA-ADM/PTT，1.5mg·kg^-1）?？梢妼嶒灲M1（免疫+HA-ADM +PTT，1.5 mg·kg^-1）、實驗組2（免疫+HA-ADM +PTT，0.5 mg·kg^-1）腫瘤生長速度明顯降低，且Cypate脂質(zhì)體的給藥濃度越高，抑瘤效果越明顯，而沒有免疫、體內(nèi)無抗體的靶向光熱治療聯(lián)合主動靶向化療組（非免疫+HA-ADM +PTT(1.5 mg·kg^-1)）的抑瘤效果也不錯。

圖17B為治療24天后各組腫瘤組織照片，由圖可知實驗組（靶向光熱治療聯(lián)合免疫治療組）與對照組相比，以及參考實例一中單獨Cypate脂質(zhì)體光熱治療抗腫瘤活性的研究，發(fā)現(xiàn)Cypate脂質(zhì)體給藥濃度為0.5 mg·kg^-1和1.5 mg·kg^-1時，腫瘤在給藥24 h后進行激光照射后，分別在第9天和13天出現(xiàn)復發(fā)情況。而將光熱治療結合免疫治療后，腫瘤復發(fā)率均有所下降。實驗組1（免疫+HA-ADM +PTT，Cypate脂質(zhì)體1.5 mg·kg^-1）、實驗組2（免疫+HA-ADM + PTT，Cypate脂質(zhì)體0.5 mg·kg^-1），以本次實驗結果統(tǒng)計，腫瘤復發(fā)抑制率從低濃度的20%，提高至高濃度的60%。而沒有免疫、體內(nèi)無抗體的靶向光熱治療聯(lián)合主動靶向化療組（非免疫+HA-ADM +PTT(1.5 mg·kg^-1)）僅能達到20%的腫瘤復發(fā)抑制率?？梢娝O計的以Cypate脂質(zhì)體經(jīng)過光熱治療后，殺死實體腫瘤，而剩余少量殘留的腫瘤細胞則通過免疫原ADM-BSA非特異性地激活機體的免疫功能并聯(lián)合分子橋HA-ADM腫瘤靶向功能的免疫治療而被消除或抑制，證實了主動靶向光熱治療聯(lián)合主動免疫治療可抑制腫瘤生長并一定程度地抑制腫瘤復發(fā)。

綜上所述，本發(fā)明由Cypate脂質(zhì)體、ADM-BSA與HA-ADM組成的復合制劑，提供了一個能方便、高效提高腫瘤特異性，并有效抑制腫瘤生長和復發(fā)的聯(lián)合治療腫瘤的方法，主要包含兩個主要部分，通過近紅外激光結合光熱試劑對間質(zhì)腫瘤照射，通過包載光熱材料的脂質(zhì)體產(chǎn)生的光熱效應，對腫瘤產(chǎn)生實質(zhì)性損傷，同時利用免疫原ADM-BSA非特異地激活機體的免疫功能，在此基礎上聯(lián)合應用分子橋HA-ADM，將增強免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的免疫識別能力以及一定的靶向化療能力，從而達到更好的抗腫瘤效果。這兩個組成部分均能激活機體的抗腫瘤免疫反應力。動物試驗研究表明，將具有選擇性光熱治療與提高免疫系統(tǒng)的響應性結合的聯(lián)合治療應用，不僅可以摧毀治療原發(fā)性腫瘤，也有根除治療遠距離轉移腫瘤的潛力。因此熱療聯(lián)合免疫治療復合制劑表現(xiàn)出了其抗腫瘤活性方面的優(yōu)勢，為進一步的免疫治療聯(lián)合光熱治療的研究提供實驗依據(jù)和基礎方法，并為開發(fā)生物相容性好、靶向性好、光熱轉換效率高的包載光熱試劑Cypate脂質(zhì)體并結合ADM-BSA、HA-ADM在腫瘤免疫治療展示出應用前景。