專利名稱：靶向性免疫綴合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般地，本發(fā)明涉及用于選擇性投遞影響細(xì)胞活性的效應(yīng)器模塊的抗原特異性免疫綴合物。另外，本發(fā)明涉及編碼此類免疫綴合物的核酸分子和包含此類核酸分子的載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于生成本發(fā)明的免疫綴合物的方法，及在治療疾病中使用這些免疫綴合物的方法。
背景技術(shù)：
對個別細(xì)胞或特定細(xì)胞類型的選擇性破壞在許多臨床背景中經(jīng)常是期望的。例如，癌癥療法的主要目的是特異性破壞腫瘤細(xì)胞，而讓健康細(xì)胞和組織保持完整且不受損傷。細(xì)胞中的許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與細(xì)胞存活和/或死亡相關(guān)聯(lián)。因而，可以使用對涉及細(xì)胞存活或死亡的途徑的因子的直接投遞來促成細(xì)胞的維持或破壞。細(xì)胞因子是參與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)分子。在癌癥療法中使用時，細(xì)胞因子可以充當(dāng)免疫調(diào)控劑，其具有抗腫瘤效果，并且其可以提高一些類型的腫瘤的免疫原性。然而，快速的血液清除和腫瘤特異性的缺乏需要高劑量細(xì)胞因子的系統(tǒng)性施用以達(dá)到在腫瘤部位足以激活免疫應(yīng)答或具有抗腫瘤效果的細(xì)胞因子濃度。這些高水平的系統(tǒng)性細(xì)胞因子可以導(dǎo)致嚴(yán)重的毒性和不利的反應(yīng)。一種將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的因子，諸如細(xì)胞因子投遞至體內(nèi)的特定部位(例如，腫瘤或腫瘤微環(huán)境)的方式是將該因子與對該部位特異性的免疫球蛋白綴合。早期策略針對將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的因子，諸如細(xì)胞因子投遞至體內(nèi)的特定部位，包括與各種細(xì)胞因子，包括淋巴毒素、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白介素-2(IL_2)和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF)綴合的免疫球蛋白重鏈。免疫球蛋白重鏈或是與細(xì)胞因子化學(xué)綴合或是免疫球蛋白-細(xì)胞因子綴合物以融合蛋白表達(dá)。見Nakamura K.和Kubo，A. Cancer Supplement80 2650-2655(1997) ;Jun, L.等，Chin. Med. J. 113 :151-153(2000)；及 BeckerJ. C.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :7826-7831 (1996)。研究人員觀察到，它們不僅能夠?qū)⒓?xì)胞因子靶向至體內(nèi)的特定部位，它們還能夠利用如下的實情，即單克隆抗體比大多數(shù)其它蛋白質(zhì)具有更長的血清半衰期。由于與高劑量的某些未綴合細(xì)胞因子，即IL-2有關(guān)的系統(tǒng)毒性， 免疫球蛋白-細(xì)胞因子融合蛋白在較低劑量使腫瘤部位的免疫刺激活性最大化，而使系統(tǒng)副作用保持最小的能力讓研究人員相信，免疫球蛋白-細(xì)胞因子免疫綴合物是最佳的治療劑。然而，免疫球蛋白作為投遞劑的臨床效用中的主要限制之一是其不充分的攝取和腫瘤中的較差分布，這部分是由于免疫球蛋白分子較大所致。見Xiang，J.等，Immunol. Cell Biol. 72 :275-285 (1994)。另外，已經(jīng)提示了，免疫球蛋白-細(xì)胞因子免疫綴合物可以激活補體，并與Fc受體相互作用。已經(jīng)不利地看待此固有的免疫球蛋白特征，因為治療性免疫綴合物可以靶向表達(dá)Fc受體的細(xì)胞，而不是優(yōu)選的攜帶抗原的細(xì)胞。一種克服這些問題的方法是使用經(jīng)工程化改造的免疫球蛋白片段。許多研究已經(jīng)詳述了免疫球蛋白片段-細(xì)胞因子免疫綴合物的特征。見&wage，P.等，Br. J. Cancer 67 :304-310(1993) ；Harvill, Ε. Τ.和 Morrison S. L.，Immunotechno1. 1 :95-105(1995)； 及Yang J.等，Mol. Immunol. 32 :873-881 (1995)。一般地，存在著兩種常見的免疫球蛋
14白片段-細(xì)胞因子融合蛋白構(gòu)建體，即哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的F(ab’ )2-細(xì)胞因子和大腸桿菌(Escherichia coli)中表達(dá)的 scFv-細(xì)胞因子。見 Xiang，J. Hum. Antibodies 9 23-36(1999)。免疫球蛋白親本分子的腫瘤結(jié)合反應(yīng)性和細(xì)胞因子的功能性活性兩者在大多數(shù)這些類型的免疫綴合物中得到維持。新近的臨床前研究已經(jīng)顯示了，這些融合蛋白能夠?qū)⒓?xì)胞因子在體內(nèi)靶向表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原的腫瘤，并抑制免疫能力動物模型中的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤兩者。免疫球蛋白片段-細(xì)胞因子免疫綴合物的例子包括如PCT公開文本 W02001/062298A2中所列的scFv-IL_2免疫綴合物；如美國專利No. 5，650, 150中所列的免疫球蛋白重鏈片段-GM-CSF免疫綴合物；如PCT公開文本W(wǎng)02006/119897A2中所列的免疫綴合物，其中scFv-IL-12第一亞基與IL-12第二亞基-scFv僅共享二硫鍵，和如PCT公開文本TO 99/29732A2中所描述的免疫綴合物，其中Ig重鏈片段-IL-12第一亞單位與Ig重鏈片段-IL-12第二亞單位僅共享二硫鍵。雖然與第一代免疫球蛋白-細(xì)胞因子綴合物相比， 這些第二代免疫綴合物具有一些改善的特性，但是開發(fā)更多且甚至更安全的特異性治療劑對于針對腫瘤細(xì)胞的更大效率和這些產(chǎn)品的副作用(例如，毒性、對非腫瘤細(xì)胞的破壞等) 的數(shù)目和嚴(yán)重性降低是期望的。另外，期望鑒定在維持可接受的治療活性水平的情況下進(jìn)一步穩(wěn)定免疫綴合物的方式。本發(fā)明提供了相對于已知的免疫綴合物，展現(xiàn)出改善的功效、高的作用特異性、降低的毒性和血液中改善的穩(wěn)定性的免疫綴合物。發(fā)明概述本發(fā)明的一方面涉及與已知的免疫綴合物相比，展現(xiàn)出改善的功效、高的作用特異性、降低的毒性和血液中改善的穩(wěn)定性的免疫綴合物?？梢允褂帽景l(fā)明的免疫綴合物來將效應(yīng)器模塊選擇性投遞至體內(nèi)的靶部位。在另一個實施方案中，免疫綴合物將細(xì)胞因子投遞至靶部位，其中所述細(xì)胞因子可以施加局部生物學(xué)效應(yīng)，諸如局部炎性應(yīng)答、刺激T細(xì)胞生長和活化和/或活化B和/或NK細(xì)胞。本發(fā)明的一方面涉及免疫綴合物，其包含至少第一效應(yīng)器模塊和至少第一和第二抗原結(jié)合模塊，其獨立選自下組FV和Fab，其中第一效應(yīng)器模塊與第一抗原結(jié)合模塊共享氨基或羧基端肽鍵，而第二抗原結(jié)合模塊與i)所述第一效應(yīng)器模塊或ii)所述第一抗原結(jié)合模塊共享氨基或羧基端肽鍵本發(fā)明的另一方面是免疫綴合物，其至少包含在其氨基端氨基酸處與一個或多個 scFv分子連接的第一單鏈效應(yīng)器模塊，且其中所述第一單鏈效應(yīng)器模塊在其羧基端氨基酸處與一個或多個scFv分子連接。本發(fā)明的另一方面是免疫綴合物，其包含至少第一單鏈效應(yīng)器模塊和第一和第二抗原結(jié)合模塊，其中第一和第二抗原結(jié)合模塊之每個包含在其羧基端氨基酸處與包含免疫球蛋白恒定域的恒定區(qū)連接的scFv分子，所述免疫球蛋白恒定域獨立選自下組IgG CHI、 IgG Ck和IgE CH4，且其中第一抗原結(jié)合模塊在其恒定區(qū)羧基端氨基酸處與效應(yīng)器模塊之一的氨基端氨基酸連接，且其中第一和第二抗原結(jié)合模塊經(jīng)由至少一個二硫鍵共價連接。本發(fā)明的另一方面是免疫綴合物，其包含至少第一單鏈效應(yīng)器模塊和第一和第二抗原結(jié)合模塊，其中第一和第二抗原結(jié)合模塊之每個包含在其羧基端氨基酸處與IgGl CH3 域連接的scFv分子，且其中第一抗原結(jié)合模塊在其羧基端氨基酸處與效應(yīng)器模塊之一的氨基端氨基酸連接，且其中第一和第二抗原結(jié)合模塊經(jīng)由至少一個二硫鍵共價連接。本發(fā)明的另一方面涉及免疫綴合物，其包含第一和第二單鏈效應(yīng)器模塊和第一和第二抗原結(jié)合模塊，其中每個抗原結(jié)合模塊包含在其重或輕鏈羧基端氨基酸處與IgGl CH3 域連接的Fab分子，且其中每個IgGl CH3域在其羧基端氨基酸處與效應(yīng)器模塊之一的氨基端氨基酸連接，且其中第一和第二抗原結(jié)合模塊經(jīng)由至少一個二硫鍵共價連接。在一個實施方案中，免疫綴合物包含多肽序列SEQ ID N0:95。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含多肽序列SEQ ID N0:104。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含多肽序列SEQ ID NO :105o在另一個實施方案中，免疫綴合物包含多肽序列SEQ ID NO :106。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含多肽序列SEQ ID N0:107。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含多肽序列SEQ ID N0:96。在又一個實施方案中，免疫綴合物包含多肽序列SEQ IDNO :96和選自下組的多肽序列SEQ ID NO :95和104-107。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含具有與選自下組的序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99% 相同的序列的多肽:SEQ ID NO :95、96和104-107。在一個實施方案中，免疫綴合物包含由與SEQ ID NO :108至少約80%、85%、 90%、95(%、96(%、97(%、98(%、或99(%相同的多核苷酸序列編碼的多肽序列。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO :108編碼的多肽序列。在一個實施方案中，免疫綴合物包含由與 SEQ ID NO :117 至少約 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、 或99%相同的多核苷酸序列編碼的多肽序列。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO :117編碼的多肽序列。在一個實施方案中，免疫綴合物包含由與SEQ ID NO 118至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列編碼的多肽序列。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO 118 編碼的多肽序列。在一個實施方案中，免疫綴合物包含由與SEQ ID NO :119至少約80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列編碼的多肽序列。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO :119編碼的多肽序列。在一個實施方案中，免疫綴合物包含由與SEQ ID NO :120至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%、或99%相同的多核苷酸序列編碼的多肽序列。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO :120編碼的多肽序列。在一個實施方案中，免疫綴合物包含由與 SEQ ID NO :109 至少約 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列編碼的多肽序列。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO 109編碼的多肽序列。在一個實施方案中，免疫綴合物包含與序列SEQ ID N0:13或SEQ IDN0:15至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的重鏈可變區(qū)。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含與序列SEQ ID NO :9或SEQ ID NO :11至少約80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的輕鏈可變區(qū)序列。在又一個實施方案中，免疫綴合物包含與序列 SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO :15 至少約 80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%、99%、或100%相同的重鏈可變區(qū)序列和與序列SEQ ID NO :9或SEQ ID NO 11 至少約80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^ 100%相同的輕鏈可變區(qū)序列。在一個實施方案中，免疫綴合物包含由與SEQ ID NO 14或SEQ ID NO 16至少約 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列編碼的重鏈可變區(qū)序
16列。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQ ID N0:14或SEQ ID NO: 16編碼的重鏈可變區(qū)序列。在一個實施方案中，免疫綴合物包含由與SEQ ID N0:10或SEQ ID NO 12至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)序列。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 12編碼的輕鏈可變區(qū)序列。在一個實施方案中，免疫綴合物包含與序列SEQ ID而99至少約80%、85%、 90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的多肽序列。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含與序列 SEQ ID NO :100 或 SEQ ID NO :215 至少約 80%、85%、90%、95%、96%、 97^^98^^99%.或100%相同的多肽序列。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含與序列 SEQ ID NO :101 或SEQ ID NO :235至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的多肽序列。在又一個實施方案中，免疫綴合物包含與序列SEQID NO :100至少約 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的多肽序列和與序列 SEQ ID NO :101至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的多肽序列。在又一個實施方案中，免疫綴合物包含與序列SEQ ID NO :215至少約80%、85%、90%、95%、 96%、97%、98%、99%、或100%相同的多肽序列和與序列SEQ ID NO :2；35至少約80%、 85%,90%,95%,96%,97%,98%,99% ^ 100%相同的多肽序列。在一個實施方案中，免疫綴合物包含由與SEQ ID NO :112至少約80%、85%、 90%、95(%、96(%、97(%、98(%、或99(%相同的多核苷酸序列編碼的多肽序列。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO :112編碼的多肽序列。在一個實施方案中，免疫綴合物包含由與SEQ ID NO :113或SEQ ID NO :216至少約80%、85%、90%、95%、 96^^97^^98%,或99%相同的多核苷酸序列編碼的多肽序列。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO :113或SEQ ID NO :216編碼的多肽序列。在一個實施方案中，免疫綴合物包含由與SEQ ID NO :114或SEQ ID NO :236至少約80%、85%、 90%、95(%、96(%、97(%、98(%、或99(%相同的多核苷酸序列編碼的多肽序列。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO :114或SEQ ID NO :236編碼的多肽序列。在一個實施方案中，免疫綴合物包含與選自下組的序列至少約80 ^^85%,90%、 95%、96%、97%、98%、99%、或 100% 相同的重鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO -J, SEQ ID NO: 179，SEQ ID NO: 183，SEQ ID NO: 187，SEQ IDNO : 191，SEQ ID NO: 195，SEQ ID NO: 199，SEQ ID NO :203和SEQ ID NO :207。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含與選自下組的序列至少約 80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%,^； 100%相同的輕鏈可變區(qū)序列=SEQ ID NO 3,SEQ ID N0:5，SEQ ID NO 177,SEQ ID NO 181,SEQ ID NO 185,SEQ ID NO 189, SEQ ID NO :193, SEQ ID NO 197, SEQ ID NO :201 禾口 SEQ ID NO :205。在又一個實施方案中， 免疫綴合物包含與選自下組的序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、 或 100%相同的重鏈可變區(qū)序列=SEQ ID NO -J, SEQ ID NO :179, SEQ ID NO :183，SEQ ID NO :187, SEQ ID NO :191，SEQ ID NO :195，SEQ ID NO :199，SEQ ID NO :203 和 SEQ ID NO 207和與選自下組的序列至少約80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^ 100%相同的輕鏈可變區(qū)序列:SEQ ID NO 3,SEQ ID N0:5，SEQ ID NO =177,SEQ ID NO =181,SEQ ID NO :185, SEQ ID NO :189, SEQ ID NO :193, SEQ ID NO :197, SEQ ID NO :201 和 SEQ ID NO 205。在一個實施方案中，免疫綴合物包含由與選自下組的序列至少約80^^85%, 90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列編碼的重鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO 8, SEQ ID NO :180，SEQ ID NO :184，SEQ ID NO :188，SEQ ID NO :192，SEQ ID NO :196， SEQ ID NO :200, SEQ ID NO :204和SEQ ID NO :208。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含由與選自下組的多核苷酸序列編碼的重鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO 8, SEQ ID NO :180，SEQ ID NO :184,SEQ ID NO 188,SEQ ID NO 192,SEQ ID NO 196,SEQ ID NO 200,SEQ ID NO: 204和SEQ ID N0:208。在一個實施方案中，免疫綴合物包含由與選自下組的序列至少約 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :6，SEQ ID NO :178，SEQ ID NO :182，SEQ ID NO :186，SEQ ID NO :190, SEQ ID NO :194, SEQ ID NO 198，SEQ ID NO :202 和 SEQ ID NO :206。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含由選自下組的多核苷酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO 4,SEQ ID N0:6，SEQ ID NO :178,SEQ ID NO :182,SEQ ID NO :186,SEQ ID NO :190,SEQ ID NO :194, SEQ ID NO :198, SEQ ID NO :202 和 SEQ ID NO :206。在一個實施方案中，免疫綴合物包含與選自下組的序列至少約80% ,85^^90%、 95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的多月太序列SEQ ID NO :239、SEQ ID NO :241 禾口 SEQ ID N0:243。在另一個實施方案中，所述綴合物包含與選自下組的序列至少約80 %、 85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的多肽序列SEQ ID NO :245、SEQ ID NO :247和SEQ ID NO :249。在又一個實施方案中，所述免疫綴合物包含與選自下組的序列至少約 80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^ 100%相同的多肽序列=SEQ ID NO :239, SEQ ID NO :241 禾口 SEQ ID NO :243，和與選自下組的序列至少約 80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的多月太序列SEQ ID NO :245、SEQ ID NO :247 禾口 SEQ ID NO :249 ο在一個實施方案中，免疫綴合物包含由與選自下組的序列至少約80^^85%, 90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列編碼的多肽序列SEQ ID N0: 240,SEQ ID NO :242和SEQ ID NO J44。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含由選自下組的多核苷酸序列編碼的多肽序列SEQ ID NO :240,SEQ ID NO :242和SEQ ID NO :244。在一個實施方案中，免疫綴合物包含由與選自下組的序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列編碼的多肽序列SEQ ID NO 246, SEQ ID NO :248 和SEQ ID N0:250。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含由選自下組的多核苷酸序列編碼的多Jft序列SEQ ID NO :246, SEQ ID NO :248 和 SEQ ID NO :250。在一個實施方案中，免疫綴合物包含與選自下組的序列至少約80 ^^85%,90%、 95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的重鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO :21，SEQ ID N0: 25，SEQ ID NO :27，SEQ ID NO :31，SEQ ID NO :35，SEQ ID NO :39，SEQ ID NO :43，SEQ ID NO 47, SEQ ID NO :51，SEQ ID NO :69，SEQ ID NO :73，SEQ ID NO -Jl, SEQ ID NO :81，SEQ ID NO 85, SEQ ID NO :89，SEQ ID NO :93，SEQ ID NO :123，SEQ ID NO :127，SEQ ID NO 131，SEQ ID NO :135，SEQ ID NO :139，SEQ ID NO :143，SEQ ID NO :147，SEQ ID NO :151， SEQ ID NO :155, SEQ ID NO :159，SEQ ID NO :163，SEQ ID NO :167，SEQ ID NO :171 和 SEQ ID N0:175。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含與選自下組的序列至少約80^^85%,90%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的輕鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO :23，SEQ ID NO :29，SEQ ID NO :33，SEQ ID NO :37，SEQ ID NO :41，SEQ ID NO 45, SEQ ID NO :49，SEQ ID NO :67，SEQ ID NO :71，SEQ ID NO :75，SEQ ID NO :79， SEQ ID NO 83,SEQ ID NO 87,SEQ ID N0:91，SEQ ID NO 121,SEQ ID NO 125,SEQ ID NO: 129，SEQ ID NO :133，SEQ ID NO :137，SEQ ID NO :141，SEQ ID NO :145，SEQ ID NO :149， SEQ ID NO :153, SEQ ID NO :157，SEQ ID NO :161，SEQ ID NO :165，SEQ ID NO :169 和 SEQ ID N0:173。在又一個實施方案中，免疫綴合物包含與選自下組的序列至少約80^^85%, 90%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的重鏈可變區(qū)序列SEQ ID N0:21，SEQ ID NO 25, SEQ ID NO :27，SEQ ID NO :31，SEQ ID NO :35，SEQ ID NO :39，SEQ ID NO :43，SEQ ID NO 47, SEQ ID NO :51，SEQ ID NO :69，SEQ ID NO :73，SEQ ID NO -Jl, SEQ ID NO :81， SEQ ID NO 85,SEQ ID NO 89,SEQ ID NO 93,SEQ ID NO 123,SEQ ID NO 127,SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO 135, SEQ ID NO 139, SEQ ID NO 143, SEQ ID NO 147, SEQ ID NO 151, SEQ ID NO :155, SEQ ID NO :159, SEQ ID NO :163, SEQ ID NO :167, SEQ ID NO :171 禾口 SEQ ID NO :175，與選自下組的序列至少約 80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^ 100% 相同的輕鏈可變區(qū)序列:SEQ ID NO :17, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO :37，SEQ ID NO :41，SEQ ID NO :45，SEQ ID NO :49，SEQ ID NO :67， SEQ ID NO 71, SEQ ID NO :75，SEQ ID NO :79，SEQ ID NO :83，SEQ ID NO :87，SEQ ID NO 91，SEQ ID NO 121, SEQ ID NO 125, SEQ ID NO 129, SEQ ID NO 133, SEQ ID NO 137, SEQ ID NO :141,SEQ ID NO 145,SEQ ID NO 149,SEQ ID NO 153,SEQ ID NO 157,SEQ ID NO: 161，SEQ ID NO :165，SEQ ID NO :169 和 SEQ ID NO :173。 在一個實施方案中，免疫綴合物包含由與選自下組的序列至少約80^^85%, 90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列編碼的重鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO 22, SEQ ID NO :26，SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :32，SEQ ID NO :36，SEQ ID NO :40，SEQ ID NO 44, SEQ ID NO :48，SEQ ID NO :52，SEQ ID NO :70，SEQ ID NO :74，SEQ ID NO :78， SEQ ID NO 82,SEQ ID NO 86,SEQ ID NO 90,SEQ ID NO 94,SEQ ID NO 124,SEQ ID NO: 128，SEQ ID NO :132，SEQ ID NO :136，SEQ ID NO :140，SEQ ID NO :144，SEQ ID NO :148， SEQ ID NO :152, SEQ ID NO 156, SEQ ID NO 160, SEQ ID NO 164, SEQ ID NO 168, SEQ ID NO :172和SEQ ID N0:176。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含由選自下組的多核苷酸序列編碼的重鏈可變區(qū)序列:SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO :32， SEQ ID NO 36, SEQ ID NO :40，SEQ ID NO :44，SEQ ID NO :48，SEQ ID NO :52，SEQ ID NO 70，SEQ ID NO :74，SEQ ID NO :78，SEQ ID NO :82，SEQ ID NO :86，SEQ ID NO :90，SEQ ID NO 94, SEQ ID NO 124, SEQ ID NO 128, SEQ ID NO 132, SEQ ID NO 136, SEQ ID NO :140， SEQ ID NO :144, SEQ ID NO 148, SEQ ID NO 152, SEQ ID NO 156, SEQ ID NO 160, SEQ ID NO :164, SEQ ID NO 168, SEQ ID NO :172 和 SEQ ID N0:176。在一個實施方案中，免疫綴合物包含由與選自下組的序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)序列:SEQ ID NO :18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO :34，SEQ ID NO :38，SEQ ID NO :42，SEQ ID NO :46，SEQ ID NO :50， SEQ ID NO 68, SEQ ID NO -J2, SEQ ID NO :76，SEQ ID NO :80，SEQ ID NO :84，SEQ ID NO 88，SEQ ID NO :92，SEQ ID NO :122，SEQ ID NO :126，SEQ ID NO :130，SEQ ID NO :134，SEQID NO :138,SEQ ID NO 142,SEQ ID NO 146,SEQ ID NO 150,SEQ ID NO 154,SEQ ID NO: 158，SEQ ID NO: 162，SEQ ID NO: 166，SEQ ID NO :170 禾口 SEQ ID NO: 174。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含由選自下組的多核苷酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO :24，SEQ ID NO :30，SEQ ID NO :34，SEQ ID NO :38，SEQ ID NO 42，SEQ ID NO :46，SEQ ID NO :50，SEQ ID NO :68，SEQ ID NO -J2, SEQ ID NO :76，SEQ ID NO 80,SEQ ID NO 84,SEQ ID NO 88,SEQ ID NO 92,SEQ ID NO 122,SEQ ID NO 126,SEQ ID NO :130,SEQ ID NO 134,SEQ ID NO 138,SEQ ID NO 142,SEQ ID NO 146,SEQ ID N0: 150，SEQ ID NO :154, SEQ ID NO :158, SEQ ID NO :162, SEQ ID NO :166, SEQ ID NO :170 和 SEQ ID NO :174ο在一個實施方案中，免疫綴合物包含與選自下組的序列至少約80 ^^85%,90%、 95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的多月太序列SEQ ID NO :209，SEQ ID NO :211， SEQ ID NO :213, SEQ ID N0:217，SEQ ID N0:219，SEQ ID NO :221, SEQ ID NO :223, SEQ ID NO :225和SEQ ID NO :227。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含與選自下組的序列至少約 80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^ 100%相同的多肽序列=SEQ ID NO 229，SEQ ID NO :231、SEQ ID NO :233 和 SEQ ID NO :237。在又一個實施方案中，免疫綴合物包含與選自下組的序列至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100% 相同的多肽序歹 Ij :SEQ ID N0:211、SEQ ID NO :219 禾口 SEQ ID NO :221，和與序列 SEQ ID NO: 231 至少約 80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%,^； 100%相同的多肽序列。在又一個實施方案中，免疫綴合物包含與選自下組的序列至少約80^^85%,90^^95%,96%、 97%、98%、99%、或 100%相同的多肽序列SEQ ID NO :209、SEQ ID NO :223、SEQ ID N0: 225和 SEQ ID NO :227，和與序列 SEQ ID NO :2 至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98 %、99 %、或100 %相同的多肽序列。在又一個實施方案中，免疫綴合物包含與序列SEQ ID NO :213 至少約 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的多肽序列，和與序列 SEQ ID NO :233 至少約 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的多肽序列。在又一個實施方案中，免疫綴合物包含與序列SEQ ID NO :217至少約80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或 100%相同的多肽序列，和與序列 SEQ ID N0: 237 至少約 80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^ 100%相同的多肽序列。在一個實施方案中，免疫綴合物包含由與選自下組的序列至少約80^^85%, 90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列編碼的多肽序列SEQ ID N0: 210，SEQ ID NO :212，SEQ ID NO :214，SEQ ID NO :218，SEQ ID NO :220，SEQ ID NO :222， SEQ ID NO :224, SEQ ID NO :2 和SEQ ID NO :2觀。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含由選自下組的多核苷酸序列編碼的多肽序列SEQ ID NO :210, SEQ ID NO :212，SEQ ID NO :214, SEQ ID NO :218，SEQ ID NO :220，SEQ ID NO :222，SEQ ID NO :224，SEQID NO :226 和SEQ ID NO :228。在一個實施方案中，免疫綴合物包含由與選自下組的序列至少約80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列編碼的多肽序列=SEQ ID NO :230, SEQ ID NO :232、SEQ ID NO:2;34 和 SEQ ID NO :238。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含由選自下組的多核苷酸序列編碼的多肽序列SEQ ID NO :230,SEQ ID NO :232、 SEQ ID NO 234 和 SEQ ID NO :238。在一個實施方案中，免疫綴合物包含與序列SEQ ID NO :257或SEQ ID NO :261至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的重鏈可變區(qū)序列。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含與序列SEQ ID NO 259或SEQ ID NO :271至少約80%、 85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的輕鏈可變區(qū)序列。在又一個實施方案中，免疫綴合物包含與序列SEQ ID NO :257或SEQ ID NO :261至少約80%、85%、90%、 95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的重鏈可變區(qū)序列，和與序列SEQ ID NO :259或 SEQ ID 而271至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的輕鏈可變區(qū)序列。在一個實施方案中，免疫綴合物包含由與序列SEQ ID NO :258或SEQ ID NO :262 至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列編碼的重鏈可變區(qū)序列。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO :258或SEQ ID NO :262編碼的重鏈可變區(qū)序列。在一個實施方案中，免疫綴合物包含由與序列SEQ ID NO :260 或 SEQ ID NO :272 至少約 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或 99%相同的多核苷酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)序列。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO 260或SEQ ID NO :272編碼的輕鏈可變區(qū)序列。在一個實施方案中，免疫綴合物包含與序列SEQ ID NO :251或SEQ ID NO :255至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的多肽序列。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含與序列SEQ ID NO :253或SEQ ID NO :265至少約80%、85%、 90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%相同的多肽序列。在又一個實施方案中，免疫綴合物包含與序列 SEQ ID NO :251 或 SEQ ID NO :255 至少約 80%、85%、90%、95%、96%、 97%、98%、99%、或100%相同的多肽序列，和與序列SEQ ID NO :253或SEQ ID NO :265至少約 80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^ 100%相同的多肽序列。在一個實施方案中，免疫綴合物包含由與序列SEQ ID NO :252或SEQ ID NO :256 至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列編碼的多肽序列。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO :252或SEQ ID NO :256編碼的多肽序列。在一個實施方案中，免疫綴合物包含由與SEQ ID NO :2 或SEQ ID NO :266至少約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的多核苷酸序列編碼的多肽序列。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQ ID NO :2 或 SEQ ID NO :266編碼的多肽序列。在另一個實施方案中，免疫綴合物包含至少一個效應(yīng)器模塊，其中所述效應(yīng)器模塊是細(xì)胞因子。在一個具體的實施方案中，效應(yīng)器模塊是選自下組的細(xì)胞因子白介素-2(IL-2)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-a (INF-a)、白介素-12(IL_12)、白介素-8(IL-8)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白_1 a (MIP-1 a )、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1β (ΜΙΡ-1 β)和轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β)。在另一個實施方案中，至少一個抗原結(jié)合模塊對下列一種抗原決定簇是特異性的纖連蛋白的額外域B(EDB)、生腱蛋白的Al域 (TNC-A1)、生腱蛋白的A2域(TNC-A》、成纖維細(xì)胞激活蛋白(FAP)；和黑素瘤硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的免疫綴合物以比對照效應(yīng)器模塊的解離常數(shù)大至少約 1、1· 5、2、2· 5、3、3· 5、4、4· 5、5、5· 5、6、6· 5、7、7· 5、8、8. 5、9、9· 5 或 10 倍的解離常
數(shù)(Kd)結(jié)合效應(yīng)器模塊受體。在另一個實施方案中，免疫綴合物在施用期結(jié)束時在體內(nèi)將腫瘤體積增加抑制至少約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 或更多。在另一個實施方案中，相對于對照效應(yīng)器模塊或“雙抗體(diabody)”免疫綴合物(immimoconjugate)分子中的效應(yīng)器模塊，在對有此需要的哺乳動物施用時免疫綴合物將患有惡性腫瘤的哺乳動物的存活延長至少約10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、 80%、90%。本發(fā)明的另一方面涉及編碼本發(fā)明的免疫綴合物或其片段的分離的多核苷酸。本發(fā)明的另一方面涉及包含含有本發(fā)明的多核苷酸序列的表達(dá)盒的表達(dá)載體。本發(fā)明的另一方面涉及表達(dá)本發(fā)明的免疫綴合物或其片段的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一方面涉及用于生成本發(fā)明的免疫綴合物或其片段的方法，其中該方法包括在適合于其表達(dá)的條件下培養(yǎng)用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體編碼本發(fā)明的免疫綴合物或片段。本發(fā)明的另一方面涉及用于促進(jìn)活化的T淋巴細(xì)胞細(xì)胞中的增殖和分化的方法， 包括使活化的T淋巴細(xì)胞細(xì)胞與有效量的本發(fā)明的免疫綴合物接觸。本發(fā)明的另一方面涉及用于促進(jìn)活化的B淋巴細(xì)胞細(xì)胞中的增殖和分化的方法， 包括使活化的B淋巴細(xì)胞細(xì)胞與有效量的本發(fā)明的免疫綴合物接觸。本發(fā)明的另一方面涉及用于促進(jìn)天然殺傷(NK)細(xì)胞中的增殖和分化的方法，包括使NK細(xì)胞與有效量的本發(fā)明的免疫綴合物接觸。本發(fā)明的另一方面涉及用于促進(jìn)粒細(xì)胞、單核細(xì)胞或樹突細(xì)胞中的增殖和分化的方法，包括使粒細(xì)胞、單核細(xì)胞或樹突細(xì)胞與有效量的本發(fā)明的免疫綴合物接觸。本發(fā)明的另一方面涉及用于促進(jìn)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)分化的方法，包括使 T淋巴細(xì)胞細(xì)胞與有效量的本發(fā)明的免疫綴合物接觸。本發(fā)明的另一方面涉及用于抑制病毒復(fù)制的方法，包括使病毒感染的細(xì)胞與有效量的本發(fā)明的免疫綴合物接觸。本發(fā)明的另一方面涉及用于上調(diào)主要組織相容性復(fù)合體I (MHC I)表達(dá)的方法，包括使靶細(xì)胞與有效量的本發(fā)明的免疫綴合物接觸。本發(fā)明的另一方面涉及用于誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法，包括對靶細(xì)胞施用有效量的本發(fā)明的免疫綴合物。本發(fā)明的另一方面涉及用于誘導(dǎo)靶細(xì)胞中的趨化性的方法，包括對靶細(xì)胞施用有效量的本發(fā)明的免疫綴合物。本發(fā)明的另一方面涉及用于治療個體中的疾病的方法，包括對個體施用治療有效量的包含本發(fā)明的免疫綴合物和藥用載體的組合物的步驟。附圖簡述

圖1 各種免疫綴合物融合形式的示意圖。圖1中的所有構(gòu)建體包含兩個抗體scFv 片段(在抗原結(jié)合模塊(antigen binding moiety)中)和一個或兩個與其連接的細(xì)胞因子分子(作為效應(yīng)器模塊(effector moiety))。小圖A至E顯示了抗原結(jié)合模塊和效應(yīng)器模塊的不同連接和化學(xué)計量學(xué)。小圖A)描繪了“雙抗體(diabody) ”-IL_2融合物?！半p抗體”自兩個相同的多肽鏈非共價裝配。小圖B顯示了一種免疫綴合物，該免疫綴合物包含在其羧基端處與細(xì)胞因子融合的Fab分子的重鏈，所述細(xì)胞因子繼而在其羧基端處與第二 Fab重鏈融合。共表達(dá)輕鏈與重鏈Fab-細(xì)胞因子-重鏈Fab多肽以形成免疫綴合物?；?br> 22者，可以將兩條輕鏈與細(xì)胞因子融合，并共表達(dá)重鏈。在小圖C中，彼此直接融合兩個Fab 重鏈。細(xì)胞因子與第二抗原結(jié)合模塊重鏈共享氨基端肽鍵。小圖B和C的兩個分子形式可以改變?yōu)槭沟糜胹cFv片段替換Fab鏈，如小圖D和E中所顯示的。圖2 包含兩個抗原結(jié)合模塊和至少一個或多個效應(yīng)器模塊的其它免疫綴合物的示意圖。小圖A顯示了經(jīng)由其羧基端與IgG CH3域融合的Fab分子。為了實現(xiàn)共價抗原結(jié)合模塊同二聚化，可以在IgG CH3域的羧基端處引入人工二硫鍵(在小圖A內(nèi)右側(cè)的免疫綴合物)。可以用IgE CH4域替換小圖A中所顯示的IgGl CH3域。用小圖B中的scFv片段替換小圖A中的Fab模塊。對于小圖C的免疫綴合物，將天然的IgG鉸鏈在Fab分子的 C端融合。因為鉸鏈的羧基端區(qū)可以對IgG鉸鏈區(qū)C端融合的恒定域裝配強加一些幾何學(xué)約束，所以可以在鉸鏈的羧基端區(qū)與IgG CH3域的氨基端間引入人工接頭。也可以在scFv 片段與免疫球蛋白恒定域間引入鉸鏈區(qū)，如小圖D中所顯示的。在小圖A至D中，使用IgGl CH3或IgE CH4域來使構(gòu)建體同二聚化。小圖E描繪了一種免疫綴合物，其中經(jīng)由CHI/Ck 異二聚化相互作用來實現(xiàn)二聚化。小圖D的免疫綴合物可以具有每個免疫綴合物一個或兩個細(xì)胞因子。圖3呈現(xiàn)了用對腫瘤基質(zhì)基質(zhì)特異性的兩種不同白介素-2免疫綴合物分子形式的功效實驗的結(jié)果。將F9畸胎瘤皮下注射入U9SvEv小鼠中，并使用測徑器來測量腫瘤大小。在兩個不同濃度比較“雙抗體”-IL-2分子與Fab-白介素-2-Fab(Fab-IL2-Fab)免疫綴合物，其中濃度反映相似數(shù)目的免疫綴合物分子。在圖3中，F(xiàn)ab-IL2-Fab免疫綴合物標(biāo)記為“Fab-L19”，未偶聯(lián)的白介素-2對照標(biāo)記為“Unconj rIL_2”，“雙抗體”-IL-2分子標(biāo)記為“雙抗體”。使用針對纖連蛋白的額外域B (EDB)的L19抗體來生成雙抗體和Fab-L19免疫綴合物兩者中的抗原結(jié)合模塊。在圖示中標(biāo)示了每只小鼠注射的免疫綴合物量(Wyg 計)。圖4呈現(xiàn)了用對腫瘤基質(zhì)基質(zhì)特異性的兩種不同白介素-2免疫綴合物分子形式的存活實驗的結(jié)果。將人胃腫瘤細(xì)胞系LS174T脾內(nèi)注射入SCID-米色小鼠中。在圖4 中，F(xiàn)ab-IL2-Fab免疫綴合物標(biāo)記為“Fab_L19”，未綴合的白介素_2對照標(biāo)記為“Unconj rIL-2”，“雙抗體” -IL-2分子標(biāo)記為“雙抗體”。使用抗-EDB抗體L19來生成雙抗體和 Fab-LlQ免疫綴合物兩者中的抗原結(jié)合模塊。在圖示中標(biāo)示了每只小鼠注射的免疫綴合物量(以μ g計)，并且反映免疫綴合物分子的相同數(shù)目。圖5顯示了 100X和400X放大率的人子宮組織的免疫組織化學(xué)圖像。通過實施例 3中所描述的方法生成的2B10可變區(qū)結(jié)合人生腱蛋白(tenascin)的A2域(TNC-A2)。融合Fab片段中的2B10可變區(qū)與FLAG片段(SHD2B10-FLAG)。制備健康的和癌性的人子宮組織樣品以進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。隨后，將樣品與SHD2B10-FLAG Fab片段一起溫育。然后，將樣品清洗，并與對FLAG表位特異性的熒光抗體一起溫育。與健康組織樣品相比，癌性組織樣品展現(xiàn)出更高的TNC-A2表達(dá)水平。圖6顯示了按％免疫熒光表面積計的各種人組織樣品中的TNC-A2表達(dá)水平。將來自健康個體和癌癥患者的各種人組織樣品與SHD2B10-FLAG Fab片段一起溫育，如圖5中所描述的。圖7顯示了按％免疫熒光表面積計的各種人組織樣品中的成纖維細(xì)胞激活蛋白 (FAP)表達(dá)水平。將來自健康個體和癌癥患者的各種人組織樣品與針對FAP的商業(yè)抗體(Abeam) 一起溫育。圖上的每個柱形的頂部部分代表FAP的腫瘤表達(dá)，而圖上的每個柱形的底部部分代表正常的FAP表達(dá)。圖8呈現(xiàn)了顯示已知的IgG抗體L19對EDB的親和力的BIAC0RE數(shù)據(jù)。圖9呈現(xiàn)了顯示對EDB特異性的Fab-IL-2-Fab免疫綴合物的親和力的BIAC0RE 數(shù)據(jù)。免疫綴合物中的Fab片段自L19抗體衍生。圖10呈現(xiàn)了顯示對EDB特異性的“雙抗體”-IL2融合蛋白的親和力的BIAC0RE數(shù)據(jù)。雙抗體scFv片段自L19抗體衍生?！半p抗體”-IL2融合蛋白包含位于scFv片段與IL-2 分子間的8個氨基酸的接頭。圖11呈現(xiàn)了顯示對EDB特異性的“雙抗體”-IL2融合蛋白的親和力的BIAC0RE數(shù)據(jù)。雙抗體scFv片段自L19抗體衍生?！半p抗體”-IL2融合蛋白包含位于scFv片段與IL-2 分子間的12個氨基酸的接頭。圖12呈現(xiàn)了顯示已知的IgG抗體F16對固定化的生腱蛋白域Al (TNC-Al)的親和力的BIAC0RE數(shù)據(jù)。圖12還呈現(xiàn)了顯示F16抗體的Fab片段對TNC-Al的親和力的BIAC0RE 數(shù)據(jù)。圖中標(biāo)示了對F16IgG和Fab分子計算的解離常數(shù)(Kd)。圖13呈現(xiàn)了顯示IL-2對固定化的IL-2受體的親和力的BIAC0RE數(shù)據(jù)。通過將相應(yīng)的鏈與人IgGlFc部分的“突出-入-穴”變體融合來實現(xiàn)IL-2R的β和γ鏈的異二聚化，如記載于 Merchant，A.M.等，Nat. Biotech. 16 :677-681 (1998)的。圖中標(biāo)示了自 BIAC0RE數(shù)據(jù)計算的Kd值。圖14呈現(xiàn)了顯示“雙抗體”-IL-2融合蛋白對TNC-Al和IL_2受體的親和力的 BIAC0RE數(shù)據(jù)?？贵w中的scFv分子自F16抗體衍生。圖中標(biāo)示了自BIAC0RE數(shù)據(jù)計算的Kd值。圖15呈現(xiàn)了顯示Fab-IL-2-Fab免疫綴合物對TNC-Al和IL_2受體的親和力的 BIAC0RE數(shù)據(jù)。免疫綴合物中的Fab分子自F16抗體衍生。圖中標(biāo)示了自BIAC0RE數(shù)據(jù)計算的Kd值。圖16呈現(xiàn)了顯示scFv-IL-2-scFv免疫綴合物對TNC-A1和IL-2受體的親和力的 BIAC0RE數(shù)據(jù)。免疫綴合物中的scFv分子自F16抗體衍生。圖中標(biāo)示了自BIAC0RE數(shù)據(jù)計算的Kd值。圖17是自圖12-16中呈現(xiàn)的BIAC0RE研究獲得的Kd值的匯總表。圖18呈現(xiàn)了比較靶向纖連蛋白的EDB域的“雙抗體”-IL-2分子與靶向生腱蛋白 C A2域的Fab-白介素-2-Fab免疫綴合物(標(biāo)記為“Fab_SH2B10”，其包含分別為SEQ ID NO 3和7的重和輕鏈可變區(qū))的功效實驗的結(jié)果。在圖18中，未綴合的白介素-2對照標(biāo)記為“Unconj rIL-2”，“雙抗體” -IL-2分子標(biāo)記為“L19雙抗體”。使用抗EDB抗體L19來生成雙抗體免疫綴合物中的抗原結(jié)合模塊。將畸胎瘤細(xì)胞系F9皮下注射入1 系的有免疫能力小鼠中。圖示中標(biāo)示了每只小鼠注射的免疫綴合物量(以Pg計)。在第6天開始處理，并總共實施5次注射，直至實驗的第11天。圖19顯示了與未綴合的人IL-2相比，抗FAP、或抗生腱蛋白C、Fab-IL2-Fab免疫綴合物(使用3F2、3D9、4B3 (抗-FAP)、2F11和2B10構(gòu)建體(抗生腱蛋白C)的Vh和Vl序列生成)對NK-92細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)。在溫育兩天后使用CellTiter Glo系統(tǒng)來測量細(xì)胞增殖。
圖20呈現(xiàn)了測量與未綴合的細(xì)胞因子，或在分開的分子中含有IL-12的p35和 P40域的免疫綴合物相比，各種含有白介素12的免疫綴合物對IFN- γ生成的誘導(dǎo)的ELISA 測定法的結(jié)果。小圖A顯示了經(jīng)纖連蛋白包被的板上的結(jié)果。小圖B顯示了溶液中的結(jié)果。圖21顯示了對親和力成熟的抗FAP Fab片段的基于表面等離振子共振(SPR)的動力學(xué)分析。對結(jié)合人(hu)FAP(A)和鼠(mu)FAP(B)的克隆19G1，對結(jié)合hu FAP(C)、mu FAP(D)的克隆20G8及對結(jié)合hu FAP(E)和mu FAP(F)的克隆4B9呈現(xiàn)了加工的動力學(xué)數(shù)據(jù)集。平滑線代表數(shù)據(jù)對1 1相互作用模型的全局?jǐn)M合。圖22顯示了對親和力成熟的抗FAP Fab片段的基于SPR的動力學(xué)分析。對結(jié)合 hu FAP(A)和mu FAP(B)的克隆5B8，對結(jié)合hu FAP (C) ,mu FAP(D)的克隆5F1及對結(jié)合hu FAP(E)和mu FAP(F)的克隆14B3呈現(xiàn)了加工的動力學(xué)數(shù)據(jù)集。平滑線代表數(shù)據(jù)對1 1 相互作用模型的全局?jǐn)M合。圖23顯示了對親和力成熟的抗FAP Fab片段的基于SI5R的動力學(xué)分析。對結(jié)合 hu FAP(A)和 mu FAP(B)的克隆 16F1，對結(jié)合 hu FAP(C)、mu FAP(D)的克隆 16F8 及對結(jié)合hu FAP(E)和mu FAP(F)的克隆03C9呈現(xiàn)了加工的動力學(xué)數(shù)據(jù)集。平滑線代表數(shù)據(jù)對 11相互作用模型的全局?jǐn)M合。圖M顯示了對親和力成熟的抗FAP Fab片段的基于SI5R的動力學(xué)分析。對結(jié)合 hu FAP(A)和 mu FAP(B)的克隆 02D7，對結(jié)合 hu FAP(C)、mu FAP (D), cyno FAP(E)的克隆 28H1及對結(jié)合hu FAP(F)、mu FAP(G)和獼猴(cyno) FAP (H)的克隆22A3呈現(xiàn)了加工的動力學(xué)數(shù)據(jù)集。平滑線代表數(shù)據(jù)對1 1相互作用模型的全局?jǐn)M合。圖25顯示了對親和力成熟的抗FAP Fab片段的基于SPR的動力學(xué)分析。對結(jié)合 hu FAP(A)、mu FAP(B)、cyno FAP(C)的克隆 ^Bll,及對結(jié)合 FAP (D)、mu FAP(E)和 cyno FAP(F)的克隆23C10呈現(xiàn)了加工的動力學(xué)數(shù)據(jù)集。平滑線代表數(shù)據(jù)對1 1相互作用模型的全局?jǐn)M合。圖沈顯示了對親和力成熟的結(jié)合人(hu) TNC A2的抗TNC A2Fab片段的基于SI3R 的動力學(xué)分析。對克隆2B10_C3B6(A)、克隆2B10_6A12(B)、克隆2B10_C3A6(C)、克隆2B10_ 07D8(D)、克隆2B10_01F7(E)和克隆2B10_6H10 (F)呈現(xiàn)了加工的動力學(xué)數(shù)據(jù)集。平滑線代表數(shù)據(jù)對11相互作用模型的全局?jǐn)M合。圖27給出了為了純化基于3F2的Fab-IL2-Fab而實施的三個純化步驟的概述。圖觀顯示了來自基于3F2的Fab-IL2-Fab的純化的結(jié)果(A和B)和來自基于 4G8 的 Fab-IL2-Fab 的純化的結(jié)果(C 禾口 D)。(A,C) 4-12% Bis-Tris 和 3-8% Tris 乙酸鹽 SDS-PAGE及純化規(guī)程期間的級分和終產(chǎn)物。(B，D)三個應(yīng)用的純化步驟后的分析用大小排阻層析。圖四顯示了來自2B10 Fab-IL2-Fab免疫綴合物的純化的結(jié)果。(A)4_12% Bis-Tris SDS-PAGE及純化規(guī)程期間的級分和終產(chǎn)物。B)三個應(yīng)用的純化步驟后的分析用大小排阻層析。圖30顯示了基于抗纖連蛋白EDB L19的Fab-IL2-Fab的穩(wěn)定性評估。將 L19Fab-IL2-Fab以濃度6. 3mg/ml在20mM鹽酸組氨酸、140mM NaCl，pH6. 0中配制，并于室溫及于4°C貯存4周。每周通過UV分光術(shù)對樣品分析(A)濃度(在離心以使?jié)撛诘某恋砦镔|(zhì)沉淀后)并通過分析用大小排阻層析來測定(B)聚集物含量。
圖31顯示了對針對人、鼠和獼猴(cyno)FAP和人IL-2受體- β / Y (IL2R bg)的 FAP靶向性3F2 Fab-IL2-Fab免疫綴合物的基于SPR的動力學(xué)分析，如通過表面等離振子共振測定的。平滑線代表數(shù)據(jù)對1 1相互作用模型的全局?jǐn)M合。圖32顯示了對針對人、鼠和獼猴(cyno) FAP的FAP靶向性4G8Fab_IL2_Fab免疫綴合物的基于SI^R的動力學(xué)分析，如通過表面等離振子共振測定的。平滑線代表數(shù)據(jù)對1 1 相互作用模型的全局?jǐn)M合。圖33顯示了對針對人和鼠IL-2受體β / Y和α鏈的FAP靶向性4G8Fab_IL2_Fab 構(gòu)建體的基于SPR的動力學(xué)分析，如通過表面等離振子共振測定的。平滑線代表數(shù)據(jù)對兩態(tài)反應(yīng)模型的全局?jǐn)M合。圖34顯示了對針對人、鼠和獼猴(cyno)FAP和人IL-2受體- β / Y (IL2R bg)的 FAP靶向性3D9 Fab-IL2-Fab構(gòu)建體的基于SPR的動力學(xué)分析，如通過表面等離振子共振測定的。平滑線代表數(shù)據(jù)對1 1相互作用模型的全局?jǐn)M合。圖35顯示了對針對人、鼠和獼猴(cyno)嵌合TNC A2融合蛋白和人IL-2受體-β / Y (IL2R bg)的TNC A2靶向性2B10Fab_IL2_Fab構(gòu)建體的基于SPR的動力學(xué)分析，如通過表面等離振子共振測定的。平滑線代表數(shù)據(jù)對1 1相互作用模型的全局?jǐn)M合。圖36顯示了與IL-2(Pr0leukin)和識別纖連蛋白-EDB的L19雙抗體相比，識別 TNC A2(2B10)或FAP(3F2和4G8)的靶向性IL-2Fab_IL2_Fab免疫綴合物在誘導(dǎo)NK92細(xì)胞增殖中的功效。相對于IL-2分子的數(shù)目對χ-軸進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，因為雙抗體具有兩個IL-2 效應(yīng)器模塊，而Fab-IL2-Fab構(gòu)建體僅含有一個IL-2效應(yīng)器模塊。在溫育2天后使用 CellTiter Glo系統(tǒng)來測量細(xì)胞增殖。圖37顯示了在溶液中，與識別不同的效應(yīng)器細(xì)胞群體上的FAP的FAP靶向性基于 4G8 的 IL-2 Fab-IL2-Fab 免疫綴合物(FAP-targeted 4G8_based IL-2Fab_IL2_Fab immunoconjugate) 一起溫育后，由于IL-2介導(dǎo)的IL-2受體信號傳導(dǎo)所致的STAT5磷酸化誘導(dǎo)，所述不同的效應(yīng)器細(xì)胞群體來自人PBMC，包括(A)⑶56+NK細(xì)胞、(B)⑶4+⑶25TD127+ 輔助T細(xì)胞、(C)⑶3+，⑶8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞和⑶⑶4+CD25+F0XP3+調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Tregs)。圖38顯示了在免疫綴合物存在于溶液中或者經(jīng)由微量滴定板上包被的FAP或TNC A2 固定化時，與 IL-2 相比識另Ij TNC A1(2F11)、TNC A2(2B10)或 FAP (3F2、4B3 禾口 3D9)的靶向性IL-2Fab-IL2-Fab免疫綴合物在誘導(dǎo)IFN-γ釋放和ΝΚ92細(xì)胞增殖中的功效。圖39呈現(xiàn)了用對腫瘤基質(zhì)特異性的兩種不同IL-2免疫綴合物分子形式的存活實驗的結(jié)果。將人結(jié)腸腫瘤細(xì)胞系LS174T脾內(nèi)注射入SCID小鼠中。TNCA2靶向性2Β10 Fab-IL2-Fab免疫綴合物標(biāo)記為“SH2B10”，未綴合的IL-2對照標(biāo)記為“Proleukin”，纖連蛋白EDB靶向性雙抗體-IL-2分子標(biāo)記為“雙抗體”。在圖示中標(biāo)示了每只小鼠注射的免疫綴合物量(以μ g計)，并且反映了免疫綴合物分子的相同數(shù)目。圖40呈現(xiàn)了用對腫瘤基質(zhì)特異性的兩種不同IL-2免疫綴合物分子形式的存活實驗的結(jié)果。將人腎細(xì)胞系A(chǔ)CHN腎內(nèi)注射入SCID小鼠中。FAP靶向性3F2或4G8Fab-IL2-Fab 免疫綴合物標(biāo)記為“FAP-3F2”和“FAP-4G8”，未綴合的IL-2對照標(biāo)記為“Proleukin”，纖連蛋白EDB靶向性雙抗體-IL-2分子標(biāo)記為“雙抗體”。在圖示中標(biāo)示了每只小鼠注射的免疫綴合物量(以μ g計)，并且反映免疫綴合物分子的相同數(shù)目。圖41呈現(xiàn)了用對腫瘤基質(zhì)特異性的兩種不同IL-2免疫綴合物分子形式的存活實驗的結(jié)果。將人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549i. ν注射入SCID小鼠中。TNC A2靶向性2B10 Fab-IL2-Fab免疫綴合物標(biāo)記為“2B10”，纖連蛋白EDB靶向性雙抗體-IL-2分子標(biāo)記為“雙抗體”。在圖示中標(biāo)示了每只小鼠注射的免疫綴合物量(以μ g計)，并且反映了免疫綴合物分子的相同數(shù)目。圖42呈現(xiàn)了㈧具有L19(纖連蛋白胞外域-B結(jié)合劑)作為Fab的 Fab-GM-CSF-Fab免疫綴合物的純化規(guī)程的概述，和(B)純化的Fab-GM-CSF-Fab免疫綴合物的SDS-PAGE (還原性、非還原性)。圖43呈現(xiàn)了比較GM-CSF與具有L19 (纖連蛋白胞外域-B結(jié)合劑)作為Fab的純化的Fab-GM-CSF-Fab免疫綴合物對TF-T細(xì)胞的影響的GM-CSF依賴性增殖測定法的結(jié)果。圖44呈現(xiàn)了(A)具有4G8 (FAP結(jié)合劑)作為Fab的Fab-IL12-Fab免疫綴合物的純化規(guī)程的概述，和(B)純化的Fab-IL12-Fab免疫綴合物的SDS-PAGE(還原性、非還原性)。圖45呈現(xiàn)了測試IL-12誘導(dǎo)的IFN- γ釋放，比較IL-12和具有4G8 (FAP結(jié)合劑) 作為Fab的純化的Fab-IL12-Fab免疫綴合物的效果，使用自健康供體的新鮮人血液分離的 PBMC的測定法的結(jié)果。圖46呈現(xiàn)了㈧具有L19(纖連蛋白胞外域-B結(jié)合劑)作為Fab的 Fab-IFNa 2-Fab免疫綴合物的純化規(guī)程的概述，和(B)純化的Fab-IFN a 2_Fab免疫綴合物的SDS-PAGE (還原性、非還原性)。圖47呈現(xiàn)了測試IFN- α誘導(dǎo)的對(A) Jurkat T細(xì)胞和(B) A549腫瘤細(xì)胞的增殖抑制比較IFN-α (Roferon A, Roche)和具有L19 (纖連蛋白胞外域-B結(jié)合劑)作為Fab的純化的Fab-IFNa 2-Fab免疫綴合物的效果的測定法的結(jié)果。圖48顯示了(A)來自純化MCSP靶向性基于MHLG的Fab_IL2_Fab的洗脫概況和 (B)來自通過 SDS-PAGE (NuPAGE Novex Bis-Tris 迷你凝膠，hvitrogen，MOPS 運行緩沖液， 還原性和非還原性)對相同F(xiàn)ab-IL2-Fab的分析表征的結(jié)果。圖49顯示了(A)來自純化MCSP靶向性基于MHLGl的Fab_IL2_Fab的洗脫概況和 (B)來自通過 SDS-PAGE (NuPAGE Novex Bis-Tris 迷你凝膠，hvitrogen，MOPS 運行緩沖液， 還原性和非還原性)對相同F(xiàn)ab-IL2-Fab的分析表征的結(jié)果。圖50呈現(xiàn)了測試IL-2誘導(dǎo)的IFN- γ釋放，比較具有4G8 (FAP結(jié)合劑)作為Fab 的純化的Fab-IL2-Fab免疫綴合物與具有MHLG KV9 (MCSP結(jié)合劑)作為Fab的純化的 Fab-IL2-Fab免疫綴合物的效果，使用IL-2饑餓的NK92細(xì)胞的測定法的結(jié)果。圖51呈現(xiàn)了測試IL-2誘導(dǎo)的IFN- γ釋放，比較具有4G8 (FAP結(jié)合劑)作為Fab 的純化的Fab-IL2-Fab免疫綴合物與具有MHLGl KV9 (MCSP結(jié)合劑)作為Fab的純化的 Fab-IL12-Fab免疫綴合物的效果，使用IL-2饑餓的NK92細(xì)胞的測定法的結(jié)果。圖52顯示了 MCSP靴向性MHLGl KV9 Fab_IL2_Fab免疫綴合物對Colo38細(xì)胞的結(jié)合，如通過流式細(xì)胞術(shù)測定的。顯示了單獨的二抗或僅細(xì)胞作為陰性對照。圖 53 呈現(xiàn)了(A)具有 2B10 (TNC A2 結(jié)合劑)作為 Fab 的 2B10 Fab_IL2_Fab 免疫綴合物的純化規(guī)程的概述，和(B)純化的2B10 Fab-IL2-Fab免疫綴合物的SDS-PAGE (還原性，非還原性)。發(fā)明詳述
定義除非另有定義，本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語一般與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的通常理解具有相同的意義。一般地，本文中所使用的命名和下文所描述的細(xì)胞培養(yǎng)、 分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)和雜交中的實驗室規(guī)程是本領(lǐng)域中公知且通常采用的。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和規(guī)程一般依照遍及本文件提供的本領(lǐng)域常規(guī)方法和各種一般參考文獻(xiàn)(一般見Sambrook 等 Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 第 2 版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，N. Y.，通過提及而將其收入本文)實施。如本文中所使用的，術(shù)語“免疫綴合物”指包含至少一個效應(yīng)器模塊和至少一個抗原結(jié)合模塊的多肽分子。在一個實施方案中，免疫綴合物包含至少一個單鏈效應(yīng)器模塊和至少兩個抗原結(jié)合模塊?？乖Y(jié)合分子可以通過多種相互作用并以多種構(gòu)象與效應(yīng)器模塊連接，如本文中所描述的。如本文中所使用的，術(shù)語“效應(yīng)器模塊”指例如經(jīng)由信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或其它細(xì)胞途徑影響細(xì)胞活性的多肽，例如蛋白質(zhì)或糖蛋白。因而，本發(fā)明的效應(yīng)器模塊可以與受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)關(guān)聯(lián)，所述受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)自細(xì)胞膜外部轉(zhuǎn)送信號以調(diào)控攜帶一種或多種效應(yīng)器模塊受體的細(xì)胞中的應(yīng)答。在一個實施方案中，效應(yīng)器模塊可以引發(fā)攜帶一種或多種效應(yīng)器模塊受體的細(xì)胞中的細(xì)胞毒性應(yīng)答。在另一個實施方案中，效應(yīng)器模塊可以引發(fā)攜帶一種或多種效應(yīng)器模塊受體的細(xì)胞中的增殖應(yīng)答。在另一個實施方案中，效應(yīng)器模塊可以引發(fā)攜帶效應(yīng)器模塊受體的細(xì)胞中的分化。在另一個實施方案中，效應(yīng)器模塊可以改變攜帶效應(yīng)器模塊受體的細(xì)胞中的內(nèi)源細(xì)胞蛋白質(zhì)的表達(dá)(即，上調(diào)或下調(diào))。效應(yīng)器模塊的非限制性例子包括細(xì)胞因子、生長因子、激素、酶、底物和輔因子。效應(yīng)器模塊可以以多種結(jié)構(gòu)與抗原結(jié)合模塊結(jié)合以形成免疫綴合物。如本文中所使用的，術(shù)語“細(xì)胞因子”指介導(dǎo)和/或調(diào)節(jié)生物學(xué)或細(xì)胞功能或過程(例如，免疫、炎癥和造血)的分子。如本文中所使用的，術(shù)語“細(xì)胞因子”包括“淋巴因子”、“趨化因子”、“單核因子”和“白介素”。有用的細(xì)胞因子的例子包括但不限于GM-CSF、 IL-I α、IL-I β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN- α、IFN- β、 IFN- γ、MIP-I α、MIP-I β、TGF- β、TNF- α 禾口 TNF- β。如本文中所使用的，術(shù)語“單鏈”指包含通過肽鍵線性連接的氨基酸單體的分子。 在一個實施方案中，效應(yīng)器模塊是單鏈效應(yīng)器模塊。單鏈效應(yīng)器模塊的非限制性例子包括細(xì)胞因子、生長因子、激素、酶、底物和輔因子。在效應(yīng)器模塊是細(xì)胞因子并且感興趣的細(xì)胞因子在自然界中通常以多聚體找到時，多聚體細(xì)胞因子的每個亞基由效應(yīng)器模塊的單鏈序貫編碼。因而，有用的單鏈效應(yīng)器模塊的非限制性例子包括GM-CSF、IL-Ia、IL-I β、 IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β,IFN-y,MIP-I α、 MIP-I β、TGF- β、TNF- α 禾口 TNF- β。如本文中所使用的，術(shù)語“對照效應(yīng)器模塊”指未綴合的效應(yīng)器模塊。例如，在比較本發(fā)明的IL-2免疫綴合物與對照效應(yīng)器模塊時，對照效應(yīng)器模塊是游離的、未綴合的 IL-2。同樣地，例如在比較本發(fā)明的IL-12免疫綴合物與對照效應(yīng)器模塊時，對照效應(yīng)器模塊是游離的、未綴合的IL_12(例如以異二聚體蛋白質(zhì)存在，其中ρ40和ρ35亞基僅共享二硫鍵))。如本文中所使用的，術(shù)語“效應(yīng)器模塊受體”指能夠特異性結(jié)合效應(yīng)器模塊的多肽分子。例如，在IL-2是效應(yīng)器模塊的情況中，結(jié)合IL-2(例如，包含IL-2的免疫綴合物) 的效應(yīng)器模塊受體是IL-2受體。相似地，例如在IL-12是免疫綴合物的效應(yīng)器模塊的情況中，效應(yīng)器模塊受體是IL-12受體。在效應(yīng)器模塊特異性結(jié)合超過一種受體的情況中，特異性結(jié)合效應(yīng)器模塊的所有受體是針對所述效應(yīng)器模塊的“效應(yīng)器模塊受體”。如本文中所使用的，術(shù)語“抗原結(jié)合模塊”指特異性結(jié)合抗原決定簇的多肽分子。 在一個實施方案中，抗原結(jié)合模塊能夠?qū)⑵涓街膶嶓w(例如，效應(yīng)器模塊或第二抗原結(jié)合模塊)引導(dǎo)至靶部位，例如攜帶抗原決定簇的腫瘤細(xì)胞或腫瘤基質(zhì)的特定類型?？乖Y(jié)合模塊包括抗體及其片段，如本文中進(jìn)一步限定的?！疤禺愋越Y(jié)合”意指結(jié)合對于抗原而言是選擇性的，并且可以與不想要的或非特異性相互作用區(qū)別。在一個實施方案中，免疫綴合物包含至少一個，通常兩個或更多個具有恒定區(qū)的抗原結(jié)合模塊，如本文中進(jìn)一步限定的且在本領(lǐng)域中已知的。有用的重鏈恒定區(qū)包括5種同種型之任一 α、δ、ε、Y、或μ。有用的輕鏈恒定區(qū)包括2種同種型之任一 κ和λ。如本文中所使用的，術(shù)語“抗原決定簇”與“抗原”和“表位”是同義的，并且指多肽大分子上與抗原結(jié)合模塊結(jié)合，形成抗原結(jié)合模塊-抗原復(fù)合物的位點(例如，氨基酸的連續(xù)區(qū)段或由不連續(xù)的氨基酸的不同區(qū)域構(gòu)成的構(gòu)象結(jié)構(gòu))。如本文中所使用的，術(shù)語“對照抗原結(jié)合模塊”指在其會存在時沒有其它抗原結(jié)合模塊和效應(yīng)器模塊的抗原結(jié)合模塊。例如，在比較本發(fā)明的Fab-IL2-Fab免疫綴合物與對照抗原結(jié)合模塊時，對照抗原結(jié)合模塊是游離的Fab，其中Fab-IL2-Fab免疫綴合物和游離的Fab分子都能特異性結(jié)合同一抗原決定簇。如本文中所使用的，使用就抗原結(jié)合模塊、效應(yīng)器模塊等而言的術(shù)語“第一”和“第二”以在存在超過一個每種類型的模塊時方便區(qū)別。使用這些術(shù)語并不意圖賦予免疫綴合物的特定次序或取向，除非明確如此規(guī)定。在本領(lǐng)域內(nèi)使用和/或接受的術(shù)語有兩個或更多個定義的情況中，如本文中所使用的，術(shù)語的定義意圖包括所有此類意義，除非明確相反地規(guī)定。一個具體的例子是使用術(shù)語“互補決定區(qū)”(“CDR”)來描述重和輕多肽兩者的可變區(qū)內(nèi)找到的非連續(xù)抗原結(jié)合位點。此特定的區(qū)域已經(jīng)由Kabat等,U. S. D印t. of Health and Human Services,"Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) R ^ Chothia φ, J. Mol. Biol. 196 901-917(1987)(通過提及而將它們收入本文)描述，其中該定義包括在彼此比較時氨基酸殘基的交疊或子集。然而，任一個定義指抗體或其變體的CDR的應(yīng)用意圖在該術(shù)語的范圍內(nèi)，如本文中定義并使用的。涵蓋如由上文所引用的每篇參考文獻(xiàn)定義的CDR的合適的氨基酸殘基在下文在表I中列出作為比較。涵蓋特定CDR的精確殘基數(shù)目會隨CDR的序列和大小而有所變化。鑒于抗體的可變區(qū)氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)地確定哪些殘基構(gòu)成特定的CDR。表1:CDR 定義權(quán)利要求
1.一種免疫綴合物，其包含(a)至少第一單鏈效應(yīng)器模塊；和(b)第一和第二抗原結(jié)合模塊，其獨立選自下組Fv和Fab，其中所述第一效應(yīng)器模塊與所述第一抗原結(jié)合模塊共享氨基或羧基端肽鍵；且其中所述第二抗原結(jié)合模塊與i)所述第一效應(yīng)器模塊或ii)所述第一抗原結(jié)合模塊共享氨基或羧基端肽鍵。
2.權(quán)利要求1的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物基本上由通過一個或多個接頭序列連接的第一效應(yīng)器模塊和第一和第二抗原結(jié)合模塊組成。
3.權(quán)利要求1或2的免疫綴合物，其中所述第一和第二抗原結(jié)合模塊之每個是Fab分子。
4.權(quán)利要求3的免疫綴合物，其中所述第一Fab分子在其重或輕鏈羧基端氨基酸處與所述第二 Fab分子的重或輕鏈的氨基端氨基酸連接。
5.權(quán)利要求4的免疫綴合物，其中所述第二Fab分子在其重或輕鏈羧基端氨基酸處與所述效應(yīng)器模塊的氨基端氨基酸連接。
6.權(quán)利要求4的免疫綴合物，其中所述效應(yīng)器模塊在其羧基端氨基酸處與所述第一 Fab分子的氨基端氨基酸連接。
7.權(quán)利要求3的免疫綴合物，其中所述第一Fab分子在其重或輕鏈羧基端與所述效應(yīng)器模塊的氨基端氨基酸連接。
8.權(quán)利要求7的免疫綴合物，其中所述效應(yīng)器模塊在其羧基端氨基酸處與所述第二 Fab分子的重或輕鏈的末端氨基酸連接。
9.一種免疫綴合物，該免疫綴合物包含在其氨基端氨基酸處與一個或多個scFv分子連接的第一單鏈效應(yīng)器模塊，且其中所述第一單鏈效應(yīng)器模塊在其羧基端氨基酸處與一個或多個scFv分子連接。
10.一種免疫綴合物，其包含a)至少第一單鏈效應(yīng)器模塊；和b)第一和第二抗原結(jié)合模塊，其中每個所述抗原結(jié)合模塊包含在其羧基端氨基酸處與包含免疫球蛋白恒定域的恒定區(qū)連接的scFv分子，所述免疫球蛋白恒定域獨立選自下組 IgG CHl、IgG Ck 和 IgE CH4 ；其中所述第一抗原結(jié)合模塊在其恒定區(qū)羧基端氨基酸處與所述第一效應(yīng)器模塊的氨基端氨基酸連接；且其中所述第一和第二抗原結(jié)合模塊經(jīng)由至少一個二硫鍵共價連接。
11.權(quán)利要求10的免疫綴合物，其中每個所述抗原結(jié)合模塊包含在其羧基端氨基酸處與包含IgG CHl域的恒定區(qū)連接的scFv分子。
12.權(quán)利要求10的免疫綴合物，其中每個所述抗原結(jié)合模塊包含在其羧基端氨基酸處與包含IgE CH4域的恒定區(qū)連接的scFv分子。
13.權(quán)利要求10的免疫綴合物，其中每個所述抗原結(jié)合模塊包含在其羧基端氨基酸處與包含IgG Ck域的恒定區(qū)連接的scFv分子。
14.權(quán)利要求10的免疫綴合物，其中所述第一抗原結(jié)合模塊包含在其羧基端氨基酸處與包含IgG CHl域的恒定區(qū)連接的scFv分子，且其中所述第二抗原結(jié)合模塊包含在其羧基端氨基酸處與包含IgG Ck域的恒定區(qū)連接的scFv分子。
15.一種免疫綴合物，其包含a)至少第一單鏈效應(yīng)器模塊；和b)第一和第二抗原結(jié)合模塊，其中每個所述抗原結(jié)合模塊包含在其羧基端氨基酸處與 IgG CH3域連接的scFv分子；其中所述第一抗原結(jié)合模塊在其羧基端氨基酸處與所述第一效應(yīng)器模塊的氨基端氨基酸連接；且其中所述第一和第二抗原結(jié)合模塊經(jīng)由至少一個二硫鍵共價連接。
16.權(quán)利要求10-15中任一項的免疫綴合物，其中所述第一抗原結(jié)合模塊的恒定區(qū)經(jīng)由至少一個二硫鍵與所述第二抗原結(jié)合模塊的恒定區(qū)共價連接。
17.權(quán)利要求16的免疫綴合物，其中所述第一抗原結(jié)合模塊的免疫球蛋白域經(jīng)由二硫鍵與所述第二抗原結(jié)合模塊的免疫球蛋白域共價連接。
18.權(quán)利要求16的免疫綴合物，其中至少一個二硫鍵位于所述第一和第二抗原結(jié)合模塊的免疫球蛋白域的羧基端。
19.權(quán)利要求16的免疫綴合物，其中至少一個二硫鍵位于所述第一和第二抗原結(jié)合模塊的免疫球蛋白域的氨基端。
20.權(quán)利要求19的免疫綴合物，其中至少兩個二硫鍵位于所述第一和第二抗原結(jié)合模塊的免疫球蛋白域的氨基端。
21.權(quán)利要求10的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物進(jìn)一步包含第二效應(yīng)器模塊，且其中所述第二抗原結(jié)合模塊在其恒定區(qū)羧基端氨基酸處與所述第二效應(yīng)器模塊的氨基端氨基酸連接。
22.一種免疫綴合物，其包含a)第一和第二單鏈效應(yīng)器模塊；和b)第一和第二抗原結(jié)合模塊，其中每個所述抗原結(jié)合模塊包含在其重或輕鏈羧基端氨基酸處與IgGl CH3域連接的Fab分子；其中每個所述IgGl CH3域在其羧基端氨基酸處與所述效應(yīng)器模塊之一的氨基端氨基酸連接；且其中所述第一和第二抗原結(jié)合模塊經(jīng)由至少一個二硫鍵共價連接。
23.權(quán)利要求22的免疫綴合物，其中所述IgGlCH3域通過單一二硫鍵連接。
24.權(quán)利要求22或權(quán)利要求23的免疫綴合物，其中至少一個二硫鍵位于所述第一和第二抗原結(jié)合模塊的所述IgGl CH3域的羧基端。
25.權(quán)利要求22或權(quán)利要求23的免疫綴合物，其中至少一個二硫鍵位于所述第一和第二抗原結(jié)合模塊的所述IgGl CH3域的氨基端。
26.權(quán)利要求25的免疫綴合物，其中至少兩個二硫鍵位于所述第一和第二抗原結(jié)合模塊的所述IgGl CH3域的氨基端。
27.權(quán)利要求116中任一項的免疫綴合物，其中蛋白水解切割位點位于所述抗原結(jié)合模塊和所述效應(yīng)器模塊間。
28.權(quán)利要求116中任一項的免疫綴合物，其中所述第一和第二抗原結(jié)合模塊的可變區(qū)對同一抗原是特異性的。
29.權(quán)利要求116中任一項的免疫綴合物，其中所述第一和第二抗原結(jié)合模塊的可變區(qū)對不同抗原是特異性的。
30.權(quán)利要求觀的免疫綴合物，其中所述第一和第二抗原結(jié)合模塊對纖連蛋白的額外域B(EDB)是特異性的。
31.權(quán)利要求四的免疫綴合物，其中所述第一或所述第二抗原結(jié)合模塊對纖連蛋白的額外域B(EDB)是特異性的。
32.權(quán)利要求30或權(quán)利要求31的免疫綴合物，其中對EDB特異性的所述一個或兩個抗原結(jié)合模塊與單克隆抗體L19競爭對EDB表位的結(jié)合。
33.權(quán)利要求30或權(quán)利要求32的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含多肽序列SEQ ID NO :95。
34.權(quán)利要求30或權(quán)利要求32的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由與SEQID NO 108具有至少80%同一性的多核苷酸序列編碼的多肽序列。
35.權(quán)利要求34的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQID NO 108編碼的多肽序列。
36.權(quán)利要求30或權(quán)利要求32的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含多肽序列SEQ ID NO :104ο
37.權(quán)利要求30或權(quán)利要求32的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由與SEQID NO 117具有至少80%同一性的多核苷酸序列編碼的多肽序列。
38.權(quán)利要求37的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQID NO 117編碼的多肽序列。
39.權(quán)利要求30或權(quán)利要求32的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含多肽序列SEQ ID NO :105。
40.權(quán)利要求30或權(quán)利要求32的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由與SEQID NO 118具有至少80%同一性的多核苷酸序列編碼的多肽序列。
41.權(quán)利要求40的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQID NO 118編碼的多肽序列。
42.權(quán)利要求30或權(quán)利要求32的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含多肽序列SEQ ID NO :106。
43.權(quán)利要求30或權(quán)利要求32的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由與SEQID NO 119具有至少80%同一性的多核苷酸序列編碼的多肽序列。
44.權(quán)利要求43的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQID NO 119編碼的多肽序列。
45.權(quán)利要求30或權(quán)利要求32的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含多肽序列SEQ ID NO :107。
46.權(quán)利要求30或權(quán)利要求32的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由與SEQID NO 120具有至少80%同一性的多核苷酸序列編碼的多肽序列。
47.權(quán)利要求46的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQID NO 120編碼的多肽序列。
48.權(quán)利要求30或權(quán)利要求32的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含多肽序列SEQID NO :96。
49.權(quán)利要求30至32中任一項的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由與SEQID NO 109具有至少80%同一性的多核苷酸序列編碼的多肽序列。
50.權(quán)利要求49的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQID NO 109編碼的多肽序列。
51.權(quán)利要求33-47中任一項的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物進(jìn)一步包含多肽序列 SEQ ID NO :96ο
52.權(quán)利要求觀的免疫綴合物，其中所述第一和第二抗原結(jié)合模塊對生腱蛋白的Al域 (TNC-Al)是特異性的。
53.權(quán)利要求四的免疫綴合物，其中所述第一或所述第二抗原結(jié)合模塊對生腱蛋白的 Al域(TNC-Al)是特異性的。
54.權(quán)利要求52或53的免疫綴合物，其中對TNC-Al特異性的所述一個或兩個抗原結(jié)合模塊與單克隆抗體F16競爭對TNC-Al表位的結(jié)合。
55.權(quán)利要求52或權(quán)利要求M的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含多肽序列SEQ ID NO :99。
56.權(quán)利要求52或權(quán)利要求M的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由與SEQID NO 112具有至少80%同一性的多核苷酸序列編碼的多肽序列。
57.權(quán)利要求56的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQID NO 112編碼的多肽序列。
58.權(quán)利要求52或權(quán)利要求M的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含多肽序列SEQ ID NO :100。
59.權(quán)利要求52或權(quán)利要求M的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由與SEQID NO 113具有至少80%同一性的多核苷酸序列編碼的多肽序列。
60.權(quán)利要求59的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQID NO 113編碼的多肽序列。
61.權(quán)利要求52至M中任一項的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含多肽序列SEQ ID NO :101。
62.權(quán)利要求52至M中任一項的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由與SEQID NO 114具有至少80%同一性的多核苷酸序列編碼的多肽序列。
63.權(quán)利要求62的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQID NO 114編碼的多肽序列。
64.權(quán)利要求58至60中任一項的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物進(jìn)一步包含多肽序列 SEQ ID NO :101ο
65.權(quán)利要求52的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含多肽序列SEQID NO :215。
66.權(quán)利要求52的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由與SEQID NO :216具有至少80%同一性的多核苷酸序列編碼的多肽序列。
67.權(quán)利要求66的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQID NO 216編碼的多肽序列。
68.權(quán)利要求52或53的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含多肽序列SEQID NO 235。
69.權(quán)利要求52或53的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由與SEQID NO :236具有至少80%同一性的多核苷酸序列編碼的多肽序列。
70.權(quán)利要求69的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQID NO 236編碼的多肽序列。
71.權(quán)利要求65至67中任一項的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物進(jìn)一步包含多肽序列 SEQ ID NO :235ο
72.權(quán)利要求52或權(quán)利要求53的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含重鏈可變區(qū)序列 SEQ ID NO 13 或 SEQ ID NO :15。
73.權(quán)利要求52或權(quán)利要求53的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含輕鏈可變區(qū)序列 SEQ ID NO 9 或 SEQ ID NO :11。
74.權(quán)利要求72的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物進(jìn)一步包含輕鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO 9 或 SEQ ID NO :11。
75.權(quán)利要求72的免疫綴合物，其中所述重鏈可變區(qū)序列由與SEQID NO 14或SEQ ID NO 16具有至少80%同一性的多核苷酸序列編碼。
76.權(quán)利要求75的免疫綴合物，其中所述重鏈可變區(qū)序列由多核苷酸序列SEQID NO 14 或 SEQ ID NO: 16 編碼。
77.權(quán)利要求73的免疫綴合物，其中所述輕鏈可變區(qū)序列由與SEQID N0:10或SEQ ID NO 12具有至少80%同一性的多核苷酸序列編碼。
78.權(quán)利要求77的免疫綴合物，其中所述輕鏈可變區(qū)序列由多核苷酸序列SEQID NO 10 或 SEQ ID NO 12 編碼。
79.權(quán)利要求觀的免疫綴合物，其中所述第一和第二抗原結(jié)合模塊對生腱蛋白的A2域 (TNC-A2)是特異性的。
80.權(quán)利要求四的免疫綴合物，其中所述第一或所述第二抗原結(jié)合模塊對生腱蛋白的 A2域(TNC-A2)是特異性的。
81.權(quán)利要求79或80的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含選自下組的重鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO 7, SEQ ID NO :179，SEQ ID NO :183，SEQ ID NO :187，SEQ ID NO :191， SEQ ID NO :195, SEQ ID NO :199，SEQ ID NO :203 和 SEQ ID NO :207。
82.權(quán)利要求79或80的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含選自下組的輕鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5 ；SEQ ID NO :177，SEQ ID NO :181，SEQ ID NO :185，SEQ ID NO :189, SEQ ID NO :193，SEQ ID NO :197，SEQ ID NO :201 和 SEQ ID NO :205。
83.權(quán)利要求81的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物進(jìn)一步包含選自下組的輕鏈可變區(qū)序歹Ij =SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 5 ；SEQ ID NO 177, SEQ ID NO 181, SEQ ID NO 185, SEQ ID NO :189, SEQ ID NO :193，SEQ ID NO :197，SEQ ID NO :201，SEQ ID NO :205。
84.權(quán)利要求81的免疫綴合物，其中所述重鏈可變區(qū)序列由與選自下組的序列具有至少80% 同一性的多核苷酸序列編碼SEQ ID N0:8，SEQ ID NO =180, SEQ ID NO =184, SEQ ID NO :188, SEQ ID NO :192, SEQ ID NO :196, SEQ ID NO :200, SEQ ID NO :204 和 SEQ ID NO 208。
85.權(quán)利要求84的免疫綴合物，其中所述重鏈可變區(qū)序列由選自下組的多核苷酸序列編碼SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 180, SEQ ID NO 184, SEQ ID NO 188, SEQ ID NO 192, SEQ ID NO :196, SEQ ID NO :200，SEQ ID NO :204 和 SEQ ID NO :208。
86.權(quán)利要求82的免疫綴合物，其中所述輕鏈可變區(qū)序列由與選自下組的序列具有至少 80% 同一性的多核苷酸序列編碼SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :6，SEQ ID NO :178，SEQ ID NO :182,SEQ ID NO 186,SEQ ID NO 190,SEQ ID NO 194,SEQ ID NO 198,SEQ ID NO :202 和 SEQ ID NO :206ο
87.權(quán)利要求86的免疫綴合物，其中所述輕鏈可變區(qū)序列由選自下組的多核苷酸序列編碼SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :6，SEQ ID NO :178，SEQ ID NO :182，SEQ ID NO :186，SEQ ID NO :190, SEQ ID NO :194，SEQ ID NO :198，SEQ ID NO :202 和 SEQ ID NO :206。
88.權(quán)利要求79的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含選自下組的多肽序列SEQ ID NO :SEQ ID NO :239, SEQ ID NO :241 和 SEQ ID NO :243。
89.權(quán)利要求79的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由與選自下組的序列具有至少80%同一性的多核苷酸編碼的多肽序列=SEQ ID NO 240, SEQ ID NO :242和SEQ ID NO: 244。
90.權(quán)利要求89的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由選自下組的多核苷酸序列編碼的多肽序歹Ij :SEQ ID NO 240、SEQ ID NO :242 和 SEQ ID NO :244。
91.權(quán)利要求79或80的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含選自下組的多肽序列 SEQ ID NO :245, SEQ ID NO :247 和 SEQ ID NO :249。
92.權(quán)利要求79或80的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由與選自下組的序列具有至少80%同一性的多核苷酸編碼的多肽序列SEQ ID NO 246, SEQ ID NO :248和SEQ ID NO :250。
93.權(quán)利要求92的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由選自下組的多核苷酸序列編碼的多肽序歹Ij :SEQ ID NO :246, SEQ ID NO :248 和 SEQ ID NO :250。
94.權(quán)利要求88至90中任一項的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物進(jìn)一步包含選自下組的多月太序列SEQ ID NO :245, SEQ ID NO :247 禾口 SEQ ID NO :249。
95.權(quán)利要求觀的免疫綴合物，其中所述第一和第二抗原結(jié)合模塊對成纖維細(xì)胞激活蛋白(FAP)是特異性的。
96.權(quán)利要求四的免疫綴合物，其中所述第一或所述第二抗原結(jié)合模塊對成纖維細(xì)胞激活蛋白(FAP)是特異性的。
97.權(quán)利要求95或96的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含選自下組的重鏈可變區(qū)序歹Ij =SEQ ID NO :21, SEQ ID NO :25，SEQ ID NO :27，SEQ ID NO :31，SEQ ID NO :35，SEQ ID NO 39, SEQ ID NO :43，SEQ ID NO :47，SEQ ID NO :51，SEQ ID NO :69，SEQ ID NO :73， SEQ ID NO77, SEQ ID NO:81，SEQ ID NO :85，SEQ ID NO:89，SEQ ID NO :93，SEQ ID NO 123，SEQ ID NO :127，SEQ ID NO :131，SEQ ID NO :135，SEQ ID NO :139，SEQ ID NO :143， SEQ ID NO :147, SEQ ID NO 151, SEQ ID NO 155, SEQ ID NO 159, SEQ ID NO 163, SEQ ID NO :167, SEQ ID NO :171 和 SEQ ID NO :175。
98.權(quán)利要求95或96的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含選自下組的輕鏈可變區(qū)序歹Ij =SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :19，SEQ ID NO :23，SEQ ID NO :29，SEQ ID NO :33，SEQ ID NO 37, SEQ ID NO :41，SEQ ID NO :45，SEQ ID NO :49，SEQ ID NO :67，SEQ ID NO :71，SEQ ID NO75,SEQ ID NO :79，SEQ ID NO:83，SEQ ID NO :87，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO 121，SEQ ID NO :125，SEQ ID NO :129，SEQ ID NO :133，SEQ ID NO :137，SEQ ID NO :141， SEQ ID NO :145, SEQ ID NO 149, SEQ ID NO 153, SEQ ID NO 157, SEQ ID NO 161, SEQ ID NO :165, SEQ ID NO :169 和 SEQ ID NO :173。
99.權(quán)利要求97的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物進(jìn)一步包含選自下組的輕鏈可變區(qū)序歹Ij =SEQ ID NO :17, SEQ ID NO :19，SEQ ID NO :23，SEQ ID NO :29，SEQ ID NO :33，SEQ ID NO 37, SEQ ID NO :41，SEQ ID NO :45，SEQ ID NO :49，SEQ ID NO :67，SEQ ID NO :71， SEQ ID NO75,SEQ ID NO :79，SEQ ID NO:83，SEQ ID NO :87，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO 121，SEQ ID NO :125，SEQ ID NO :129，SEQ ID NO :133，SEQ ID NO :137，SEQ ID NO :141， SEQ ID NO :145, SEQ ID NO 149, SEQ ID NO 153, SEQ ID NO 157, SEQ ID NO 161, SEQ ID NO :165, SEQ ID NO :169 和 SEQ ID NO :173。
100.權(quán)利要求97的免疫綴合物，其中所述重鏈可變區(qū)序列由與選自下組的序列具有至少 80% 同一性的多核苷酸序列編碼=SEQ ID NO :22，SEQ ID NO :26，SEQ ID NO :28，SEQ ID NO 32, SEQ ID NO :36，SEQ ID NO AO, SEQ ID NO :44，SEQ ID NO :48，SEQ ID NO :52， SEQ ID NO 70, SEQ ID NO :74，SEQ ID NO :78，SEQ ID NO :82，SEQ ID NO :86，SEQ ID NO 90，SEQ ID NO :94，SEQ ID NO :124，SEQ ID NO :128，SEQ ID NO :132，SEQ ID NO :136，SEQ ID NO :140,SEQ ID NO 144,SEQ ID NO 148,SEQ ID NO 152,SEQ ID NO 156,SEQ ID NO: 160，SEQ ID NO :164，SEQ ID NO :168，SEQ ID NO :172 和 SEQ ID NO :176。
101.權(quán)利要求100的免疫綴合物，其中所述重鏈可變區(qū)序列由選自下組的多核苷酸序列編碼:SEQ ID NO 22, SEQ ID NO :26，SEQ ID NO :28，SEQ ID NO :32，SEQ ID NO :36，SEQ ID NO 40, SEQ ID NO :44，SEQ ID NO :48，SEQ ID NO :52，SEQ ID NO :70，SEQ ID NO :74， SEQ ID NO 78, SEQ ID NO :82，SEQ ID NO :86，SEQ ID NO :90，SEQ ID NO :94，SEQ ID NO 124，SEQ ID NO :128，SEQ ID NO :132，SEQ ID NO :136，SEQ ID NO :140，SEQ ID NO :144， SEQ ID NO :148, SEQ ID NO 152, SEQ ID NO 156, SEQ ID NO 160, SEQ ID NO 164, SEQ ID NO :168, SEQ ID NO :172 和 SEQ ID NO :176。
102.權(quán)利要求98的免疫綴合物，其中所述輕鏈可變區(qū)序列由與選自下組的序列具有至少 80% 同一性的多核苷酸序列編碼=SEQ ID NO :18，SEQ ID NO :20，SEQ ID NO :24，SEQ ID NO 30, SEQ ID NO :34，SEQ ID NO :38，SEQ ID NO :42，SEQ ID NO :46，SEQ ID NO :50， SEQ ID NO 68, SEQ ID NO -J2, SEQ ID NO :76，SEQ ID NO :80，SEQ ID NO :84，SEQ ID NO 88，SEQ ID NO :92，SEQ ID NO :122，SEQ ID NO :126，SEQ ID NO :130，SEQ ID NO :134，SEQ ID NO :138,SEQ ID NO 142,SEQ ID NO 146,SEQ ID NO 150,SEQ ID NO 154,SEQ ID NO: 158，SEQ ID NO :162，SEQ ID NO :166，SEQ ID NO :170 和 SEQ ID NO :174。
103.權(quán)利要求102的免疫綴合物，其中所述輕鏈可變區(qū)序列由選自下組的多核苷酸序列編碼:SEQ ID NO :18, SEQ ID NO :20，SEQ ID NO :24，SEQ ID NO :30，SEQ ID NO :34，SEQ ID NO 38, SEQ ID NO :42，SEQ ID NO :46，SEQ ID NO :50，SEQ ID NO :68，SEQ ID NO -J2, SEQ ID NO 76, SEQ ID NO :80，SEQ ID NO :84，SEQ ID NO :88，SEQ ID NO :92，SEQ ID NO 122，SEQ ID NO :126，SEQ ID NO :130，SEQ ID NO :134，SEQ ID NO :138，SEQ ID NO :142， SEQ ID NO :146, SEQ ID NO 150, SEQ ID NO 154, SEQ ID NO 158, SEQ ID NO 162, SEQ ID NO :166, SEQ ID NO :170 和 SEQ ID NO :174。
104.權(quán)利要求95的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含選自下組的多肽序列SEQ ID NO :209,SEQ ID N0:211，SEQ ID NO :213,SEQ ID NO :217,SEQ ID NO :219,SEQ ID NO: 221，SEQ ID NO :223, SEQ ID NO :225 和 SEQ ID NO :227。
105.權(quán)利要求95的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由與選自下組的序列具有至少80%同一性的多核苷酸編碼的多肽序列=SEQ ID N0:210，SEQ ID N0:212，SEQ ID NO: 214，SEQ ID NO :218, SEQ ID NO :220, SEQ ID NO :222, SEQ ID NO :224, SEQ ID NO :226 和 SEQ ID NO :228。
106.權(quán)利要求105的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由選自下組的多核苷酸序列編碼的多肽序列SEQ ID NO :210, SEQ ID N0:212，SEQ ID NO :214, SEQ ID NO :218, SEQ ID NO :220, SEQ ID NO :222, SEQ ID NO :224, SEQ ID NO :226 和 SEQ ID NO :228。
107.權(quán)利要求95或96的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含選自下組的多肽序列 SEQ ID N0:229、SEQ ID NO: 231、SEQ ID NO :233 禾口 SEQ ID NO :237。
108.權(quán)利要求95或96的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由與選自下組的序列具有至少80%同一性的多核苷酸序列編碼的多肽序列SEQ ID N0:230、SEQ ID NO :232、 SEQ ID NO 234 和 SEQ ID NO :238。
109.權(quán)利要求108的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由選自下組的多核苷酸序列編碼的多肽序歹Ij :SEQ ID NO :230, SEQ ID NO 232, SEQ ID NO:2;34 禾口 SEQ ID NO :238。
110.權(quán)利要求95的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含選自由SEQID NO :211、SEQ ID NO 219和SEQ ID NO :221組成的組的多肽序列，以及多肽序列SEQ ID NO :231。
111.權(quán)利要求95的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含選自由SEQID NO :209、SEQ ID NO :223,SEQ ID NO :225和SEQ ID NO :227組成的組的多肽序列，以及多肽序列SEQ ID NO :229。
112.權(quán)利要求95的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含多肽序列SEQID NO :213和多肽序歹Ij SEQ ID NO :2330
113.權(quán)利要求95的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含多肽序列SEQID NO :217和多肽序歹Ij SEQ ID NO :2370
114.權(quán)利要求觀的免疫綴合物，其中所述第一和第二抗原結(jié)合模塊對黑素瘤硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)是特異性的。
115.權(quán)利要求四的免疫綴合物，其中所述第一或所述第二抗原結(jié)合模塊對黑素瘤硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)是特異性的。
116.權(quán)利要求114或115的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含重鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO 257 或 SEQ ID NO :261。
117.權(quán)利要求114或115的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含輕鏈可變區(qū)序列SEQ ID NO 259 或 SEQ ID NO :271。
118.權(quán)利要求116的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物進(jìn)一步包含輕鏈可變區(qū)序列 SEQ ID NO 259 或 SEQ ID NO :271。
119.權(quán)利要求116的免疫綴合物，其中所述重鏈可變區(qū)序列由與序列SEQID NO :258 或SEQ ID NO :262具有至少80%同一性的多核苷酸序列編碼。
120.權(quán)利要求119的免疫綴合物，其中所述重鏈可變區(qū)序列由多核苷酸序列SEQIDNO 258 或 SEQ ID NO :262 編碼。
121.權(quán)利要求117的免疫綴合物，其中所述輕鏈可變區(qū)序列由與序列SEQID NO :260 或SEQ ID NO :272具有至少80%同一性的多核苷酸序列編碼。
122.權(quán)利要求121的免疫綴合物，其中所述輕鏈可變區(qū)序列由多核苷酸序列SEQID NO 260 或 SEQ ID NO :272 編碼。
123.權(quán)利要求114的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含多肽序列SEQID NO :251 或 SEQ ID NO :255ο
124.權(quán)利要求114的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由與SEQID NO :252或SEQ ID NO 256具有至少80%同一性的多核苷酸編碼的多肽序列。
125.權(quán)利要求124的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQID NO 252或SEQ ID NO :256編碼的多肽序列。
126.權(quán)利要求114或115的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含多肽序列SEQID NO 253 或 SEQ ID NO :265。
127.權(quán)利要求114或115的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由與SEQID NO 2M或SEQ ID NO :266具有至少80%同一性的多核苷酸編碼的多肽序列。
128.權(quán)利要求127的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物包含由多核苷酸序列SEQID NO :2 或SEQ ID NO :266編碼的多肽序列。
129.權(quán)利要求123-125中任一項的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物進(jìn)一步包含多肽序歹Ij SEQ ID NO 253 或 SEQ ID NO :265。
130.權(quán)利要求1- 中任一項的免疫綴合物，其中所述第一和第二抗原結(jié)合模塊的可變區(qū)對癌細(xì)胞或病毒感染的細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原或?qū)δ[瘤中表達(dá)的ECM分子是特異性的。
131.權(quán)利要求130的免疫綴合物，其中所述細(xì)胞表面抗原是腫瘤相關(guān)抗原或病毒抗原。
132.權(quán)利要求1-20中任一項的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物僅具有一個效應(yīng)器模塊；且其中所述效應(yīng)器模塊是細(xì)胞因子。
133.權(quán)利要求132的免疫綴合物，其中所述細(xì)胞因子選自下組白介素-2(IL-2)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素-a (INF-α)和白介素-12 (IL_12)。
134.權(quán)利要求133的免疫綴合物，其中所述細(xì)胞因子是IL-2。
135.權(quán)利要求133的免疫綴合物，其中所述細(xì)胞因子是IL-12。
136.權(quán)利要求132-135中任一項的免疫綴合物，其中所述細(xì)胞因子引發(fā)攜帶所述細(xì)胞因子受體的細(xì)胞的細(xì)胞毒性應(yīng)答。
137.權(quán)利要求132-135中任一項的免疫綴合物，其中所述細(xì)胞因子引發(fā)攜帶所述細(xì)胞因子受體的細(xì)胞的增殖應(yīng)答。
138.權(quán)利要求1或10-26中任一項的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物具有兩個效應(yīng)器模塊；且其中所述效應(yīng)器模塊是細(xì)胞因子。
139.權(quán)利要求138的免疫綴合物，其中每個所述細(xì)胞因子獨立選自下組IL-2、 GM-CSF、INF-α 和 IL—12。
140.權(quán)利要求139的免疫綴合物，其中所述細(xì)胞因子兩者都是IL-2。
141.權(quán)利要求139的免疫綴合物，其中所述細(xì)胞因子兩者都是IL-12。
142.權(quán)利要求138-141中任一項的免疫綴合物，其中所述細(xì)胞因子引發(fā)攜帶所述細(xì)胞因子受體的細(xì)胞的細(xì)胞毒性應(yīng)答。
143.權(quán)利要求138-141中任一項的免疫綴合物，其中所述細(xì)胞因子引發(fā)攜帶所述細(xì)胞因子受體的細(xì)胞的增殖應(yīng)答。
144.權(quán)利要求1-143中任一項的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物以比對照效應(yīng)器模塊的解離常數(shù)大至少2倍的解離常數(shù)(Kd)結(jié)合效應(yīng)器模塊受體。
145.權(quán)利要求1-144中任一項的免疫綴合物，其中所述免疫綴合物在施用期結(jié)束時在體內(nèi)將腫瘤體積增加抑制至少30%。
146.一種編碼權(quán)利要求1或2的免疫綴合物的片段的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼所述第一和第二抗原結(jié)合模塊的重鏈和所述第一效應(yīng)器模塊。
147.—種編碼權(quán)利要求1或2的免疫綴合物的片段的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼所述第一和第二抗原結(jié)合模塊的輕鏈和所述第一效應(yīng)器模塊。
148.一種編碼權(quán)利要求1或2的免疫綴合物的片段的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼來自所述第一抗原結(jié)合模塊的一條輕鏈、來自所述第二抗原結(jié)合模塊的一條重鏈和所述第一效應(yīng)器模塊。
149.一種編碼權(quán)利要求3-8中任一項的免疫綴合物的片段的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼所述第一和第二 Fab分子兩者的重鏈和所述效應(yīng)器模塊。
150.一種編碼權(quán)利要求3-8中任一項的免疫綴合物的片段的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼所述第一和第二 Fab分子兩者的輕鏈和所述效應(yīng)器模塊。
151.一種編碼權(quán)利要求3-8中任一項的免疫綴合物的片段的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼來自所述第一 Fab分子的一條輕鏈、來自所述第二 Fab分子的一條重鏈和所述效應(yīng)器模塊。
152.編碼權(quán)利要求9的免疫綴合物的分離的多核苷酸。
153.—種編碼權(quán)利要求10-20中任一項的免疫綴合物的片段的分離的多核苷酸，其中所述免疫綴合物僅具有一個效應(yīng)器模塊；且其中所述多核苷酸編碼所述抗原結(jié)合模塊之一和所述效應(yīng)器模塊。
154.一種編碼權(quán)利要求10-21中任一項的免疫綴合物的片段的分離的多核苷酸，其中所述免疫綴合物具有兩個效應(yīng)器模塊；且其中所述多核苷酸編碼所述抗原結(jié)合模塊之一和所述效應(yīng)器模塊之一。
155.—種編碼權(quán)利要求22-26中任一項的免疫綴合物的片段的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含編碼所述第一抗原結(jié)合模塊的重鏈可變區(qū)和所述第一效應(yīng)器模塊的序列。
156.—種編碼權(quán)利要求22-26中任一項的免疫綴合物的片段的分離的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含編碼所述第一抗原結(jié)合模塊的輕鏈可變區(qū)和所述第一效應(yīng)器模塊的序列。
157.一種表達(dá)盒，其包含權(quán)利要求146-156中任一項的多核苷酸序列。
158.—種表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求157的表達(dá)盒。
159.—種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求158的表達(dá)載體。
160.權(quán)利要求159的宿主細(xì)胞，其進(jìn)一步限定為原核宿主細(xì)胞。
161.權(quán)利要求159的宿主細(xì)胞，其進(jìn)一步限定為真核宿主細(xì)胞。
162.一種生成權(quán)利要求1-145中任一項的免疫綴合物的方法，其中該方法包括在適合于表達(dá)所述免疫綴合物的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求159-161中任一項的宿主細(xì)胞。
163.—種用于促進(jìn)活化的T淋巴細(xì)胞細(xì)胞中的增殖和分化的方法，包括使活化的T淋巴細(xì)胞與有效量的權(quán)利要求1-145中任一項的免疫綴合物接觸。
164.權(quán)利要求163的方法，其中所述免疫綴合物誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)活性。
165.一種用于促進(jìn)活化的B淋巴細(xì)胞細(xì)胞中的增殖和分化的方法，包括使活化的B淋巴細(xì)胞細(xì)胞與有效量的權(quán)利要求1-134、136-140、或142-145中任一項的免疫綴合物接觸。
166.一種用于促進(jìn)天然殺傷(NK)細(xì)胞中的增殖和分化的方法，包括使NK細(xì)胞與有效量的權(quán)利要求1-145中任一項的免疫綴合物接觸。
167.權(quán)利要求166的方法，其中所述免疫綴合物誘導(dǎo)NK/淋巴細(xì)胞活化的殺傷細(xì)胞 (LAK)的抗腫瘤細(xì)胞毒性。
168.權(quán)利要求163-167中任一項的方法，其中所述免疫綴合物的至少一個效應(yīng)器模塊是 IL-2。
169.一種用于促進(jìn)粒細(xì)胞、單核細(xì)胞或樹突細(xì)胞中的增殖和分化的方法，包括使粒細(xì)胞、單核細(xì)胞或樹突細(xì)胞與有效量的權(quán)利要求1-133、137-139、或143-145中任一項的免疫綴合物接觸。
170.權(quán)利要求169的方法，其中所述免疫綴合物的至少一個效應(yīng)器模塊是GM-CSF。
171.一種用于促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分化的方法，包括使T淋巴細(xì)胞細(xì)胞與有效量的權(quán)利要求1-145中任一項的免疫綴合物接觸。
172.權(quán)利要求163、166或171中任一項的方法，其中所述免疫綴合物的至少一個效應(yīng)器模塊是IL-12。
173.—種抑制病毒復(fù)制的方法，包括使病毒感染的細(xì)胞與有效量的權(quán)利要求1-133、 138、139、144、或145中任一項的免疫綴合物接觸。
174.—種上調(diào)主要組織相容性復(fù)合體I (MHC I)表達(dá)的方法，包括使細(xì)胞與有效量的權(quán)利要求1-133、138、139、144、或145中任一項的免疫綴合物接觸。
175.權(quán)利要求173或174中任一項的方法，其中所述免疫綴合物的至少一個效應(yīng)器模塊是IFN- α。
176.一種誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方法，包括對細(xì)胞施用有效量的權(quán)利要求1-132、136、138、 142、144、或145中任一項的免疫綴合物。
177.權(quán)利要求176的方法，其中所述免疫綴合物對EDB是特異性的。
178.權(quán)利要求176的方法，其中所述免疫綴合物對TNC-Al是特異性的。
179.權(quán)利要求176的方法，其中所述免疫綴合物對TNC-A2是特異性的。
180.權(quán)利要求176的方法，其中所述免疫綴合物對MCSP是特異性的。
181.權(quán)利要求176的方法，其中所述免疫綴合物的所述效應(yīng)器模塊選自下組IL-2、腫瘤壞死因子-α (TNF- α )和腫瘤壞死因子-β (TNF- β )。
182.權(quán)利要求181的方法，其中所述效應(yīng)器模塊是IL-2。
183.—種誘導(dǎo)靶細(xì)胞中的趨化性的方法，包括對靶細(xì)胞施用有效量的權(quán)利要求 1-132、138、144、或145中任一項的免疫綴合物。
184.權(quán)利要求183的方法，其中所述免疫綴合物的所述效應(yīng)器模塊選自下組白介素-8 (IL-8)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1 α (ΜΙΡ-1 α )、巨噬細(xì)胞炎性蛋白_1 β (ΜΙΡ-1 β )和轉(zhuǎn)化生長因子-β (TGF-β)。
185.權(quán)利要求163-184中任一項的方法，其中所述細(xì)胞在體內(nèi)。
186.—種治療個體中的疾病的方法，包括對所述個體施用治療有效量的包含權(quán)利要求 1-145中任一項的免疫綴合物的組合物的步驟。
187.權(quán)利要求186的方法，其中所述疾病是癌癥。
188.權(quán)利要求186或187的方法，其中所述免疫綴合物對EDB是特異性的。
189.權(quán)利要求186或187的方法，其中所述免疫綴合物對TNC-Al是特異性的。
190.權(quán)利要求186或187的方法，其中所述免疫綴合物對TNC-A2是特異性的。
191.權(quán)利要求186或187的方法，其中所述免疫綴合物對FAP是特異性的。
192.權(quán)利要求186或187的方法，其中所述免疫綴合物對MCSP是特異性的。
193.權(quán)利要求186至192中任一項的方法，其中所述免疫綴合物包含IL-2。
194.權(quán)利要求186至193中任一項的方法，其中靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、損傷內(nèi)、顱內(nèi)、前列腺內(nèi)、脾內(nèi)、腎內(nèi)、胸膜內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、表面、腫瘤內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、囊內(nèi)、粘膜、心包內(nèi)、臍帶內(nèi)、眼內(nèi)、口服、表面、局部、通過吸入、通過注射、通過輸注、通過連續(xù)輸注、通過直接浸泡靶細(xì)胞的局部灌注、經(jīng)由導(dǎo)管、 通過灌洗、在乳劑中、或在脂質(zhì)組合物中施用所述組合物。
195.—種組合物，其包含權(quán)利要求1-145中任一項的免疫綴合物和藥用載體。
196.權(quán)利要求1-145中任一項的免疫綴合物或權(quán)利要求195的組合物，其在制造用于治療有此需要的患者中的疾病的藥物中使用。
197.權(quán)利要求196的免疫綴合物，其中所述疾病是癌癥。
198.權(quán)利要求1-145中任一項的免疫綴合物或權(quán)利要求195的組合物用于制造用于治療有此需要的患者中的疾病的藥物中的用途。
199.權(quán)利要求198的用途，其中所述疾病是癌癥。
200.權(quán)利要求1-145中任一項的免疫綴合物，其用于治療有此需要的患者中的疾病。
201.權(quán)利要求200的免疫綴合物，其中所述疾病是癌癥。
202.如上文所描述的發(fā)明。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫綴合物。在具體的實施方案中，本發(fā)明涉及包含至少一個單鏈效應(yīng)器模塊和兩個或更多個抗原結(jié)合模塊的免疫綴合物。另外，本發(fā)明涉及編碼此類免疫綴合物的核酸分子、包含此類核酸分子的載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于生成本發(fā)明的免疫綴合物的方法，及在治療疾病中使用這些免疫綴合物的方法。
文檔編號A61K47/48GK102573922SQ201080046453
公開日2012年7月11日 申請日期2010年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月17日
發(fā)明者E.莫斯納, M.希拉奇-梅爾科, P.烏馬納, R.霍斯 申請人:羅切格利卡特公司