專利名稱：用于治療病毒性乙型肝炎的靶向小干擾rna制劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于治療病毒性乙型肝炎的靶向小干擾RNA制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(HBV)是嚴(yán)重?fù)p害人類健康的病毒性肝炎的重要致病因子之一。乙型病毒性肝炎在臨床上呈現(xiàn)各種不同的疾病類型，包括無癥狀攜帶狀態(tài)，急、慢性肝炎，重癥肝炎，肝硬化，最終可能發(fā)展為肝癌。目前干擾素是最常用的抗HBV藥物，在嚴(yán)格選擇適應(yīng)癥的患者中，有效率僅達(dá)30％～40％。核苷類似物未呈現(xiàn)明顯的臨床效果，且有明顯的毒性。
1965年Blumberg及其同事發(fā)現(xiàn)了澳大利亞抗原(Austril-ianantigen)，經(jīng)過一系列臨床觀察證明澳大利亞抗原就是乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)，這是最早發(fā)現(xiàn)的肝炎病毒抗原。1970年Dane發(fā)現(xiàn)了完整的HBV顆粒，稱之為Dane顆粒，直徑為42nm，含外膜和核心。HBV為雙鏈環(huán)狀DNA病毒。其外膜為糖脂蛋白結(jié)構(gòu)，約含25％脂質(zhì)和75％糖蛋白，糖蛋白主要成分為HBsAg。在電鏡下存在于血清中的HBsAg為直徑約22nm的小球形顆粒和管狀結(jié)構(gòu)。用去污劑破壞HBV的外膜，就可見到27nm的核心顆粒，由核心抗原(HBcAg)、e抗原(HBeAg)、DNA多聚酶(DNA-P)和乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)所組成。HBV-DNA含正鏈和負(fù)鏈，負(fù)鏈全長3200bp，包括HBV的全部基因，共4個開放讀碼框架(ORF)即S、C、P和X區(qū)，各ORF之間相互重疊。不同HBV之間存在著基因變異，即使在同一血清型的HBV之間，HBV基因的變異也達(dá)10.4％。HBV基因變異與病毒的致病性有關(guān)。近年來很多研究表明從重癥肝炎和慢性活動性肝炎患者中分離的HBV，其C區(qū)基因中均有基因點(diǎn)突變。由于這些突變改變了HBV的抗原成分，而激起了機(jī)體不同免疫反應(yīng)，使病情加重，病程遷延化。
RNAi技術(shù)(RNA干涉技術(shù))，簡言之，就是當(dāng)把21-23個核苷酸長的RNA片段(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞或組織中后，后者會使目的mRNA被切割為21-23核苷酸長的片段，從而降解mRNA，阻礙或阻止了由mRNA翻譯成相應(yīng)蛋白質(zhì)的過程。舉例說明，根據(jù)病毒復(fù)制相關(guān)的mRNA序列，設(shè)計21-23個核苷酸長的RNA片段(dsRNA)，當(dāng)病毒侵入生物體后，把dsRNA導(dǎo)入生物體，引起病毒復(fù)制相關(guān)的mRNA的降解，從而阻斷了病毒的復(fù)制，達(dá)到清除病毒的作用。
RNAi發(fā)現(xiàn)僅短短5年的時間，由于其高效性和高度特異性，RNAi成為頗為理想的細(xì)胞水平基因敲除工具，并迅速成為后基因組時代功能基因組學(xué)研究中不可或缺的重要手段。通過采取21 nt siRNA在哺乳動物細(xì)胞中誘導(dǎo)了強(qiáng)有力的特異性RNA干擾作用，這一突破性研究進(jìn)展開創(chuàng)了人類疾病治療的新天地，在AIDS等病毒感染性疾病治療中的應(yīng)用研究非常活躍和深入，并取得了令人鼓舞的成果。
在AIDS的治療上，RNA干擾可能成為對抗HIV病毒感染、復(fù)制的最有利方式。人們針對HIV生活周期的不同階段設(shè)計了多種siRNA，針對HIV病毒gag、tat、rev、nef等基因的siRNA可用以控制病毒復(fù)制，針對宿主細(xì)胞的表面HIV受體基因的siRNA可用以控制病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，抑制病毒的感染過程。RNAi技術(shù)除用于抗HIV研究以外，還用于抗其他多種病毒的探索。它們包括乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒(influenzavirus)、脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovirus)等。
2002年12月20日，Small RNA & RNAi被Science雜志評為年度十大科技成就之首，Nature雜志亦將Small RNA評為年度重大科技成果之一。RNA研究的突破性進(jìn)展，是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域近20年來，可與人類基因組計劃(human genomicsprogram，HGP)相提并論的最重大成果之一。RNAi最主要的功能在于可以調(diào)節(jié)和關(guān)閉基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的各種高級生命活動。人們對小RNA分子的深入研究必將大大推進(jìn)基因功能的研究，更為各種病毒性疾病和腫瘤等疾病的根治，開辟新的治療途徑。具有極其重要的理論和實(shí)際意義，它必將對生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。
多肽基因釋放系統(tǒng)中最早使用的是二油酰蜂毒肽(dioleoylmelittin)，與質(zhì)粒DNA形成環(huán)形顆粒，可有效地轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，建立了多肽轉(zhuǎn)基因載體的方法。堿性氨基酸多肽長度16～18氨基酸足以轉(zhuǎn)移DNA至細(xì)胞內(nèi)。陽離子多聚賴氨酸或精氨酸肽鏈壓縮DNA分子，最少需6到8個陽離子氨基酸殘基；添加半胱氨酸和組氨酸后可以增加轉(zhuǎn)染效率，如Cys-His-(Lys)(6)-His-Cys寡肽等。多肽載體是配體區(qū)、結(jié)合DNA的陽離子區(qū)、核定位信號區(qū)、兩性分子功能區(qū)，是四位一體的合成短肽。如THALWHT寡肽可特異結(jié)合氣道上皮，共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的THALWHT寡肽與細(xì)胞結(jié)合后，被吞入細(xì)胞內(nèi)；包含CTHALWHTC序列和DNA結(jié)合部分的合成多肽，能有效地將基因轉(zhuǎn)移到氣道上皮細(xì)胞內(nèi)。添加吞噬泡釋放劑、陽離子聚合物以及病毒的表面蛋白顆粒有助于提高轉(zhuǎn)染效率。多肽載體的優(yōu)勢在于可用多肽合成儀合成，便于體內(nèi)應(yīng)用和基因工程法生產(chǎn)，克服了配體寡肽與多聚賴氨酸或PEI偶聯(lián)制備的復(fù)雜性、不均一性以及系統(tǒng)誤差大的缺陷。多肽載體是非病毒載體小型化的趨勢。不足之處在于陽離子負(fù)荷相對偏少。
肝臟為靶器官的給藥系統(tǒng)能提高肝臟的藥物濃度，提高藥物對某些肝臟疾病的治療效果和降低毒副作用。目前，主要有如下幾種機(jī)制可以實(shí)現(xiàn)肝靶向藥物的傳輸1.含糖基的大分子化合物通過肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞去唾液酸糖蛋白受體或非實(shí)質(zhì)細(xì)胞(Kupffer細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)甘露糖受體介導(dǎo)途徑；2.聚陰離子化合物通過肝巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的清除介導(dǎo)途徑，如強(qiáng)陰離子化合物丁二酰脂蛋白，但弱聚陰離子化合物僅有很小程度的肝攝入；3.聚陽離子化合物在肝細(xì)胞膜上經(jīng)獨(dú)特的靜電作用途徑，如二乙胺葡聚糖與肝細(xì)胞膜產(chǎn)生靜電作用，使肝攝入增加；4.某些內(nèi)源性載體，利用其特異性、可溶性優(yōu)勢，包裹或攜帶藥物進(jìn)入肝組織，如類脂乳、膽酸、微球等。經(jīng)肝臟去唾液酸糖蛋白受體介導(dǎo)的給藥系統(tǒng)對肝有較高的親和性，且肝吸收迅速，在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中直接發(fā)揮作用，是目前最好的肝靶向的給藥途徑之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于治療病毒性乙型肝炎的靶向小干擾RNA制劑，治療效率高，毒副作用??；本發(fā)明的另一個目的在于提供其制備方法。
本發(fā)明治療病毒性乙型肝炎的靶向小干擾RNA制劑，由小干擾RNA、肝細(xì)胞靶向分子和核酸結(jié)合分子組成，能將小干擾RNA高效導(dǎo)入肝細(xì)胞或肝組織，使乙肝病毒(HBV)病毒的反轉(zhuǎn)錄酶失活，使HBV的Enhancer I核心區(qū)的功能喪失，降解HBV前基因組RNA，從而達(dá)到調(diào)控HBV基因及其表達(dá)的作用；也可抑制宿主細(xì)胞上HBV病毒的受體基因及肝損傷相關(guān)基因的表達(dá)。
本發(fā)明所述的小干擾RNA可以是化學(xué)合成的21-23堿基對的雙鏈RNA；也可以是表達(dá)載體或表達(dá)框架表達(dá)的21-23堿基對的雙鏈RNA，所述的表達(dá)載體或表達(dá)框架為RNA聚合酶III啟動子和RNA聚合酶III終止子調(diào)控小干擾RNA在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)，RNA聚合酶III啟動子包括人源或鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。
本發(fā)明所述的小干擾RNA可以是由作用于一個靶序列的單一小干擾RNA組成，也可以由作用于一個基因的多個靶序列或多個基因上的靶序列的多個小干擾RNA組成；所述的靶序列是乙型肝炎病毒的RNA基因組序列，或發(fā)病宿主自身基因的序列包括人肝細(xì)胞的乙型肝炎病毒的受體去唾液酸糖蛋白或Fas基因；小干擾RNA的序列可以由序列表中至少一個序列組成。
本發(fā)明所述的肝細(xì)胞靶向分子為乳糖或半乳糖、乳糖或半乳糖化蛋白或去唾液酸糖蛋白；可以是聚乙二醇(PEG)修飾的聚乙烯亞胺(PEI)。
本發(fā)明所述的核酸結(jié)合分子可以是富含堿性氨基酸和兩性氨基酸分子，可以是線性分子，其序列特征為KKALLALALHHLALLAHHLALALKKA，CCKKHHHKKHKKHGGLLALALHHLALLAHHLALAL；也可以是分枝型的分子(序列特征見圖1)；所述的核酸結(jié)合分子核酸結(jié)合分子可以是通過化學(xué)方法合成的，也可以在酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞或昆蟲桿狀病毒中表達(dá)。
本發(fā)明所述的在酵母細(xì)胞中表達(dá)生產(chǎn)體系包括酵母細(xì)胞和酵母表達(dá)載體，其中酵母細(xì)胞可以是畢赤酵母細(xì)胞、釀酒酵母細(xì)胞，酵母表達(dá)載體是pICZα或pYES2/CT或其它酵母表達(dá)載體；哺乳動物細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)體系包括人的CHO細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞外源基因表達(dá)載體；昆蟲表達(dá)生產(chǎn)體系包括昆蟲細(xì)胞和桿狀病毒表達(dá)載體。
本發(fā)明治療病毒性乙型肝炎的靶向小干擾RNA制劑的制備方法，重組生產(chǎn)的核酸結(jié)合分子經(jīng)超速離心或柱純化后，透析后凍干，取適量多肽與α-乳糖按照1∶3-9的比例，與氰硼酸鈉共溶于500-3000ml水中，37℃反應(yīng)6-72小時后，用KOH溶液將反應(yīng)液調(diào)至pH7.5-8.5，37℃繼續(xù)反應(yīng)6小時。反應(yīng)液室溫下用水透析終止反應(yīng)去除未反應(yīng)的乳糖，硫酸一蔥酮法定性檢測，直至透析液中乳糖含量為陰性，產(chǎn)物真空干燥。制備的乳糖化的肝靶向核酸結(jié)合分子溶于pH5-7的PBS溶液中與5-20∶1的比例的siRNA混合，使siRNA與融合分子形成復(fù)合物。
本發(fā)明治療病毒性乙型肝炎的靶向小干擾RNA制劑的制備方法，化學(xué)合成的分枝型核酸結(jié)合分子與α-乳糖按照1∶3-9的比例，與氰硼酸鈉共溶于500-3000ml水中，37℃反應(yīng)6-24小時后，用KOH溶液將反應(yīng)液調(diào)至pH7.5-8.5，37℃繼續(xù)反應(yīng)6小時。反應(yīng)液室溫下用水透析終止反應(yīng)去除未反應(yīng)的乳糖，硫酸一蔥酮法定性檢測，直至透析液中乳糖含量為陰性，真空干燥，與siRNA按10∶1的比例混合，靜置一定時間后，形成復(fù)合物，最終形成靶向分子/分枝型核酸結(jié)合分子/siRNA復(fù)合物。
本發(fā)明治療病毒性乙型肝炎的靶向小干擾RNA制劑的制備方法，取適量乳糖化或半乳糖化蛋白溶于二甲基亞砜(DMSO)加入TEA，在氮的保護(hù)下攪拌1分鐘，PEG(PEG3400-N-hydroxy succinimide)以2-5∶1的重量比例加入，在室溫下攪拌4小時，后使有機(jī)溶劑揮發(fā)完，獲得乳糖化或半乳糖化蛋白螯合的PEG；乳糖化或半乳糖化蛋白螯合的PEG溶于DMSO，加入4-8倍體積的TEA，攪拌均勻，并在攪拌的條件下加入PEI，加入PEI的質(zhì)量為PEG的20-40倍，攪拌條件下過夜反應(yīng)。乳糖化或半乳糖化蛋白螯合的PEG-PEI和PEI按1∶1的比例混合溶于pH為8的5mM HEPES緩沖液。合成的siRNA也溶于pH為8的5mM HEPES緩沖液；兩者按2∶1的比例混合，振蕩混勻30秒，獲得治療病毒性乙型肝炎的靶向小干擾RNA制劑。
本發(fā)明治療病毒性乙型肝炎的靶向小干擾RNA制劑能夠提高肝臟的藥物濃度，提高藥物乙型肝炎疾病的治療效果，并沒有明顯的毒副作用。治療病毒性乙型肝炎的靶向小干擾RNA制劑能夠抑制HBV病毒復(fù)制和感染及對肝組織的保護(hù)作用，能夠減少HBV DNA和RNA的含量，減少HBsAg及HbeAg顆粒的分泌；肝組織的病理指標(biāo)評價siRNA制劑對肝有很好的保護(hù)作用。


圖1分枝型核酸結(jié)合分子的結(jié)構(gòu)特征。
圖2siRNA、靶向分子和核酸結(jié)合分子所形成的復(fù)合物能夠有效介導(dǎo)siRNA高效轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞。A靶向分子、核酸結(jié)合分子和熒光標(biāo)記的siRNA組成的制劑轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞；B熒光標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞。
圖3pCI-HBV-Luc重組質(zhì)粒圖。
圖4HBV特異的siRNA敲低HBV-Luc融合基因的表達(dá)。
具體實(shí)施例方式
通過基因重組的方法在酵母表達(dá)載體或昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體或哺乳動物細(xì)胞生產(chǎn)直線型多肽化合物，或采用化學(xué)方法合成了直線型或分枝型的多肽化合物，這些多肽化合物富含賴氨酸、精氨酸、組氨酸和亮氨酸，賴氨酸或精氨酸為帶正電荷的堿性氨基酸，可以和核酸分子有效結(jié)合，亮氨酸則有利于形成多肽空間結(jié)構(gòu)的形成，組氨酸有利于siRNA等核酸分子在細(xì)胞內(nèi)從復(fù)合物中釋放出來，是核酸分子到達(dá)所需要作用的部位。多肽化合物通過半乳糖?；蛉樘酋；苟嚯木哂懈渭?xì)胞或肝器官靶向性。
直線型的核酸結(jié)合多肽如上所述，具有如下結(jié)構(gòu)特征KKALLALALHHLALLAHHLALALKKA或CCKKHHHKKHKKHGGLLALALHHLALLAHHLALAL人工合成編碼KKALLALALHHLALLAHHLALALKKA-NH2多肽的基因序列5’aagaaggccttattggcgttcgccttcgcccaccacctcgcgctcctcgcgctcctcgcgcaccacctcgcgctcgcgctccaccacctggcgctcgccctt’3，將序列克隆到T載體中，經(jīng)測序驗(yàn)證正確，將編碼的基因序列克隆進(jìn)酵母表達(dá)載體或大腸桿菌表達(dá)載體，生產(chǎn)能結(jié)合核酸的直線型多肽分子。通過半乳糖?；蛉樘酋；苟嚯木哂懈渭?xì)胞或肝器官靶向性，并與siRNA分子結(jié)合。從而制備成具有肝靶向型的siRNA制劑。
也可通過人工合成的的方法合成直線型或分枝型的核酸結(jié)合分子，分枝型的核酸結(jié)合分子的序列特征見圖1。通過半乳糖?；蛉樘酋；苟嚯木哂懈渭?xì)胞或肝器官靶向性，并與siRNA分子結(jié)合。從而制備成具有肝靶向型的siRNA制劑。
并設(shè)計了針對乙型肝炎病毒基因組及前RNA基因組，設(shè)計了50條siRNA，其中包括靶向順向重復(fù)序列(DR區(qū))、S基因區(qū)、C基因區(qū)、P基因區(qū)、X基因區(qū)的siRNA。并采用化學(xué)方法和體外轉(zhuǎn)錄的合成了這50條siRNA。采用本發(fā)明所制備的多肽與所設(shè)計的siRNA在室溫下結(jié)合，在體外轉(zhuǎn)染含有HepG2.2.15或Huh7.0肝細(xì)胞、通過靜脈注射或局部組織注射或經(jīng)肺的系統(tǒng)給藥方式導(dǎo)入到活體的肝組織中。
本發(fā)明使用的細(xì)胞模型是HepG2.2.15細(xì)胞，攜帶HBV DNA包括染色體整合序列及染色體外松弛環(huán)狀、共價閉合環(huán)狀和不完全拷貝的HBV基因組，并產(chǎn)生多種HBV特異性mRNA(3.5，2.5，2.1kb)，在培養(yǎng)上清中也可檢測到病毒DNA，HBsAg濃度可達(dá)4.2～94.3μg·L-1，免疫電鏡發(fā)現(xiàn)22nm球形和桿狀HBsAg樣顆粒及42nmDane樣顆粒?；蚴褂肏B611細(xì)胞株，可產(chǎn)生高水平HBsAg及HBeAg?；蚴褂肅2.4.10細(xì)胞株，能表達(dá)、分泌HBsAg與HbeAg，進(jìn)一步鑒定發(fā)現(xiàn)其中C2.4.10細(xì)胞株含整合型及染色體外游離型HBV基因組，并可測到HBVDNA復(fù)制中間體及3.6kb與2.2kbRNA轉(zhuǎn)錄物，培養(yǎng)上清中也測到病毒DNA及22nm球形顆粒，后者含前S1，前S2及HBsAg成分?；蚴褂肣7HBV-21細(xì)胞株，能產(chǎn)生高水平HBsAg及HBeAg的細(xì)胞克隆。
本發(fā)明使用的動物模型是HBV全長片段的轉(zhuǎn)基因動物模型，具有病毒DNA復(fù)制及蛋白合成的能力，能夠產(chǎn)生較高水平的血清HBsAg及HBeAg，分別可達(dá)1.5與2μg·L-1，血清中可測到HBV DNA。轉(zhuǎn)基因小鼠肝、腎組織內(nèi)可檢測到HBV特異性3.5，2.1與0.8kbmRNA及單鏈與雙鏈HBVDNA，肝組織內(nèi)還發(fā)現(xiàn)存在2.4kbmRNA。每一肝細(xì)胞可測到約100～200拷貝的HBV復(fù)制中間體，與土撥鼠肝炎病毒感染期間約100～700拷貝數(shù)相當(dāng)。每毫升血清可測到約107～108病毒基因組，與慢性感染人的血清濃度相當(dāng)?；蚴褂肏BV部分基因片段的轉(zhuǎn)基因動物模型，包括轉(zhuǎn)X基因小鼠模型、轉(zhuǎn)S基因小鼠模型、轉(zhuǎn)C基因小鼠模型?；蚴褂肏BV感染樹鼩模型，用HBV陽性患者血清靜脈注射或腹腔接種96只云南產(chǎn)的中緬樹鼩滇西亞種，實(shí)驗(yàn)觀察137周。結(jié)果顯示感染率為55％，感染樹鼩血ALT明顯升高；HBsAg血癥者47％，平均持續(xù)7周，HBV DNA陽性率51％，持續(xù)41周以上；電鏡下，血清可查見Dane顆粒及HBsAg顆粒；免疫組化法可測出肝細(xì)胞內(nèi)HBsAg與HbcAg；肝細(xì)胞HBVDNA陽性率67％，并存在復(fù)制型HBV DNA。用感染樹鼩的血清可連續(xù)傳代感染。
熒光標(biāo)記的siRNA和乳糖或半乳糖化的核酸結(jié)合多肽形成復(fù)合物，將復(fù)合物與肝細(xì)胞共培養(yǎng)，24小時或37小時后，使用PBS溶液洗滌細(xì)胞后，在顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞的熒光狀況，以熒光標(biāo)記的siRNA為對照，從圖2中可見未結(jié)合乳糖或半乳糖化的核酸結(jié)合多肽的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞未能觀察到熒光，使用乳糖或半乳糖化的核酸結(jié)合多肽制備的siRNA制劑轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可觀察到細(xì)胞有明顯的熒光。
在成功將siRNA高效導(dǎo)入肝細(xì)胞后，我們設(shè)計了乙型肝炎病毒基因序列和螢火蟲熒光素酶基因(Luc基因)的融合基因，并將融合基因克隆到哺乳動物表達(dá)載體pCI，夠建成pCI-HBV-Luc重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄出的mRNA含有HBV mRNA并且能夠翻譯出有活性的螢火蟲熒光素酶，如果HBV特異的siRNA能夠降解該融合基因的mRNA，就檢測不到螢火蟲熒光素酶。該質(zhì)粒和HBV特異的siRNA通過與乳糖或半乳糖化的核酸結(jié)合多肽形成復(fù)合物，經(jīng)靜脈注射導(dǎo)入鼠體內(nèi)，從圖3圖4中可知，HBV特異的siRNA能有效抑制肝組織中螢火蟲熒光素酶的表達(dá)。
在建立了siRNA藥物靶向肝器官的給藥方法后，我們將進(jìn)一步在體外和體內(nèi)評價siRNA對乙型病毒性肝炎或肝癌的防治作用。通過實(shí)時定量RT-PCR評價siRNA分子對降低細(xì)胞內(nèi)病毒基因組拷貝數(shù)的抑制作用。將siRNA的序列克隆進(jìn)哺乳動物表達(dá)載體或表達(dá)框架，含siRNA序列的哺乳動物重組表達(dá)載體或表達(dá)框感染，可獲得與上述類似的結(jié)果。
設(shè)計了一系列試驗(yàn)評價HBV特異siRNA在動物體內(nèi)藥效和安全性。將權(quán)力要求中的至少一條siRNA與乳糖或半乳糖化的核酸結(jié)合多肽制成siRNA體內(nèi)導(dǎo)入制劑。配制好的siRNA在病毒攻擊前后不同時間把不同劑量的siRNA制劑通過靜脈或呼吸道或局部肝組織給藥。在動物模型體內(nèi)導(dǎo)入HBV特異的siRNA與乳糖或半乳糖化的核酸結(jié)合多肽制劑。在24小時、48小時、72小時以及96小時分別通過實(shí)時定量RT-PCR評價siRNA分子對降低肝組織樣品中病毒基因組拷貝數(shù)的抑制作用；檢測血清中HBsAg及HbeAg顆粒的含量；通過肝組織的病理指標(biāo)評價siRNA分子對肝的保護(hù)作用，結(jié)果表明本發(fā)明的siRNA及制備的siRNA制劑在體內(nèi)能夠有效抑制乙型肝炎病毒的復(fù)制與感染，并有效保護(hù)了肝組織。將這10條siRNA的序列克隆進(jìn)哺乳動物表達(dá)載體或表達(dá)框架，含siRNA序列的哺乳動物重組表達(dá)載體或表達(dá)框，可獲得與上述類似的結(jié)果。
在本發(fā)明所使用的siRNA制劑及其劑量范圍內(nèi)，尚未有毒理反應(yīng)。
這類siRNA物質(zhì)組成和制劑制備方法不僅適用乙型肝炎的的防治，而且適用于其他肝臟類疾病的治療，如丙型肝炎、肝癌等。
實(shí)施例1直線型核酸結(jié)合多肽的制備。
合成以下相鄰片斷的末端重疊的單鏈的DNA序列，5’aagaaggccttattggcgttcgccttcgcc’3；5’caccacctcgcgctcctcgcgctcctcgcgcaccacctcgc’3；5’gctcgcgctccaccacctggcgctcgccctt’3溶解與適量水中，在T4DNA連接酶作用下，連接成雙鏈DNA分子，并克隆進(jìn)酵母表達(dá)載體pICZα，經(jīng)酶切驗(yàn)證、測序驗(yàn)證后，采用以下程序?qū)⒈磉_(dá)載體導(dǎo)入畢赤酵母細(xì)胞中。
首先，用Sacl切酵母表達(dá)載體pICZαDNA 1小時以上，使之線性化。補(bǔ)水至300ul，加300ul酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)顛倒混勻。離心12000rpm，5分。取上清，加750ml乙醇，30ul NaAc，-20℃，30分鐘。離心，12000rpm，10分。80％乙醇清洗，吹干，溶于10ul水。
再準(zhǔn)備對數(shù)生長期酵母菌(1挑單菌落接種于5ml YPD液體培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)過夜。(2)取過夜培養(yǎng)的菌液0.1-0.5ml接種于50ml新鮮YPD液體培養(yǎng)基，再30℃培養(yǎng)至OD600＝1.3-1.5。(3)在+4℃，1500Xg離心5分鐘，用50ml 0℃無菌水重懸菌體。(4)離心同上，再重懸于25ml 0℃無菌水。(5)離心同上，重懸于20ml 0℃ 1M山梨醇溶液。(6)離心同上，再重懸于1ml 0℃ 1M山梨醇溶液，置于冰上(當(dāng)天使用)。
最后通過電擊方法將表達(dá)載體導(dǎo)入酵母細(xì)胞(1)將制備的細(xì)胞80μl和5-90μg線性化DNA注入0℃電擊池，混勻，置冰上5分鐘。(2)據(jù)酵母脈沖參數(shù)處理細(xì)胞。(電壓1500V；電容25μF；電阻400Ω；次數(shù)1次；時間8.9s)。后即加1ml 0℃ 1M山梨醇溶液到電擊池內(nèi)，混勻。(3)再將池內(nèi)液體轉(zhuǎn)置1.5ml EP管，30℃培養(yǎng)1-2小時。(4)取100μl菌液涂布于含ZeocinTM 100μg/ml的YPDS平板，剩余菌液全涂布于另一含ZeocinTM 100μg/ml的YPDS平板，30℃培養(yǎng)3-4天。
挑取酵母轉(zhuǎn)化子單菌落接種于2.5mlBMGY中，置于50ml錐形瓶中，在28-30℃，250-300rpm搖瓶培養(yǎng)至OD600＝2-6(大約16-18個小時)，酵母細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期。3000rpm，室溫下，離心菌體5分鐘，去上清，菌體重懸于10-20mlBMMY中，至OD600＝1。置于100ml錐形瓶中蓋兩層紗布，繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)。每隔24小時加入100％甲醇至終濃度0.5％，保持誘導(dǎo)。每次加甲醇之前收集一次培養(yǎng)物(即在培養(yǎng)的不同時間段24，48，72，96小時，分別取樣)，每次取培養(yǎng)物2ml，12000rpm離心3分鐘，取上清貯于-20℃，SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(dá)量和分子量。采用Invitrogen公司的純化試劑盒進(jìn)行純化，其過程如下1樹脂處理(1)取2毫升親和樹脂，1000轉(zhuǎn)離心1分鐘，去上清液；(2)加入6毫升水混勻，1000轉(zhuǎn)離心1分鐘，去上清液；(3)加入6毫升Binding buffer混勻，1000轉(zhuǎn)離心1分鐘，去上清液；2蛋白純化(1)8毫升左右的發(fā)酵液與樹脂混合，室溫放置1小時；
(2)1000轉(zhuǎn)離心1分鐘，去上清液；(3)加入8毫升Wash buffer混勻，1000轉(zhuǎn)離心1分鐘，去上清液；(4)加入2毫升Elution buffer混勻，1000轉(zhuǎn)離心1分鐘，收集上清液。
冷凍干燥后得到純化的蛋白。
實(shí)施例2分枝型核酸結(jié)合多肽的制備。
分枝型多肽合成可在ABI431A固相自動肽合成儀上進(jìn)行也可通過手工合成，序列結(jié)構(gòu)見圖1。采用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc方法，選用0.125mmolFmoc-MAP-Branch-PSC樹脂，按照序列使肽鏈從C端逐個向N端延伸，各氨基酸的用量為0.5mmol，氨基酸∶樹脂＝4∶1，第一個氨基酸連接到樹脂上用DMAP，氨基酸的活化用HOBt和DCC偶聯(lián)后用20％哌啶溶液去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)。多肽合成后按照PE公司推薦的步驟，將冰浴后合成物加入處于冰浴條件，下的10ml切割液中采用切割液B其成份為結(jié)晶苯酚0.75mg EDT0.25ml，苯甲硫醚0.5ml去離子水0.5ml TFA10ml待切割混合液溫度上升至室溫后，室溫條件下持續(xù)攪拌反應(yīng)1.5小時，使肽鏈從樹脂上裂解下來，同時去除多種保護(hù)基團(tuán).將反應(yīng)混合液G4玻沙漏斗過濾以濾掉樹脂，先后用1mlTFA 5 10mlDCM沖洗反應(yīng)瓶、樹脂和漏斗。濾液在常溫下低壓蒸發(fā)至1-2ml加入至少50ml預(yù)冷后的乙醚沉淀多肽，4度放置過夜，經(jīng)G6玻璃漏斗過濾，真空抽干至少3小時，所得便是多肽粗產(chǎn)品-20℃儲存?zhèn)溆?。將MAP粗品溶解濃度為15mg/ml經(jīng)0.45 m纖維濾膜過濾后explore100型中壓液相色譜儀上純化，根據(jù)其溶解特性為脂溶性采用POROS-50-R1，填充料的純化柱，流動相為A(10％乙醇+0.1％TFA)，(90％乙醇+0.1％TFA)。洗脫梯度為100％流動相A平衡柱子1.5個柱體積；100％A-100％B10個柱體積；100％B 0.5個柱體積，上樣量為2ml，在主峰處收集多肽溶液。使用樹脂柱脫鹽，冷凍干燥后待用。
實(shí)施例3；乳糖化或半乳糖化核酸結(jié)合多肽的制備。
取上述制備的多肽200mg，α-乳糖800mg，氰硼酸鈉500mg共溶于200ml水中，37℃反應(yīng)24小時后，用5mol/L KOH溶液將反應(yīng)液調(diào)至pH8.5，37℃繼續(xù)反應(yīng)6小時。反應(yīng)液室溫下用水透析終止反應(yīng)去除未反應(yīng)的乳糖，硫酸一蔥酮法定性檢測，直至透析液中乳糖含量為陰性，產(chǎn)物真空干燥備用。
實(shí)施例4乳糖化或半乳糖化核酸結(jié)合多肽高效介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞。
熒光標(biāo)記的siRNA與乳糖化或半乳糖化核酸結(jié)合多肽按照實(shí)施例4中所述的方法制備成復(fù)合物。在轉(zhuǎn)染的前一天，4-5 104細(xì)胞接種在24孔板上，0.5mL含F(xiàn)BS和抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基，應(yīng)能在24小時內(nèi)使細(xì)胞密度達(dá)到最終密度的40-70％。在100μl的無血清的培養(yǎng)基中稀釋靶向蛋白/核酸結(jié)合蛋白/siRNA制劑，充分混合，加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻。細(xì)胞在37℃溫育24h-120h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光狀況圖1。
實(shí)施例5乳糖化或半乳糖化多肽/siRNA制劑敲低肝組織中外源基因的表達(dá)。
設(shè)計了HBV S基因序列和螢火蟲熒光素酶基因(Luc基因)的融合基因，并將融合基因克隆到哺乳動物表達(dá)載體pCI，夠建成pCI-HBV-Luc重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄出的mRNA含有HBV S基因的mRNA并且能夠翻譯出有活性的螢火蟲熒光素酶，如果HBV S特異的siRNA能夠降解該融合基因的mRNA，就檢測不到螢火蟲熒光素酶。按照實(shí)施例4中所述的方法制備HBV S基因特異的乳糖化或半乳糖化多肽/siRNA制劑，通過靜脈注射導(dǎo)入到體內(nèi)，3天后將動物安樂死，分離肝組織，提取總RNA，通過RT-PCR定量分析HBV S和Luc融合基因的表達(dá)水平。從圖3、4中可知，HBV特異的siRNA能有效抑制螢火蟲熒光素酶的表達(dá)。
實(shí)施例6應(yīng)用轉(zhuǎn)基因鼠評價siRNA抑制HBV病毒感染與復(fù)制的的藥效。
(一)建立乙型病毒性肝炎的動物模型。
可使用裸鼠肝內(nèi)移植瘤及腹水瘤乙型肝炎動物模型選用2月齡的BALB/c裸鼠，雌雄不拘。以6-7/ml的HepG 2.2.15細(xì)胞接種于2月齡BALB/c裸鼠，在剖腹直視下肝內(nèi)和腹腔內(nèi)聯(lián)合注射，接種細(xì)胞數(shù)目為1.4-3.4×104/ml。接種量肝臟0.2ml-0.5ml。腹腔0.3-0.5ml，腫瘤出現(xiàn)后2-11周分批處死動物。具有肝移植瘤出現(xiàn)早，出瘤率高，實(shí)驗(yàn)周期短，帶瘤裸鼠血清和肝腫瘤組織內(nèi)有HBV標(biāo)志物的高效表達(dá)。
或采用樹鼩HBV感染模型。
(二)實(shí)驗(yàn)動物的安排盡量選擇性別、年齡一致的純種動物，對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行隨機(jī)分組。實(shí)驗(yàn)和動物分組情況見表1。
將制備的乳糖化或半乳糖化多肽/siRNA制劑通過靜脈注射或腹腔注射或肝臟直接注射或肌注導(dǎo)入到肝細(xì)胞中。
(三)乳糖化或半乳糖化多肽/siRNA制劑抑制HBV病毒復(fù)制和感染及對肝組織的保護(hù)作用。分別在不同時期(第1、4、7、10、14、21天)取肝組織細(xì)胞和血液樣品提取RNA，進(jìn)行RT-PCR檢驗(yàn)。檢測血清中HBsAg及HbeAg顆粒的含量；通過肝組織的病理指標(biāo)評價siRNA分子對肝的保護(hù)作用，結(jié)果表明本發(fā)明的siRNA及制備的siRNA制劑在體內(nèi)能夠有效抑制乙型肝炎病毒的復(fù)制與感染，并有效保護(hù)了肝組織。
HBV-siRNA.WorkFileOrganization Applicant----------------------Street廣州經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)寶石路11號8樓805室City廣州State廣東Country中國PostalCode510730PhoneNumber(0)13302207795FaxNumber020-37617478EmailAddresschengducd@21cn.com<110>OrganizationName廣州拓譜基因技術(shù)有限公司Application Project-------------------<120>Title治療乙型病毒性肝炎的小干擾RNA制劑及其制備方法<130>AppFileReference0<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate___-__-__Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringgaagaaccaa caagaagaut t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA1SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA1Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringgaugaagagg aauaugauat t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA2SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA2Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringaggacaaauu ggaggacaat t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA3SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA3Sequence---------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringgcucaaggaa ccucuaugut t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA4SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA4
HBV-siRNA.WorkFileSequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringcucaaggaac cucuauguut t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA5SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA5Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringggcuuucgca agauuccuat t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA6SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA6Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringccaauuacau aucccaugat t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA7SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA7Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringuuacauaucc caugaaguut t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA8SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA8Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringuacauauccc augaaguuat t21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA9SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA9Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringacauauccca ugaaguuaat t 21
HBV-siRNA.WorkFile<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA10SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA10Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringauguauaccc aaagacaaat t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA11SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA11Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringccacaucauc cauauaacut t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA12SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA12Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringcaucauccau auaacugaat t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA13SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA13Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringcccacaaucc uuugacauat t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA14SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA14Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringcacaauccuu ugacauacut t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA15SequenceDescription
HBV-siRNA.WorkFileCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA15Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringcaauccuuug acauacuuut t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA16SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA16Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringuugacauacu uuccaaucat t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA17SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA17Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringugacauacuu uccaaucaat t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA18SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA18Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringgacauacuuu ccaaucaaut t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA19SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA19Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringaagugaaagc cugcuuagat t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA20SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA20Sequence
HBV-siRNA.WorkFile--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringagugaaagcc ugcuuagaut t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA21SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA21Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringgagguguauu uccgagagat t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA22SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA22Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringccuaguacaa agaccauuat t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA23SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA23Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringcuaguacaaa gaccauuaat t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA24SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA24Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringguacaaagac cauuaaccut t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA25SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA25Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringcccagucuuu aaacaaacat t 21<212>TypeDNA/RNA
HBV-siRNA.WorkFile<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA26SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA26Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringgagaucucga auagaaggat t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA27SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA27Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringgaucucgaau agaaaggaaat t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA28SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA28Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringucucgaauag aaggaaagat t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA29SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA29Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringcucgaauaga aggaaagaat t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA30SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA30Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringcgaauagaag gaaagaagut t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA31SequenceDescriptionCustom Codon
HBV-siRNA.WorkFile------------Sequence NameHBV-siRNA31Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringuccacagaag cuccaaauut t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA32SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA32Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringccacagaagc uccaaauuct t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA33SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA33Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringcacagaagcu ccaaauucut t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA34SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA34Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringagcuccaaau ucuuuauact t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA35SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA35Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringgcccauauua acauugacat t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA36SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA36Sequence--------
HBV-siRNA.WorkFile<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringugacauagcu gacuaccaat t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA37SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA37Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringgacuaccaau ucccuggaut t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA38SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA38Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringccggaagugu ugauaagaut t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA39SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA39Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringauacucaaga accguuucut t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA40SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA40Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringucaggauuaa agacagguat t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA41SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA41Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringaggauuaaag acagguacat t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21
HBV-siRNA.WorkFileSequenceNameHBV-siRNA42SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA42Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringccaguaaagu uucccaccut t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA43SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA43Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringcaguaaaguu ucccaccuut t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA44SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA44Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringguaaaguuuc ccaccuuaut t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA45SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA45Seqience---------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringgcaaauauuu gguaagguut t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA46SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA46Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringuugguaaggu uaggauagat t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA47SequenceDescriptionCustom Codon------------
HBV-siRNA.WorkFileSequence NameHBV-siRNA47Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringugguaagguu aggauagaat t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA48SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA48Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringgaauauggug acccacaaat t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA49SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA49Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringggaugacugu cucuuagagt t 21<212>TypeDNA/RNA<211>Length21SequenceNameHBV-siRNA50SequenceDescriptionCustom Codon------------Sequence NameHBV-siRNA50Sequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringKKALLALALH HLALLAHHLA LALKKA 26<212>TypePRT<211>Length26SequenceName核酸結(jié)合分子1SequenceDescriptionSequence--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringCCKKHHHKKH KKHGGLLALA LHHLALLAHH LALAL35<211>Length35SequenceName核酸結(jié)合分子2SequenceDescription
權(quán)利要求
1.一種治療病毒性乙型肝炎的靶向小干擾RNA制劑，其特征在于小干擾RNA制劑由小干擾RNA、肝細(xì)胞靶向分子和核酸結(jié)合分子組成，能將小干擾RNA高效導(dǎo)入肝細(xì)胞或肝組織，使乙肝病毒(HBV)病毒的反轉(zhuǎn)錄酶失活，使HBV的Enhancer I核心區(qū)的功能喪失，降解HBV前基因組RNA，從而達(dá)到調(diào)控HBV基因及其表達(dá)的作用；也可抑制宿主細(xì)胞上HBV病毒的受體基因及肝損傷相關(guān)基因的表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于治療病毒性乙型肝炎的靶向小干擾RNA制劑，其特征在于所述的小干擾RNA可以是化學(xué)合成的21-23堿基對的雙鏈RNA；也可以是表達(dá)載體或表達(dá)框架表達(dá)的21-23堿基對的雙鏈RNA，所述的表達(dá)載體或表達(dá)框架為RNA聚合酶III啟動子和RNA聚合酶III終止子調(diào)控小干擾RNA在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)，RNA聚合酶III啟動子包括人源或鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療病毒性乙型肝炎的靶向小干擾RNA制劑，其特征在于所述的小干擾RNA可以是由作用于一個靶序列的單一小干擾RNA組成，也可以由作用于一個基因的多個靶序列或多個基因上的靶序列的多個小干擾RNA組成；所述的靶序列是乙型肝炎病毒的RNA基因組序列，或發(fā)病宿主自身基因的序列包括人肝細(xì)胞的乙型肝炎病毒的受體去唾液酸糖蛋白或Fas基因；小干擾RNA的序列可以由序列表中至少一個序列組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療病毒性乙型肝炎的靶向小干擾RNA制劑及其制備方法，其特征在于所述的肝細(xì)胞靶向分子為乳糖或半乳糖、乳糖或半乳糖化蛋白或去唾液酸糖蛋白；可以是聚乙二醇(PEG)修飾的聚乙烯亞胺(PEI)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療病毒性乙型肝炎的靶向小干擾RNA制劑及其制備方法，其特征在于所述的核酸結(jié)合分子可以是富含堿性氨基酸和兩性氨基酸分子，可以是線性分子，其序列特征為KKALLALALHHLALLAHHLALALKKA，CCKKHHHKKHKKHGGLLALALHHLALLAHHLALAL；也可以是分枝型的分子(序列特征見圖1)；所述的核酸結(jié)合分子核酸結(jié)合分子可以是通過化學(xué)方法合成的，也可以在酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞或昆蟲桿狀病毒中表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的治療病毒性乙型肝炎的靶向小干擾RNA制劑，其特征在于所述的在酵母細(xì)胞中表達(dá)生產(chǎn)體系包括酵母細(xì)胞和酵母表達(dá)載體，其中酵母細(xì)胞可以是畢赤酵母細(xì)胞、釀酒酵母細(xì)胞，酵母表達(dá)載體是pICZα或pYES2/CT或其它酵母表達(dá)載體；哺乳動物細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)體系包括人的CHO細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞外源基因表達(dá)載體；昆蟲表達(dá)生產(chǎn)體系包括昆蟲細(xì)胞和桿狀病毒表達(dá)載體。
7.權(quán)利要求1所述的治療病毒性乙型肝炎的靶向小干擾RNA制劑的制備方法，其特征在于重組生產(chǎn)的核酸結(jié)合分子經(jīng)超速離心或柱純化后，透析后凍干，取適量多肽與α-乳糖按照1∶3-9的比例，與氰硼酸鈉共溶于500-3000ml水中，37℃反應(yīng)6-72小時后，用KOH溶液將反應(yīng)液調(diào)至pH7.5-8.5，37℃繼續(xù)反應(yīng)6小時。反應(yīng)液室溫下用水透析終止反應(yīng)去除未反應(yīng)的乳糖，硫酸一蔥酮法定性檢測，直至透析液中乳糖含量為陰性，產(chǎn)物真空干燥。制備的乳糖化的肝靶向核酸結(jié)合分子溶于pH5-7的PBS溶液中與5-20∶1的比例的siRNA混合，使siRNA與融合分子形成復(fù)合物。
8.權(quán)利要求1所述的治療病毒性乙型肝炎的靶向小干擾RNA制劑的制備方法，其特征在于化學(xué)合成的分枝型核酸結(jié)合分子與α-乳糖按照1∶3-9的比例，與氰硼酸鈉共溶于500-3000ml水中，37℃反應(yīng)6-24小時后，用KOH溶液將反應(yīng)液調(diào)至pH7.5-8.5，37℃繼續(xù)反應(yīng)6小時。反應(yīng)液室溫下用水透析終止反應(yīng)去除未反應(yīng)的乳糖，硫酸一蔥酮法定性檢測，直至透析液中乳糖含量為陰性，真空干燥，與siRNA按10∶1的比例混合，靜置一定時間后，形成復(fù)合物，最終形成靶向分子/分枝型核酸結(jié)合分子/siRNA復(fù)合物。
9.權(quán)利要求1所述的治療病毒性乙型肝炎的靶向小干擾RNA制劑的制備方法，其特征在于取適量乳糖化或半乳糖化蛋白溶于二甲基亞砜(DMSO)加入TEA，在氮的保護(hù)下攪拌1分鐘，PEG(PEG3400-N-hydroxy succinimide)以2-5∶1的重量比例加入，在室溫下攪拌4小時，后使有機(jī)溶劑揮發(fā)完，獲得乳糖化或半乳糖化蛋白螯合的PEG；乳糖化或半乳糖化蛋白螯合的PEG溶于DMSO，加入4-8倍體積的TEA，攪拌均勻，并在攪拌的條件下加入PEI，加入PEI的質(zhì)量為PEG的20-40倍，攪拌條件下過夜反應(yīng)。乳糖化或半乳糖化蛋白螯合的PEG-PEI和PEI按1∶1的比例混合溶于pH為8的5mM HEPES緩沖液。合成的siRNA也溶于pH為8的5mM HEPES緩沖液；兩者按2∶1的比例混合，振蕩混勻30秒，獲得治療病毒性乙型肝炎的靶向小干擾RNA制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于治療病毒性乙型肝炎的靶向小干擾RNA制劑及其制備方法，由小干擾RNA、肝細(xì)胞靶向分子和核酸結(jié)合分子組成，能將小干擾RNA高效導(dǎo)入肝細(xì)胞或肝組織，能夠提高肝臟的藥物濃度，提高藥物乙型肝炎疾病的治療效果，使乙肝病毒(HBV)病毒的反轉(zhuǎn)錄酶失活，使HBV的Enhancer I核心區(qū)的功能喪失，降解HBV前基因組RNA，從而達(dá)到調(diào)控HBV基因及其表達(dá)的作用；也可抑制宿主細(xì)胞上HBV病毒的受體基因及肝損傷相關(guān)基因的表達(dá)，沒有明顯的毒副作用。
文檔編號A61P31/12GK1631442SQ20041005156
公開日2005年6月29日 申請日期2004年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月22日
發(fā)明者程度, 李寶健 申請人:廣州拓譜基因技術(shù)有限公司