專利名稱：白背葉提取物制備方法以及抗乙肝病毒的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗乙肝病毒的中藥提取物及其制備方法，特別是白背葉中提取所得有效 成分群的抗乙肝病毒活性劑制備具有治療由乙肝病毒感染引起的各種病癥作用藥物的用途。
背景技術(shù)：
乙肝病毒(HBV)為病毒性乙型肝炎的病原體，持續(xù)性HBV復(fù)制導(dǎo)致肝臟炎性病引起 乙型肝炎。該疾病為我國(guó)的常見病、多發(fā)病，具有傳染性強(qiáng)、傳播途徑復(fù)雜、流行面廣泛， 發(fā)病率較高等特點(diǎn)。據(jù)衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)，僅2004年有記錄的乙型肝炎病例就達(dá)到91萬(wàn)人，而慢 性無(wú)癥狀HBV攜帶者可能占普通人口數(shù)量的9.09。/。，達(dá)到1.2億人。長(zhǎng)期HBV復(fù)制引起的 肝臟炎癥能導(dǎo)致患者肝臟纖維化、肝硬化、肝細(xì)胞癌變等嚴(yán)重后果。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年有約 100萬(wàn)病人死于乙型肝炎病毒感染相關(guān)的肝硬化或肝癌，在我國(guó)由慢性肝炎患者發(fā)展為原發(fā) 性肝癌的相對(duì)危險(xiǎn)高于正常人200倍。
抗乙肝病毒治療能抑制或清除HBV，減少和防止肝臟功能失代償、肝硬化、肝細(xì)胞癌及 其并發(fā)癥的發(fā)生，改善患者生活質(zhì)量并延長(zhǎng)其存活時(shí)間。目前臨床抗病毒治療常采用干擾素 及核苷類藥物。干擾素是一類具有廣譜抗病毒活性的蛋白質(zhì)，能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白。 但干擾素治療在實(shí)現(xiàn)乙肝病毒e抗原(HBeAg)陰轉(zhuǎn)和HBV清除上療效有限，HBeAg陽(yáng)性 病人經(jīng)干擾素a-2b治療的HBeAg陰轉(zhuǎn)率和乙肝病毒脫氧核糖核苷酸(HBV-DNA)清除率 僅分別為33%和37%,，并且干擾素副作用較多，包括流感樣癥狀、疲勞、應(yīng)激性抑郁和骨髓 抑制等。核苷類藥物包括拉米夫定(3TC)、阿德福韋、恩替卡韋等藥物，該類藥物主要抑制 HBVDNA聚合酶，導(dǎo)致前基因組核糖核酸(RNA)無(wú)法反轉(zhuǎn)錄為DNA;或與某種三磷酸脫 氧核糖核苷競(jìng)爭(zhēng)參與HBV-DNA合成，整合后終止病毒DNA的延伸。但是核苷類藥物只能 抑制病毒復(fù)制，不能從根本上清除病毒，并且長(zhǎng)時(shí)間用藥易引起病毒突變，產(chǎn)生耐藥性。此 外，干擾素及核苷類藥物均有明顯的停藥反跳，停藥后易出現(xiàn)病毒大量復(fù)制、肝功能迅速惡 化的癥狀。并且藥品的造價(jià)昂貴，患者治療的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)很重。
白背葉(whitebackleaf)為大戟科野桐屬植物Mallotus apelta (Lour.) MuelL.-Arg.，別名
酒藥子樹、野桐、白背桐、吊栗，性味歸經(jīng)微苦、澀，平。功能主治根柔肝活血，
4健脾化濕，收斂固脫。用于慢性肝炎，肝脾腫大，子宮脫垂，脫肛，白帶，妊娠水腫。葉 消炎止血。外用治中耳炎，癤腫，跌打損傷，外傷出血。文獻(xiàn)記載，白背葉具有清熱利濕、 解毒止血、止痛之功，常用于腸炎腹瀉、慢性肝炎、脾臟腫大及跌打損傷等。中國(guó)人民解放 軍第二軍醫(yī)大學(xué)的徐一新、陳海生等采用醇提取，硅腔TLC，低壓柱層析分離，光譜鑒定。 結(jié)果分得4個(gè)化合物，它們的結(jié)構(gòu)為Acetyl aleuritolic acid(I)，高根二醇-3-醋酸酯 (erythordiol-3-acetate)( II)，東莨菪內(nèi)酯(acopoletin)(III)， P -谷甾醇-3-O- P -D-吡喃葡萄糖武(P -sitosterol-3-O-e -D-glucopyranoside)(IV)，認(rèn)為這是白背葉的主要活性白背葉成分，"白背葉 根化學(xué)成分研究"《解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)》.1999，15(5).-7-10。廣西中醫(yī)學(xué)院的吳桂凡、韋松等將 白背葉的乙醇浸出物，用各種柱色譜進(jìn)行分離和純化，所得化合物以理化性質(zhì)和波譜數(shù)據(jù)進(jìn)
行鑒定。結(jié)果分得5個(gè)化合物，分別鑒定為蒲公英賽醇(i )、 e谷甾醇(11)、 5， 7-二羥基 -6-異戊烯基-4'-甲氧基二氫黃酮(m)、洋芹素(IV)、洋芹素-7-0-e-D-葡萄糖苷(V)。"白 背葉中一個(gè)新的異戊烯基二氫黃酮"《中草藥》.2006,37(8),1126-1128。但是未進(jìn)行這些化合 物的藥效學(xué)試驗(yàn)。
張曉剛等發(fā)現(xiàn)白背葉根水煎液對(duì)HepG2215細(xì)胞乙型肝炎表面抗原(HBsAg)及HBeAg 的分泌有明顯抑制，其對(duì)2213細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度(TC50)為48.25mg/ml，而在此濃度以 下的水煎液均明顯抑制2215細(xì)胞分泌HBsAg及HBeAg，半數(shù)有效濃度(IC50)分別為3.64 和1.12 mg/ml。但白背葉根水煎液對(duì)2215細(xì)胞HBV DNA復(fù)制的抑制作用不顯著[張曉剛， 等，時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2006， 17 (8))， 1437-1438]。徐舒等通過鴨乙肝病毒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，白背葉 根水煎液有抑制鴨乙肝病毒(DHBV) DNA復(fù)制的作用，并且停藥后仍有后續(xù)抑制DHBV 復(fù)制的作用[徐舒，等，中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào)，2006， 4 (3)， 285-288]。
第一軍醫(yī)大學(xué)的趙進(jìn)軍等通過大鼠肝纖維化動(dòng)物模型，研究白背葉根防治肝纖維化的作 用以及白背葉根抗氧化能力的研究。方法應(yīng)用40% CCl4花生油溶液制備大鼠肝纖維化模 型，觀察白背葉根對(duì)肝纖維化大鼠血清和肝組織中多種指標(biāo)的影響，觀察的指標(biāo)包括丙氨 酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，天門氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)， MDA， NO和肝組織中羥脯氨酸的含量以及肝 組織損傷程度(病理切片觀察)，結(jié)果白背葉根能顯著降低大鼠血清中多項(xiàng)指標(biāo)的水平， 并能減輕肝臟膠原纖維增生程度，認(rèn)為白背葉根具有較好的抗肝纖維化作用和抗氧化能力， 抗氧化作用可能是白背葉根阻斷肝纖維化形成的機(jī)理之一?！吨兴幉?2002,25(3).-185-187，"白 背葉根在肝纖維化動(dòng)物模型中抗氧化作用的實(shí)驗(yàn)研究"》
從上述公開文獻(xiàn)了解到，白背葉和根對(duì)肝炎病毒有抑止作用，也能夠防治肝纖維化以及 具有抗氧化能力。但是白背葉提取物中的那一部分起抑止肝炎病毒有、防治肝纖維化的作用， 公開文獻(xiàn)沒有披露。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供抗白背葉植物提取物中具有抗乙肝病毒的制備方法，具體涉及白背 葉植物中提取的黃酮類化合物抗乙肝病毒活性及治療乙肝病毒感染所引起疾病的用途。
從上述的背景技術(shù)中我們看到，白背葉中有許多種化合物，不同的提取方法得到不同的 物質(zhì)，它們的結(jié)構(gòu)以及作為藥物治療的疾病也有所不同。
本發(fā)明'人就是根據(jù)幾年來(lái)的科學(xué)試驗(yàn)中從白背葉植物中提取的黃酮類化合物進(jìn)行分析， 經(jīng)過藥效學(xué)試驗(yàn)，確定了抗乙肝病毒活性及制備治療乙肝病毒感染疾病的藥物。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一、白背葉植物中的化合物提取和提純
取白背葉的干燥植物葉，去除雜質(zhì)，打碎或剪碎后于沸水中提取，每公斤干燥植物葉加 水1 20L，加熱提取1 8小時(shí)，趁熱過濾，收集濾液。濾渣再次采用沸水重復(fù)提取1~3次， 趁熱過濾后合并所得濾液。
所得濾液控溫通過大孔吸附樹脂柱，溫度20'C 8(TC，采用水洗脫，再采用10%~80%乙 醇進(jìn)行洗脫，收集與鹽酸-鎂粉溶液呈陽(yáng)性反應(yīng)的乙醇洗脫液，減壓干燥，重結(jié)晶得到終產(chǎn)物。
所述的大孔吸附樹脂可以選用D101大孔樹脂(國(guó)內(nèi)有很多廠家生產(chǎn))，也可以選用X5、 AB-8樹脂，(南開大學(xué)化工廠生產(chǎn))；或者XAD-4、 XAD-7樹脂，(美國(guó)Rohm. Hass公司生 產(chǎn))。
提取物干燥后所得白背葉黃酮類化合物為棕黃色粉末狀結(jié)晶，經(jīng)液相色譜分析，其基本 組分為洋芹素，洋芹苷-7-0-e-D-葡萄糖苷，5，7-二羥基-6-異戊烯基-4'-甲氧基二氫黃酮，結(jié) 構(gòu)如下
洋芹素結(jié)構(gòu)式:<formula>formula see original document page 6</formula>
洋芹苷-7-O- P -D-葡萄糖苷結(jié)構(gòu)式:<formula>formula see original document page 6</formula>5,7-二羥基-6-異戊烯基-4'-甲氧基二氫黃酮結(jié)構(gòu)式:
本發(fā)明提取的基本組分可以是上述兩種或三種化合物的組合物，最好的比例是洋芹素 5%~70%，洋芹苷-7-O-P-D-葡萄糖苷30%~90%， 5，7-二羥基-6-異戊烯基-4'-甲氧基二氫黃酮 0%~20%。本發(fā)明提供上述白背葉黃酮類化合物抑制HBsAg及HBeAg的表達(dá)，并抑制乙肝 病毒DNA復(fù)制的活性；以及用于制備治療乙肝病毒感染所引起各種疾病藥物的新用途。
二、白背葉黃酮類化合物的抗乙肝病毒作用
本發(fā)明人的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，白背葉黃酮類化合物在沒有細(xì)胞毒性的濃度下，對(duì)HepG 2215細(xì)胞HBsAg和HBeAg表達(dá)有顯著抑制作用。白背葉黃酮類化合物最大無(wú)毒濃度為 37.5tig/ml ，在該濃度下培養(yǎng)三天后，對(duì)2215細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg的抑制率分別達(dá)到 86.6%和74.79%，對(duì)2215細(xì)胞分泌HBsAg和HBeAg的IC50分別為8.61嗎/ml和20.87 ng/ml。 此外，發(fā)明人經(jīng)鴨乙肝病毒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，白背葉黃酮類化合物能顯著抑制DHBV-DNA的復(fù)制。 感染了鴨乙肝病毒的雛鴨，連續(xù)10天口服50 200mg/kg白背葉黃酮類化合物，顯著抑制了 血清DHBV-DNA濃度，服藥5 10天，其抑制率為14~20%，并且停藥后對(duì)血清DHBV DNA 有后續(xù)的抑制效果。
根據(jù)發(fā)明人的上述研究，本發(fā)明提供白背葉黃酮類化合物具有抑制HBsAg和HBeAg表 達(dá)，抑制乙肝病毒DNA復(fù)制的活性，有望用于治療乙肝病毒感染引起的疾病。該發(fā)明具有 以下優(yōu)點(diǎn)白背葉黃酮類化合物制備方法簡(jiǎn)單易行，適宜工業(yè)化生產(chǎn)；經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明白背葉黃 酮類化合物抗乙肝病毒作用顯著，優(yōu)于白背葉的其他粗提??；白背葉在我國(guó)資源豐富，分布 廣泛，原料成本低廉。
具體實(shí)施例方式
為更好地說(shuō)明本發(fā)明的特點(diǎn)和實(shí)質(zhì)，下面用實(shí)施例的形式提供白背葉黃酮類化合物(洋 開素5%~70%，洋芹苷-7-0-e-D-葡萄糖苷30%~90%， 5,7-二羥基-6-異戊烯基-4'-甲氧基二氫 黃酮0%~20%)的提取工藝及抗乙肝病毒的藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明其在制藥領(lǐng)域中的用途。實(shí)施例l:白背葉植物中的黃酮類化合物提取和提純-
取白背葉的干燥植物葉，去除雜質(zhì)，打碎或剪碎后于沸水中提取，每公斤干燥植物葉加 水1~20L，加熱提取1~8小時(shí)，趁熱過濾，收集濾液。濾渣再次采用沸水重復(fù)提取1~3次，
趁熱過濾后合并所得濾液。
所得濾液控溫通過大孔吸附樹脂柱，溫度2(TC 8(TC，采用水洗脫，再采用10%~80%乙 醇進(jìn)行洗脫，收集與鹽酸-鎂粉溶液呈陽(yáng)性反應(yīng)的乙醇洗脫液，減壓干燥，重結(jié)晶得到終產(chǎn)物。
所述的大孔樹脂采用D101大孔樹脂或者AB-8樹脂。將層析柱底用棉花塞緊，加入干樹 脂體積一倍的乙醇用玻璃棒充分?jǐn)嚢韬鬂穹ㄑb柱，層析柱柱徑高比一般在h 5 10。乙醇沖 洗后用水沖洗除盡柱中的乙醇。裝上蓄液球，打開柱下活塞，將所得濾液加熱后傾入蓄液球 內(nèi)，過柱濾液控制溫度在20~80°C，以提高吸附效率。采用水洗脫至洗脫液無(wú)色之后可換乙 醇洗脫，并注意控制洗脫液流速。減壓干燥乙醇洗脫液，將洗脫液體積濃縮至原體積的 5%~50%，之后靜置重結(jié)晶，洗脫液的濃縮程度很大程度上影響重結(jié)晶的速度和純度，故應(yīng) 嚴(yán)格控制。
提取物干燥后所得白背葉黃酮類化合物為棕黃色粉末狀結(jié)晶，經(jīng)液相色譜分析，其基本 組分為洋芹素5%~70%，洋芹苷-7-0-e-D-葡萄糖苷30%~90%， 5,7-二羥基-6-異戊烯基-4'-甲氧基二氫黃酮0%~20%。
實(shí)施例2:白背葉黃酮類化合物對(duì)HepG2215細(xì)胞HBsAg和HBeAg表達(dá)的抑制作用。 2.1試劑Eagles MEM干粉(美國(guó)Gibco產(chǎn).品);胎牛血清(美國(guó)Hyclone Lab產(chǎn)品)；G-418 (Genticin產(chǎn)品)；L-谷氨酰胺(Amresco分裝)；卡那霉素(Amresco分裝)；DMSO (博大 泰克公司產(chǎn)品)；0.25%胰蛋白酶(美國(guó)Hyclone Lab產(chǎn)品)；乙肝表面抗原測(cè)試盒及乙肝e抗 原測(cè)試盒(酶聯(lián)免疫法，上海榮盛生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)。
2.2體外細(xì)胞培養(yǎng)2215細(xì)胞由美國(guó)Mount Sinai醫(yī)學(xué)中心構(gòu)建，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物 技術(shù)研究所惠贈(zèng)。細(xì)胞培養(yǎng)用MEM培養(yǎng)液含胎牛血清10%，谷氨酰胺300pg/ml, G-418 380 pg/ml，卡那霉素750 |xg/ml，用5%NaHC03調(diào)pH值至7.2~7.4。細(xì)胞于含10%胎牛血清的 MEM培養(yǎng)液中，置37'C、 5XC02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2~3天換培養(yǎng)液一次，約7~10天長(zhǎng)滿培養(yǎng) 瓶。
2.3實(shí)驗(yàn)方法以細(xì)胞形態(tài)學(xué)病變?yōu)橹笜?biāo)評(píng)價(jià)白背葉黃酮類化合物對(duì)2215細(xì)胞的毒性。設(shè)細(xì)
胞對(duì)照組和7個(gè)白背葉黃酮類化合物藥物組(基本組分為洋芹素5%~70%，洋芹苷-7-O- e -D-
葡萄糖苷30%~90%， 5,7-二羥基-6-異戊烯基-4'-甲氧基二氫黃酮0%~20%)，藥物終濃度分別
為150、 75、 37.5、 18.75、 9.38、 4.69、 2.34 ng/ml。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞長(zhǎng)滿后，經(jīng)0.25
8%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度至l()Scells/ml，接種于96孔板，每孔0.2ml。培養(yǎng)24h后棄原培 養(yǎng)液，細(xì)胞對(duì)照組加正常培養(yǎng)液，用藥組加含藥培養(yǎng)液，培養(yǎng)3天。至培養(yǎng)第4天，各組均 換正常培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4天。至培養(yǎng)第8天，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。以細(xì) 胞形態(tài)學(xué)病變?yōu)橹笜?biāo)評(píng)價(jià)WF對(duì)2215細(xì)胞的毒性，依Reed-Muench法將細(xì)胞受損百分率高 于25%的認(rèn)為藥物有細(xì)胞毒性，低于25%即認(rèn)為細(xì)胞未受藥源性損傷，由此確定最大無(wú)毒濃 度。收集最大無(wú)毒濃度及低于該濃度WF培養(yǎng)的各孔上清，供HBsAg和HBeAg測(cè)定用。
取上述細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按HBsAg和HBeAg酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒說(shuō)明書測(cè)定HBsAg 禾口HBeAgOD值?？乖种坡省C5o，分別按下式計(jì)算
抗原鵬U百分率,纖對(duì)照^值:f合藥，0灘xKK)(公式—)
/C50 = lg—
細(xì)胞對(duì)照OD值 50-小于50%抑制百分率
(公式二)
.B + (大于50%抑制百分率-小于50%抑制百分率)x C.
其中A=lg (抑制率大于50%的藥物濃度)B=lg (抑制率小于50%的藥物濃度) C=A-B
2.4統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用t檢驗(yàn)分析各組間差異。
2.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)救過顯示，不同濃度的白背葉黃酮類化合物培養(yǎng)導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)
不同程度死亡，其中150pg/ml組細(xì)胞約98%死亡；75 ng/ml組細(xì)胞約40%死亡，細(xì)胞皺縮；
37.5pg/ml組細(xì)胞約15%死亡，細(xì)胞鈹縮；18.75 ^g/ml組及該濃度以下組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)與細(xì)
胞對(duì)照組比較細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變，細(xì)胞數(shù)量也沒有明顯減少。由此確定37.5 ng/ml為最大
無(wú)毒濃度。
采用ELISA法檢測(cè)最大無(wú)毒濃度以下的白背葉黃酮類化合物對(duì)2215細(xì)胞HBsAg及 HBeAg表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白背葉黃酮類化合物在2.34-37.5 pg/ml對(duì)2215細(xì)胞表 達(dá)HBsAg和HBeAg均有較強(qiáng)的抑制作用，并且其抑制程度與用藥濃度呈正相關(guān)，對(duì)二者的 抑制率分別達(dá)到84.6%和74.8%。白背葉黃酮類化合物抑制2215細(xì)胞表達(dá)HBsAg的IC50為 8.61嗎/ml，對(duì)HBeAg表達(dá)的IC5Q為20.87pg/ml。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表一和表二。
抑制率最高達(dá)到
2.6結(jié)論HBsAg及HBeAg是乙肝病毒活躍程度的重要指標(biāo)，發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)表明，白背葉 黃酮類化合物在無(wú)毒性的濃度下，對(duì)2215細(xì)胞表達(dá)HBsAg和HBeAg有強(qiáng)大抑制作用。表一.白背葉黃酮類化合物對(duì)2215細(xì)胞表達(dá)HBsAg的抑制作用(f士" n=3)
組別 藥物濃度0ig/ml) OD值抑制率(％)IC50(pg/ml)
對(duì)照組 一1.932±0.082—一
提取物WF8.61
37.50.180士0.01(T86.60
18.750.501士0.013"70.04
9.38.0駕±0.149**51.79
4.690.939士0.198"37.39
2.340.957±0.200**21.91
注表示與細(xì)胞對(duì)照組比較P〈0.01。
表二白背葉黃酮類化合物對(duì)2215細(xì)胞表達(dá)HBeAg的抑制作用(n=3)
組別藥物濃度(ug/ml) OD值抑制率(％)IC50Og/ml)
對(duì)照組 一2.716±0.121—_
提取物WF20.87
37.50.130±0扁**74.79
18.751.621±0.209**45.46
9.381.973士0.078"27.13
4.691.979±0.157**16.25
2.341.985士0.16廣8.68
注"表示與細(xì)胞對(duì)照組比較P〈0.01。
實(shí)施例3:白背葉黃酮類化合物對(duì)DHBV-DNA復(fù)制的抑制作用實(shí)驗(yàn)
3.1試劑陽(yáng)性對(duì)照藥物拉米夫定(lamivudine， 3TC，葛蘭素史克制藥公司)；DMSO (廣州
市新港化工有限公司)；a -32 -0鄰(北京福瑞生物技術(shù)工程公司)；缺口翻譯試劑盒(Promega公司)；SephadexG-50 (Ficoll公司)；PVP (Pharmacia公司)；SDS (Merck公司)；0.45nm 硝酸纖維素膜(Amersham公司)；魚精DNA及牛血清白蛋白均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院生物物理所。 3.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及病毒來(lái)源1日齡北京麻鴨，體重60 100g，購(gòu)自北京前進(jìn)種鴨動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)。 DHBV-DNA強(qiáng)陽(yáng)性血清，采自南京麻鴨，-70"保存。
3.3實(shí)驗(yàn)方法l日齡北京鴨，經(jīng)腿脛靜脈注射DHBV-DNA陽(yáng)性血清0.2 ml/只。雛鴨經(jīng)DHBV 感染第7天隨機(jī)分為4組，分別為病毒對(duì)照組(生理鹽水，p.o.)、白背葉黃酮類化合物低劑 量組(75mg/kg， p.o.)、白背葉黃酮類化合物高劑量組(150mg/kg， p.o.)、陽(yáng)性對(duì)照組每組 GTC 50 mg/kg， p.o.)，每組6只。感染DHBV后第7天(即TO)開始給藥，2次/天，連 續(xù)給藥10天。(白背葉黃酮類化合物基本組分為洋芹素5% 70%，洋并苷-7-0-e-D-葡萄糖 苷30%~90%， 5,7-二羥基-6-異戊烯基-4'-甲氧基二氫黃酮0%~20%)
分別在DHBV感染后第7天(TO)用藥前，用藥第5天(T5)，用藥第10天(T10)及 停藥后第3天(P3),自鴨腿脛靜脈取血，離心分離血清，-70^保存待檢。嚴(yán)格按照缺口翻 譯試劑盒說(shuō)明書測(cè)定血清DHBV-DNA水平。用32P標(biāo)記DHBV-DNA探針，并做鴨血清斑點(diǎn) 雜交，放射自顯影膜片斑點(diǎn)，酶標(biāo)檢測(cè)儀測(cè)定490nm處OD值，計(jì)算血清DHBV-DNA密度， 以雜交斑點(diǎn)OD值作為標(biāo)本DHBV-DNA水平值。按以下公式計(jì)算藥物在各時(shí)間點(diǎn)對(duì)動(dòng)物血 清DHBV-DNA的抑制率
房扁率(%)=給藥前二T-OD值、—給i后⑨值x 1。0%
給藥前(T0) <9￡)值
3.4統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)分析藥物治療前后 各時(shí)間點(diǎn)同組動(dòng)物血清DHBV-DNA水平變化；采用成組數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)分析各時(shí)間點(diǎn)的藥物對(duì) 血清DHBV-DNA的抑制率。
3.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果DHBV感染后T0、 T5、 T10及P3時(shí)間點(diǎn)鴨血清DHBV-DNA經(jīng)斑點(diǎn)雜交法
測(cè)定，所有4組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染DHBV后，血清DHBV-DNA均呈強(qiáng)陽(yáng)性。酶標(biāo)儀檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)
樣本在490nm處OD值表明，口服白背葉黃酮類化合物后5-10天動(dòng)物血清DHBV-DNA濃度
呈極顯著下降，且停藥3天后仍顯著抑制DHBV-DNA。而口服陽(yáng)性藥3TC 5-10天也顯著降
低動(dòng)物血清DHBV-DNA濃度，但停藥3天后動(dòng)物血清DHBV-DNA濃度明顯反跳性回升。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表三及附圖。
計(jì)算藥物對(duì)DHBV-DNA的抑制率發(fā)現(xiàn)，白背葉黃酮類化合物對(duì)動(dòng)物血清DHBV-DNA的
抑制率與用藥時(shí)間正相關(guān)，且停藥3天后低劑量白背葉黃酮類化合物對(duì)DHBV-DNA的抑制
率仍有所上升，而高劑量對(duì)DHBV-DNA的抑制率僅略低于用藥第10天。而陽(yáng)性藥3TC在
用藥期間對(duì)動(dòng)物血清DHBV-DNA有明顯抑制，但停藥3天后其抑制率迅速下降。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
11見表三。
表三.白背葉黃酮類化合物對(duì)動(dòng)物血清DHBV-DNA復(fù)制的影響)
組別劑量 TO mg/kgT5 T10P3
OD柳OD柳抑制率(。/0) OD的o抑制率(％)OD49o抑制率(％)病毒對(duì)照組-1.83士0.211.75士0.15* 3.64 1.66士0.229.291.73士0.23 5.64
白背葉黃酮類化合物
75 2.09士0.131.90士0.11* 8.57 1.78士0.15"14.761.68士0.1廣19.49#
150 2.67士0.132.34士0.23** 12.32# 2.20士0.22"17.372.22士0.16** 16.54
3TC組 50 1.88士0.111.56士0.31* 17.34 1.25士0.43"33.77#L60士0.35 15.41
注n=6，血清DHBV-DNA以測(cè)定樣本在490nm處吸光值表示，數(shù)據(jù)以3f土s列出，采用釆用 配對(duì)數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)，*P<0.05， "PO.Ol，與同組TO比較。DNA抑制率以平均值表示，采用成組 數(shù)據(jù)t檢驗(yàn)，#P<0.05，與同時(shí)間點(diǎn)病毒對(duì)照組比較。
3.6結(jié)論幼年感染DHBV的雛鴨可發(fā)展成持續(xù)性DHBV感染。鴨乙型肝炎病毒和人乙型肝 炎病毒在基因結(jié)構(gòu)和復(fù)制方式等方面有其相似性，故常以DHBV感染動(dòng)物的模型，研究抗 HBV藥物的療效、抑制病毒復(fù)制的動(dòng)力學(xué)、消毒劑效果的觀察。本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)表明，白背 葉黃酮類化合物對(duì)雛鴨血清DHBV -DNA的復(fù)制有顯著抑制，其停藥后反跳明顯小于拉米夫 定，并且停藥后對(duì)DHBV-DNA仍有后繼的抑制效果。


圖1 一圖4是.DHBV感染后雛鴨血清DHBV-DNA的動(dòng)態(tài)變化情況，其中圖1是病毒對(duì) 照組；圖2是3TC組；圖3是白背葉黃酮類化合物低劑量組；圖4是白背葉黃酮類化合物高 劑量組。
圖中看到，DHBV感染后雛鴨血清DHBV-DNA用不同的藥物，結(jié)果白背葉黃酮類化 合物對(duì)雛鴨血清DHBV -DNA的復(fù)制有顯著抑制。
權(quán)利要求
1.一種白背葉提取物抗乙肝病毒提取物，其特征在于它的主要化學(xué)成分為洋芹素洋芹苷-7-O-β-D-葡萄糖苷5，7-二羥基-6-異戊烯基-4′-甲氧基二氫黃酮
2. —種白背葉提取物抗乙肝病毒提取物，其特征在于其提取物中各成分的質(zhì)量含量包 括洋芹素5%~70%;洋芹苷-7-O-P-D-葡萄糖苷30%~90%和5，7-二羥基-6-異戊烯基-4'-甲氧 基二氫黃酮0%~20%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的白背葉提取物抗乙肝病毒提取物，其特征在于提取方法是取 白背葉的干燥植物葉，去除雜質(zhì),打碎或剪碎后于沸水中提取，每公斤干燥植物葉加水1~20L， 加熱提取1~8小時(shí)，趁熱過濾，收集濾液，濾渣再次采用沸水重復(fù)提取1~3次，趁熱過濾后 合并所得濾液，所得濾液控溫通過大孔吸附樹脂柱，溫度2(TC 80'C，采用水洗脫，再采用 10% 80%乙醇進(jìn)行洗脫，收集與鹽酸-鎂粉溶液呈陽(yáng)性反應(yīng)的乙醇洗脫液，減壓干燥，重結(jié)晶得到終產(chǎn)物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述白背葉提取物的活性及用途，其特征在于所述的提取物包括白背 葉黃酮類化合物的抗乙肝病毒活性及制備治療乙肝病毒感所引起相關(guān)疾病藥物的用途。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述白背葉提取物的抗乙肝病毒活性，其特征在于所述的提取物對(duì)乙 肝病毒復(fù)制、表達(dá)及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)公認(rèn)的乙肝病毒活性相關(guān)指標(biāo)的抑制。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述白背葉提取物制備治療乙肝病毒感所引起相關(guān)疾病藥物的用途，其 特征在于所述的提取物加入醫(yī)用輔料用于制備治療乙肝病毒感所引起相關(guān)疾病藥物或藥物 組合。
全文摘要
本發(fā)明涉及白背葉提取物抗乙肝病毒活性及制備治療乙肝病毒感所引起相關(guān)疾病藥物的用途。本發(fā)明的白背葉提取物為基本組分包括洋芹素、洋芹苷-7-O-β-D-葡萄糖苷、及5，7-二羥基-6-異戊烯基-4′-甲氧基二氫黃酮的黃酮類化合物，白背葉黃酮類化合物有顯著的抑制HepG 2215細(xì)胞表的乙肝病毒表面抗原和乙肝病毒e抗原的作用，并能顯著抑制鴨乙肝病毒脫氧核糖核酸的復(fù)制，停藥反跳弱于陽(yáng)性對(duì)照藥物拉米夫定，且停藥后對(duì)乙肝病毒有后續(xù)的抑制效果。本發(fā)明提藥物抗乙肝病毒作用強(qiáng)大，藥效成分明確，適宜工業(yè)化生產(chǎn)，可預(yù)期用于制備治療乙肝病毒感染所致疾病的藥物。
文檔編號(hào)A61K31/352GK101584702SQ200910114160
公開日2009年11月25日 申請(qǐng)日期2009年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日
發(fā)明者鄧家剛, 鄭作文, 松 韋 申請(qǐng)人:廣西中醫(yī)學(xué)院