一種中性粒細(xì)胞載藥制劑及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種中性粒細(xì)胞載藥制劑及應(yīng)用，所述載藥制劑以中性粒細(xì)胞為載體，待載藥物通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞、巨胞飲或吞噬作用入載體，獲得中性粒細(xì)胞載藥制劑。針對(duì)現(xiàn)有靶向制劑的不足，將大鼠中性粒細(xì)胞與藥物共孵育，形成載藥細(xì)胞，用于體內(nèi)藥物遞送，提高靶向效率。
【專利說明】
一種中性粒細(xì)胞載藥制劑及應(yīng)用
(一)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種靶向遞藥制劑，特別涉及一種以中性粒細(xì)胞作為藥物載體的制劑及應(yīng)用。
(二)
【背景技術(shù)】
[0002]革巴向制劑即革巴向遞藥系統(tǒng)(Targetingdrug delivery system)屬于藥物控制釋放系統(tǒng)，涉及到藥物學(xué)、生物學(xué)、化學(xué)、化工、材料學(xué)等諸多領(lǐng)域，是指藥物通過局部或全身血液循環(huán)而濃集定位于靶組織，靶器官，靶細(xì)胞的給藥系統(tǒng)。靶向給藥系統(tǒng)也是一種藥物載體系統(tǒng)，具有將藥物選擇性的傳輸并釋放于靶組織、靶器官或者靶細(xì)胞，使靶區(qū)藥物濃度增大，降低其他非靶部位濃度，減少毒副作用的特性。靶向給藥系統(tǒng)發(fā)展至今按照靶向源動(dòng)力可分為被動(dòng)靶向制劑、主動(dòng)靶向制劑、前體靶向制劑等。
[0003]在被動(dòng)靶向系統(tǒng)中，藥物以微粒(乳劑、脂質(zhì)體、微囊、微球等)為載體通過正常的生理過程運(yùn)送至肝、脾、肺等器官。被動(dòng)靶向制劑的作用機(jī)制為:網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)具有豐富的吞噬細(xì)胞，可將一定大小(直徑0.1_3μπι)的微粒作為異物攝取于肝、脾;較大直徑(7-30μπι)微粒不能濾過毛細(xì)血管床，被機(jī)械截留于肺部;而直徑<50nm微?？梢酝ㄟ^毛細(xì)血管末梢進(jìn)入骨髓。一般的微粒給藥系統(tǒng)都具有被動(dòng)靶向給藥的性能。主動(dòng)靶向是指藥物載體表面經(jīng)修飾后，使其能夠逃避單核吞噬系統(tǒng)的作用，而被靶組織、靶器官或者靶細(xì)胞識(shí)別。主動(dòng)靶向給藥系統(tǒng)的作用機(jī)制為:通過生物識(shí)別設(shè)計(jì)，如抗體識(shí)別、受體識(shí)別、免疫識(shí)別等將藥物導(dǎo)向特異的識(shí)別靶。主動(dòng)靶向需要載體表面進(jìn)行化學(xué)修飾，連接上具有特異性的靶頭，利用抗體與抗原、受體與配體的特異性結(jié)合將藥物導(dǎo)向特定的組織或器官。前體靶向即活性藥物衍生成的藥理惰性物質(zhì)的前體藥物，前體藥物能在體內(nèi)的靶器官或靶組織經(jīng)化學(xué)反應(yīng)或酶反應(yīng)，使藥理惰性物質(zhì)再生為活性的母體藥物而僅在靶器官或靶組織發(fā)揮正常的藥理作用，在非靶組織則不能。前體靶向的源動(dòng)力在于不同器官或組織的特異的化學(xué)反應(yīng)或酶反應(yīng)的選擇作用。
[0004]然而，上述這些靶向載體都有不同的局限性，如被動(dòng)靶向的載體，進(jìn)入體內(nèi)后會(huì)被肝脾攝取，使其靶向效率降低;主動(dòng)靶向載體選擇正確的靶部位高表達(dá)或特異性表達(dá)地受體或抗原是首要關(guān)鍵問題，其次，通常選用的小分量低免疫原性配體如:葉酸，生長(zhǎng)因子，由于它們可以從食物中獲取，使人體本身就具有很高濃度，這樣會(huì)與主動(dòng)靶向載體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合受體，阻止藥物主動(dòng)傳遞，降低靶向效率;前體藥物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)具有一定難度，體內(nèi)水解酶或催化酶種類繁多，很難篩選出最優(yōu)結(jié)構(gòu)。
[0005]因此，需要構(gòu)建一種新的、不同于現(xiàn)有的靶向技術(shù)載體。
(三)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的是在于針對(duì)現(xiàn)有靶向制劑的不足，提供一種細(xì)胞作為藥物載體制備中性粒細(xì)胞載藥制劑的方法及應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0008]本發(fā)明提供一種中性粒細(xì)胞載藥制劑，所述載藥制劑以中性粒細(xì)胞為載體，待載藥物通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞、巨胞飲或吞噬作用入載體，獲得中性粒細(xì)胞載藥制劑。
[0009]進(jìn)一步，所述待載藥物以游離藥物、納米粒、脂質(zhì)體或膠束中的一種或幾種的形式進(jìn)入載體。
[0010]進(jìn)一步，所述待載藥物為抗腫瘤藥物、抗炎藥物或神經(jīng)類藥物，優(yōu)選紫杉醇或阿霉素，更優(yōu)選2mg/mL的紫杉醇白蛋白納米粒(優(yōu)選購(gòu)自Abraxis B1Science)或2mg/mL的阿霉素脂質(zhì)體(優(yōu)選購(gòu)自羅氏美羅華)或10mg/mL的甲潑尼龍(購(gòu)自輝瑞制藥)。
[0011 ]進(jìn)一步，所述中性粒細(xì)胞載藥制劑按如下步驟制備:將中性粒細(xì)胞接種至含RPM1-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔，加入待載藥物，在37 °C，5 %⑶2條件下共孵育1-4小時(shí)，離心，沉淀用PH值為7.4的PBS緩沖液洗去游離的藥物，收集細(xì)胞，獲得中性粒細(xì)胞載藥制劑。
[0012]更進(jìn)一步，所述中性粒細(xì)胞載藥制劑按如下步驟制備:(I)采用密度梯度離心法從大鼠外周血中分離中性粒細(xì)胞，具體為:取濃度為65 % (V/V)細(xì)胞分離液0.6ml于離心管中，上面加入0.3ml濃度為55 % (V/V)細(xì)胞分離液，最后加入0.3ml大鼠外周血，2500轉(zhuǎn)/分鐘，離心30分鐘，收集濃度為65 %細(xì)胞分離液和濃度為55 %細(xì)胞分離液之間的細(xì)胞層，獲得中性粒細(xì)胞；
[0013](2)將中性粒細(xì)胞接種至RPM1-1640培養(yǎng)基，加入待載藥物，在37°C，5%⑶2條件下共孵育1-4小時(shí)，離心，沉淀用pH值為7.4的PBS緩沖液洗去游離的藥物，收集載藥細(xì)胞，獲得中性粒細(xì)胞載藥制劑;所述中性粒細(xì)胞接種量為I X 15?I X 17個(gè)細(xì)胞/孔，所述待載藥物加入量為l-100g/L培養(yǎng)基(或者0.2-lmg/孔)。
[0014]本發(fā)明采用趨化能力，吞噬能力作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，評(píng)價(jià)載藥細(xì)胞的活性。將指標(biāo)合格的載藥細(xì)胞用于體內(nèi)藥物遞送。
[0015]本發(fā)明還提供一種所述中性粒細(xì)胞載藥制劑在制備治療腫瘤、腦部或自身炎癥藥物中的應(yīng)用。
[0016]現(xiàn)有靶向治療腫瘤或自身炎癥的遞藥系統(tǒng)，在體內(nèi)受到身體免疫系統(tǒng)的作用，難以實(shí)現(xiàn)病灶部位的方向靶向，缺乏組織靶向性，無法提高臨床療效。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明提供一種中性粒細(xì)胞載藥制劑及其應(yīng)用，將大鼠中性粒細(xì)胞與藥物共孵育，形成載藥細(xì)胞，用于體內(nèi)藥物遞送。利用腫瘤或自身炎癥疾病在發(fā)病過程中的病理學(xué)特征，利用疾病與中性粒細(xì)胞之間的免疫學(xué)關(guān)系，形成主動(dòng)響應(yīng)型的靶向遞藥系統(tǒng)，提高靶向效率。進(jìn)一步的，在腫瘤或自身炎癥疾病發(fā)病時(shí)，會(huì)釋放一系列高表達(dá)的趨化因子，吸引中心粒細(xì)胞蓄積到病灶部位，幫助疾病的發(fā)展和惡化，本發(fā)明利用這一點(diǎn)，設(shè)計(jì)和發(fā)明了中性粒細(xì)胞載藥制劑，通過趨化因子作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)病灶部位的精準(zhǔn)靶向。
(四)
【附圖說明】
[0017]圖1為實(shí)施例1中性粒細(xì)胞顯微圖。
[0018]圖2為實(shí)施例1載藥細(xì)胞藥物濃度圖。
[0019]圖3為實(shí)施例1制備的中性粒細(xì)胞載藥制劑的激光共聚焦顯微鏡照片，A為阿霉素(紅色)，BSHoechst 33258(藍(lán)色)染細(xì)胞核，C為空白，D*A和B疊加在一起。
[0020]圖4為實(shí)施例1制備的中性粒細(xì)胞載藥制劑吞噬試驗(yàn)熒光顯微鏡照片。
[0021 ]圖5為實(shí)施例1制備的中性粒細(xì)胞載藥制劑在趨化刺激因子作用下的迀移率。
[0022]圖6為實(shí)施例2載藥細(xì)胞藥物釋放濃度曲線圖。
(五)
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
[0024]本發(fā)明實(shí)施例細(xì)胞孔板中所用培養(yǎng)基均為RPM1-1640培養(yǎng)基，購(gòu)自BD公司。
[0025]實(shí)施例1:
[0026]分離中性粒細(xì)胞:1mL注射器抽取肝素，濕潤(rùn)注射器管壁后將肝素推出。抽取小鼠靜脈血1mL。取2mL紅細(xì)胞裂解液(購(gòu)自BD公司)，與靜脈血混合，4°C下裂解紅細(xì)胞3min，1500rpm離心3min，沉淀細(xì)胞使用ImL PBS(pH值為7.4)重新分散，獲得細(xì)胞懸液。取濃度為65%(V/V)細(xì)胞分離液(購(gòu)自BD公司)0.6ml于離心管中，上面加入0.3ml濃度為55%(V/V)細(xì)胞分離液，最后加入0.3ml細(xì)胞懸液，2500轉(zhuǎn)/分鐘，離心30分鐘，收集濃度為65 %細(xì)胞分離液和濃度為55%細(xì)胞分離液之間的細(xì)胞層，獲得中性粒細(xì)胞。細(xì)胞按1.5X 16個(gè)/瓶接種于含RPM1-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，如圖1。實(shí)施例2:
[0027]載抗腫瘤藥細(xì)胞的制備:將實(shí)施例1制備的中性粒細(xì)胞以IX 16個(gè)/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(含RPM1-1640培養(yǎng)基)，置37°C，5 % CO2培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)0.5h后吸出培養(yǎng)基，每孔加入ΙΟΟμΙ^^度為2mg/mL的紫杉醇白蛋白納米粒(購(gòu)自Abraxis B1Science)培養(yǎng)2h，用37°C預(yù)熱的RPM1-1640培養(yǎng)基清洗3遍，細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，1200rpm離心lOmin。棄上清液，加入1mL PBS，重復(fù)3次，收集載藥細(xì)胞，即為中性粒細(xì)胞載藥制劑;待用。
[0028]實(shí)施例3:
[0029]載抗腫瘤藥細(xì)胞的制備:將實(shí)施例1制備的中性粒細(xì)胞以IX 16個(gè)/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(含RPM1-1640培養(yǎng)基)，置37°C，5 % CO2培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)0.5h后吸出培養(yǎng)基，每孔加入10yL濃度為2mg/mL的阿霉素脂質(zhì)體(購(gòu)自羅氏美羅華)培養(yǎng)2h，用37°C預(yù)熱的RPM1-1640培養(yǎng)基清洗3遍，細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，1200rpm離心1min。棄上清液，加入1mL PBS，重復(fù)3次，收集載藥細(xì)胞，測(cè)定濃度，待用。
[0030]實(shí)施例4
[0031]載抗炎藥細(xì)胞的制備:將實(shí)施例1制備的中性粒細(xì)胞以IX 16個(gè)/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(含RPM1-1640培養(yǎng)基)，置37 °C，5 % CO2培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)0.5h后吸出培養(yǎng)基，每孔加入10yL濃度為10mg/mL的甲潑尼龍(購(gòu)自輝瑞制藥)培養(yǎng)2h，用37°C預(yù)熱的RPM1-1640培養(yǎng)基清洗3遍，細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，1200rpm離心1min。棄上清液，加入1mL PBS，重復(fù)3次，收集載藥細(xì)胞，測(cè)定濃度，待用。
[0032]實(shí)施例5:
[0033]藥物進(jìn)入細(xì)胞途徑實(shí)驗(yàn):
[0034]將實(shí)施例1制備的中性粒細(xì)胞以IX 16個(gè)/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(含RPM1-1640培養(yǎng)基)，置37 °C,5%⑶2培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)0.5h后吸出培養(yǎng)基，將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板分成空白組、鹿糖(sucrose)組、阿米洛利(amiloride)組、制霉菌素(nystatin)組、鹿糖+阿米洛利組、蔗糖+制霉菌素組、阿米洛利+制霉菌素組。空白組加入去離子水，蔗糖組加入100μL154mg/ml蔗糖水溶液，阿米洛利(amiloride)組加入100yL5mM阿米洛利水溶液，制霉菌素(nystatin)組加入10yL 15yg/ml制霉菌素水溶液，鹿糖+阿米洛利組加入50yL154mg/ml鹿糖水溶液+50yL5mM阿米洛利水溶液，蔗糖+制霉菌素組加入50yL154mg/ml蔗糖水溶液+50yL15yg/ml制霉菌素水溶液，阿米洛利+制霉菌素組加入50yL5mM阿米洛利水溶液+50yL 15μg/ml制霉菌素水溶液。每組再分別加入10yL濃度為2mg/mL的紫杉醇白蛋白納米粒(購(gòu)自Abraxis B1Science)，培養(yǎng)2h，用37°C預(yù)熱的RPM1-1640培養(yǎng)基清洗3遍，細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，1200rpm離心1min。棄上清液，測(cè)載藥細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，如圖2，阿米洛利組和阿米洛利加制霉菌素組可以明顯抑制藥物被細(xì)胞攝取，因此該模型劑型是以巨胞飲形式被細(xì)胞載入。鹿糖能抑制網(wǎng)格蛋白有被小窩介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑;阿米洛利(5mM)能抑制巨胞飲途徑介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞;制霉菌素(lSyg/ml)抑制細(xì)胞膜小窩凹陷介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑。
[0035]實(shí)施例6:
[0036]激光共聚焦顯微鏡觀察載藥細(xì)胞實(shí)驗(yàn):
[0037]取ImL載阿霉素細(xì)胞懸液(具體制備方法如同實(shí)施例2，只是將紫杉醇白蛋白納米粒換成阿霉素)加入藍(lán)色探針(Hoechst 33342)0.2yL，4°C下放置3min，1200rpm離心1min。棄上清液，加入1mL PBS，重復(fù)3次，收集染色的載藥細(xì)胞以2 X 16個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(含RPM1-1640培養(yǎng)基)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，如圖3 4為藥物(紅色)，8為Hoechst 33342染色的細(xì)胞核，D為A和B疊加在一起。由D可見，紅色包圍在藍(lán)色周圍，并處于細(xì)胞內(nèi)，證明藥物被包載在細(xì)胞中。
[0038]實(shí)施例7:
[0039]載藥細(xì)胞藥物質(zhì)量評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn):
[0040]吞噬實(shí)驗(yàn):實(shí)施例2制備的載藥細(xì)胞以2X 16個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(含RPM1-1640培養(yǎng)基)，置37 °C, 5%⑶2培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)，加入粒徑3μπι聚丙烯微球(購(gòu)自南京化學(xué)試劑廠)，于0h、2h、4h時(shí)取細(xì)胞進(jìn)行熒光顯微鏡觀察，結(jié)果如圖4所示。載藥細(xì)胞依然具有免疫細(xì)胞特有的吞噬能力，表明載藥細(xì)胞經(jīng)過載藥過程沒有失活。
[0041]趨化能力:實(shí)施例2制備的載藥細(xì)胞以2X 16個(gè)/孔接種于6孔板(孔內(nèi)置3.0μmTranswel I皿，購(gòu)自美國(guó)BD公司，含RPM1-1640培養(yǎng)基)中，置37 °C, 5%⑶2培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)，Transwe 11皿下室中加入趨化刺激因子(IL-8或THF-α)，孵育2h，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Coul terAC T series analyzer；Coulter Corporat1n,Miami ,Florida,USA)計(jì)算Transwell皿上室中未迀移的載藥細(xì)胞，結(jié)果如圖5所示。載藥細(xì)胞在趨化因子的作用下，仍然保持迀移能力，說明載藥細(xì)胞依然具有活性。
[0042]實(shí)施例8:
[0043](I)分離中性粒細(xì)胞:20mL注射器抽取肝素，濕潤(rùn)注射器管壁后將肝素推出。抽取靜脈血20mL。取4mL紅細(xì)胞裂解液，與靜脈血混合，4°C下裂解紅細(xì)胞3min，1500rpm離心3min，沉淀細(xì)胞使用ImL PBS重新分散。取濃度為65% (V/V)細(xì)胞分離液1.2mL于離心管中，上面加入0.6mL濃度為55 % (V/V)細(xì)胞分離液，最后加入0.6mL細(xì)胞懸液，2500轉(zhuǎn)/分鐘，離心30分鐘，收集濃度為65 %細(xì)胞分離液和濃度為55 %細(xì)胞分離液之間的細(xì)胞層，獲得中性粒細(xì)胞。細(xì)胞按1.5 X 16個(gè)/孔接種于培養(yǎng)瓶中，置37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
[0044](2)載藥細(xì)胞的制備:將中性粒細(xì)胞以I X 16個(gè)/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(含RPM1-1640培養(yǎng)基)，置37°C，5%⑶2培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)0.5h后吸出培養(yǎng)基，每孔加入10yL濃度為2mg/mL的阿霉素脂質(zhì)體(購(gòu)自羅氏美羅華)培養(yǎng)2h，用37°C預(yù)熱的RPM1-1640培養(yǎng)基清洗3遍，細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，1200rpm離心1min。棄上清液，加入1mL PBS，重復(fù)3次，收集載藥細(xì)胞，測(cè)定濃度，待用。
[0045]實(shí)施例9:
[0046]載藥細(xì)胞藥物濃度測(cè)定實(shí)驗(yàn):
[0047]實(shí)施例8制備的載藥細(xì)胞以IX 16個(gè)/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(含RPM1-1640培養(yǎng)基)，置37°C，5 %CO2培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)，與Oh、2h、4h、8h時(shí)分別取樣測(cè)定釋放至培養(yǎng)基中阿霉素和細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度，結(jié)果如圖6所示。經(jīng)過4h培養(yǎng)基中阿霉素濃度為32.32nM，載藥細(xì)胞內(nèi)濃度為10.32nM，表明載藥細(xì)胞能夠?qū)⑤d入的藥物逐漸釋放。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種中性粒細(xì)胞載藥制劑，其特征在于所述載藥制劑以中性粒細(xì)胞為載體，待載藥物通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞、巨胞飲或吞噬作用進(jìn)入載體，獲得中性粒細(xì)胞載藥制劑。2.如權(quán)利要求1所述中性粒細(xì)胞載藥制劑，其特征在于所述待載藥物以游離藥物、納米粒、脂質(zhì)體或膠束中的一種或幾種的形式進(jìn)入載體。3.如權(quán)利要求1所述中性粒細(xì)胞載藥制劑，其特征在于所述待載藥物為抗腫瘤藥物、抗炎藥物或神經(jīng)類藥物。4.如權(quán)利要求1所述中性粒細(xì)胞載藥制劑，其特征在于所述待載藥物為紫杉醇或阿霉素。5.如權(quán)利要求1所述中性粒細(xì)胞載藥制劑，其特征在于所述待載藥物為2mg/mL的紫杉醇白蛋白納米?；?mg/mL的阿霉素脂質(zhì)體。6.如權(quán)利要求1所述中性粒細(xì)胞載藥制劑，其特征在于所述中性粒細(xì)胞載藥制劑按如下步驟制備:將中性粒細(xì)胞接種至含RPM1-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔，加入待載藥物，在37°C，5 %CO2條件下共孵育1-4小時(shí)，離心，沉淀用pH值為7.4的PBS緩沖液洗滌，收集細(xì)胞，獲得中性粒細(xì)胞載藥制劑。7.如權(quán)利要求6所述中性粒細(xì)胞載藥制劑，其特征在于所述中性粒細(xì)胞接種量為IXlO5?I X 17個(gè)/孔，所述待載藥物加入量為l-100g/L培養(yǎng)基。8.—種權(quán)利要求1所述中性粒細(xì)胞載藥制劑在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。9.一種權(quán)利要求1所述中性粒細(xì)胞載藥制劑在制備治療自身炎癥藥物中的應(yīng)用。10.—種權(quán)利要求1所述中性粒細(xì)胞載藥制劑在制備治療腦部疾病藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K9/127GK106039317SQ201610348885
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年5月23日
【發(fā)明人】靳翔
【申請(qǐng)人】浙江工業(yè)大學(xué)