本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種豬病毒性腹瀉三聯(lián)抗原抗體復(fù)合物及其制備方法。

背景技術(shù)：

目前，豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉和豬輪狀病毒腹瀉是我國豬群中危害最嚴重的三種病毒性腹瀉病，嚴重影響了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。

豬傳染性胃腸炎是由豬傳染性胃腸炎病毒引起的，是以豬嘔吐、腹瀉、脫水為特征的傳染病，對新生豬仔具有高度致死率；豬流行性腹瀉是豬流行性腹瀉病毒引起的一種豬腸道傳染病，以水瀉、嘔吐和脫水為特征，各年齡的豬均易感，尤其哺乳仔豬受害最為嚴重，主要發(fā)生在冬季和早春天氣較為寒冷的季節(jié)；流行病學(xué)調(diào)查顯示，豬群中輪狀病毒的帶毒率非常高，中豬和大豬多為亞臨床感染和隱性感染，即只攜帶病毒不發(fā)病，發(fā)病的只是仔豬。這三種病常?；旌细腥?，在流行病學(xué)、臨床癥狀、病理解剖學(xué)變化上都非常的相似，很難區(qū)分到底是哪一種病毒感染，而且發(fā)病迅速，因此，治療豬的病毒性腹瀉疾病已刻不容緩。

現(xiàn)在用于治療豬病毒性腹瀉的主要產(chǎn)品包括疫苗、抗生素、中藥及其制劑。疫苗需要一定時間產(chǎn)生免疫應(yīng)答，緊急發(fā)病無法馬上產(chǎn)生保護；抗生素對病毒性疾病效果不佳；中藥及其制劑藥效慢、作用弱、用量大、質(zhì)量難以穩(wěn)定以致使用不方便等。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種使用方便快捷，能安全有效的防治豬病毒性腹瀉的抗原抗體復(fù)合物及其制備方法。這種抗原抗體復(fù)合物，既可以快速地使機體產(chǎn)生被動免疫，也可持續(xù)的使機體產(chǎn)生自主免疫有效保護機體。它與母源抗體共同作用，通過改變抗原的提呈路徑，在短時間內(nèi)刺激機體產(chǎn)生長期有效的保護力，同時與病毒抗原制成的復(fù)合物疫苗相比，能有效降低機體的免疫應(yīng)激反應(yīng)，加快保護產(chǎn)生速度，迅速提高機體抗體滴度，在生產(chǎn)和使用過程中會不存在散毒風險。

為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：

一種豬病毒性腹瀉三聯(lián)抗原抗體復(fù)合物，該抗原抗體復(fù)合物包括抗原和抗體，所述抗原為豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬輪狀病毒混合得到的三聯(lián)病毒液，所述抗體是由所述抗原制備的三聯(lián)卵黃抗體。

進一步的，所述豬病毒性腹瀉三聯(lián)抗原抗體復(fù)合物中抗原和抗體的體積比為1:1。

進一步的，在所述抗原抗體復(fù)合物中，每種病毒的毒價均為1×10^6.0TCID₅₀以上，每種卵黃抗體的中和效價均達到1:7TCID₅₀以上。

進一步的，所述三聯(lián)病毒液中豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬輪狀病毒的體積比為1:1:1。

進一步的，所述豬傳染性胃腸炎病毒為豬傳染性胃腸炎病毒華毒株，所述豬流行性腹瀉病毒為豬流行性腹瀉病毒CV777株，所述豬輪狀病毒為豬輪狀病毒NX株。

進一步的，所述抗原抗體復(fù)合物按照常規(guī)方法制成抗原抗體復(fù)合物制劑，所述抗原抗體復(fù)合物制劑為普通液體制劑、油乳劑或固體制劑。

普通液體制劑的制備方法：取處方量的三聯(lián)病毒液及三聯(lián)卵黃抗體加入PBS液中，經(jīng)除菌處理制備而成。

油乳劑的制備方法：取處方量的三聯(lián)病毒液及三聯(lián)卵黃抗體加入油佐劑混合乳化，按常規(guī)油乳劑疫苗的制備方法制成。

固體制劑的制備方法：取處方量的三聯(lián)病毒液及三聯(lián)卵黃抗體加入凍干保護劑中，凍干制成。

進一步的，所述豬病毒性腹瀉三聯(lián)抗原抗體復(fù)合物還包括角鯊烯，所述角鯊烯與抗原以及抗體的體積比為1:2:2。

本發(fā)明還提供了上述豬病毒性腹瀉三聯(lián)抗原抗體復(fù)合物的制備方法，該方法包括如下步驟：

a、抗原的制備

將豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬輪狀病毒分別利用細胞擴增培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)得到的3種病毒分別進行濃縮，濃縮后混合，其中每種病毒的毒價均為1×10^7.0TCID₅₀以上，甲醛滅活，最終得到含有3種滅活病毒的三聯(lián)病毒液，即為所需抗原；

b、抗體的制備

用步驟a中制得的三聯(lián)病毒液免疫產(chǎn)蛋雞，將獲得的高免雞蛋經(jīng)過酸化、辛酸萃取、超濾濃縮經(jīng)過濾除菌后得到三聯(lián)卵黃抗體，即為所需抗體；

c、抗原抗體復(fù)合物的制備

將步驟a所制得的三聯(lián)病毒液和步驟b所制得的三聯(lián)卵黃抗體混合，然后濃縮，得到抗原抗體復(fù)合物。

進一步的，在所述步驟a中，豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬輪狀病毒分別利用PK-15細胞、Vero細胞和MA104細胞擴增培養(yǎng)。

進一步的，在所述步驟b中，產(chǎn)蛋雞每隔14天加強免疫一次，三次免疫后10天收集高免蛋，取樣檢測，每種卵黃抗體中和效價均達到1：10TCID₅₀以上。

進一步的，在所述步驟c中，所述抗原抗體復(fù)合物中還包括角鯊烯，所述角鯊烯與抗原以及抗體的體積比為1:2:2。

本發(fā)明的有益效果：

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明所述的一種豬病毒性腹瀉三聯(lián)抗原抗體復(fù)合物及其制備方法具有以下優(yōu)勢：

(1)本發(fā)明所述的一種豬病毒性腹瀉三聯(lián)抗原抗體復(fù)合物及其制備方法，所獲得的抗原抗體復(fù)合物具有性能穩(wěn)定、安全性好、動物免疫后產(chǎn)生免疫作用快、免疫力強、保護率高的特點，制備的復(fù)合物制劑具有制備簡單快捷、使用安全方便的特點。用禽蛋黃抗體防治豬的疫病可避免同源或近源帶毒和傳播疫病的潛在危險，避免了動物高免血清在治療過程中引起的副作用。

(2)本發(fā)明所述的一種豬病毒性腹瀉三聯(lián)抗原抗體復(fù)合物中添加角鯊烯，角鯊烯是一種脂質(zhì)不皂化物，最初是從鯊魚的肝油中發(fā)現(xiàn)的，1914年被命名為Squalene,其化學(xué)名為(6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-廿四碳六烯，屬開鏈三萜，又稱魚肝油萜，具有提高體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性、增強機體免疫能力、改善性功能、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤等多種生理功能，是一種無毒性的具有防病治病作用的海洋生物活性物質(zhì)

角鯊烯具有：a、保肝作用，促進肝細胞再生并保護肝細胞，從而改善肝臟功能；b、抗疲勞和增強機體的抗病能力，提高人體免疫功能；c、保護腎上腺皮質(zhì)功能，提高機體的應(yīng)激能力；d、抗腫瘤，尤其在癌切除外科手術(shù)后或采用放化療時使用，效果顯著，其最大的特點是防止癌癥向肺部轉(zhuǎn)移；e、升高白細胞的作用，在抗原抗體復(fù)合物中加入角鯊烯可以使其效果明顯增加，對免疫效果有明顯的改善作用。

附圖說明

構(gòu)成本發(fā)明的一部分的附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當限定。在附圖中：

圖1為試驗1免疫試驗的血清抗體平均效價繪制圖，其中空白組為每頭仔豬注射2ml生理鹽水，疫苗組為每頭仔豬注射2ml常規(guī)三聯(lián)疫苗，抗原抗體復(fù)合物I組為每頭仔豬注射2ml實施例1制備的抗原抗體復(fù)合物I，抗原抗體復(fù)合物II組為每頭仔豬注射2ml實施例2制備的抗原抗體復(fù)合物II；

圖2為試驗2豬流行性腹瀉病毒攻毒保護試驗的仔豬發(fā)病率、死亡率和保護率的對比圖，其中空白組為每頭仔豬注射2ml生理鹽水，疫苗組為每頭仔豬注射2ml常規(guī)三聯(lián)疫苗，抗原抗體復(fù)合物I組為每頭仔豬注射2ml實施例1制備的抗原抗體復(fù)合物I，抗原抗體復(fù)合物II組為每頭仔豬注射2ml實施例2制備的抗原抗體復(fù)合物II；

圖3為試驗3豬傳染性胃腸炎攻毒保護試驗數(shù)的仔豬發(fā)病率、死亡率和保護率的對比圖，其中空白組為每頭仔豬注射2ml生理鹽水，疫苗組為每頭仔豬注射2ml常規(guī)三聯(lián)疫苗，抗原抗體復(fù)合物I組為每頭仔豬注射2ml實施例1制備的抗原抗體復(fù)合物I，抗原抗體復(fù)合物II組為每頭仔豬注射2ml實施例2制備的抗原抗體復(fù)合物II；

圖4為試驗4豬輪狀病毒攻毒保護試驗的仔豬發(fā)病率、死亡率和保護率的對比圖，其中空白組為每頭仔豬注射2ml生理鹽水，疫苗組為每頭仔豬注射2ml常規(guī)三聯(lián)疫苗，抗原抗體復(fù)合物I組為每頭仔豬注射2ml實施例1制備的抗原抗體復(fù)合物I，抗原抗體復(fù)合物II組為每頭仔豬注射2ml實施例2制備的抗原抗體復(fù)合物II。

具體實施方式

除非另外說明，本文中所用的術(shù)語均具有本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)理解的含義。

下面結(jié)合實施例及附圖來詳細說明本發(fā)明。

實施例1：抗原抗體復(fù)合物I

一種豬病毒性腹瀉三聯(lián)抗原抗體復(fù)合物，該抗原抗體復(fù)合物包括抗原和抗體，所述抗原為豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬輪狀病毒混合得到的三聯(lián)病毒液，所述抗體是由所述抗原制備的三聯(lián)卵黃抗體。

所述抗原抗體復(fù)合物中所述抗原和所述抗體的體積比為1:1。

在所述豬病毒性腹瀉三聯(lián)抗原抗體復(fù)合物中，每種病毒的毒價均為1×10^6.0TCID₅₀以上，每種卵黃抗體的中和效價均達到1:7TCID₅₀以上。

所述三聯(lián)病毒液中豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬輪狀病毒的體積比為1:1:1。

所述豬傳染性胃腸炎病毒為豬傳染性胃腸炎病毒華毒株，所述豬流行性腹瀉病毒為豬流行性腹瀉病毒CV777株，所述豬輪狀病毒為豬輪狀病毒NX株。

該三聯(lián)抗原抗體復(fù)合物具體制備方法包括以下步驟：

a、抗原的制備

將豬傳染性胃腸炎病毒華毒株、豬流行性腹瀉病毒CV777株和豬輪狀病毒NX株分別利用PK-15細胞、Vero細胞和MA104細胞擴增培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)得到的3種病毒分別進行濃縮，濃縮后將3種病毒按體積比1:1:1混合，其中每種病毒的毒價均為1×10^7.0TCID₅₀以上，甲醛滅活，最終得到含有3種滅活病毒的三聯(lián)病毒液，即為所需抗原；

b、抗體的制備

用步驟a中制得的三聯(lián)病毒液免疫產(chǎn)蛋雞，每隔14天加強免疫一次，三次免疫后10天收集高免蛋，取樣檢測，留蛋使用，高免雞蛋經(jīng)過酸化、辛酸萃取、超濾濃縮經(jīng)過濾除菌后得到三聯(lián)卵黃抗體，即為所需抗體，在所得到的三聯(lián)卵黃抗體中，每種卵黃抗體的中和效價均達到1:10TCID₅₀以上；

c、抗原抗體復(fù)合物的制備

將步驟a所制備的三聯(lián)病毒液和步驟b所制備的三聯(lián)卵黃抗體按體積比1:1混合得到抗原抗體復(fù)合物。所得到的抗原抗體復(fù)合物濃縮后，每種病毒的毒價均為1×10^6.0TCID₅₀以上，每種卵黃抗體的中和效價均達到1:7TCID₅₀以上。

所述步驟b中的中和效價的測定方法包括以下步驟：

I、制備細胞懸液

將長至單層的PK-15細胞、Vero細胞、MA104細胞按常規(guī)方法消化，計數(shù)后用維持液稀釋至所需濃度獲得細胞懸液；

II、96孔細胞板制備

將該中和效價的測定步驟I中計數(shù)完畢的細胞懸液按照200μl/孔加入細胞培養(yǎng)板各細胞孔中，置于37℃的CO₂培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，約24小時可長至單層；

III、TCID₅₀測定

將抗原抗體復(fù)合物制備步驟a中制得的三聯(lián)病毒液用稀釋液作10倍系列稀釋，從10^-1～10^-10；將步驟I制備細胞懸液中已長至單層的PK-15細胞、Vero細胞、MA104細胞取出，棄掉原有營養(yǎng)液，各稀釋度取50μl三聯(lián)病毒液按順序加入該中和效價的測定步驟II中制備的細胞培養(yǎng)板中，記錄加樣順序，每個稀釋度做8孔，設(shè)正常細胞對照2孔，置于37℃的CO₂培養(yǎng)箱中孵育1小時。病毒吸附后，按照150μl/孔向細胞板中加入37℃預(yù)熱的維持液，并置于37℃的CO₂培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；

IV、抗體中和試驗

將抗原抗體復(fù)合物制備步驟b中制得的三聯(lián)卵黃抗體倍比稀釋，稀釋好的抗體與該中和效價的測定步驟III標定好的三聯(lián)病毒液按體積比1:1依次混合，放入37℃的CO₂培養(yǎng)箱中孵育1小時。將孵育后稀釋液各稀釋度取50μl液按順序加入細胞培養(yǎng)板，然后按照150μl/孔向細胞板中加入37℃預(yù)熱的維持液，并置于37℃的CO₂培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；

V、毒液TCID₅₀檢測

細胞板接毒后觀察至第二天，低稀釋度的病毒出現(xiàn)病變；第三天時病變數(shù)繼續(xù)增加，進行結(jié)果判定并記錄；由Reed-Muench法計算出本次三聯(lián)病毒液TCID₅₀；

VI、根據(jù)中和試驗結(jié)果計算每種卵黃抗體的中和效價。

所述抗原抗體復(fù)合物按照常規(guī)方法制成抗原抗體復(fù)合物制劑，所述抗原抗體復(fù)合物制劑為普通液體制劑、油乳劑或固體制劑；

所述普通液體制劑的制備方法：取處方量的三聯(lián)病毒液及三聯(lián)卵黃抗體加入PBS液中，經(jīng)除菌處理制備而成；

所述油乳劑的制備方法：取處方量的三聯(lián)病毒液及三聯(lián)卵黃抗體加入油佐劑混合乳化，按常規(guī)油乳劑疫苗的制備方法制成；

所述固體制劑的制備方法：取處方量的三聯(lián)病毒液及三聯(lián)卵黃抗體加入凍干保護劑中，凍干制成。

實施例2：抗原抗體復(fù)合物II

在實施例1的基礎(chǔ)上，所述抗原抗體復(fù)合物還包括角鯊烯，所述角鯊烯與抗原以及抗體的體積比為1:2:2。該抗原抗體復(fù)合物的制備方法與實施例1相同，在此不再贅述。

將實施例1中得到的豬病毒性腹瀉三聯(lián)抗原抗體復(fù)合物I和實施例2中得到的豬病毒性腹瀉三聯(lián)抗原抗體復(fù)合物II分別進行如下試驗：

試驗1、免疫試驗

取非免疫3日齡仔豬40頭，隨機分成四組，每組10頭，具體操作如下：

空白對照組：每頭仔豬注射2ml生理鹽水。

疫苗對照組：每頭仔豬注射2ml常規(guī)三聯(lián)疫苗組(2ml為常規(guī)疫苗一頭份注射量)。

抗原抗體復(fù)合物I組：每頭仔豬注射2ml實施例1制備的抗原抗體復(fù)合物I。

抗原抗體復(fù)合物II組：每頭仔豬注射2ml實施例2制備的抗原抗體復(fù)合物II。

上述各組在肌注后，每隔一天隨機取4頭上述仔豬進行采血，并測其血清的抗體水平；15天后每隔5天，取4頭上述仔豬進行采血，并測其血清的抗體水平。取測得的各組血清抗體平均效價繪制圖，如圖1。

結(jié)果表明：注射抗原抗體復(fù)合物I和抗原抗體復(fù)合物II的仔豬開始產(chǎn)生免疫應(yīng)答的時間都要早于常規(guī)疫苗組；其中注射抗原抗體復(fù)合物II的仔豬體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的效應(yīng)時間最短，抗體效價上升最快，持續(xù)時間最長；說明抗原抗體復(fù)合物II明顯優(yōu)于抗原抗體復(fù)合物I。

試驗2、豬流行性腹瀉病毒攻毒保護試驗

取非免疫3日齡仔豬80頭，隨機分成四組，每組20頭，具體操作如下：：

空白對照組：每頭仔豬注射2ml生理鹽水。

疫苗對照組：每頭仔豬注射2ml常規(guī)三聯(lián)疫苗組(2ml為常規(guī)疫苗一頭份注射量)。

抗原抗體復(fù)合物I組：每頭仔豬注射2ml實施例1制備的抗原抗體復(fù)合物I。

抗原抗體復(fù)合物II組：每頭仔豬注射2ml實施例2制備的抗原抗體復(fù)合物II。

上述各組仔豬在肌注后5天，每頭豬用2ml的豬流行性腹瀉病毒CV777株強毒肌肉注射(含100LD50)，統(tǒng)計各組仔豬發(fā)病率和死亡率，并計算保護率，如圖2。

結(jié)果表明：注射抗原抗體復(fù)合物的小組保護效果最好，其中注射實施例2制備的抗原抗體復(fù)合物II的小組的死亡率最低，保護率95％，而空白對照組的死亡率高達100％。

試驗3、豬傳染性胃腸炎病毒攻毒保護試驗

取非免疫3日齡仔豬80頭，隨機分成四組，每組20頭，具體操作如下：：

空白對照組：每頭仔豬注射2ml生理鹽水。

疫苗對照組：每頭仔豬注射2ml常規(guī)三聯(lián)疫苗組(2ml為常規(guī)疫苗一頭份注射量)。

抗原抗體復(fù)合物I組：每頭仔豬注射2ml實施例1制備的抗原抗體復(fù)合物I。

抗原抗體復(fù)合物II組：每頭仔豬注射2ml實施例2制備的抗原抗體復(fù)合物II。

上述各組仔豬在肌注后5天，每頭豬用2ml的豬傳染性胃腸炎病毒華毒株強毒肌肉注射(含100LD50)，統(tǒng)計各組仔豬發(fā)病率和死亡率，并計算保護率，如圖3。

結(jié)果表明：注射抗原抗體復(fù)合物的小組保護效果最好，其中注射實施例2制備的抗原抗體復(fù)合物II的小組的死亡率最低，保護率高達100％，而空白對照組的死亡率高達100％。

試驗4、豬輪狀病毒攻毒保護試驗

取非免疫3日齡仔豬80頭，隨機分成四組，每組20頭，具體操作如下：：

空白對照組：每頭仔豬注射2ml生理鹽水。

疫苗對照組：每頭仔豬注射2ml常規(guī)三聯(lián)疫苗組(2ml為常規(guī)疫苗一頭份注射量)。

抗原抗體復(fù)合物I組：每頭仔豬注射2ml實施例1制備的抗原抗體復(fù)合物I。

抗原抗體復(fù)合物II組：每頭仔豬注射2ml實施例2制備的抗原抗體復(fù)合物II。

上述各組仔豬在肌注后5天，每頭豬用2ml的豬輪狀病毒NX株強毒肌肉注射(含100LD50)，統(tǒng)計各組仔豬發(fā)病率和死亡率，并計算保護率，如圖4。

結(jié)果表明：注射抗原抗體復(fù)合物的小組保護效果最好，其中注射實施例2制備的抗原抗體復(fù)合物II的小組的死亡率最低，保護率高達90％，而空白對照組的死亡率高達100％。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。