本發(fā)明屬于腫瘤免疫干預的材料技術領域，具體涉及應用調節(jié)性T細胞靶向性納米粒子及制備。

背景技術：

腫瘤免疫治療作為一種具有良好機體耐受性和高度病變選擇性的療法，已被視為腫瘤傳統(tǒng)三大療法外的第四極，成為了個性化治療手段的典范。然而，基于免疫治療的緩解率和總生存期不如人意，與免疫治療在體外實驗中所得的一系列令人矚的成果形成強烈反差。隨著對腫瘤體內微環(huán)境認識的不斷加深，表型為CD4+CD25+FoxP3+，被稱為調節(jié)性T細胞(Regulatory T cells，Tregs)的細胞引起了人們廣泛的關注。Tregs在體內的功能主要是抑制細胞殺傷性T細胞的過度活化以及樹突狀細胞對于抗原的呈遞，平衡Th1免疫反應。臨床結果已經(jīng)證實多種不同類型腫瘤內Tregs細胞量顯著上調，對自體回輸?shù)陌┘毎禺愋訲細胞及樹突狀細胞疫苗活性具有明顯的抑制力。而體外細胞培養(yǎng)中顯然沒有考慮到Tregs細胞的存在，抗腫瘤疫苗所激活的免疫反應可以按照預定方式發(fā)揮細胞殺傷作用，這也是造成體內外治療效果巨大差異的原因。

認識到了這一問題后，新型的基于阻斷Tregs細胞對于免疫細胞活性抑制的免疫治療手段已經(jīng)被研發(fā)。例如殺傷性T細胞相關抗原4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4)是Treg細胞通過接觸誘導殺傷性T細胞失活的關鍵蛋白。通過體內注射人源化CTLA-4抗體，可以預先封閉Treg細胞表面受體，抑制與對于殺傷性T細胞的CD28受體的結合，維持T細胞的活化。而新近獲批的用于阻斷諸如PD-1，PD-L1，4-1BB等靶點的藥物毒副作用更低，進一步便顯出了更大的治療優(yōu)越性。然而必須認識到的時，由于腫瘤患者自體免疫力較弱，即便受益于此類療法，自身的抗腫瘤免疫反應依舊無法有效殺傷癌細胞。為了取得理想的治療效果，阻斷免疫抑制的藥物必須與刺激抗腫瘤免疫治療方案聯(lián)合，抬高了治療成本。尋找一種簡便易行的治療手段，激活抗腫瘤免疫反應的同時又能抑制Tregs的活性對于免疫治療而言顯得尤為重要。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是，在現(xiàn)有的技術基礎上，設計了一種聯(lián)合光熱治療與免疫治療的新型材料-光熱轉換靶向熱消除調節(jié)性T細胞的納米顆粒及制備方法、應用。此納米顆?？赏ㄟ^光熱治療誘導Tregs細胞的凋亡，從而阻斷其針對殺傷性T細胞活性的抑制；再利用光熱治療產(chǎn)生的熱量刺激外周血殺傷性T細胞活化，削弱腫瘤免疫耐受的同時刺激抗腫瘤免疫反應，增強腫瘤的抗腫瘤免疫治療能力。

為實現(xiàn)上述目地，本發(fā)明采用如下技術方案：一種靶向熱消除調節(jié)性T細胞的光熱轉換納米顆粒，所述納米顆粒是將一種具有光熱轉換功能的納米顆粒，所述納米顆粒表面設有接枝有長循環(huán)的親水性官能團以及靶向調節(jié)性T細胞的官能團，其粒徑在2-100納米之間；所述的納米顆粒，包括非化學計量比的氧化鎢納米顆粒或者金納米顆粒；其中非化學計量比的氧化鎢納米顆粒，其分子式為WO_x，2<X<3；氧化鎢納米顆粒的粒徑在2-100納米之間；其形狀為球形或棒狀、長徑比大于1且小于20；所述的靶向納米顆粒為金納米顆粒時，其粒徑在1-200納米之間，形狀為球形，三角形或棒狀結構中一種或多種；棒狀結構的納米顆粒的長徑比大于1小于20；以表面修飾靶向調節(jié)性T細胞的單抗的光熱轉化納米顆粒作為與Tregs細胞靶向性結合的載體，賦予了這一納米顆粒選擇性結合Tregs細胞的能力，并通過體內和體外實驗驗證其Tregs靶向作用及對腫瘤的免疫熱療效果。所述的納米顆粒，其特征是在可見-近紅外區(qū)即500-2000nm波長范圍內具有較強的光吸收能力，產(chǎn)生光熱轉化。

進一步，所述的納米顆粒表面靶向調節(jié)性T細胞的官能團為：CD39單抗、CD25單抗、CTLA-4單抗或者Foxp3單抗中的一種或多種。

所述的納米顆粒，其表面接枝有長循環(huán)的親水性官能團是指長循環(huán)層為聚乙二醇(PEG)，聚丙烯酸(PAA)，聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)中的一種或多種。

所要求的長循環(huán)層的親水性官能團，PEG的分子量為500-20000Da；聚丙烯酸分子量為1000-10000Da，聚乙烯基吡咯烷酮分子量為2000-20000Da。

所述的納米顆粒的制備方法，納米顆粒的納米內核為氧化鎢時，以WCl₆在氮氣保護條件下，溶解在乙二醇中，室溫下攪拌溶解，得到金黃色溶液，而后加入分子量5KDa的聚丙烯酸聚合物，攪拌至全部溶解后，在140±15℃條件下氮氣保護攪拌反應，體系受熱后，最初為深棕黃色，最終轉變?yōu)樯钏{色，繼續(xù)加熱1.5h，而后降溫至80℃，加入50mL去離子水，繼續(xù)攪拌反應1h，停止加熱，將反應后的溶液離心純化，棄去上清液，產(chǎn)物用去離子水洗滌分散，重復這一洗滌過程三次，最終得到純化產(chǎn)物，為深藍色顆粒粉末；所制備的帶聚丙烯酸聚合物的氧化鎢W₁₈O₄₉納米材料分散在生理鹽水中，和靶向官能團結合，制備靶向納米材料。WCl₆與聚丙烯酸聚合物的質量比為1:0.9-1.6。

納米顆粒的納米內核為金納米顆粒時的制備方法：十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)加入HAuCl₄溶液中，攪拌溶解后，加入的硼氫化鈉反應，得到藍色溶液；取CTAB和0.08g水楊酸鈉，溶解于25ml蒸餾水中，溶解完全后，加入0.5ml、4mM的硝酸銀，水浴30℃靜置15min左右，再加入25ml，1mM的HAuCl₄和0.2ml濃鹽酸，溫和攪拌15min后，加入300微升0.1M的抗壞血酸，得到無色溶液。最后加入80微升步驟1所得的藍色溶液，反應12h～24h后，終止反應，8500rpm離心、蒸餾水洗滌三次。獲得金納米棒，其長徑比為4；所制備的金納米棒分散在生理鹽水中，和靶向官能團結合，制備靶向納米材料。

本發(fā)明得到的光熱轉換靶向熱消除調節(jié)性T細胞的納米顆粒在制備聯(lián)合光熱治療與免疫治療的藥物中的應用：此納米顆?？赏ㄟ^光熱治療誘導Tregs細胞的凋亡，以表面修飾靶向調節(jié)性T細胞的單抗的光熱轉化納米粒子作為與Tregs細胞靶向性結合的載體，賦予了這一納米粒子選擇性結合Tregs細胞的能力，并通過體內和體外實驗驗證其Tregs靶向作用及對腫瘤的免疫熱療效果。

Tregs細胞的凋亡阻斷其針對殺傷性T細胞活性的抑制；再利用光熱治療產(chǎn)生的熱量刺激外周血殺傷性T細胞活化，削弱腫瘤免疫耐受的同時刺激抗腫瘤免疫反應，增強腫瘤的抗腫瘤免疫治療能力。免疫熱療在腫瘤區(qū)內選擇性誘導了Treg細胞的凋亡，破壞了其對免疫細胞活性的抑制。同時腫瘤組織局域產(chǎn)生熱量。

具體操作如下：

(1)鎢藍納米粒子的合成，首先稱取WCl₆ 600mg，PAA 200mg加入50mL一縮二乙二醇當中，N₂保護條件下在60℃條件下攪拌反應30min直至全部溶解，所得溶液為金黃色。而后將該分散液直接加入預熱至180℃的油浴當中，反應30min后停止加熱，將所得溶液自然冷卻至室溫，向體系中加入50mL去離子水，靜置約30min后，9000rpm×10min離心收集所得藍色沉淀后去離子水洗滌三遍，去除未反應的PAA和WCl₆，所得產(chǎn)物放置于4℃冰箱中待用。

(2)鎢藍納米粒子的靶向性修飾，將100mg新制的鎢藍納米顆粒分散在20mL去離子水當中(4℃)攪拌均勻后，加入150mg EDC和90mg sulfo-NHS，磁力攪拌條件下反應1.5小時，而后將所得溶液離心純化后去離子水洗滌三次，去除EDC和sulfo-NHS反應后的副產(chǎn)物，所得納米顆粒重新分散在50mL預冷至4℃的PBS溶液當中。在冰浴條件下加入30μL CD39單抗(1mg/mL，兔抗小鼠CD39多抗，Lot#ab 128666,Abcam)反應5h。離心收集表面修飾的鎢藍納米粒子后用PBS洗滌三次，將所得的納米粒子分散在PBS當中，保存在4℃冰箱中待用(W₁₈O₄₉anti-CD39antibody，簡記為WOAA納米粒子)。

(3)光熱轉化納米粒子和Tregs細胞體外共培養(yǎng)結果：我們將Tregs細胞和我們所制備的納米微粒共培養(yǎng)，并采用808nm的激光照射，研究納米顆粒對Tregs細胞的靶向性熱殺傷能力。研究發(fā)現(xiàn)Tregs細胞與WOAA納米粒子共培養(yǎng)并不會抑制其活性，WOAA本身不具有治療效果。經(jīng)激光照射后，Tregs細胞大量凋亡，WOAA納米顆粒靶向性熱療破壞的不僅僅是Treg細胞自身的結構，同時還對其細胞因子的代謝相關機能造成了破壞，在一定程度上解除了Treg細胞對于抗腫瘤免疫反應的抑制。

(4)光熱轉化納米粒子和荷瘤小鼠的體內光熱治療效果：

將靶向納米顆粒注射到荷瘤小鼠體內，并經(jīng)808nm激光多次照射后，靶向性熱療顯著刺激了CD8+細胞毒淋巴細胞(CD8+CTL)的增殖，這對于刺激外周血重建抗腫瘤細胞免疫反應具有積極的治療意義。同時發(fā)現(xiàn)隨著時間的變化，WOAA熱療引起的CD8+CTL其比例雖然逐漸下調，但是即便經(jīng)過15天，CD8+/CD4+比例仍高達0.47。這部分活化的CTL細胞浸潤到腫瘤組織后，具有腫瘤細胞殺傷活性的亞群比例顯著高于非靶向性熱療組和陰性對照組，證明靶向性熱療可以募集具有抗腫瘤活性的免疫細胞群進入腫瘤組織。

有益效果：本發(fā)明中免疫熱療在腫瘤區(qū)內選擇性誘導了Treg細胞的凋亡，破壞了其對免疫細胞活性的抑制。同時腫瘤組織局域產(chǎn)生的熱量，活化了外周血當中具有抗腫瘤活性的CD8+CTL細胞，這部分細胞被募集到腫瘤區(qū)域后，與M1型巨噬細胞協(xié)同作用誘導了腫瘤細胞的凋亡，最終形成了免疫熱療結束后短期內僅有Treg細胞凋亡，而后腫瘤細胞凋亡持續(xù)上升的結果。

附圖說明

圖1為所制備的WOAA納米顆粒的透射電鏡照片；

圖2為經(jīng)808納米的激光照射后的納米微粒的升溫曲線(左圖)和形貌(透射電鏡，右圖，右圖的四幅圖中，上兩幅(分別對應兩個放大倍數(shù))是未經(jīng)照射微粒形貌，下兩幅(分別對應兩個放大倍數(shù))是經(jīng)5循環(huán)照射微粒形貌)；

圖3為WOAA納米顆粒和4T1(I左)細胞及Tregs(II左)的結合。I、II右圖為元素分析照片，在Tregs細胞表面有大量的鎢元素，證明了WOAA納米顆粒和Tregs的選擇性結合。

圖4為WOAA納米顆粒在瘤內的代謝。72小時后，仍能觀察到約1/5的納米微粒存在于腫瘤中。表明WOAA與腫瘤微環(huán)境浸潤Treg細胞充分結合。

圖5為荷瘤小鼠注射不同的材料后，經(jīng)激光照射后，腫瘤大小的變化(注射WOAA納米顆粒并經(jīng)808nm激光照射后的腫瘤幾乎完全消退)；

圖6為荷瘤小鼠注射不同的材料后，經(jīng)激光照射后，生存率的變化(注射WOAA納米顆粒并經(jīng)808nm激光照射后，小鼠40天后全部存活)。

圖7為光熱轉換納米顆粒靶向熱消除調節(jié)性T細胞的納米微粒(左圖)及其體內變化(右圖)示意圖。

具體實施方式

下面通過具體實施方式描述本發(fā)明的技術方案，但并不限于下述實施例。本發(fā)明中，將一種具有光熱轉換功能的納米顆粒表面接枝有體內長循環(huán)組分和靶向調節(jié)性T細胞的官能團(圖7左)。該復合納米顆粒在腫瘤組織中顯示對調節(jié)性T細胞的高度靶向性。將具有皮膚高透過性的近紅外光照射已經(jīng)注射了該復合納米微粒腫瘤組織，發(fā)生光熱轉化，產(chǎn)生熱量，升高溫度，殺死腫瘤組織中的調節(jié)性T細胞，解除腫瘤中調節(jié)性T細胞產(chǎn)生的腫瘤免疫抑制作用，增強人體免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細胞的作用。本發(fā)明是一種聯(lián)合光熱治療與免疫治療的新型光熱免疫熱療手段。通過去除腫瘤組織中的調節(jié)性T細胞，不但能阻斷調節(jié)性T細胞對殺傷性T細胞活性的抑制，而且光熱治療產(chǎn)生的熱量刺激外周血殺傷性T細胞的活化，削弱腫瘤免疫耐受的同時刺激抗腫瘤免疫反應，對腫瘤細胞具有特異性殺傷作用，有效治愈腫瘤疾病，適合推廣使用。

實施例1，

(1)、稱取WCl₆ 200mg，在氮氣保護條件下，溶解在50mL乙二醇中，室溫下攪拌溶解，得到金黃色溶液，而后加入分子量5KDa的聚丙烯酸聚合物300mg，攪拌至全部溶解后，在140℃條件下氮氣保護攪拌反應，體系受熱后，最初為深棕黃色，30min后轉為藍綠色，1h后最終轉變?yōu)樯钏{色，并保持不變，繼續(xù)加熱1.5h，而后降溫至80℃，加入50mL去離子水，繼續(xù)攪拌反應1h，停止加熱，將反應后的溶液離心純化，棄去上清液，產(chǎn)物用去離子水洗滌分散，重復這一洗滌過程三次，最終得到純化產(chǎn)物，為深藍色W₁₈O₄₉顆粒粉末，TEM可見其平均粒徑為4.9nm。

(2)所制備的氧化鎢納米材料分散在生理鹽水中，和靶向官能團CD39單抗結合，制備靶向納米材料。CD39單抗可以靶向到腫瘤內Tregs細胞表面高表達的CD39，從而將復合WOAA納米顆粒靶向高效的結合到Tregs。

(3)，建立相應的小鼠腫瘤模型，將上述靶向WOAA納米顆粒和進尾靜脈注射或者瘤內原位注射后，采用1064nm的激光器波長，照射腫瘤，檢測經(jīng)不同激光照射時間，次數(shù)，強度，并測定其抗腫瘤效果。

實施例2

1)、稱取WCl₆ 200mg，在氮氣保護條件下，溶解在50mL乙二醇中，室溫下攪拌溶解，得到金黃色溶液，而后加入分子量5KDa的聚丙烯酸聚合物300mg，攪拌至全部溶解后，在140℃條件下氮氣保護攪拌反應，體系受熱后，最初為深棕黃色，30min后轉為藍綠色，1h后最終轉變?yōu)樯钏{色，并保持不變，繼續(xù)加熱1.5h，而后降溫至80℃，加入50mL去離子水，繼續(xù)攪拌反應1h，停止加熱，將反應后的溶液離心純化，棄去上清液，產(chǎn)物用去離子水洗滌分散，重復這一洗滌過程三次，最終得到純化產(chǎn)物，為深藍色W₁₈O₄₉顆粒粉末，TEM可見其平均粒徑為4.9nm。

(2)所制備的氧化鎢納米材料分散在生理鹽水中，和靶向官能團Foxp3單抗結合，制備靶向納米材料。Foxp3單抗可以靶向到腫瘤內Tregs細胞表面高表達的Foxp3，從而將復合WOAA納米顆粒靶向高效的結合到Tregs。

(3)，建立相應的小鼠腫瘤模型，將上述靶向WOAA納米顆粒和進尾靜脈注射或者瘤內原位注射后，采用1064nm的激光器波長，照射腫瘤，檢測經(jīng)不同激光照射時間，次數(shù)，強度，并測定其抗腫瘤效果。

實施例3

1)、稱取WCl₆ 200mg，在氮氣保護條件下，溶解在50mL乙二醇中，室溫下攪拌溶解，得到金黃色溶液，而后加入分子量5KDa的聚丙烯酸聚合物300mg，攪拌至全部溶解后，在140℃條件下氮氣保護攪拌反應，體系受熱后，最初為深棕黃色，30min后轉為藍綠色，1h后最終轉變?yōu)樯钏{色，并保持不變，繼續(xù)加熱1.5h，而后降溫至80℃，加入50mL去離子水，繼續(xù)攪拌反應1h，停止加熱，將反應后的溶液離心純化，棄去上清液，產(chǎn)物用去離子水洗滌分散，重復這一洗滌過程三次，最終得到純化產(chǎn)物，為深藍色W₁₈O₄₉顆粒粉末，TEM可見其平均粒徑為4.9nm。

(2)所制備的氧化鎢納米材料分散在生理鹽水中，和靶向官能團CD25單抗結合，制備靶向納米材料。CD25單抗可以靶向到腫瘤內Tregs細胞表面高表達的CD25，從而將復合WOAA納米顆粒靶向高效的結合到Tregs。

(3)，建立相應的小鼠腫瘤模型，將上述靶向WOAA納米顆粒和進尾靜脈注射或者瘤內原位注射后，采用1064nm的激光器波長，照射腫瘤，檢測經(jīng)不同激光照射時間，次數(shù)，強度，并測定其抗腫瘤效果。

實施例4

(1)5ml,0.2M的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)加入到5ml，0.5mM的HAuCl₄溶液中，攪拌溶解后，加入0.6ml，1.0mM的硼氫化鈉反應，得到藍色溶液。

(2)取0.912g CTAB和0.08g水楊酸鈉，溶解于25ml蒸餾水中，溶解完全后，加入0.5ml，4mM的硝酸銀，水浴30℃靜置15min左右，再加入25ml，1mM的HAuCl₄和0.2ml濃鹽酸，溫和攪拌15min后，加入300微升0.1M的抗壞血酸，得到無色溶液。最后加入80微升步驟1所得的藍色溶液，反應12h～24h后，終止反應，8500rpm離心、蒸餾水洗滌三次。獲得金納米棒，其長徑比為4。測量紫外吸收光譜，得到的吸收峰在～523nm有一小峰，在800～900處有一大吸收峰。

(3)所制備的金棒納米材料分散在生理鹽水中，和靶向官能團CD25單抗結合，制備靶向納米材料。CD25單抗可以靶向到腫瘤內Tregs細胞表面高表達的CD25，從而將復合金棒納米顆粒靶向高效的結合到Tregs。

(3)，建立相應的小鼠腫瘤模型，將上述靶向金棒納米顆粒和進尾靜脈注射或者瘤內原位注射后，采用808nm的激光器波長，照射腫瘤，檢測經(jīng)不同激光照射時間，次數(shù)，強度，并測定其抗腫瘤效果。