本發(fā)明屬于藥學(xué)領(lǐng)域，涉及一種新的脂蟾毒配基與環(huán)糊精的包合物，以及該包合物的制備方法。本發(fā)明還涉及脂蟾毒配基環(huán)糊精包合物的用途。

背景技術(shù)：

脂蟾毒配基(resibufogenin，化學(xué)式c24h32o4)是蟾酥(蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍bufobufogargarizanscantor或黑眶蟾酥b.melanostictusschoeider的耳后及皮膚腺分泌的白色漿液,經(jīng)加工干燥制成)中主要的活性成分，具有抗腫瘤、強(qiáng)心、局部麻醉等多種活性(劉俊珊,張冬梅,栗原博,葉文才.蟾酥及其活性成分抗腫瘤作用研究進(jìn)展.國(guó)際藥學(xué)研究雜志[j].2009,36:115-120；唐信威,肖潔,宋健,鄒強(qiáng),汪瑞雪,李晏齊,陽(yáng)泰.脂蟾毒配基選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞的研究.中國(guó)癌癥雜志[j].2012,03:196-199.)。其結(jié)構(gòu)式如下：

脂蟾毒配基難溶于水，治療有效劑量與中毒劑量接近，限制了其在臨床上的應(yīng)用。增加脂蟾毒配基的水溶性，保證制劑的均一性、降低毒副作用有利于其安全有效利用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決脂蟾毒配基毒副作用大、溶解度低，不利于制備成液體制劑、以及制備成固體制劑均勻度難以控制等問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種脂蟾毒配基環(huán)糊精包合物及其制備方法和用途。

一種脂蟾毒配基環(huán)糊精包合物，其特征在于：

(1)脂蟾毒配基與環(huán)糊精投料摩爾比為：1:1～100；較優(yōu)為1:2～30；最優(yōu)1:5～20。

(2)本發(fā)明所述的脂蟾毒配基環(huán)糊精包合物，環(huán)糊精選自β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精及環(huán)糊精的衍生物包括但不限于羥丙基β-環(huán)糊精、羥乙基β-環(huán)糊精、甲基β-環(huán)糊精或羧甲基β-環(huán)糊精。

(3)本發(fā)明所述的脂蟾毒配基環(huán)糊精包合物的制備可以通過(guò)溶劑法實(shí)現(xiàn)：將環(huán)糊精溶于適當(dāng)?shù)娜軇﹊中，將脂蟾毒配基用適量溶劑ii溶解后滴加入環(huán)糊精溶液中持續(xù)攪拌至包合物生成，回收溶劑，干燥，所得粉末狀物質(zhì)用溶劑iii洗去未包合的脂蟾毒配基，干燥后得包合物產(chǎn)品。

(4)本發(fā)明所述的溶劑i選自但不限于水、甲醇、乙醇、丙酮、丙醇、異丙醇、丙二醇、丙三醇、二甲基亞砜、n,n-二甲基甲酰胺、四氫呋喃、乙酸乙酯、乙酸甲酯、二氯甲烷、三氯甲烷或它們的混合物；溶劑ii選自但不限于甲醇、乙醇、丙酮、丙醇、異丙醇、丙二醇、丙三醇、二甲基亞砜、n,n-二甲基甲酰胺、四氫呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、石油醚、環(huán)己烷、正己烷或它們的混合物。溶劑iii選自但不限于水、甲醇、乙醇、丙酮、丙醇、異丙醇、丙二醇、丙三醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、石油醚、環(huán)己烷、正己烷及它們的混合物。

(5)本發(fā)明所述的脂蟾毒配基環(huán)糊精包合物的制備可以通過(guò)研磨法實(shí)現(xiàn)，其特征在于，將脂蟾毒配基與環(huán)糊精混勻后經(jīng)適當(dāng)溶劑i調(diào)制成糊狀，加入上述糊狀物中充分研磨至包合物形成，干燥，干燥物用溶劑iii洗滌后，再次干燥即成。

(6)本發(fā)明所述的脂蟾毒配基環(huán)糊精包合物可用于藥物制劑中，特別是抗癌、強(qiáng)心藥物制劑的應(yīng)用。

為了進(jìn)一步了解本發(fā)明及其實(shí)質(zhì)，說(shuō)明如下：

本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

(一)溶液法制備：將環(huán)糊精加入到適量的溶劑i中，配制成質(zhì)量濃度為1-65％的溶液，5-60％較優(yōu)，脂蟾毒配基溶解于適合的溶劑ii中，加至上述環(huán)糊精的溶液中持續(xù)攪拌至包合物生成，回收溶劑，干燥，所得粉末狀物質(zhì)用溶劑iii洗去未包合脂蟾毒配基，干燥后得包合物產(chǎn)品。

溶解環(huán)糊精的溶劑i可以但不限于水、甲醇、乙醇、丙酮、丙醇、異丙醇、丙二醇、丙三醇、二甲基亞砜、n,n-二甲基甲酰胺、四氫呋喃、乙酸乙酯、乙酸甲酯、二氯甲烷、三氯甲烷或它們的混合物。優(yōu)選溶劑為水。

溶解脂蟾毒配基的溶劑ii可以但不限于甲醇、乙醇、丙酮、丙醇、異丙醇、丙二醇、丙三醇、二甲基亞砜、n,n-二甲基甲酰胺、四氫呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、石油醚、環(huán)己烷、正己烷。優(yōu)選為乙醇。

洗滌包和產(chǎn)品的溶劑iii可以但不限于水、甲醇、乙醇、丙酮、丙醇、異丙醇、丙二醇、丙三醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、石油醚、環(huán)己烷、正己烷及它們的混合物。優(yōu)選為乙酸乙酯、乙醚。

(二)研磨法制備：脂蟾毒配基與環(huán)糊精經(jīng)適當(dāng)溶劑i調(diào)制成糊狀，將上述糊狀物充分研磨至包合物形成，干燥，干燥物用溶劑iii洗滌后，再次干燥即成。

調(diào)制環(huán)糊精糊狀物的溶劑i的優(yōu)選溶劑為水。洗滌溶劑iii優(yōu)選為乙酸乙酯、乙醚。

研磨法推薦的研磨設(shè)備為球磨機(jī)、膠體磨、蘭式研磨機(jī)。

制備工藝的干燥過(guò)程可以采用熱風(fēng)干燥、減壓干燥、冷凍干燥或者噴霧干燥，即可得固體包合物。

本發(fā)明所述的脂蟾毒配基環(huán)糊精包合物及制備包合物工藝過(guò)程中脂蟾毒配基與環(huán)糊精投料摩爾比為：1:1～100；較優(yōu)為1:2～30；最優(yōu)1:5～20。

本發(fā)明中的脂蟾毒配基與環(huán)糊精包合物主要通過(guò)以下方法驗(yàn)證：

驗(yàn)證方法一、薄層色譜法(tlc)：

取脂蟾毒配基乙酸乙酯溶液(1mg/ml)，脂蟾毒配基包合物乙醇溶液(1mg/ml)，脂蟾毒配基包合物乙酸乙酯溶液(1mg/ml)，分別點(diǎn)樣1-5μl，在硅膠g-cmc板上展開(kāi)，展開(kāi)劑為環(huán)己烷-二氯甲烷-丙酮(4:3:3),顯色劑為10％硫酸乙醇溶液，結(jié)果見(jiàn)圖1。薄層色譜圖顯示脂蟾毒配基乙酸乙酯溶液與脂蟾毒配基包合物乙醇溶液斑點(diǎn)完全一致(rf＝0.49)，而脂蟾毒配基包合物乙酸乙酯溶液無(wú)斑點(diǎn)，說(shuō)明形成了包合物。

驗(yàn)證方法二、傅里葉紅外光譜法(ft-ir)

ft-ir結(jié)果見(jiàn)圖2。脂蟾毒配基分子中芳香環(huán)上酚羥基的吸收峰在3419cm^-1波數(shù)處，羰基吸收峰在1719cm^-1左右，芳環(huán)骨架上c-h伸縮振動(dòng)在2937cm^-1左右；β環(huán)糊精(β-cd)在3385cm^-1波數(shù)處為多締合體-oh伸縮振動(dòng)峰，2930cm^-1波數(shù)處為甲基、亞甲基的c-h伸縮振動(dòng)峰；在物理混合物的譜圖(c)中脂蟾毒配基和β-cd的吸收峰都明顯存在，只是吸收峰的強(qiáng)度稍有減弱；而包合物的譜圖(d)中脂蟾毒配基的羰基吸收峰明顯向低波處移動(dòng)(1719cm^-1～1708cm^-1)，且羰基的吸收峰強(qiáng)度減弱。羥丙基β環(huán)糊精包合物(hp-β-cd)在3395cm^-1波數(shù)處為多締合體-oh伸縮振動(dòng)峰，2932cm^-1波數(shù)處為甲基、亞甲基的c-h伸縮振動(dòng)峰；在物理混合物的譜圖(f)中脂蟾毒配基和hp-β-cd的吸收峰都明顯存在，只是吸收峰的強(qiáng)度稍有減弱；而包合物的譜圖(g)中脂蟾毒配基的羰基吸收峰明顯向低波處移動(dòng)(1719cm^-1～1709cm^-1)，且羰基的吸收峰強(qiáng)度減弱。以上光譜變化，說(shuō)明脂蟾毒配基分子可能進(jìn)入β-cd、hp-β-cd的空腔中。

驗(yàn)證方法三、差示掃描量熱法(dsc)

dsc結(jié)果見(jiàn)附圖3。從dsc圖譜看出，脂蟾毒配基作為晶體物質(zhì)，在168℃處有明顯的吸熱峰，為其熔融峰；β-cd由于失水的原因，在92℃處有很寬的脫水峰；脂蟾毒配基與β-cd物理混合物、的dsc圖譜(c)基本為藥物與β-cd的疊加；而脂蟾毒配基/β-cd包合物中藥物的熔融峰完全消失，形成一種新的物相。hp-β-cd也由于失水的原因，在66℃處有很寬的脫水峰；脂蟾毒配基與hp-β-cd物理混合物的dsc圖譜(f)基本為藥物與環(huán)糊精的疊加；而脂蟾毒配基/hp-β-cd包合物中藥物的熔融峰完全消失，形成一種新的物相。以上熱力學(xué)性質(zhì)的變化，說(shuō)明脂蟾毒配基與β-cd、hp-β-cd可能形成了包合物。

驗(yàn)證方法四、x-射線衍射法(xrd)

xrd結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖可見(jiàn)，脂蟾毒配基在2θ為7.50°,15.58°,16.66°,18.83°,19.43°,20.55°,22.35°,24.23°位置有一系列強(qiáng)烈的衍射峰，說(shuō)明它具有晶體性質(zhì)；β-cd作為晶體物質(zhì)，其在2θ為9.09°,12.73°,22.71°,32.01°處具有明顯的特征衍射峰；物理混合物為脂蟾毒配基與β-cd的簡(jiǎn)單疊加，除峰的強(qiáng)度有所減弱外沒(méi)有出現(xiàn)新的峰，而脂蟾毒配基/β-cd包合物中rbg的特征衍射峰消失，出現(xiàn)了新的xrd圖譜，說(shuō)明藥物與β-cd己經(jīng)形成了包合物。而hp-β-cd則表現(xiàn)很寬的峰，說(shuō)明hp-β-cd的無(wú)定形性質(zhì)；物理混合物為脂蟾毒配基與hp-β-cd的簡(jiǎn)單疊加，除峰的強(qiáng)度有所減弱外沒(méi)有出現(xiàn)新的峰；脂蟾毒配基/β-cd包合物中脂蟾毒配基的特征衍射峰消失，表現(xiàn)為hp-β-cd的無(wú)定形態(tài)。通過(guò)以上x(chóng)rd圖譜分析，證明脂蟾毒配基可能進(jìn)入了β-cd、hp-β-cd的內(nèi)腔中。

驗(yàn)證方法五、相溶解度的研究

分別配制一系列不同濃度(0～0.015mol/l)的β-cd水溶液，各取5ml上述溶液置10ml具塞試管中，分別加入過(guò)量的脂蟾毒配基密封，置于25℃恒溫振蕩器(120r·min^-1)振蕩48h。待溶液達(dá)到平衡，取上清液經(jīng)0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾，分別取續(xù)濾液1ml用甲醇稀釋到合適的倍數(shù)，使?jié)舛仍跇?biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍內(nèi)。精密吸取上述溶液各20μl，注入高效液相色譜儀，測(cè)定脂蟾毒配基的濃度。以β-cd的濃度(mmol/l)為橫坐標(biāo)，脂蟾毒配基的濃度(mmol/l)為縱坐標(biāo)，繪制平衡相溶解圖。

分別配制一系列不同濃度(0～0.015mol/l)的hp-β-cd水溶液，各取5ml上述溶液置10ml具塞試管中，分別加入過(guò)量的脂蟾毒配基密封，置于25℃恒溫振蕩器(120r·min^-1)振蕩48h。待溶液達(dá)到平衡，取上清液經(jīng)0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾，分別取續(xù)濾液1ml用甲醇稀釋到合適的倍數(shù)，使?jié)舛仍跇?biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍內(nèi)。精密吸取上述溶液各20μl，注入高效液相色譜儀，測(cè)定脂蟾毒配基的濃度。以hp-β-cd的濃度(mmol/l)為橫坐標(biāo)，脂蟾毒配基的濃度(mmol/l)為縱坐標(biāo)，繪制平衡相溶解圖。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖5)，在研究濃度范圍內(nèi)，脂蟾毒配基的溶解度隨β-cd濃度的增加先增加再經(jīng)歷平臺(tái)期，當(dāng)β-cd濃度大于12mmol/l時(shí)，由于微晶態(tài)的包合物沉淀的出現(xiàn)其溶解度逐漸下降。而脂蟾毒配基的溶解度隨hp-β-cd濃度的增加呈非線性增加且負(fù)向偏離直線，說(shuō)明有可溶性包合物的形成。

相溶解度圖通常分為a型和b型，a型是藥物濃度隨著環(huán)糊精濃度增大而增加，可進(jìn)一步分為三個(gè)亞型：al、ap和an；若環(huán)糊精對(duì)藥物以摩爾比1:1進(jìn)行包合物，相溶解度呈線性增加，表現(xiàn)為al型。ap和an型分別為線性增加的正偏差和負(fù)偏差。b型又分為bs和bl型，bs型為隨環(huán)糊精濃度增加，藥物溶解度先上升再經(jīng)歷平臺(tái)期，最后由于微晶態(tài)的包合物沉淀出現(xiàn)而下降；bl型為隨著環(huán)糊精濃度增加，藥物溶解度起初不變，然后逐漸下降，表明難溶性包合物的形成。因此判斷脂蟾毒配基與β-cd、hp-β-cd的相溶解度圖分別為bs型和an型，表明脂蟾毒配基與β-cd、hp-β-cd之間最終均以1:2摩爾比進(jìn)行包合。

本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包括脂蟾毒配基環(huán)糊精包合物和制藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明的脂蟾毒配基環(huán)糊精包合物可采用本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員所公知的方法，制成可作為人用藥物使用的適當(dāng)?shù)氖褂眯问交騽┝啃问健?/p>

所述的藥物組合物，包括但不限定于，液體脂蟾毒配基環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物直接用于制備的輸液、水針、粉針、口服液、糖漿劑等液體劑型；固體脂蟾毒配基環(huán)糊精或環(huán)糊精衍生物包合物制成片劑、膠囊、顆粒劑、分散片、口崩片、含片等多種固體劑型。

優(yōu)選的液體劑型包括脂蟾毒配基羥丙基β-環(huán)糊精包合物的注射液，注射液的濃度為0.001～10(mg/ml)，較優(yōu)為0.01～1(mg/ml)；注射液的ph值為4～7.5；注射液中可含有氯化鈉、葡萄糖等滲透壓調(diào)節(jié)劑。

優(yōu)選的液體劑型還包括脂蟾毒配基羥丙基β-環(huán)糊精包合物脂質(zhì)體的注射液，注射液的濃度為0.01～1(mg/ml)，膽固醇與磷脂的質(zhì)量比較優(yōu)為1:2～10；注射液中可含有氯化鈉、葡萄糖等滲透壓調(diào)節(jié)劑。

所述的粉針劑包括脂蟾毒配基羥丙基β-環(huán)糊精包合物的粉針劑，粉針劑溶解后的ph值為4～7.5，注射液中可含有甘露醇、乳糖等支撐劑。

本發(fā)明的有益效果：

通過(guò)環(huán)糊精對(duì)脂蟾毒配基進(jìn)行包合，使脂蟾毒配基分子包埋于環(huán)糊精分子的管狀結(jié)構(gòu)中，成為脂蟾毒配基環(huán)糊精的包合物，從而提高了脂蟾毒配基的水溶性。本發(fā)明所述的包合物在分子結(jié)構(gòu)上的優(yōu)勢(shì)摩爾比為，脂蟾毒配基:環(huán)糊精＝1:2。經(jīng)測(cè)定在25℃時(shí)，脂蟾毒配基β-環(huán)糊精包合物在水中的溶解度可達(dá)到312μg/ml，比藥物的溶解度(10.35μg/ml)增大30倍；其在ph6.8pbs溶液中的累積溶出度5min就可達(dá)到90％，溶出速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于藥物、藥物與環(huán)糊精及其衍生物的物理混合物，解決了脂蟾毒配基難溶于水的問(wèn)題。

本發(fā)明的脂蟾毒配基-環(huán)糊精包合物具有較好溶解性和抗腫瘤活性，使脂蟾毒配基這一活性成分以包合物的形式直接應(yīng)用于各種固體、液體劑型。

本發(fā)明的脂蟾毒配基-環(huán)糊精包合物，具有水溶性好、毒性低、血管刺激性小的特點(diǎn)，特別適用于制備液體制劑。解決了脂蟾毒配基水溶性差、劑量小、準(zhǔn)確分劑量困難，尤其是注射劑型的技術(shù)問(wèn)題，為臨床提供更安全、穩(wěn)定、療效顯著的藥物。

附圖說(shuō)明

圖1為包合物的薄層色譜檢查；

a：脂蟾毒配基的β環(huán)糊精包合物；b：脂蟾毒配基的羥丙基β環(huán)糊精包合物；

1脂蟾毒配基對(duì)照品；2包合物的乙醇溶液；3包合物的乙酸乙酯溶液。

圖2為脂蟾毒配基及其環(huán)糊精包合物傅里葉紅外光譜；

a：脂蟾毒配基(rbg)，b：β環(huán)糊精(β-cd),c：rbg與β-cd的物理混合物，d：rbg的β-cd包合物，e：羥丙基β環(huán)糊精(hp-β-cd)，f：rbg與hp-β-cd物理混合物，g：rbg的hp-β-cd包合物。

圖3為脂蟾毒配基及其環(huán)糊精包合物差示掃描量熱法結(jié)果(dsc)；

a：脂蟾毒配基(rbg)，b：β環(huán)糊精(β-cd),c：rbg與β-cd的物理混合物，d：rbg的β-cd包合物，e：羥丙基β環(huán)糊精(hp-β-cd)，f：rbg與hp-β-cd物理混合物，g：rbg的hp-β-cd包合物。

圖4為脂蟾毒配基及其環(huán)糊精包合物的x射線衍射分析結(jié)果；

a：脂蟾毒配基(rbg)，b：β環(huán)糊精(β-cd),c：rbg與β-cd的物理混合物，d：rbg的β-cd包合物，e：羥丙基β環(huán)糊精(hp-β-cd)，f：rbg與hp-β-cd物理混合物，g：rbg的hp-β-cd包合物。

圖5為脂蟾毒配基與其環(huán)糊精包合增溶效應(yīng)及相溶解度研究

rbg：脂蟾毒配基；β-cd：β環(huán)糊精；hp-β-cd：羥丙基β環(huán)糊精。

圖6為采用本發(fā)明方法制備的脂蟾毒配基β-環(huán)糊精包合物的溶出曲線圖。

圖7為采用本發(fā)明方法制備的脂蟾毒配基羥丙基β-環(huán)糊精包合物的溶出曲線圖。

圖8為采用本發(fā)明方法制備的脂蟾毒配基環(huán)糊精包合物的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線。

rbg：脂蟾毒配基；5-fu：5-氟尿嘧啶。

圖9為采用本發(fā)明方法制備的脂蟾毒配基β-環(huán)糊精包合物的胃黏膜刺激性實(shí)驗(yàn)的胃黏膜病理組織切片。

陰性對(duì)照組(a)、藥物組(b)、脂蟾毒配基β-環(huán)糊精包合物組(c)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1溶劑法制備一種脂蟾毒配基β-環(huán)糊精包合物

精密稱取7.69mg脂蟾毒配基和22.70mgβ-環(huán)糊精,加入到20ml50％乙醇溶液中,400r/min,50℃磁力攪拌2h使其完全溶解,溶液在50℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸干,減壓真空干燥得白色粉末.用10ml乙酸乙酯洗滌3-5次至洗滌液tlc層析未顯示藥物斑點(diǎn),抽干得白色疏松狀粉末，即得脂蟾毒配基β-環(huán)糊精包合物。

實(shí)施例2溶劑法制備一種脂蟾毒配基羥丙基β-環(huán)糊精包合物

精密稱取7.69mg脂蟾毒配基和28.62mg羥丙基β-環(huán)糊精,加入到20ml50％乙醇溶液中,400r/min,50℃磁力攪拌2h使其完全溶解,溶液在50℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸干,減壓真空干燥得白色粉末.用10ml乙酸乙酯洗滌3-5次至洗滌液tlc層析未顯示藥物斑點(diǎn),抽干得白色疏松狀粉末，即得脂蟾毒配基羥丙基β-環(huán)糊精包合物。

實(shí)施例3溶劑法制備一種脂蟾毒配基γ-環(huán)糊精包合物

精密稱取7.69mg脂蟾毒配基和25.94mgγ-環(huán)糊精,加入到20ml50％乙醇溶液中,400r/min,50℃磁力攪拌2h使其完全溶解,溶液在50℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸干,減壓真空干燥得白色粉末。用10ml乙酸乙酯洗滌3-5次至洗滌液tlc層析未顯示藥物斑點(diǎn),抽干得白色疏松狀粉末，即得脂蟾毒配基γ-環(huán)糊精包合物。

實(shí)施例4溶劑法制備一種脂蟾毒配基羥丙基β-環(huán)糊精包合物工藝的參數(shù)優(yōu)化。操作過(guò)程如實(shí)施例2所述。具體參數(shù)及結(jié)果見(jiàn)表1及表2。

表1因素與水平正交設(shè)計(jì)表

表2正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表2結(jié)果進(jìn)行直觀極差比較。因素a>d>b>c。直觀最優(yōu)條件為a3d2b2c2，即藥物與環(huán)糊精比例1:30，乙醇濃度為50％，包合溫度為40℃，包合時(shí)間為3h時(shí)包合率最高。但是我們注意到，當(dāng)環(huán)糊精比例提高到5倍(a2，a3)以上時(shí)，包合率增加不明顯。所以環(huán)糊精的比例是藥物的5倍即可保證較高的包和率。

實(shí)施例5研磨法制備脂蟾毒配基環(huán)糊精包合

取脂蟾毒配基100mg，加入5倍摩爾比的β-環(huán)糊精混勻后，加入適量水調(diào)成糊狀，置球磨機(jī)內(nèi)研磨24h，取出研磨樣品干燥，干燥后樣品用50ml乙酸乙酯洗滌2次，減壓干燥至完全、粉碎過(guò)篩即得。

脂蟾毒配基的羥丙基-β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精包合物制備方法同上。

所得產(chǎn)品的包和率分別為：93.1，97.2，91.1％。

實(shí)施例6、包合穩(wěn)定常數(shù)的測(cè)定

藥物與環(huán)糊精形成包合物的過(guò)程是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程，該過(guò)程涉及到影響包合物穩(wěn)定性的重要參數(shù)，即包合物的穩(wěn)定常數(shù)(kc)，其值大小反映了藥物與環(huán)糊精衍生物形成包合物時(shí)結(jié)合力的強(qiáng)弱，該值越大，表明形成的包合物越穩(wěn)定。

包合物穩(wěn)定常數(shù)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，脂蟾毒配基與hp-β-cd形成的包合物穩(wěn)定常數(shù)大于β-cd，說(shuō)明脂蟾毒配基與hp-β-cd進(jìn)行包合時(shí)反應(yīng)較容易進(jìn)行，且形成的包合物比β-cd穩(wěn)定。藥物與環(huán)糊精的包合常數(shù)(kc)一般在100-20000l/mol之間，kc值太小則包合物不穩(wěn)定，容易解離，kc值太大則藥物很難從包合物中游離出來(lái)。本發(fā)明所得脂蟾毒配基與環(huán)糊精的包合物的穩(wěn)定常數(shù)適中，適合用于藥物制劑中。

表1.脂蟾毒配基的兩種環(huán)糊精包合物的穩(wěn)定常數(shù)(kc)

實(shí)施例7一種脂蟾毒配基環(huán)糊精包合物脂質(zhì)體

精密稱定處方量的大豆磷脂、膽固醇(膽固醇:磷脂＝1:5，質(zhì)量比)，至10ml無(wú)水乙醇中，65℃磁力攪拌至完全熔融，趁熱注入到350ml預(yù)熱至65℃的含脂蟾毒配基環(huán)糊精包合物(按實(shí)施例4優(yōu)化工藝制備)的磷酸鹽緩沖液(ph＝6.5)中，剪切乳化10-20min，再加入150ml預(yù)熱至65℃的含脂蟾毒配基環(huán)糊精包合物的磷酸鹽緩沖液(ph＝6.5),剪切乳化3-5min，即得脂蟾毒配基環(huán)糊精包合物脂質(zhì)體。

實(shí)施例8脂蟾毒配基β-環(huán)糊精包合物片劑的制備

取按實(shí)施例5方法制備的脂蟾毒配基β-環(huán)糊精包合物適量，與可壓性淀粉、羧甲基淀粉鈉或交聯(lián)pvp粉末，同時(shí)混入硬脂酸鎂、滑石粉等混勻，按直壓法進(jìn)行壓片，得分散片。

實(shí)施例9脂蟾毒配基β-環(huán)糊精包合物膠囊劑的制備

取按實(shí)施例5方法制備的脂蟾毒配基β-環(huán)糊精包合物適量，與適量輔料混勻，直接制?；蛑瞥晌⑼韬螅b膠囊，即得膠囊。將制成的微丸以不同的包衣材料進(jìn)行包衣后，混勻，裝膠囊，即得緩釋/控釋膠囊。

實(shí)施例10脂蟾毒配基羥丙基β-環(huán)糊精包合物粉針劑的制備

取按實(shí)施例4優(yōu)化工藝所制得的脂蟾毒配基羥丙基β-環(huán)糊精包合物適量溶于注射用水中，加入適量乳糖和0.1％活性炭，加熱20分鐘以除熱原后，過(guò)濾除去活性炭，用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾，用注射用水調(diào)至規(guī)定量，所得溶液分裝于西林瓶中，進(jìn)行冷凍干燥，得脂蟾毒配基凍干粉針劑。

實(shí)施例11脂蟾毒配基羥丙基β-環(huán)糊精包合物注射液的制備

取按實(shí)施例4優(yōu)化工藝所制得脂蟾毒配基羥丙基β-環(huán)糊精包合物適量溶于注射用水中，加入適量注射用葡萄糖和0.3％活性炭，加熱20分鐘以除熱原后，過(guò)濾除去活性炭，用0.22μm的微孔濾膜過(guò)濾，用注射用水調(diào)至規(guī)定量，所得溶液分裝，110℃滅菌30分鐘，得脂蟾毒配基葡萄糖注射液。

實(shí)施例12脂蟾毒配基β-環(huán)糊精包合物的溶出度實(shí)驗(yàn)

按照《中國(guó)藥典》2010版二部附錄xc溶出度測(cè)定法第二法(槳法),溶出介質(zhì)為900mlph6.8pbs溶液,溫度為(37±0.5)℃,轉(zhuǎn)速為100rpm。分別精密稱取脂蟾毒配基3mg、脂蟾毒配基與β-環(huán)糊精物理混合物、按實(shí)施例5工藝制備的脂蟾毒配基β-環(huán)糊精包合物(相當(dāng)于脂蟾毒配基3mg)，分別于5、15、30、45、60、90、120、150、180、240min時(shí)取樣5ml(同時(shí)補(bǔ)充等量溶出介質(zhì))，0.45μm微孔濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液20μl,hplc測(cè)定藥物含量.計(jì)算脂蟾毒配基的累積溶出百分率。由結(jié)果可以看出，將脂蟾毒配基制備成β-環(huán)糊精包合物后藥物溶出迅速，結(jié)果見(jiàn)附圖6。

實(shí)施例13脂蟾毒配基hp-β-環(huán)糊精包合物的溶出度實(shí)驗(yàn)

按照《中國(guó)藥典》2010版二部附錄xc溶出度測(cè)定法第二法(槳法),溶出介質(zhì)為900mlph6.8pbs溶液,溫度為(37±0.5)℃,轉(zhuǎn)速為100rpm。分別精密稱取脂蟾毒配基3mg、脂蟾毒配基與hp-β-環(huán)糊精物理混合物、按照實(shí)施例5工藝制備的脂蟾毒配基hp-β-環(huán)糊精包合物(相當(dāng)于脂蟾毒配基3mg)，分別于5、15、30、45、60、90、120、150、180、240min時(shí)取樣5ml(同時(shí)補(bǔ)充等量溶出介質(zhì))，0.45μm微孔濾膜過(guò)濾,取續(xù)濾液20μl,hplc測(cè)定藥物含量.計(jì)算脂蟾毒配基的累積溶出百分率。由結(jié)果可以看出，將脂蟾毒配基制備成hp-β-環(huán)糊精包合物后藥物溶出迅速，結(jié)果見(jiàn)附圖7。

實(shí)施例14脂蟾毒配基-環(huán)糊精包合物的抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)

人肺癌a549細(xì)胞株以含10％胎牛血清dmem培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度37℃、濕度95％，co2濃度5％。細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)至80％-90％細(xì)胞發(fā)生融合時(shí)，用0.5‰胰酶消化液(含edta)消化細(xì)胞以傳代培養(yǎng)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。精密稱取脂蟾毒配基3mg、脂蟾毒配基β-環(huán)糊精包合物21.26mg(相當(dāng)于脂蟾毒配基3.0mg)、脂蟾毒配基hp-β-環(huán)糊精包合物21.15mg(相當(dāng)于脂蟾毒配基3.0mg)，用dmso配制成100μmol/l母液。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以5×10⁴/ml的細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板，置37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，棄去上清液，依次加入含藥物濃度為0.001、0.01、0.1、1、10、100μm的dmem培養(yǎng)液，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，棄去上清液，以每孔加入dmem配制5mg/mlmtt溶液100μl，空白對(duì)照組加100μldmem培養(yǎng)液，37℃、5％co2培養(yǎng)箱中孵育3h后終止培養(yǎng)。然后棄去上清，每孔加入150μldmso，震蕩10min，使細(xì)胞內(nèi)紫色沉淀結(jié)晶物充分溶解于dmso。用酶標(biāo)儀于492nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔光密度(od)值。按以下公式計(jì)算藥物不同濃度下腫瘤細(xì)胞的抑制率，繪制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率曲線。

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率計(jì)算方法為:

ir％＝(1－樣品組平均od值/對(duì)照組平均od值)×100％

由結(jié)果可以看出脂蟾毒配基制備成包合物后抗腫瘤活性沒(méi)有降低，見(jiàn)圖8。

實(shí)施例15脂蟾毒配基β-環(huán)糊精包合物的胃黏膜刺激性實(shí)驗(yàn)

取健康昆明種小鼠15只，體重約(28±1.5)g。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水12h，隨機(jī)分組，包括陰性對(duì)照組(0.5％cmcna組)，實(shí)驗(yàn)組1(rbg4mg/kg),實(shí)驗(yàn)組2(rbg-β-cd包合物4mg/kg)，每組5只。分別灌胃給予上述劑量的0.5％cmc-na混懸液0.3ml。6h后處死小鼠,立即解剖取胃,沿胃大彎剪開(kāi)并用生理鹽水沖洗胃內(nèi)容物,肉眼觀察胃黏膜損傷情況，將小鼠胃浸泡在10％福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋切片，he染色，做病理組織切片觀察。由結(jié)果(圖9)可見(jiàn)，未處理原藥對(duì)胃粘膜有明顯的刺激，可見(jiàn)胃粘膜細(xì)胞有明顯脫落，而經(jīng)環(huán)糊精包合后，未觀察到明顯的刺激性。