相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2014年11月7日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/077,105；2014年12月4日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/087,448；和在2015年10月28日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/247,705的優(yōu)先權(quán)。這些申請(qǐng)的每一個(gè)的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明領(lǐng)域涉及il-6。更具體地，所述領(lǐng)域涉及il-6的調(diào)節(jié)劑及其在治療疾病如眼病中的用途。發(fā)明背景il-6是一種在炎癥、造血(hematopoiesis)、血管生成、細(xì)胞分化和神經(jīng)元存活中具有報(bào)導(dǎo)作用的多效性細(xì)胞因子。本發(fā)明涉及改進(jìn)的il-6抗體及其用途。發(fā)明概述本發(fā)明涉及il-6抗體及其片段(例如抗原結(jié)合片段)或衍生物，以及編碼il-6抗體和片段的核酸。本發(fā)明還涉及此類抗體，片段或衍生物的用途?？贵w及其片段或衍生物可用于例如il-6相關(guān)疾病的治療。在實(shí)施方案中，抗體，其片段或衍生物可結(jié)合(例如，特異性結(jié)合)至il-6，例如，人il-6。在實(shí)施方案中，抗體，其片段或衍生物可結(jié)合(例如，特異性結(jié)合)至il-6的位點(diǎn)ii(例如，人il-6的位點(diǎn)ii)。本文提供的一個(gè)方面是包含重鏈可變區(qū)的分離的抗體或抗原結(jié)合片段，所述重鏈可變區(qū)包含(i)vhcdr1，其包含gyx1lx2nylie的序列(seqidno：45)，(ii)vhcdr2，其包含vx3tpgx4gtin的序列(seqidno：46)和(ii)vhcdr3，其中以下的一個(gè)或多個(gè)(例如，1,2,3或全部)是真實(shí)的：x1不是a，x2不是s，x3不是i，和x4不是s。在實(shí)施方案中，x1不是a，x2不是s，x3不是i和x4不是s。在實(shí)施方案中，x1是v或v的保守取代。在實(shí)施方案中，x2是p或p的保守取代。在實(shí)施方案中，x3是t或t的保守取代。在實(shí)施方案中，x4是g或g的保守取代。在實(shí)施方案中，以下一個(gè)，兩個(gè)，三個(gè)或全部是真實(shí)的：x1是v或v的保守取代，x2是p或p的保守取代，x3的保守取代是t或t的保守取代，和x4是g或g的保守取代。在實(shí)施方案中，x1是v或v的保守取代，x2是p或p的保守取代，x3是t或t的保守取代，和x4是g或g的保守取代。在實(shí)施方案中，x1選自v，i，l和m。在實(shí)施方案中，x1選自v，i和l。在實(shí)施方案中，x2選自p，g和a。在實(shí)施方案中，x2選自p和g。在實(shí)施方案中，x3選自t和s。在實(shí)施方案中，x4選自g和p。在實(shí)施方案中，以下的一個(gè)或多個(gè)(例如，1、2、3個(gè)或全部)是真實(shí)的：x1是v，x2是p，x3是t，和x4是g。在實(shí)施方案中，x1是v，x2是p，x3是t，和x4是g.在實(shí)施方案中，vhcdr3包含seqidno:33的序列。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段具有對(duì)人il-6增加的親和力和/或增加的效力。在實(shí)施方案中，與包含序列，其中以下的一個(gè)或多個(gè)(例如1、2、3個(gè)或全部)是真實(shí)的：x1是a，x2是s，x3是i和x4是s的抗體或抗原結(jié)合片段(例如，其他方面相同的抗體或抗原結(jié)合片段)相比，抗體或抗原結(jié)合片段具有對(duì)人il-6增加的親和力和/或增加的效力。在一些實(shí)施方案中，分離的抗體或其抗原結(jié)合片段包含含有seqidno：31的序列的vhcdr1，含有seqidno：32的序列的vhcdr2和任選地含有seqidno：no：33的序列的vhcdr3。在實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)包含與seqidno：17至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列。在實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)由以下序列組成，所述序列與seqidno：17至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列或者與seqidno：17差別不超過(guò)5個(gè)，4個(gè)，3個(gè)，2個(gè)或1個(gè)氨基酸。在實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)與seqidno：17差別不超過(guò)5個(gè)，4個(gè)，3個(gè)，2個(gè)或1個(gè)氨基酸。在實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)與seqidno：17差別1-5個(gè)氨基酸。在實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)包含與seqidno：37至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列。在實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)由與seqidno：37至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列組成。在實(shí)施方案中，重鏈可變區(qū)與seqidno：37差別不超過(guò)5、4、3、2或1個(gè)氨基酸。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含含有seqidno：37的重鏈可變區(qū)序列。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含由seqidno：37組成的重鏈可變區(qū)序列。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含與seqidno：39至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含與seqidno：39差別不超過(guò)5、4、3、2或1個(gè)氨基酸的序列。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含seqidno：39。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是fab。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含與seqidno：54至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性的序列。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含與seqidno：54差別不超過(guò)5、4、3、2或1個(gè)氨基酸的序列。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含seqidno：54。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是fab。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是scfv。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合包含下列scfv序列或由下列scfv序列組成：qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgyvlpnyliewvrqapgqglewmgvttpgggtinyaqkfqgrvtitadeststaymelsslrsedtavyycarsrwdplyyyaleywgqgttvtvssggggsggggsggggsdivmtqspdslavslgeratincrasesvdnygipfmnwyqqkpgqppklliyaasnrgsgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqseevpltfgqgtkleikrtv(seqidno:52)或divmtqspdslavslgeratincrasesvdnygipfmnwyqqkpgqppklliyaasnrgsgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqseevpltfgqgtkleikrtvggggsggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgyvlpnyliewvrqapgqglewmgvttpgggtinyaqkfqgrvtitadeststaymelsslrsedtavyycarsrwdplyyyaleywgqgttvtvss(seqidno:53)。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含與seqidno：52或seqidno：53至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含seqidno：52或seqidno：53。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是scfv。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含與seqidno：41至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的重鏈序列。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含與seqidno：41差別不超過(guò)5、4、3、2或1個(gè)氨基酸的重鏈序列。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含含有seqidno：41的重鏈序列。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含由seqidno：41組成的重鏈序列。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段與ebi-029或其片段相比具有增加的對(duì)人il-6的親和力和/或增加的效力。在實(shí)施方案中，與包含含有seqidno：4的序列的vhcdr1，含有seqidno：5的序列的vhcdr2，以及任選地含有seqidno：6的序列的vhcdr3的抗體或抗原結(jié)合片段相比，抗體或抗原結(jié)合片段具有增加的對(duì)人il-6的親和力和/或增加的效力。在實(shí)施方案中，與包含含有seqidno：17的重鏈可變區(qū)序列或由seqidno：17組成的重鏈可變區(qū)序列的抗體或抗原結(jié)合片段相比，抗體或抗原結(jié)合片段具有增加的對(duì)人il-6的親和力和/或增加的效力。在實(shí)施方案中，與包含seqidno：24的抗體或抗原結(jié)合片段相比，抗體或抗原結(jié)合片段具有增加的對(duì)人il-6的親和力和/或增加的效力。在實(shí)施方案中，與包含含有seqidno：11的重鏈序列或由seqidno：11組成的重鏈序列的抗體或抗原結(jié)合片段相比，抗體或抗原結(jié)合片段具有增加的對(duì)人il-6的親和力和/或增加的效力。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含表4中所提供的ebi-030或ebi-031的一個(gè)或多個(gè)序列。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含如圖15所示的ebi-030或ebi-031的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域(例如，重鏈序列的fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4、ch1、鉸鏈、ch2和ch3和/或輕鏈序列的fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4和ck中的一個(gè)或多個(gè))。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含重鏈和輕鏈。在實(shí)施方案中，重鏈和輕鏈通過(guò)一個(gè)或多個(gè)二硫鍵連接。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是fab。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是scfv。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是fab、fab’、f(ab’)2、scfv或fv片段。在實(shí)施方案中，與包含ebi-029的一個(gè)或多個(gè)相應(yīng)序列或在wo2014/074905(將其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文)中描述的抗體的序列的抗體或抗原結(jié)合片段相比，抗體或抗原結(jié)合片段具有增加的對(duì)人il-6的親和力和/或增加的效力。在實(shí)施方案中，與托珠單抗(tocilizumab)相比，抗體或抗原結(jié)合片段具有增加的對(duì)人il-6的親和力和/或增加的效力。表4：ebi-029、ebi-030和ebi-031序列的概述aa＝氨基酸；na＝核酸；hc＝重鏈；lc＝輕鏈；vh＝重鏈可變區(qū)；vl＝輕鏈可變區(qū)可以使用本文所述的方法和/或本領(lǐng)域已知的方法評(píng)估增加的親和力和/或增加的效力。在實(shí)施方案中，使用表面等離子體共振(spr)評(píng)估親和力。在實(shí)施方案中，親和力增加至少1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3或4倍。在實(shí)施方案中，效力增加。在實(shí)施方案中，如ic50的降低和/或ic90的降低所指明的，效力增加。在實(shí)施方案中，ic50降低至少5、10、20、30、40或50倍。在實(shí)施方案中，ic50降低至少約50倍。在實(shí)施方案中，ic90降低至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500倍。在實(shí)施方案中，ic90降低至少約100倍。在實(shí)施方案中，例如通過(guò)使用hek-bluetm測(cè)定法或t1165增殖測(cè)定法來(lái)評(píng)價(jià)效力。在實(shí)施方案中，例如，如基于使用本文所述的hek-bluetm測(cè)定法，例如用20pm游離il-6獲得的ic50值或ic90值評(píng)估的，抗體或抗原結(jié)合片段抑制順式-il-6信號(hào)傳遞。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段具有小于47pm的ic50和/或小于4350pm的ic90。在實(shí)施方案中，ic50小于47pm，例如小于40、30、20、10、5、4、3、2或1pm。在實(shí)施方案中，ic90小于4350pm，例如小于4000、2000、1000、100、50、40、30、20、15、10或5pm。在實(shí)施方案中，在用20pmil-6進(jìn)行的hek-bluetm測(cè)定中評(píng)估ic50和/或ic90。在實(shí)施方案中，例如，如基于使用hek-bluetm測(cè)定用20pmil-6獲得的ic50值評(píng)估的，抗體或抗原結(jié)合片段相比于托珠單抗以更高效力阻斷游離il-6。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段與托珠單抗相比以超過(guò)900倍的效力抑制il-6。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是ebi-031或其抗原結(jié)合片段。在實(shí)施方案中，對(duì)于抑制il-6，抗體或抗原結(jié)合片段具有小于15pm的ic50，例如14.2pm的ic50。在實(shí)施方案中，例如，如基于使用本文所述的hek-bluetm測(cè)定法，例如用200pm超(hyper)il-6評(píng)估的，抗體或抗原結(jié)合片段抑制反式-il-6信號(hào)傳遞。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段抑制超il-6的信號(hào)傳遞。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段以比托珠單抗更高的效力，例如以與托珠單抗相比超過(guò)900倍的效力抑制超il-6的信號(hào)傳遞。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段以小于1μm的ic50抑制超il-6的信號(hào)傳遞。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段以小于1nm的ic50抑制超il-6的信號(hào)傳遞。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段以小于100pm或小于50pm的ic50，例如以約14-15pm的ic50抑制超il-6的信號(hào)傳遞。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是ebi-031或其抗原結(jié)合片段。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段抑制順式-il-6信號(hào)傳遞和反式il-6信號(hào)傳遞。在實(shí)施方案中，例如在玻璃體內(nèi)施用后，抗體或抗原結(jié)合片段持續(xù)至少1個(gè)月，2個(gè)月，3個(gè)月，4個(gè)月，5個(gè)月或6個(gè)月有效阻斷眼睛中il-6信號(hào)傳遞。在實(shí)施方案中，例如在玻璃體內(nèi)施用后，抗體或抗原結(jié)合片段持續(xù)至少1個(gè)月，2個(gè)月，3個(gè)月，4個(gè)月，5個(gè)月或6個(gè)月有效阻斷眼睛中95％的il-6信號(hào)傳遞。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段持續(xù)約150天阻斷眼中95％的il-6信號(hào)傳遞。在另一個(gè)方面，本文提供的是分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其包含與seqidno：37至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的重鏈可變區(qū)序列，其中所述重鏈序列包含選自v28，p30，t51和g55的一個(gè)或多個(gè)(例如，1、2、3或4個(gè))氨基酸(氨基酸編號(hào)根據(jù)seqidno：41進(jìn)行)。在另一個(gè)方面，本文提供的是分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其包含與seqidno：39至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列，其中所述序列包含選自v28，p30，t51和g55的一個(gè)或多個(gè)(例如，1、2、3或4個(gè))氨基酸(氨基酸編號(hào)根據(jù)seqidno：41進(jìn)行)。在另一個(gè)方面，本文提供的是分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其包含與seqidno：54至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的序列，其中所述序列包含選自v28，p30，t51和g55的一個(gè)或多個(gè)(例如，1、2、3或4個(gè))氨基酸(氨基酸編號(hào)根據(jù)seqidno：41進(jìn)行)。本文還提供的是分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其包含與seqidno：41至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的重鏈序列，其中所述重鏈序列包含選自v28，p30，t51和g55的一個(gè)或多個(gè)(例如，1、2、3或4個(gè))氨基酸(氨基酸編號(hào)根據(jù)seqidno：41進(jìn)行)。在實(shí)施方案中，相對(duì)于對(duì)照抗體,例如相對(duì)于ebi-029或其片段，抗體或抗原結(jié)合片段具有對(duì)人il-6的增加的親和力。在實(shí)施方案中，相對(duì)于除了其不包含選自v28，p30，t51和/g55的一種或多種氨基酸，并且替代地包含選自a28,s30，i51和s55的一種或多種(例如，1、2、3或4種)氨基酸其他方面相同的抗體或抗原結(jié)合片段，抗體或抗原結(jié)合片段具有增加的對(duì)人il-6的親和力。在實(shí)施方案中，親和力增加至少1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3或4倍。在實(shí)施方案中，使用表面等離子體共振(spr)評(píng)估親和力。在實(shí)施方案中，相對(duì)于對(duì)照抗體，例如相對(duì)于ebi-029或其片段，抗體或抗原結(jié)合片段具有增加的效力。在實(shí)施方案中，相對(duì)于除了其不包含選自v28，p30，t51和/g55的所述一種或多種氨基酸，并且替代地包含選自a28,s30，i51和s55的一種或多種(例如，1、2、3或4種)氨基酸其他方面相同的抗體或抗原結(jié)合片段，抗體或抗原結(jié)合片段具有增加的效力。在實(shí)施方案中，如ic50降低和/或ic90降低所指示的，效力增加。在實(shí)施方案中，ic50降低至少5、10、20、30、40或50倍。在實(shí)施方案中，ic50降低至少約50倍。在實(shí)施方案中，ic90降低至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400或500倍。在實(shí)施方案中，ic90降低至少約100倍。在實(shí)施方案中，使用hek-bluetm測(cè)定或t1165增殖測(cè)定來(lái)評(píng)估效力。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段具有小于47pm的ic50和/或小于4350pm的ic90。在實(shí)施方案中，ic50小于47pm，例如小于40、30、20、10、5、4、3、2或1pm。在實(shí)施方案中，ic90小于4350pm，例如小于4000、2000、1000、100、50、40、30、20、15、10或5pm。在實(shí)施方案中，在使用20pmil-6的hek-bluetm測(cè)定中評(píng)估ic50和/或ic90。在一些實(shí)施方案中，與除了其包含a28，s30，i51和s55在其他方面相同的抗體或抗原結(jié)合片段相比，包含v28，p30，t51和g55的抗體或抗原結(jié)合片段顯示出對(duì)人il-6的改善的親和力和/或改善的效力。在實(shí)施方案中，本文所述的抗體或抗原結(jié)合片段進(jìn)一步包含輕鏈可變區(qū)或其抗原結(jié)合片段，其包含vlcdr1，vlcdr2和vlcdr3。在實(shí)施方案中，vlcdr1包含seqidno：34的序列，vlcdr2包含seqidno：35的序列，并且vlcdr3包含seqidno：36的序列。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段進(jìn)一步包含與seqidno：38至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的輕鏈可變區(qū)序列。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段進(jìn)一步包含輕鏈可變區(qū)序列，其包含seqidno：38或與seqidno：38差別不超過(guò)5、4、3、2或1個(gè)氨基酸。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段進(jìn)一步包含含有seqidno：38的輕鏈可變區(qū)序列。在實(shí)施方案中，輕鏈可變區(qū)序列由seqidno：38組成。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段進(jìn)一步包含與seqidno：42至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％相同的輕鏈序列。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段進(jìn)一步包含與seqidno：42差別不超過(guò)5、4、3、2或1個(gè)氨基酸的輕鏈序列。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段進(jìn)一步包含含有seqidno:42的輕鏈序列。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段進(jìn)一步包含含有seqidno:42或與seqidno：42差別不超過(guò)5、4、3、2或1個(gè)氨基酸的序列的輕鏈序列。在實(shí)施方案中，輕鏈序列由seqidno:42組成。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含(i)包含seqidno：31的序列的vhcdr1，包含seqidno：32的序列的vhcdr2和包含seqidno：33以及(ii)包含seqidno：34的序列的vlcdr1，包含seqidno：35的序列的vlcdr1和包含seqidno：36的序列的vlcdr3。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段除了其具有突變，例如，在所有六個(gè)cdr中總共至多1、2或3個(gè)突變外包含前述cdr。在實(shí)施方案中，突變不降低抗體或抗原結(jié)合片段的親和力和/或效力。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是igg1，igg2，igg3或igg4抗體或其片段。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是igg1或igg2抗體或其片段。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是igg1fab或igg2fab。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是igg2抗體或抗原結(jié)合片段。在實(shí)施方案中，將抗體或抗原結(jié)合片段工程化以減少或消除adcc活性。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是人源化或人單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含含有seqidno：37或由seqidno：37組成的重鏈可變區(qū)，和包含含有seqidno：38或由seqidno：38組成的輕鏈可變區(qū)。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段除了它具有突變，例如總共至多1、2或3個(gè)突變包含前述重鏈和輕鏈可變區(qū)。在實(shí)施方案中，突變不降低抗體或抗原結(jié)合片段的親和力和/或效力。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含含有seqidno：41的重鏈序列和任選地包含seqidno：42的輕鏈序列。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含由seqidno：41組成的重鏈序列和任選地由seqidno：42組成的輕鏈序列。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含含有seqidno：47的重鏈序列和任選地含有seqidno：42的輕鏈序列。在實(shí)施方案中，除了抗體或抗原結(jié)合片段包含突變(例如相對(duì)于seqidno：41和/或seqidno：42的1、2、3、4或5個(gè)總突變)之外，所述抗體或抗原結(jié)合片段包含與seqidno：41相同的重鏈序列和與seqidno：42相同的輕鏈序列。在實(shí)施方案中，突變?cè)诳蚣軈^(qū)中。在實(shí)施方案中，相對(duì)于不包含所述突變的抗體或抗原結(jié)合片段，突變不降低所述抗體或抗原結(jié)合片段的親和力和/或效力。在實(shí)施方案中，除了抗體或抗原結(jié)合片段包含突變(例如相對(duì)于seqidno：47和/或seqidno：42的1、2、3、4或5個(gè)總突變)之外，所述抗體或抗原結(jié)合片段包含與seqidno：47相同的重鏈序列和與seqidno：42相同的輕鏈序列。在實(shí)施方案中，突變?cè)诳蚣軈^(qū)中。在實(shí)施方案中，相對(duì)于不包含所述突變的抗體或抗原結(jié)合片段，突變不降低抗體或抗原結(jié)合片段的親和力和/或效力。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是fab。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是igg1fab。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是包含含有seqidno：39的重鏈序列和含有seqidno：42的輕鏈序列的分離的fab。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是分離的fab，其包含由seqidno：39組成的重鏈序列和由seqidno：42組成的輕鏈序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是igg2fab。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是包含含有seqidno：54的重鏈序列和含有seqidno：42的輕鏈序列的分離的fab。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是分離的fab，其包含由seqidno：54組成的重鏈序列和由seqidno：42組成的輕鏈序列。在實(shí)施方案中，除了抗體或抗原結(jié)合片段包含突變(例如相對(duì)于seqidno：39和/或seqidno：42的1、2、3、4或5個(gè)總突變)之外，所述抗體或抗原結(jié)合片段包含與seqidno：39相同的重鏈序列和與seqidno：42相同的輕鏈序列。在實(shí)施方案中，突變?cè)诳蚣軈^(qū)中。在實(shí)施方案中，相對(duì)于不包含所述突變的抗體或抗原結(jié)合片段，突變不降低抗體或抗原結(jié)合片段的親和力和/或效力。在實(shí)施方案中，除了抗體或抗原結(jié)合片段包含突變(例如相對(duì)于seqidno：54和/或seqidno：42的1、2、3、4或5個(gè)總突變)之外，所述抗體或抗原結(jié)合片段包含與seqidno：54相同的重鏈序列和與seqidno：42相同的輕鏈序列。在實(shí)施方案中，突變?cè)诳蚣軈^(qū)中。在實(shí)施方案中，相對(duì)于不包含所述突變的抗體或抗原結(jié)合片段，突變不降低抗體或抗原結(jié)合片段的親和力和/或效力。在一些實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段可以結(jié)合人il-6的r24、k27、y31、d34、s118或v121中的至少一個(gè)。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段可以結(jié)合人il-6的r24、k27、y31、d34、s118和v121。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段可以結(jié)合人il-6的r24、k27、y31、d34、s118和v121的至少1個(gè)，至少2個(gè)，至少3個(gè)，至少4個(gè)，或至少5個(gè)。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段可以結(jié)合(例如，可以特異性結(jié)合)至人il-6的位點(diǎn)ii。在實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段可以以70℃或更高的tm結(jié)合il-6。在實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段可以以80℃或更高的tm結(jié)合il-6。在實(shí)施方案中，抗體或其片段(例如其抗原結(jié)合片段)結(jié)合至人il-6的r24、k27、y31、d34、s118和v121中的至少一個(gè)。在實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合至人il-6的r24、k27、y31、d34、s118和v121中的至少兩個(gè)。在實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合至人il-6的r24、k27、y31、d34、s118和v121中的至少三個(gè)。在實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合至人il-6的r24、k27、y31、d34、s118和v121中的至少四個(gè)。在實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合至人il-6的r24、k27、y31、d34、s118和v121中的至少五個(gè)。在實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合至人il-6的r24、k27、y31、d34、s118和v121。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是人源化單克隆抗體。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段是人單克隆抗體。在實(shí)施方案中，在ph7.4的pbs中，抗體或抗原結(jié)合片段在100-150mg/ml的濃度，例如在約142mg/ml的濃度顯示<10％的聚集。在實(shí)施方案中，與另一種治療劑相比，例如與托珠單抗，貝伐單抗(bevacizumab)，蘭尼單抗(ranibizumab)和/或相比，抗體或抗原結(jié)合片段具有改善的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。在實(shí)施方案中，當(dāng)施用于眼時(shí)，例如，玻璃體內(nèi)，例如通過(guò)玻璃體內(nèi)注射施用時(shí)，所述抗體或抗原結(jié)合片段具有在眼睛中的改善的保留。在實(shí)施方案中，在眼中改善的保留通過(guò)眼中，例如在玻璃體，視網(wǎng)膜，眼房水，脈絡(luò)膜和/或鞏膜中增加的半衰期來(lái)指示。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段在玻璃體中具有至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天的半衰期。在實(shí)施方案中，玻璃體中的半衰期至少為10天。在實(shí)施方案中，玻璃體中的半衰期在動(dòng)物中，例如在兔或猴中評(píng)估。在實(shí)施方案中，玻璃體中的半衰期在人中評(píng)估。在實(shí)施方案中，與另一種治療劑相比，例如與托珠單抗，貝伐單抗，蘭尼單抗和/或阿柏西普相比，本文所述的抗體或抗原結(jié)合片段具有降低的系統(tǒng)半衰期(例如，較低的t1/2β)和/或更快的系統(tǒng)清除。在實(shí)施方案中，系統(tǒng)半衰期(例如，t1/2β)低于托珠單抗和/或阿柏西普的系統(tǒng)半衰期。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含在對(duì)應(yīng)于h311，d313，i254或h436(編號(hào)如seqidno：41)的一個(gè)或多個(gè)位置包含突變(例如，以1，2，3或4個(gè)突變)的fc域。在實(shí)施方案中，突變選自h311a，h311e，h311n，d313t，i254a，i254r和h436a中的一個(gè)或多個(gè)。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段包含含有對(duì)應(yīng)于h311a的突變的fc域(編號(hào)如seqidno：41)。在實(shí)施方案中，fc域是igg1fc域。在實(shí)施方案中，fc域是igg2fc域。在實(shí)施方案中，fc域是具有seqidno：50的序列并且任選地在一個(gè)或多個(gè)加下劃線位置(h90，d92，i33和h215)包含突變的人igg1fc域：dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:50)。在實(shí)施方案中，igg1fc域包含對(duì)應(yīng)于h90a，h90e，h90n，d92t，i33a，i33r和h215a中的一個(gè)或多個(gè)的突變(根據(jù)seqidno：50編號(hào))。在實(shí)施方案中，fc域是具有seqidno：51的序列并且任選地在一個(gè)或多個(gè)加下劃線位置(h86，d88，i29和h211)包含突變的人igg2fc域：vecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:51)。在實(shí)施方案中，igg2fc域包含對(duì)應(yīng)于h86a，h86e，h86n，d88t，i29a，i29r和h211a(編號(hào)為seqidno：51)的一個(gè)或多個(gè)的突變。在實(shí)施方案中，fc突變減少了抗體或抗原結(jié)合片段的系統(tǒng)積累(例如增加抗體或抗原結(jié)合片段的清除或降低半衰期，例如t1/2β)。在實(shí)施方案中，與另一種治療劑(例如，托珠單抗，貝伐單抗，蘭尼單抗和/或阿柏西普)相比，系統(tǒng)累積減少。在實(shí)施方案中，與托珠單抗和/或阿柏西普相比，系統(tǒng)累積減少。在實(shí)施方案中，與不包含所述突變的相應(yīng)抗體或抗原結(jié)合片段的系統(tǒng)累積相比，系統(tǒng)積累減少。在實(shí)施方案中，在玻璃體內(nèi)施用抗體或抗原結(jié)合片段后評(píng)價(jià)系統(tǒng)累積。在另一方面本文提供了減少抑制受試者中il-6的系統(tǒng)效應(yīng)的方法，所述方法包括向受試者施用包含如本文所述的突變fc域的抗體或其片段。在實(shí)施方案中，與具有野生型fc域的相應(yīng)抗體或其片段相比，抗體或抗原結(jié)合片段可以抑制il-6的活性并具有減少的fc活性(例如減少的與fcrn的結(jié)合)。在一些情況下，減少抑制受試者中il-6的系統(tǒng)效應(yīng)的方法包括向受試者施用包含如本文所述的突變fc域的il-6拮抗劑。在另一方面，本文提供的是包含編碼本文所述的抗體或抗原結(jié)合片段的序列的核酸。在實(shí)施方案中，核酸編碼本文公開(kāi)的氨基酸序列。在實(shí)施方案中，核酸包含seqidno：40，seqidno：43或seqidno：48。在實(shí)施方案中，核酸編碼表4中公開(kāi)的序列。本文還提供了包含核酸的載體。本文還提供了包含核酸或載體的細(xì)胞。在實(shí)施方案中，本文所述的il-6抗體或抗原結(jié)合片段用于治療患有il-6相關(guān)疾病的受試者(例如，人)。在實(shí)施方案中，疾病是眼部疾病，例如以il-6水平升高(例如在玻璃體中)為特征的眼部疾病。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段用于治療患有以下病癥的受試者(例如，人)：糖尿病黃斑水腫(dme)、糖尿病視網(wǎng)膜病、葡萄膜炎(、青光眼、干眼(例如，干眼病或干眼綜合征)、過(guò)敏性結(jié)膜炎、眼部疼痛、孔源性視網(wǎng)膜脫離(rrd)、年齡相關(guān)性黃斑變性(amd)、增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(pdr)、視網(wǎng)膜靜脈阻塞(rvo)、視神經(jīng)脊髓炎(nmo)、角膜移植物、角膜擦傷或?qū)ρ鄣奈锢頁(yè)p傷。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段用于治療患有dme的受試者(例如，人)。對(duì)眼的物理?yè)p傷在實(shí)施方案中，本文所述的il-6抗體或抗原結(jié)合片段用于制備用于治療il-6相關(guān)疾病的藥物。在實(shí)施方案中，該疾病是眼部疾病，例如以玻璃體中升高的il-6水平為特征的眼部疾病。在實(shí)施方案中，il-6相關(guān)疾病是糖尿病黃斑水腫(dme),糖尿病視網(wǎng)膜病,葡萄膜炎,干眼(例如，干眼病或干眼綜合征),年齡相關(guān)性黃斑變性(amd),增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(pdr),孔源性視網(wǎng)膜脫離(rrd),視網(wǎng)膜靜脈阻塞(rvo),視神經(jīng)脊髓炎(nmo),角膜移植物,角膜擦傷，或?qū)ρ鄣奈锢頁(yè)p傷。在實(shí)施方案中，il-6相關(guān)疾病是糖尿病黃斑水腫。在實(shí)施方案中，將藥物配制用于遞送至受試者眼的玻璃體(例如，用于玻璃體內(nèi)注射)。本文還提供了包含本文所述的抗體或抗原結(jié)合片段的組合物。在實(shí)施方案中，組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體和一種或多種藥學(xué)可接受的賦形劑。在實(shí)施方案中，組合物用于治療il-6相關(guān)疾病。在實(shí)施方案中，該疾病是眼部疾病，例如以玻璃體中升高的il-6水平為特征的眼部疾病。在實(shí)施方案中，該組合物用于治療以下病癥：糖尿病黃斑水腫(dme),糖尿病視網(wǎng)膜病,葡萄膜炎,干眼(例如，干眼病或干眼綜合征),年齡相關(guān)性黃斑變性(amd),增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(pdr),孔源性視網(wǎng)膜脫離(rrd),視網(wǎng)膜靜脈阻塞(rvo),視神經(jīng)脊髓炎(nmo),角膜移植物,角膜擦傷,或?qū)ρ鄣奈锢頁(yè)p傷。本文還提供了治療il-6相關(guān)疾病的方法，所述方法包括向受試者施用治療有效量的本文所述的il-6抗體或片段。在實(shí)施方案中，il-6相關(guān)疾病是眼部疾病，例如以玻璃體中升高的il-6水平為特征的眼部疾病。在實(shí)施方案中，il-6相關(guān)疾病是以下病癥：糖尿病黃斑水腫(dme),糖尿病視網(wǎng)膜病,葡萄膜炎,干眼(例如，干眼病或干眼綜合征),年齡相關(guān)性黃斑變性(amd),增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(pdr),孔源性視網(wǎng)膜脫離(rrd),視網(wǎng)膜靜脈阻塞(rvo),視神經(jīng)脊髓炎(nmo),角膜移植物,角膜擦傷,或?qū)ρ鄣奈锢頁(yè)p傷。在實(shí)施方案中，il-6相關(guān)疾病是糖尿病黃斑水腫。在實(shí)施方案中，將抗體或抗原結(jié)合片段或包含抗體或抗原結(jié)合片段的組合物遞送至受試者眼睛的玻璃體(例如，通過(guò)玻璃體內(nèi)注射)。在實(shí)施方案中，抗體或抗原結(jié)合片段或包含抗體或抗原結(jié)合片段的組合物用于玻璃體內(nèi)注射。在實(shí)施方案中，il-6相關(guān)疾病是糖尿病黃斑水腫，并且將抗體或片段或包含所述抗體或抗原結(jié)合片段的組合物遞送至受試者眼睛的玻璃體。本文還提供了抗體或其片段(例如，其抗原結(jié)合片段)(例如本文所述的il-6抗體或其片段)，或包含此類抗體或其片段的組合物，其用于治療il-6相關(guān)疾病(例如，用于治療受試者，例如具有il-6相關(guān)疾病的人受試者)。在實(shí)施方案中，所述疾病是以例如玻璃體中升高的il-6水平為特征的眼睛疾病。在實(shí)施方案中，所述疾病是糖尿病黃斑水腫(dme),糖尿病視網(wǎng)膜病,葡萄膜炎,干眼(例如，干眼癥或干眼病),過(guò)敏性結(jié)膜炎,年齡相關(guān)性黃斑變性(amd),增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(pdr),孔源性視網(wǎng)膜脫離(rrd),視網(wǎng)膜靜脈阻塞(rvo),視神經(jīng)脊髓炎(nmo),角膜移植物,角膜擦傷,或?qū)ρ鄣奈锢頁(yè)p傷。在實(shí)施方案中，所述疾病是dme。在實(shí)施方案中，所述疾病是干眼病。在實(shí)施方案中，所述疾病是干眼綜合征。在實(shí)施方案中，所述疾病是葡萄膜炎。在實(shí)施方案中，所述疾病是amd。在實(shí)施方案中，所述疾病是pdr。在實(shí)施方案中，所述疾病是角膜移植物,角膜擦傷,或?qū)ρ鄣奈锢頁(yè)p傷。在實(shí)施方案中，抗體或其片段(如抗原結(jié)合片段)適合于遞送至眼睛的玻璃體。在實(shí)施方案中，將抗體或其片段(如抗原結(jié)合片段)遞送至眼睛的玻璃體。本發(fā)明還提供了治療il-6相關(guān)疾病的方法，所述方法包括向受試者施用il-6抗體或其片段(如其抗原結(jié)合片段)，例如本發(fā)明所描述的il-6抗體或其片段。在實(shí)施方案中，以治療有效量施用il-6抗體或其片段(如其抗原結(jié)合片段)。在實(shí)施方案中，il-6相關(guān)疾病是以玻璃體內(nèi)升高的il-6水平為特征的眼部疾病。在實(shí)施方案中，所述疾病是糖尿病黃斑水腫(dme)、糖尿病視網(wǎng)膜病、葡萄膜炎、干眼綜合癥、干眼病、年齡相關(guān)性黃斑變性(amd)、增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(pdr)、視網(wǎng)膜靜脈阻塞(rvo)、視神經(jīng)脊髓炎(nmo)、角膜移植物、角膜擦傷或?qū)ρ鄣奈锢頁(yè)p傷。在實(shí)施方案中，抗體或其片段(例如其抗原結(jié)合片段)適合于遞送至眼睛的玻璃體。在實(shí)施方案中，將抗體或其片段(例如其抗原結(jié)合片段)遞送至受試者眼睛的玻璃體。在實(shí)施方案中，il-6相關(guān)疾病是糖尿病黃斑水腫，并且將抗體或其片段遞送至受試者眼睛的玻璃體。本文還提供了包含本文公開(kāi)的il-6抗體或組合物以及任選地用于使用的說(shuō)明書(shū)的試劑盒。本文還提供了容器或裝置，例如藥物遞送裝置，其包含本文公開(kāi)的il-6抗體或組合物。在實(shí)施方案中，將所述裝置配置為用于將抗體或組合物遞送至眼睛，例如玻璃體。本文還提供了包含所述容器或裝置的試劑盒。如本發(fā)明所用，術(shù)語(yǔ)“抗體”與免疫球蛋白含義相同，且在本領(lǐng)域中是公知的。術(shù)語(yǔ)抗體不受制備抗體的任何特定方法的限制。例如，術(shù)語(yǔ)抗體包括，特別是重組抗體、單克隆抗體和多克隆抗體。如本發(fā)明所用，抗體是一種四聚體，且除非另外公開(kāi)，每個(gè)抗體均由兩對(duì)相同的多肽鏈組成，其中每對(duì)具有一個(gè)輕鏈和一個(gè)重鏈。每一條鏈的氨基端包含在抗原識(shí)別中起主要作用的約100到120或更多氨基酸的可變區(qū)。每一條鏈的羧基端包含在抗體效應(yīng)子功能(antibodyeffectorfunction)中起主要作用的恒定區(qū)。人輕鏈的種類被稱為kappa和lambda輕鏈。重鏈種類為mu、delta、gamma、alpha或epsilon，并定義了抗體的同種型?？贵w的同種型分別為igm、igd、igg、iga和ige。在輕鏈和重鏈中，可變區(qū)和恒定區(qū)通過(guò)約12或更多個(gè)氨基酸的“j”區(qū)連接，重鏈還包括一個(gè)約3個(gè)或更多個(gè)氨基酸的“d”區(qū)。每一重鏈/輕鏈對(duì)(vh和vl)的可變區(qū)分別形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。因此，例如完整的igg抗體具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。除雙功能或雙特異性抗體外，所述的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是相同的。抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)表現(xiàn)出通過(guò)3個(gè)高變區(qū)(也稱為互補(bǔ)決定區(qū)或cdr)連接的相對(duì)保守框架區(qū)(fr)的相同通用結(jié)構(gòu)。術(shù)語(yǔ)“可變”指抗體間可變域的某些位點(diǎn)在序列上存在廣泛的差異，并且這些位點(diǎn)涉及每一特定抗體與其特定抗原的結(jié)合和特異性?？勺冃?variability)主要位于cdrs中，其被更加高度保守的框架區(qū)(frs)分開(kāi)。根據(jù)kabatsequencesofproteinsofimmnunologicalinterest(nationalinstitutesofhealth，bethesda，md，1987和1991)或chothia和lesk，jmolbiol196:901-917(1987)；chothia等，nature342:878-883(1989)(其記載了本領(lǐng)域公知的方法)的定義進(jìn)行每個(gè)結(jié)構(gòu)域的氨基酸的分配。“野生型”可指一個(gè)群體中最為普遍的等位基因或種類，或指來(lái)自于未經(jīng)操作的動(dòng)物的抗體，后者是與來(lái)自某種形式的操作的等位基因或多態(tài)性或變體或衍生物相較而言的，所述操作是例如誘變、使用重組方法等來(lái)改變?cè)摽乖Y(jié)合分子的氨基酸。術(shù)語(yǔ)“抗體片段”是指完整或全長(zhǎng)鏈或抗體的一部分，通常為靶結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括但不限于fab、fab’、f(ab’)2和fv片段?！肮δ芷巍被颉翱?il-6的位點(diǎn)ii抗體的類似物”是可防止或?qū)嵸|(zhì)降低il-6結(jié)合到受體的能力、降低il-6/il-6r復(fù)合物結(jié)合到gp130的能力或降低配體結(jié)合到gp130或起始信號(hào)(initialsignaling)的能力。如本文所用，“抗原結(jié)合片段”或“功能片段”通常與“抗體片段”含義相同，并且可指能防止或?qū)嵸|(zhì)降低il-6結(jié)合到受體的能力、降低il-6/il-6r復(fù)合物結(jié)合到gp130的能力或降低配體結(jié)合到gp130或起始信號(hào)能力的片段，例如fv、fab、f(ab')2等。抗體的“衍生物”是包括本文公開(kāi)的抗體的至少一個(gè)cdr的多肽。通常，該衍生物可以結(jié)合至il-6的位點(diǎn)ii?！案?jìng)爭(zhēng)”是指第一抗體或其片段能夠與第二抗體或其片段競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，使得與第二抗體不存在時(shí)第一抗體的結(jié)合相比，在第二抗體存在下，可檢測(cè)到第一抗體與其表位結(jié)合的降低。在某些情況下，該術(shù)語(yǔ)也指在第一抗體存在下，第二抗體與其表位的結(jié)合是可檢測(cè)的降低。在非限制性的例子中，該競(jìng)爭(zhēng)的機(jī)制可通過(guò)位阻、構(gòu)象改變或與共同表位結(jié)合。核酸序列內(nèi)容中的術(shù)語(yǔ)“序列同一性百分比”是指當(dāng)比對(duì)以獲得最大對(duì)應(yīng)時(shí)，兩序列中相同的殘基。序列同一性比較的長(zhǎng)度可以超過(guò)至少約9個(gè)核苷酸，例如，至少約18個(gè)、至少約24個(gè)、至少約28個(gè)、至少約32個(gè)、至少約36個(gè)或至少約48個(gè)或更多個(gè)核苷酸。可以使用本領(lǐng)域中已知的算法測(cè)量核苷酸序列的同一性。例如，可以使用fasta、gap或bestfit(wisconsinpackage10.0版本，geneticscomputergroup(gcg),madison,wi)比較多核苷酸序列。fasta，包括例如程序fasta2和fasta3，提供查詢和搜索序列之間最佳重疊區(qū)域的比對(duì)和序列同一性百分比(pearson,methodsenzymol183:63-98(1990)；pearson,methodsmolbiol132:185-219(2000)；pearson,methodsenzymol266:227-258(1996)；pearson,jmolbio1276:71-84(1998)；通過(guò)引用并入本文)。通常使用特定程序或算法的缺省參數(shù)。例如，可以使用fasta及其缺省參數(shù)(字長(zhǎng)為6和用于計(jì)分矩陣的nopam系數(shù))確定核酸序列間序列同一性百分比，或使用gcg第6.1版提供的具有默認(rèn)參數(shù)的gap來(lái)確定，通過(guò)引用并入本文。氨基酸序列中的術(shù)語(yǔ)“序列同一性百分比”是指當(dāng)比對(duì)以獲得最大對(duì)應(yīng)性時(shí)，兩序列中相同的殘基。序列同一性比對(duì)的長(zhǎng)度可以超過(guò)至少5個(gè)氨基酸殘基，例如，至少20個(gè)氨基酸殘基、至少30個(gè)氨基酸殘基、至少50個(gè)氨基酸殘基、至少100個(gè)氨基酸殘基、至少150個(gè)氨基酸殘基或至少200個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基。通常使用序列分析軟件測(cè)量多肽的序列同一性。用于確定序列同一性百分比的算法是已知的。例如可以使用fasta、gap或bestfit(wisconsinpackage第10.0版，geneticscomputergroup(gcg),madison,wi)比較氨基酸序列。蛋白分析軟件使用比對(duì)多種取代、缺失以及包括保守性氨基酸置換的其他修飾的相似性的測(cè)量來(lái)匹配序列。例如，gcg含有諸如“gap”和“bestfit”程序，它們可以與默認(rèn)參數(shù)一起用來(lái)決定密切相關(guān)的多肽(諸如來(lái)自不同物種之生物的同源性多肽)或野生型蛋白與其類似物之間的序列同源性或序列同一性。參見(jiàn)，例如gcg第6.1版(universityofwisconsin，madison，wi)。多肽序列也可以使用默認(rèn)或建議參數(shù)的fasta(參見(jiàn)gcg第6.1版)來(lái)比對(duì)。fasta(例如fasta2和fasta3)提供查詢和搜索序列之間最佳重疊區(qū)域的比對(duì)和序列同一性百分比(pearson,methodsenzymoi183:63-98(1990)；pearson,methodsmolbioi132:185-219(2000))。當(dāng)要將序列與含有大量來(lái)自不同生物的序列的數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)時(shí)，可以使用的另一種算法是blast，例如blastp或tblastn，使用程序提供的默認(rèn)參數(shù)。參見(jiàn)例如altschul等,jmolbioi215:403-410(1990)；altschul等人，,nucleicacidsres25:3389-402(1997)。當(dāng)樣品的至少約60或75％顯示出單一種類的多肽時(shí)，蛋白或多肽是“基本純凈的，”“基本均質(zhì)的，”或“基本純化的”。多肽或蛋白可以是單體或多聚體。基本純的多肽或蛋白可包含約50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％純品；例如，一個(gè)基本純的多肽或蛋白是50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％純的。蛋白的純度或均質(zhì)性可通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄔu(píng)價(jià)，如蛋白樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳，接著通過(guò)觀察一條或多條與蛋白或多肽相關(guān)的條帶(如在染色的凝膠上)、大小排阻hplc、陽(yáng)離子交換hplc、sds中的減壓毛細(xì)管電泳、肽圖譜或聚糖圖譜。例如可使用現(xiàn)有技術(shù)中的已知方法或其他純化方式實(shí)現(xiàn)高分辨率。當(dāng)指核酸或其片段時(shí)，術(shù)語(yǔ)“基本相似性”是指當(dāng)以適當(dāng)核苷酸插入或缺失，與另一核酸(或其互補(bǔ)鏈)進(jìn)行最佳比對(duì)時(shí)，通過(guò)任何已知的序列同一性算法，如fasta、blast或gap測(cè)量的核苷酸堿基的核苷酸序列的同一性為至少約85％、至少約90％，和至少約95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。當(dāng)用在多肽上時(shí)，術(shù)語(yǔ)“基本同一性”或“基本相似性”是指當(dāng)兩個(gè)多肽序列用如gap或bestfit程序使用默認(rèn)空位權(quán)重進(jìn)行最佳比對(duì)時(shí)，共享至少約70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性；例如，70％、75％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在某些實(shí)施方案中，不相同的殘基位置的差異在于保守氨基酸變化?！爸委熡行Я俊笔侵甘┯迷搫┝康闹委焺⒕徑馑委熂膊〉闹辽僖环N征兆或癥狀或增加或提高可用于治療il-6相關(guān)疾病的另一療法(如另一種治療劑)的預(yù)防和或治療效果。應(yīng)當(dāng)理解治療有效量可以在有限的時(shí)間內(nèi)多劑量施用或作為長(zhǎng)期治療?！爸委煛笔侵妇徑饧膊〉囊环N或多種體征或癥狀的方法。如本發(fā)明所用，術(shù)語(yǔ)“疾病”包括疾病和病癥。本發(fā)明所提到的每一個(gè)專利文件和科學(xué)文章的全部公開(kāi)，以及在此所引用的這些專利文件和科學(xué)文章，出于所有的目的通過(guò)引用明確地并入本文中。本發(fā)明其他的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)在下面詳細(xì)描述。附圖簡(jiǎn)述圖1是說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖表，該實(shí)驗(yàn)在大鼠cnv模型中ivt施用抗il-6抗體。抗vegf抗體作為陽(yáng)性對(duì)照被施用且陰性對(duì)照是載體本身?？?il-6對(duì)載體對(duì)照，第15天時(shí)p＝0.0054，第22天時(shí)p＝0.0005。圖2是說(shuō)明測(cè)試鼠64抗體抑制il-6/il-6r結(jié)合gp130的能力的結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖表。圖3a是說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的圖表，該實(shí)驗(yàn)中測(cè)試了020在缺乏過(guò)多的可溶性il-6rα的情況下阻斷il-6信號(hào)傳導(dǎo)的能力。實(shí)驗(yàn)是在具有0.2ng/mlil-6和2μg/mlil6rα情況中在hek-blue-il-6細(xì)胞上進(jìn)行。圖3b是說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的圖表，該實(shí)驗(yàn)中測(cè)試了020在過(guò)多的可溶性il-6rα存在的情況下阻斷il-6信號(hào)傳導(dǎo)的能力。實(shí)驗(yàn)是在具有0.2ng/mlil-6和2μg/mlil6rα的情況中在hek-blue-il-6細(xì)胞上進(jìn)行。圖4是說(shuō)明在小鼠cnv模型中ivt施用單克隆抗il-6抗體(“il-6阻斷”)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖。對(duì)照為無(wú)處理(對(duì)側(cè)眼)，玻璃體內(nèi)注射抗vegf抗體(“vegf阻斷”)或玻璃體內(nèi)注射抗hrp同種型對(duì)照抗體(“對(duì)照抗體”)。圖5顯示了相對(duì)于野生型抗體(ebi-029)，具有以下突變的抗體與il-6的結(jié)合：(1)i51t/s55g,(2)a28v/i51t/s55g,(3)s30p/i51t/s55g,和(4)a28v/s30p/i51t/s55g(也稱為ebi-030)。圖6顯示了用il-6和下列fab之一處理的hek-bluetmil6報(bào)告細(xì)胞中的信號(hào)傳遞分?jǐn)?shù)(fractionalsignaling)：(1)wt(ebi-029),(2)a28v/i51t/s55g,(3)s30p/i51t/s55g,(4)a28v/s30p/i51t/s55g(ebi-030)。圖7顯示了用il-6和下列fab之一以顯示的濃度處理的t1165.85.2.1細(xì)胞中的發(fā)光(il-6誘導(dǎo)的增殖的量度)：(1)wt(ebi-029),(2)a28v/i51t/s55g,(3)s30p/i51t/s55g,(4)a28v/s30p/i51t/s55g(ebi-030)。圖8顯示了用20pmil-6和各種濃度的以下項(xiàng)處理的hek-bluetmil6報(bào)告細(xì)胞中產(chǎn)生的信號(hào)傳遞：(1)hek-6e細(xì)胞中產(chǎn)生的ebi-029igg2(ebi029),(2)hek-6e細(xì)胞中產(chǎn)生的ebi-030igg2(ebi030),和(3)hek-6e細(xì)胞中產(chǎn)生的ebi-030igg2-h311a(ebi030h311a)；(4)托珠單抗(toci)和(5)穩(wěn)定的cho池中產(chǎn)生的ebi-030igg2(ebi-030cho)。圖9描述了實(shí)施例20中描述的藥代動(dòng)力學(xué)模型。圖10描述了使用實(shí)施例20中描述的藥代動(dòng)力學(xué)模型模擬的增加抗體效力對(duì)眼睛中il-6抑制的持續(xù)時(shí)間的影響。圖11顯示玻璃體內(nèi)施用后玻璃體中ebi-029，ebi-029-h311a，ebi-030，ebi-030-h311a，和托珠單抗(tcz)隨著時(shí)間的藥物濃度。圖12顯示玻璃體內(nèi)施用后視網(wǎng)膜中ebi-029，ebi-029-h311a，ebi-030，ebi-030-h311a，和托珠單抗(tcz)隨著時(shí)間的藥物濃度。圖13顯示玻璃體內(nèi)施用后眼房水中ebi-029，ebi-029-h311a，ebi-030，ebi-030-h311a，和托珠單抗(tcz)隨著時(shí)間的藥物濃度。圖14顯示玻璃體內(nèi)施用后脈絡(luò)膜中ebi-029，ebi-029-h311a，ebi-030，ebi-030-h311a，和托珠單抗(tcz)隨著時(shí)間的藥物濃度。圖15a描繪了ebi-029(seqidno:11),ebi-030(seqidno:41),和ebi-031(ebi-031在本文中也稱為ebi-030-h311a)(seqidno：47)的重鏈序列中的fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3，fr4，ch1，鉸鏈，ch2和ch3中的位置。圖15b描繪了輕鏈序列中的fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3，fr4和ck的位置(ebi-029，ebi-030和ebi-031具有相同的輕鏈序列)(seqidno：12)。圖16a顯示用20pmil-6和各種濃度的ebi-031或托珠單抗處理的hek-bluetmil-6報(bào)告細(xì)胞中的信號(hào)傳遞分?jǐn)?shù)。圖16b顯示用200pm超il-6和各種濃度的ebi-031或托珠單抗處理的hek-bluetmil-6報(bào)告細(xì)胞中的信號(hào)傳遞分?jǐn)?shù)。圖17顯出了實(shí)施例24中描述的計(jì)算模擬的結(jié)果。圖18顯示了由于二硫鍵改組(shuffling)引起的igg2抗體的三種不同結(jié)構(gòu)亞型的示意圖。圖19顯示ebi-031樣品的rp-hplc層析圖：未處理(頂圖)，5mmdtt(中間圖)，10mm半胱氨酸(底圖)。圖20顯示了從不同ebi-031細(xì)胞系收集的ebi-031樣品的rp-hplc層析圖：克隆細(xì)胞系的200l規(guī)模培養(yǎng)物(頂部圖)，來(lái)自親本細(xì)胞系的10l規(guī)模培養(yǎng)物(中間圖)，和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞池(底圖)。圖21顯示了從克隆細(xì)胞系的200l規(guī)模培養(yǎng)物收集的ebi-031的rp-hplc層析圖，并指定和定量層析圖中每個(gè)峰表示的亞型。圖22a是顯示來(lái)自非洲綠猴(k797)的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)的圖，如實(shí)施例26所述。圖22b是顯示來(lái)自非洲綠猴(k679)的藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)的圖，如實(shí)施例26所述。圖23是顯示來(lái)自兩種非洲綠猴(k797或k679)藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)和擬合曲線的圖。圖24a顯示玻璃體內(nèi)施用后玻璃體液中隨著時(shí)間的ebi-031的藥物濃度。圖24b顯示玻璃體內(nèi)施用后眼房水中隨著時(shí)間的ebi-031的藥物濃度。圖24c顯示玻璃體內(nèi)施用后脈絡(luò)膜中隨著時(shí)間的ebi-031的藥物濃度。圖24d顯示玻璃體內(nèi)施用后結(jié)膜中隨著時(shí)間的ebi-031的藥物濃度。圖24e顯示玻璃體內(nèi)施用后角膜中隨著時(shí)間的ebi-031的藥物濃度。圖24f顯示玻璃體內(nèi)施用后虹膜睫狀體中隨著時(shí)間的ebi-031的藥物濃度。圖24g顯示玻璃體內(nèi)施用后晶狀體中隨著時(shí)間的ebi-031的藥物濃度。圖24h顯示玻璃體內(nèi)施用后視網(wǎng)膜中隨著時(shí)間的ebi-031的藥物濃度。圖24i顯示玻璃體內(nèi)施用后鞏膜中隨著時(shí)間的ebi-031的藥物濃度。發(fā)明詳述已經(jīng)暗示il-6在諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的多種疾病中起作用，且已經(jīng)報(bào)道在包括眼部疾病在內(nèi)的多種疾病中顯著上調(diào)。il-6可通過(guò)順式和反式機(jī)制起作用。在順式機(jī)制中，認(rèn)為游離的il-6結(jié)合至膜結(jié)合型il-6受體(il-6r，也稱為il-6rα和cd126)，且然后，il-6/il-6r復(fù)合物與gp130(也稱作cd130、制瘤素m受體、il-6rbeta和il-6信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物)相互作用，以激活含有所述復(fù)合物的細(xì)胞中的信號(hào)傳導(dǎo)。在反式機(jī)制中，游離的il-6結(jié)合可溶性il-6受體(sil-6r)。il-6/sil-6r復(fù)合物然后能夠結(jié)合存在于細(xì)胞膜上的gp130。這些機(jī)制間關(guān)鍵的不同之處在于表達(dá)gp130的細(xì)胞類型多于表達(dá)il-6r(其表達(dá)是更有限的)的細(xì)胞類型。因此在希望抑制il-6信號(hào)傳導(dǎo)的疾病中，例如在那些希望廣泛地抑制il-6信號(hào)傳導(dǎo)的疾病中，抑制順式和反式il-6信號(hào)兩者是有用的。申請(qǐng)人已經(jīng)工程化了il-6拮抗劑，如抗il-6抗體、片段和衍生物，該拮抗劑能夠抑制il-6的順式和反式的信號(hào)傳導(dǎo)。此外，申請(qǐng)人已經(jīng)工程化了這樣的il-6拮抗劑以實(shí)現(xiàn)更快速的系統(tǒng)清除。il-6拮抗劑，例如il-6抗體及其片段或衍生物，描述在wo2014/074905中，將其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本文。本發(fā)明涉及改進(jìn)的il-6抗體及其用途。除非上下文另有明確說(shuō)明，如本文所使用的包括但不限于“一”，“一個(gè)”或“那個(gè)”的單數(shù)術(shù)語(yǔ)包括復(fù)數(shù)。il-6拮抗劑(il-6a)的特點(diǎn)一般而言，本發(fā)明描述的il-6拮抗劑(il-6a)特異地結(jié)合il-6的位點(diǎn)ii(位點(diǎn)2)，且對(duì)于il-6相關(guān)的眼病和某些其他疾病的治療是有用的。il-6相關(guān)的眼病是一種疾病，其中不希望的癥狀或疾病的生物學(xué)活性與il-6的表達(dá)或存在有關(guān)。在一些實(shí)施方案中il-6a對(duì)游離的和結(jié)合的il-6具有高親和力，在機(jī)體中是相對(duì)穩(wěn)定的，能夠抑制結(jié)合到il-6r的il-6(本發(fā)明中被稱為il-6/il-6r復(fù)合物或il-6/il-6r)與gp130的結(jié)合，并且能具有治療效果。一般來(lái)說(shuō)，il-6a是抗體或衍生自抗體。例如，il-6a是高親和性的人源化fab，其能夠特異地結(jié)合il-6的位點(diǎn)ii并有效阻止順式和反式il-6信號(hào)傳導(dǎo)。在另一個(gè)例子中，il-6a是全長(zhǎng)抗體，如igg1或igg2抗體。在一些實(shí)施方案中，fab也被設(shè)置為fc-工程化的序列或位于全長(zhǎng)的抗體中。在一些實(shí)施方案中，fc-工程化的il-6a(如fc-工程化的fab)與適當(dāng)?shù)膶?duì)照相比，如與相應(yīng)的不具有工程化的fc的抗體、其片段或衍生物相比，具有更快的全身清除。il-6a的這些和其他特點(diǎn)在本發(fā)明中被進(jìn)一步描述。申請(qǐng)人已經(jīng)設(shè)計(jì)出選擇地結(jié)合il-6的位點(diǎn)ii的il-6拮抗劑以提供il-6信號(hào)傳導(dǎo)的廣泛抑制，因?yàn)檫@類分子可以抑制gp130與il-6的結(jié)合，無(wú)論il-6是游離的，結(jié)合膜il-6r或結(jié)合sil-6r。此外，靶向配體(il-6)相對(duì)于il-6受體可以避免受體介導(dǎo)的清除和由adcc帶來(lái)的毒性(抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)。由于il-6在疾病中起到病理和保護(hù)性作用，因此使用il-6拮抗劑(il-6a)治療與增加的il-6相關(guān)的疾病可以改善某些方面的狀況，但也可能造成顯著的副作用，如系統(tǒng)性效應(yīng)。這種il-6通路的雙重性(如具有希望的和/或不希望的效應(yīng)的能力)使其不適合作為全身性抑制劑治療il-6相關(guān)病癥。因此，本發(fā)明提供的組合物和方法對(duì)于治療是有用的，所述組合物抑制至少一種il-6的活性但對(duì)il-6的積極活性不具有不當(dāng)?shù)挠绊?，部分因?yàn)樗鼋M合物能被配制為局部遞送，如配制為局部遞送至眼睛。例如，在某些方面，il-6a被設(shè)計(jì)為適合于遞送至特定位點(diǎn)的尺寸。在一些實(shí)施方案中，il-6a是全長(zhǎng)抗體。在一些實(shí)施方案中，il-6a衍生自抗體且處于一種可在眼睛的玻璃體中具有更長(zhǎng)的停留期和有限的系統(tǒng)性漏出(systemicleakage)的方式。在一些實(shí)施方案中，il-6a是修飾的抗體(如具有修飾的fc結(jié)構(gòu)域的抗體)，與相應(yīng)的未修飾的抗體相比，其在眼睛的玻璃體中具有更長(zhǎng)的停留期和/或更為有限的全身性漏出。在一些實(shí)施方案中il-6a是igg2抗體。在一些方面，il-6a是相對(duì)小的il-6a，如抗體的片段或其他抗體衍生物即小于全長(zhǎng)抗體，例如衍生自il-6抗體的fab。在一些情況下，il-6a處于一種能夠從一個(gè)組織的一部分傳遞到另一個(gè)組織并與相應(yīng)的全長(zhǎng)il-6抗體相比具有增加的動(dòng)力學(xué)的形式。在一些實(shí)施方案中，il-6a是被工程化為更大分子的fab，其與fab單獨(dú)相比更可能在被遞送的區(qū)域中具有延長(zhǎng)的停留，例如il-6a通過(guò)fc結(jié)構(gòu)域二聚化。在某些實(shí)施方案中，fc結(jié)構(gòu)域被工程化從而使fc部分具有消弱的(ablated)或減弱的fcrn結(jié)合，從而可以與包含野生型fc的相同的il-6結(jié)合體(il-6bindingentity)相比減少全身積累。工程化的fc域可以是，例如，igg1結(jié)構(gòu)域或igg2結(jié)構(gòu)域。通常，本發(fā)明所描述的il-6拮抗劑對(duì)其靶標(biāo)il-6具有足夠高的親和性從而有效改善il-6的至少一個(gè)不希望的效應(yīng)，并且還是足夠穩(wěn)定的以有助于其作為治療劑。一般而言，il-6a的pk，如適合用在眼睛中的il-6a在遞送的位點(diǎn)(如玻璃體)中具有提供治療效果的足夠長(zhǎng)的半衰期。在非限定的例子中，所述pk可以是至少8天、10天、14天、21天、28天或30天的半衰期。結(jié)合到位點(diǎn)ii的il-6拮抗劑的鑒定一般來(lái)說(shuō)，本領(lǐng)域中已知的任何方法都可用于生產(chǎn)能夠結(jié)合il-6的分子，例如，實(shí)驗(yàn)中，多肽文庫(kù)或分子文庫(kù)可用于篩選具有結(jié)合到il-6的能力的多肽或化合物的候選化合物。一旦鑒定了該候選化合物，可以使用本領(lǐng)域中已知的方法確定化合物的結(jié)合位點(diǎn)。例如，可以測(cè)試分子結(jié)合到野生型il-6的能力并將該結(jié)合力與該分子與在位點(diǎn)i、位點(diǎn)ii或位點(diǎn)iii突變了的il-6的結(jié)合能力作比較。在實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的il-6a保留結(jié)合到il-6/il-6rα復(fù)合物和結(jié)合到il-6的能力，并阻止il-6/il-6rα結(jié)合到gp130。在實(shí)施方案中，例如本發(fā)明所述的il-6a通過(guò)與il-6的位點(diǎn)ii的結(jié)合能夠與gp130競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合il-6/il-6rα復(fù)合物?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的方法測(cè)定該結(jié)合能力。例如，可使用hek-bluetmil-6測(cè)定系統(tǒng)(invivogen,sandiego)測(cè)試il-6a候選物。hek-bluetmil-6細(xì)胞是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了人il-6r和stat3-可誘導(dǎo)seap報(bào)告基因的hek293細(xì)胞。在il-6存在下，stat3被激活且seap被分泌。例如可以使用quanti-bluetm(invivogen,sandiego)測(cè)定seap。向細(xì)胞加入il-6拮抗劑抑制了游離和可溶性受體與il-6的結(jié)合，從而阻止了seap的分泌或降低了seap的水平。kd指特定抗體-抗原相互作用或抗體片段-抗原相互作用的結(jié)合親和平衡常數(shù)。在實(shí)施方案中，本文描述的抗體或抗原結(jié)合片段以低于或等于250pm，如低于或等于225pm、220pm、210pm、205pm、150pm、100pm、50pm、20pm、10pm或1pm的kd與抗原(例如il-6)特異性結(jié)合。可使用現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法確定kd，例如表面等離振子共振，如使用biacoretm系統(tǒng)確定kd。koff指特定抗體-抗原相互作用或抗體片段-抗原復(fù)合物的解離速率常數(shù)?？墒褂帽砻娴入x振子共振，例如使用biacoretm系統(tǒng)確定解離速率常數(shù)。一個(gè)相對(duì)慢的koff可產(chǎn)生治療所希望的特征，如允許以低頻率向需要該治療的個(gè)體施用抑制劑。特異性在一些實(shí)施方案中，本文所述的il-6a特異性結(jié)合靶物，例如il-6。通常，本文所用的“特異性結(jié)合”指示分子優(yōu)先結(jié)合選擇的分子并且展示對(duì)一種或多種其它分子的低得多的結(jié)合親和力。在實(shí)施方案中，對(duì)另一分子的結(jié)合親和力比對(duì)靶物的結(jié)合親和力低1、2、3或更多個(gè)數(shù)量級(jí)。如上文所討論，il-6可作為游離il-6和作為結(jié)合到可溶性il-6rα的il-6存在。申請(qǐng)人已經(jīng)鑒定出，與結(jié)合il-6位點(diǎn)i的抑制劑相比，il-6的位點(diǎn)ii是il-6拮抗劑的最佳靶點(diǎn)。位點(diǎn)i的抑制劑可抑制游離il-6與il-6rα的結(jié)合。然而，該抑制劑不能阻止由事先存在的復(fù)合物所引起的活性，除非通過(guò)替換，其受限于il-6/il-6r復(fù)合物的koff。在另一個(gè)可選方案中，結(jié)合il-6rα的抑制劑是不太合適的，因?yàn)槌瞧湟燥柡蜐舛却嬖?，該抑制劑具有有限的阻止il-6活性的能力。由于il-6受體的量較il-6的量通常是相當(dāng)高的，因此這種方法可能需要施用不期望的大量的通過(guò)與受體結(jié)合來(lái)抑制il-6活性的化合物。在實(shí)施方案中，本發(fā)明所描述的il-6拮抗劑(如本發(fā)明所描述的抗體和片段及其衍生物)能夠甚至當(dāng)il-6結(jié)合到il-6r時(shí)阻斷il-6的活性。因此，本發(fā)明所描述的il-6a的優(yōu)勢(shì)在于與靶向il-6受體的抑制劑相比，實(shí)現(xiàn)治療效果所需施用的化合物的量相對(duì)較小?？故荏w抗體已被報(bào)道通過(guò)受體介導(dǎo)的清除被快速清除，這顯著限制了抗體的pk，因此需要加大劑量、更高頻給藥或使用前述兩者。另外，抗受體抗體和抗位點(diǎn)iil-6抗體的問(wèn)題在于它們通過(guò)阻斷配體的正常受體介導(dǎo)的清除途徑顯著地增加了il-6的組織濃度，從而使受試者處于組織中il-6的潛在不需要的水平。此外，使用靶向il-6rα的抑制劑可能使抑制劑必需存在于尋求抑制劑的位點(diǎn)和不希望的位點(diǎn)(如全身治療)附近。使用與位點(diǎn)ii(gp130結(jié)合該位點(diǎn))結(jié)合的il-6a允許抑制游離的il-6以及結(jié)合了il-6r的il-6，但并不激活經(jīng)過(guò)gp130的il-6途徑。因此，不受理論的限制，本發(fā)明所描述的il-6拮抗劑被設(shè)計(jì)為結(jié)合兩種形式的il-6(可溶的和結(jié)合到受體的)，特別是結(jié)合到il-6的位點(diǎn)ii的拮抗劑，該拮抗劑能夠結(jié)合兩種形式的il-6。本發(fā)明所描述的包含il-6a的組合物可通過(guò)il-6抑制順式和反式信號(hào)。在某些情況下，本發(fā)明所提供的化合物和方法被設(shè)計(jì)為提供一種有效的il-6阻斷劑，其足以治療至少一種il-6相關(guān)病癥的征兆或癥狀，如抑制血管發(fā)生和/或炎癥。本發(fā)明所描述的化合物還可用于治療以不期望的高水平il-6為特征的眼病，如在玻璃體中的疾病(參見(jiàn)yuuki等人，,jdiabetescompl15:257(2001)；funatsu等人，,ophthalmology110:1690,(2003)；oh等人，,curreyeres35:1116(2010)；noma等人，,eye22:42(2008)；kawashima等人，,jpnjophthalmol51:100(2007)；kauffman等人，,investophthalmolvissci35:900(1994)；miao等人，,molecvis18:574(2012))。通常，本發(fā)明所描述的il-6a是il-6信號(hào)傳導(dǎo)強(qiáng)效拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，本文所述的il-6a對(duì)il-6具有高親和力，例如，在使用10pmil-6的hek-blueil-6試驗(yàn)中ic50小于或等于100pm。可根據(jù)il-6a的kd確定il-6a的高親和性，例如，小于或等于1nm的kd、小于或等于500pm的kd、小于或等于400pm的kd、小于或等于300pm的kd、小于或等于240pm的kd或小于或等于200pm的kd。為了制備可用于治療與增加的il-6表達(dá)或活性有關(guān)病癥的生物制劑il-6a(例如蛋白或多肽如抗體、片段或其衍生物)，通常最好是所述生物制劑il-6a具有高的產(chǎn)率。例如，合適的產(chǎn)率為高于或等于1g/l(如高于或等于2g/l、高于或等于5g/l或高于或等于10g/l)。為了有效地施用il-6拮抗劑，需要抑制劑具有與將要施用的濃度相匹配的溶解度。例如，在全長(zhǎng)抗體的il-6a的情況下，其溶解度大于或等于20mg/ml、大于或等于10mg/ml、大于或等于5mg/ml或大于或等于1mg/ml。另外，抑制劑必須具有遞送的體溫下的高度穩(wěn)定性和活性位點(diǎn)及儲(chǔ)存穩(wěn)定性從而成為一種可行的治療。在實(shí)施方案中，抑制劑具有高于或等于60℃的tm(如高于或等于60℃、高于或等于62.5℃、高于或等于65℃、高于或等于70℃、高于或等于73℃、或高于或等于75℃)。在實(shí)施方案中，抑制劑具有高于或等于45℃的tonset，如高于或等于50℃、高于或等于51℃、高于或等于55℃或高于或等于60℃。可以用本領(lǐng)域已知的方法確定tm和tonset的方法?？蓮谋绢I(lǐng)域中已知的分子的類型中選擇具有所需要的特性的拮抗劑，例如抗體，包括靶向il-6的位點(diǎn)ii的抗體的片段和衍生物，其一般保留或維持足夠的親本il-6抗體的特征(如需要的結(jié)合特性)。該拮抗劑包括fab片段、scfvs、工程化的含有fc部分的fab片段，以及工程化的具有不同于親本il-6的位點(diǎn)ii靶向抗體框架的全長(zhǎng)抗體。在一些方面中，本發(fā)明所描述的il-6a包括人抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)能夠競(jìng)爭(zhēng)或交叉競(jìng)爭(zhēng)能夠結(jié)合il-6的位點(diǎn)ii的抗體或其片段。例如，抗體或其片段可以由本發(fā)明中公開(kāi)的vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域組成，且vh和vl結(jié)構(gòu)域包含本發(fā)明中公開(kāi)的il-6/位點(diǎn)ii結(jié)合抗體的一組cdrs?？墒褂萌魏魏线m的方法，例如通過(guò)突變il-6上的多種位點(diǎn)來(lái)確定與il-6a結(jié)合的結(jié)構(gòu)域和/或表位。那些含有突變的表位阻止或降低il-6a的結(jié)合，且il-6配體直接參與與il-6a的結(jié)合或如通過(guò)影響il-6的構(gòu)型間接影響結(jié)合位點(diǎn)?？梢允褂闷渌椒ù_定il-6a所結(jié)合的氨基酸。例如，可以使用肽-結(jié)合掃描，如基于pepscan的酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(elisa)。在這種類型的肽-結(jié)合掃描中，源自抗原的短重疊肽被系統(tǒng)地針對(duì)其與結(jié)合成員的結(jié)合進(jìn)行篩選。所述肽可以共價(jià)地連接于支持物表面，以形成肽陣列。肽可以是線性的或受限的構(gòu)象?？梢允褂迷诿恳浑男蛄械哪┒司哂邪腚装彼?cys)殘基的多肽產(chǎn)生受限的構(gòu)象?？蓪ys殘基直接或間接共價(jià)偶聯(lián)到支持物表面從而使肽保持環(huán)形構(gòu)象。因此，所述方法中所使用的肽可能具有一個(gè)添加在與抗原片段相關(guān)的肽的每一末端的cys殘基。還可使用雙環(huán)形肽，其中cys殘基額外地定位于或靠近肽序列的中間部位?？蓪ys殘基直接或間接共價(jià)偶聯(lián)到支持物表面從而使肽形成雙環(huán)的在中央cys殘基的每一側(cè)具有一個(gè)環(huán)的構(gòu)象。可以合成產(chǎn)生肽，因而可以在需要的位置修飾cys殘基，盡管其不是在il-6的位點(diǎn)ii序列天然發(fā)生的。任選地，可在肽-結(jié)合試驗(yàn)中篩選線性或構(gòu)象受限的肽。肽-結(jié)合掃描可包括鑒定(如使用elisa)一組結(jié)合到結(jié)合成員的肽，其中所述肽具有與il-6a的片段相對(duì)應(yīng)的氨基酸序列(如包括il-6a的約5、10或15個(gè)連續(xù)殘基的肽)，以及比對(duì)所述肽以確定結(jié)合成員所結(jié)合的殘基的足跡，其中該足跡包含重疊肽共同的殘基?？蛇x地或額外地，可以使用肽-結(jié)合掃描方法以至少選定的信號(hào)：噪音比鑒定il-6a要結(jié)合的肽。可使用本領(lǐng)域中已知的其他方法確定抗體所結(jié)合的殘基，和/或確認(rèn)肽-結(jié)合掃描結(jié)果，包括例如，定點(diǎn)突變(如本發(fā)明所描述的)、氫氘交換、質(zhì)譜、nmr和x-射線晶體法。一般地，本發(fā)明所描述的有用的il-6a是人抗體分子、人源化抗體分子或其結(jié)合片段。通常，抗體是單克隆抗體。該抗體的來(lái)源可以是人、小鼠、大鼠、駱駝、兔子、羊、豬或牛，且可按照那些本領(lǐng)域中已知的方法生產(chǎn)所述抗體。通常，il-6a至少包含抗體的cdr，所述cdr特異地結(jié)合至il-6(例如人il-6)，例如結(jié)合至il-6的位點(diǎn)ii。帶有本發(fā)明的cdr或一組cdrs的結(jié)構(gòu)可以是抗體重鏈或輕鏈序列或其實(shí)質(zhì)性部分，在重鏈和輕鏈中cdr或一組cdrs位于天然發(fā)生的由重排免疫球蛋白基因編碼的vh和vl抗體可變結(jié)構(gòu)域的cdr或一組cdrs的對(duì)應(yīng)位置。可通過(guò)參考kabat等人，1983(國(guó)立健康研究院)以及使用任何因特網(wǎng)搜索引擎在“kabat”下查找到的更新(updates)來(lái)確定免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)和位置。如本文公開(kāi)的il-6a通常是一般包含抗體vh結(jié)構(gòu)域和/或vl結(jié)構(gòu)域的抗體。vh結(jié)構(gòu)域包含一組重鏈cdrs(vhcdrs)，以及vl結(jié)構(gòu)域包含一組輕鏈cdrs(vlcdrs)。本文在實(shí)施例中提供了此類cdrs的例子。抗體分子可包含含有vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3和框架的抗體vh結(jié)構(gòu)域。其可選地或還包含含有vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3和框架的抗體vl結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明所公開(kāi)的il-6拮抗劑包含如那些在本發(fā)明中所公開(kāi)的vhcdr1和/或vhcdr2和/或vhcdr3和/如那些在本發(fā)明中所公開(kāi)的vlcdr1和/或vlcdr2和/或vlcdr3。il-6a可包含一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明所描述的任何抗體、片段或衍生物的cdrs。il-6a可包含一組vhcdrs(如vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3)，且可選地其還可以包含一組vlcdrs(如vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3)。cdrs可源于一種或多種本發(fā)明所描述的抗體、片段或衍生物。例如，vlcdrs可源于與vhcdrs相同或不同的抗體。通常，vh結(jié)構(gòu)域與vl結(jié)構(gòu)域配對(duì)以提供一個(gè)抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)。例如seqidno：1或seqidno：3的hc結(jié)構(gòu)域與seqidno：2的lc結(jié)構(gòu)域配對(duì)。在某些情況下，vh或vl結(jié)構(gòu)域獨(dú)自可以用作il-6a。在某些方面，il-6a是抗體分子、片段或其衍生物，其包含(i)與本發(fā)明所描述的vh結(jié)構(gòu)域(例如seqidno：37)具有至少60、70、80、85、90、95、98或99％氨基酸序列同一性的vh結(jié)構(gòu)域序列，或(ii)來(lái)自vh域序列的一組vhcdrs(如，vhcdr1、vhcdr2和/或vhcdr3)。在實(shí)施方案中，抗體分子、片段或其衍生物包含seqidno：37的vhcdr1、vhcdr和vhcdr3。在實(shí)施方案中，抗體分子、片段或其衍生物包含整體上與seqidno：37的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3的差異不超過(guò)1個(gè)、不超過(guò)2個(gè)、不超過(guò)3個(gè)、不超過(guò)4個(gè)或不超過(guò)5個(gè)氨基酸的vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3。抗體分子、片段或其衍生物還可以任選地包含(i)與本發(fā)明所描述的vl結(jié)構(gòu)域(例如seqidno：38的vl結(jié)構(gòu)域)具有至少60、70、80、85、90、95、98或99％氨基酸序列同一性的vl結(jié)構(gòu)域序列，或(ii)來(lái)自vl域的一組vlcdrs(如，vlcdr1、vlcdr2和/或vlcdr3)。在實(shí)施方案中，抗體分子、片段或其衍生物包含seqidno：38的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。在實(shí)施方案中，抗體分子、片段或衍生物包含整體上與seqidno：38的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3的差異不超過(guò)1個(gè)、不超過(guò)2個(gè)、不超過(guò)3個(gè)、不超過(guò)4個(gè)或不超過(guò)5個(gè)氨基酸的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。能夠用于計(jì)算兩氨基酸序列百分比同一性的算法包括例如blast、fasta，或smith-waterman算法，如采用缺省參數(shù)。本發(fā)明所描述的il-6a可包含抗體恒定區(qū)或其部分，如人抗體恒定區(qū)或其部分。例如，vl結(jié)構(gòu)域可以在其c-末端附著包括人ck或cl鏈的抗體輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域。相似的，基于vh結(jié)構(gòu)域的il-6a能夠在其c-末端附著免疫球蛋白重鏈的全部或部分(如ch1結(jié)構(gòu)域)，該重鏈源于任何同種型抗體，如igg、iga、ige和igm以及任何的同種型亞類，特別是igg1、igg2、igg3和igg4。在實(shí)施方案中，將抗體或抗原結(jié)合片段工程化以減少或消除adcc活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是igg2抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體包含如本文所述的igg2框架，igg2恒定區(qū)或igg2fc區(qū)。igg2抗體可以作為三種主要結(jié)構(gòu)亞型存在：igg2-a，igg2-b和igg2-a/b(wypychj.等人，journalofbiologicalchemistry.2008,383：16194-16205)。這種結(jié)構(gòu)異質(zhì)性是由于將fab臂連接到重鏈鉸鏈區(qū)的二硫鍵的不同構(gòu)型。在igg2-a亞型中，沒(méi)有將fab臂連接到鉸鏈區(qū)的二硫鍵。在igg2-b亞型中，兩個(gè)fab臂具有將重鏈和輕鏈與鉸鏈區(qū)連接的二硫鍵。igg2-a/b亞型是igg2-a和igg2-b亞型之間的混雜，其中僅一個(gè)fab臂具有將fab臂的重鏈和輕鏈連接到鉸鏈區(qū)的二硫鍵。兩種或所有不同結(jié)構(gòu)亞型之間的igg2抗體的轉(zhuǎn)化，也稱為二硫鍵改組，天然地發(fā)生于在體內(nèi)和體外的天然存在和重組抗體中。因此，本領(lǐng)域中igg2抗體的制劑包含igg2-a，igg2-b和igg2-a/b亞型的異質(zhì)混合物。不同的igg2亞型可以具有獨(dú)特和不同的功能性質(zhì)，例如在穩(wěn)定性，聚集，粘度，fc受體結(jié)合或效力中的差異。igg2抗體制劑中多種亞型的存在或特定亞型增加的水平可以不利地影響穩(wěn)定性，聚集或效力。本發(fā)明提供了具有主要以igg2-a或igg2-a/b亞型存在的優(yōu)點(diǎn)的抗體。本發(fā)明的抗體不以igg2-b亞型存在，或者在大量的時(shí)間中不以igg2-b亞型存在。因此，包含本發(fā)明抗體的組合物和制劑與本領(lǐng)域已知的其它igg2抗體相比是較少的異質(zhì)性的，并且因此更優(yōu)選地用于治療應(yīng)用。包含本發(fā)明抗體的組合物主要包含抗體的igg2-a和/或igg2-a/b亞型。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含本文所述抗體的組合物包含至少50、60、70、80、90、95、96、97、98或99％的igg2-a或igg2-a/b亞型的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含本文所述的抗體的組合物總的來(lái)說(shuō)包含至少60、70、80、90、95、96、97、98或99％的igg2-a和igg2-a/b亞型。在此類實(shí)施方案中，包含本文所述抗體的組合物不包含大量的igg2-b亞型的抗體。例如，組合物包含少于10％，5％，2％，1％，0.5％或0.1％的igg2-b亞型的抗體。在某些情況下，本發(fā)明的抗體被進(jìn)一步使用本領(lǐng)域已知的方法修飾以制備具有特定同種異型(allotype)的序列，例如一種在具有特定地域起源的人群中占主導(dǎo)地位的同種異型。在某些情況下，修飾人類重鏈恒定區(qū)以達(dá)到該目的。il-6a可以是抗體分子、其結(jié)合片段或變體，其具有在抗體框架內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)cdrs，例如一組cdrs。例如，抗體(例如本發(fā)明所描述的抗體或其片段或衍生物)的一個(gè)或多個(gè)cdrs或一組cdrs可以被移植到框架中(如人框架)以提供抗體分子?？蚣軈^(qū)可以是源自人種系基因序列，或可以是非種系來(lái)源的。vh和/或vl框架殘基可以如所討論的那樣被修飾并在本發(fā)明中作為例子，如使用位點(diǎn)特異性突變?？梢栽谠醋园邢騣l-6的位點(diǎn)ii的抗體il-6a(本發(fā)明中定義為“參考il-6抗體”)的一個(gè)或多個(gè)框架區(qū)和/或一個(gè)或多個(gè)cdrs中使用本領(lǐng)域已知的方法和參數(shù)進(jìn)行氨基酸改變。本發(fā)明中還包括所產(chǎn)生的il-6拮抗劑，其保留了與il-6的位點(diǎn)ii(如人il-6的位點(diǎn)ii)的結(jié)合且與參考il-6抗體相比通常具有至少相同的結(jié)合或提高的親和力。在一些情況下，為了改善諸如穩(wěn)定性的參數(shù)，可以引入導(dǎo)致與參考il-6a(如參考抗體)相比降低的結(jié)合親和力的變化以制備有用的il-6a。在某些實(shí)施方案中，例如在某些情況下，其中所述參考涉及fcrn結(jié)合或藥代動(dòng)力學(xué)(pk)參數(shù)，如在玻璃體中的半衰期或全身的半衰期(如，在血液、血漿、血清、淋巴、肝、腎、其他組織或體液)，參考抗體可以是非特異地結(jié)合il-6的抗體。il-6a多肽的氨基酸序列中的變化可包括用非天然發(fā)生或非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸取代一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，將一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基修飾為非天然發(fā)生或非標(biāo)準(zhǔn)形式，或在序列中插入一個(gè)或多個(gè)非天然發(fā)生或非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸。本發(fā)明序列中改變的數(shù)量和位置的例子在本發(fā)明別處描述。天然發(fā)生的氨基酸包括20種“標(biāo)準(zhǔn)的”l-氨基酸，其由它們的標(biāo)準(zhǔn)單字母被確定為g、a、v、l、i、m、p、f、w、s、t、n、q、y、c、k、r,、h、d、e。非天然發(fā)生氨基酸包括任何其他能夠滲入多肽骨架或源自已有氨基酸殘基修飾的殘基。非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸可以是天然發(fā)生或非天然發(fā)生的氨基酸。本領(lǐng)域已知數(shù)種天然發(fā)生的非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，如4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸、3-甲基組氨酸和n-乙酰絲氨酸。那些在n-alpha位置衍生化的氨基酸殘基將僅能位于氨基酸序列的n-末端。氨基酸一般地為l-氨基酸。在一些情況下，氨基酸是d-氨基酸。因此改造可以包含將l-氨基酸修飾為，或?qū)⑵涮鎿Q為d-氨基酸。氨基酸的甲基化、乙酰化和/或磷酸化形式是已知的，且本發(fā)明中的氨基酸可進(jìn)行該種修飾。本發(fā)明的抗體結(jié)構(gòu)域和結(jié)合成員中的氨基酸序列可包含本發(fā)明所討論的非天然或非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的方法，例如分子的合成或合成后修飾或氨基酸的替換，將非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(如d-氨基酸)滲入氨基酸序列。在一些情況下，d-氨基酸被用于增加il-6a的pk。可通過(guò)隨機(jī)突變一個(gè)或多個(gè)選擇的vh和/或vl核酸序列在整個(gè)可變結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生突變的方式產(chǎn)生本發(fā)明攜帶cdr來(lái)源序列的新的vh或vl區(qū)。例如可使用易錯(cuò)pcr(chao等,natureprotocols,1:755-768(2006))。在一些實(shí)施方案中，在整個(gè)可變區(qū)或一組cdrs中進(jìn)行一個(gè)或兩個(gè)氨基酸替換。可使用其他本領(lǐng)域中已知的方法產(chǎn)生突變，例如一般在一個(gè)或多個(gè)cdrs中的定點(diǎn)突變。用于產(chǎn)生抗體il-6a的一種方法是通過(guò)添加、缺失、取代或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸來(lái)改變vh結(jié)構(gòu)域，如本文公開(kāi)的那些。改變的結(jié)構(gòu)域可與vl結(jié)構(gòu)域(例如本文公開(kāi)的vl結(jié)構(gòu)域)組合，所述vl結(jié)構(gòu)域也可以使用本領(lǐng)域中已知的方法如本發(fā)明所描述方式被改變。測(cè)試這些改變了的分子結(jié)合il-6的位點(diǎn)ii的能力以及任選地測(cè)試其他需要的特性如與參考分子相比增加的親和力。在某些情況下，變體vh或vl結(jié)構(gòu)域可具有1、2、3、4或5個(gè)這樣的改變(如1、2、3、4或5個(gè)氨基酸替換)。在實(shí)施方案中，本發(fā)明的il-6a是結(jié)合il-6的位點(diǎn)ii的抗體的片段并且包含抗原結(jié)合位點(diǎn)，如能夠結(jié)合il-6的位點(diǎn)ii的抗原結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明的抗體片段一般從參考(親本)抗體分子獲得，如包含seqidno：41和seqidno：42的抗體分子?？墒褂帽绢I(lǐng)域中已知的方法如重組dna、酶切割(如使用胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)、抗體的化學(xué)切割(如二硫橋的化學(xué)還原)的方式產(chǎn)生抗體片段。包含抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段包括，但不限于分子如fab、fab'、fab'-sh、scfv、fv、dab、fd和二硫鍵穩(wěn)定的可變區(qū)(dsfv)?？梢愿脑彀ㄒ粋€(gè)或多個(gè)抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的多種其他抗體，包括例如f(ab’)2、f(ab)3、雙抗體、三鏈抗體、四鏈抗體和迷你抗體?？贵w分子以及它們的構(gòu)建和使用方法的例子描述于holliger和hudson,2005,natbiotechnol23:1126-1136。結(jié)合片段的非限定性的例子是由vl、vh、恒定輕鏈結(jié)構(gòu)域(cl)和恒定重鏈結(jié)構(gòu)域1(ch1)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的fab片段；由vh和ch1結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的fd片段；由單鏈抗體(singleantibody)的vl和vh結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的fv片段；由vh或vl結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的dab片段；分離的cdr區(qū)；f(ab')2片段、含有兩個(gè)連接的fab片段的二價(jià)片段；單鏈fv分子(scfv)，其中vh結(jié)構(gòu)域和vl結(jié)構(gòu)域由肽連接子(linker)連接從而聯(lián)合兩結(jié)構(gòu)域以形成抗原結(jié)合位點(diǎn)；雙特異性單鏈fv二聚體(如公開(kāi)于wo1993/011161)以及使用基因融合(如公開(kāi)于wo94/13804)構(gòu)建的多價(jià)或雙特異性片段的雙抗體?？赏ㄟ^(guò)滲入連接vh和vl結(jié)構(gòu)域的二硫橋來(lái)穩(wěn)定fv、scfv或雙抗體。還可以使用包含scfv連接到ch3結(jié)構(gòu)域的迷你抗體作為il-6a。其他可用作il-6a的抗體的片段和衍生物包括fab'，其通過(guò)在重鏈ch1結(jié)構(gòu)域的羧基末端添加數(shù)個(gè)氨基酸殘基(包括抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸)而不同于fab片段，以及包括恒定區(qū)的半胱氨酸分子帶有一個(gè)游離巰基的fab'-sh。在一些情況下，il-6a是抗體片段，其已被化學(xué)修飾以增強(qiáng)或引入需要的特性，如peg化或以增加半衰期或整合。dab(結(jié)構(gòu)域抗體)是抗體的小單體抗原結(jié)合片段(抗體重鏈或輕鏈的可變區(qū)。vhdabs天然發(fā)生于駱駝科動(dòng)物中(例如駱駝和美洲駝)并能通過(guò)用靶抗原免疫駱駝?lì)悇?dòng)物、分離抗原特異性b細(xì)胞和直接從單個(gè)b細(xì)胞中克隆dab基因的方式產(chǎn)生。本發(fā)明的il-6a可以是包含大體上本發(fā)明中vh或vl結(jié)構(gòu)域的dab，或包含大體上本發(fā)明中的一組cdrs的vh或vl結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的抗體包括雙特異性抗體，該抗體的兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域被組合到相同分子中。可將il-6a作為雙特異性抗體的一部分滲入，所述抗體可使用本領(lǐng)域已知方法制備，例如化學(xué)制備或從雜交瘤制備。該分子可以是前文已討論過(guò)的類型的雙特異性抗體片段。產(chǎn)生雙特異性抗體的方法的一個(gè)非限制性的例子是bitetm技術(shù)，該技術(shù)中可使用具有不同特異性的兩個(gè)抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域并通過(guò)短的柔性肽直接連接。這將兩抗體組合成一個(gè)短的單肽鏈?？刹皇褂胒c區(qū)而僅使用可變結(jié)構(gòu)域來(lái)構(gòu)建雙抗體和scfv，這潛在地減輕了抗獨(dú)特型反應(yīng)。雙特異性抗體可構(gòu)建為整個(gè)igg、構(gòu)建為雙特異性fab'2、構(gòu)建為fab'peg、構(gòu)建為雙抗體或構(gòu)建為其他雙特異性scfv。此外，兩種雙特異性抗體可利用本領(lǐng)域中已知的常規(guī)方法進(jìn)行連接以形成四價(jià)抗體。雙特異性雙抗體，與雙特異性完全抗體相對(duì)，是有用的，在某種程度上是因?yàn)樗鼈兡軌虮粯?gòu)建并在大腸桿菌中并表達(dá)?？蓮奈膸?kù)中使用噬菌體展示(wo1994/13804)容易地選擇出合適的結(jié)合特異性的雙抗體(以及許多其他多肽，如抗體片段)。如果保持雙抗體的一個(gè)臂恒定，例如，直接針對(duì)il-6的位點(diǎn)ii的特異性，則可以產(chǎn)生其他臂可變的文庫(kù)，從而選擇合適特異性的抗體。雙特異性全抗體可通過(guò)其他描述于wo1996/27011、wo1998/50431和wo2006/028936的改造工程化方法制備。在某些情況下，本發(fā)明的il-6a在非抗體分子中包含抗原結(jié)合位點(diǎn)，例如，通過(guò)合并一個(gè)或多個(gè)cdrs，如在非抗體蛋白骨架中的一組cdrs，將在下文中進(jìn)一步討論。在某些情況下，cdrs被合并到非抗體的骨架中。可通過(guò)在非抗體蛋白骨架(如纖連蛋白或細(xì)胞色素b)上排列cdrs來(lái)提供il-6的位點(diǎn)ii的結(jié)合位點(diǎn)，或通過(guò)隨機(jī)或突變蛋白骨架內(nèi)環(huán)(loop)的氨基酸殘基來(lái)賦予對(duì)il-6的位點(diǎn)ii的結(jié)合特異性。用于蛋白中工程化的新的結(jié)合位點(diǎn)的骨架是現(xiàn)有技術(shù)已知的。例如用于抗體模擬物的蛋白骨架在wo200034784被公開(kāi)，其描述了包括具有至少一個(gè)隨機(jī)化的環(huán)的纖連蛋白iii型結(jié)構(gòu)域的蛋白(抗體模擬物)。任何免疫球蛋白超家族的結(jié)構(gòu)域成員可提供適合于移植入一個(gè)或多個(gè)cdrs，如一組hcdrs的骨架。骨架可以是人或非人蛋白。非抗體蛋白骨架的優(yōu)勢(shì)在于其可以在骨架分子中提供抗原結(jié)合位點(diǎn)，所述骨架分子至少比一些抗體分子更小和/或更易制備。小尺寸的結(jié)合成員可帶來(lái)有用的生理特性，如進(jìn)入細(xì)胞的能力、深度穿透組織或到達(dá)其他結(jié)構(gòu)內(nèi)的靶位，或結(jié)合靶抗原蛋白穴的能力。典型的是具有穩(wěn)定主鏈和一個(gè)或多個(gè)可變環(huán)的蛋白質(zhì)，在可變環(huán)中一個(gè)環(huán)或多個(gè)環(huán)的氨基酸序列被特別或隨機(jī)突變以產(chǎn)生具有結(jié)合靶抗原特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)。該蛋白包括來(lái)自金黃色葡萄球菌(s.aureus)蛋白質(zhì)a的igg結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)鐵蛋白、四連接素(tetranectin)、纖連蛋白(如第10纖連蛋白的iii型結(jié)構(gòu)域)和脂籠蛋白(lipocalins)以及γ-晶體和其他affilintm骨架(scilproteins,halle,germany)。其他方法的例子包括合成的微體，其基于環(huán)肽(cyclotides)--具有分子內(nèi)二硫鍵的小蛋白(如versabodiestm,amunixinc.,mountainview,ca)和錨蛋白重復(fù)蛋白(darpins，如來(lái)自molecularpartnersag,zurich-schlieren,switzerland)。這些蛋白也包括小的，改造的蛋白結(jié)構(gòu)域，如，免疫結(jié)構(gòu)域(參見(jiàn)例如，美國(guó)專利公開(kāi)第2003/082630和2003/157561號(hào))。免疫結(jié)構(gòu)域含有抗體的至少一個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)。il-6a可包含額外的氨基酸，如賦予所述分子除結(jié)合抗原的能力以外的其他功能特征的氨基酸。在一些情況下，il-6a攜帶一個(gè)可檢測(cè)的標(biāo)記，或與毒素或靶向部分或酶綴合(如，通過(guò)肽鍵或連接子)。例如，il-6a可包含一催化位點(diǎn)(如在酶結(jié)構(gòu)域中)和一抗原結(jié)合位點(diǎn)(如針對(duì)il-6的位點(diǎn)ii的結(jié)合位點(diǎn))，這樣，抗原結(jié)合位點(diǎn)與抗原結(jié)合并因此靶向催化位點(diǎn)到il-6或il-6/il-6r復(fù)合物。所述催化位點(diǎn)能夠，在一些情況下，進(jìn)一步抑制il-6的生物學(xué)功能，如通過(guò)切割il-6、il-6r，或其他與il-6a/il-6復(fù)合物有關(guān)的分子。在一些方面中，本發(fā)明包括與參考抗體相比已經(jīng)被修飾的抗體il-6a以改變，例如增加、降低或消除il-6a的生物學(xué)效應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施例中，fc區(qū)被修飾或用修飾的fc結(jié)構(gòu)域替換親本fc結(jié)構(gòu)域以改變(與未修飾的親本相比)修飾的il-6a的藥代動(dòng)力學(xué)。在一些實(shí)施方案中，il-6a經(jīng)改造以具有igg2框架。在其他實(shí)施方案中，il-6a是在igg1或igg2框架中并具有修飾的fc，與親本或其他參考il-6a相比，其在ph6.0時(shí)增加了結(jié)合親和力而在ph7.0時(shí)基本上不改變結(jié)合親和力。在實(shí)施方案中，fc結(jié)構(gòu)域被修飾且與親本或其他參考il-6a相比，所述il-6a具有減少的系統(tǒng)累積，降低的半衰期和/或增加的系統(tǒng)清除。在一些實(shí)施方案中，抗體il-6a被修飾以增加補(bǔ)體結(jié)合和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性。在其他方面中，抗體il-6a被修飾以增加(與參考抗體相比)抗體激活效應(yīng)細(xì)胞和參與抗體依賴的細(xì)胞毒性(adcc)的能力。在一些情況下，本發(fā)明中所公開(kāi)的抗體可以被修飾以增強(qiáng)其激活效應(yīng)細(xì)胞和參與抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(adcc)的能力以及增加其補(bǔ)體結(jié)合和參與補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(cdc)的能力。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所公開(kāi)的抗體被修飾以減小其固定補(bǔ)體和參與補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(cdc)的能力。在另一個(gè)的實(shí)施方案中，抗體被修飾以減小其抗體激活效應(yīng)細(xì)胞和參與抗體依賴的細(xì)胞毒性(adcc)的能力。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明所公開(kāi)的抗體可以被修飾以減小其激活效應(yīng)細(xì)胞和參與抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(adcc)的能力以及減小其補(bǔ)體結(jié)合和參與補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(cdc)的能力。避免頻繁地遞送il-6a劑量通常是有利的，例如，當(dāng)注射遞送入眼睛時(shí)。為了促進(jìn)這一特征，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明所公開(kāi)的il-6a在遞送位點(diǎn)如玻璃體的半衰期為至少4天、例如至少7天、至少9天、至少11天或至少14天。在某些實(shí)施方案中，il-6a的平均半衰期為至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、25天、30天、40天、50天或60天。增加抗體半衰期的方法是本領(lǐng)域中已知的，例如描述于美國(guó)專利第6,277,375號(hào)和國(guó)際公開(kāi)第wo1998/23289號(hào)和第wo1997/3461號(hào)。在一些實(shí)施方案中，il-6a在靶向遞送位點(diǎn)如玻璃體的半衰期大于全身半衰期，如血液、血漿、淋巴、肝、腎或其他組織或體液中的半衰期)。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種包括容器的制造品。所述容器包括含有本發(fā)明所公開(kāi)的il-6a的組合物，以及指示該組合物可用于治療il-6相關(guān)病癥的包裝說(shuō)明書(shū)或標(biāo)簽。一般地，該組合物是包含il-6a和藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物。在一些情況下，本發(fā)明是含有包含本發(fā)明所公開(kāi)的il-6a的組合物以及指示施用者向需要治療的受試者施用所述組合物的說(shuō)明的試劑盒。在需要大的il-6a的實(shí)施方案中，例如增強(qiáng)il-6a位于或在遞送位點(diǎn)附近的保留，增加大小但不顯著地對(duì)il-6a的功能(如對(duì)il-6或il-6/il-6r復(fù)合物的結(jié)合親和力)產(chǎn)生不利影響的部分可與il-6a聯(lián)合。例如可基因工程化fab以表達(dá)含fab和fc部分的單個(gè)多肽。在需要相對(duì)小尺寸的il-6a的實(shí)施方案中，可使用il-6的抗體或片段，例如scfv或fab片段。igg抗體的大小約為150kd，fab約為50kd，而scfv約為25kd。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所描述的il-6a的大小小于約50kd。這種拮抗劑可以是，例如，小于或等于50kd并大于10kd、小于或等于50kd并大于20kd、小于或等于50kd并大于25kd。在一些情況下，通過(guò)制造變體來(lái)提高il-6拮抗劑(如具有二硫鍵的抗體或其他抑制劑)的穩(wěn)定性，其中該變體的一個(gè)或多個(gè)二硫橋比親本分子的更為穩(wěn)定。本發(fā)明所描述的某些il-6a分子的其他優(yōu)勢(shì)可以是有效的分子的可用性，所述有效的分子具有合適的遞送方式、遞送位點(diǎn)或活性模式的大小。例如，fab形式的il-6a可用于局部應(yīng)用。改造該分子的方法在本發(fā)明中所描述并且是本領(lǐng)域已知的。適應(yīng)癥/il-6相關(guān)疾病可用本發(fā)明的il-6a治療的疾病包括這些疾病，在這些疾病中升高的il-6與疾病狀態(tài)相關(guān)或作為疾病狀態(tài)的先決條件。這樣的疾病包括由il-6驅(qū)動(dòng)的導(dǎo)致血管發(fā)生和炎癥的疾病病理。這包括與正常水平相比升高的il-6，例如玻璃體中il-6升高的疾病(如糖尿病黃斑水腫、糖尿病性視網(wǎng)膜病和葡萄膜炎)或眼組織中il-6升高的疾病。某些眼病的例子包括但不限于干眼(例如，干眼病或干眼綜合征)、過(guò)敏性結(jié)膜炎,葡萄膜炎,年齡相關(guān)性黃斑變性(amd),增生型糖尿病視網(wǎng)膜病變(pdr),糖尿病黃斑水腫(dme),孔源性視網(wǎng)膜脫離(rrd),視網(wǎng)膜靜脈阻塞(rvo),視神經(jīng)脊髓炎(nmo)?？梢灾委煹钠渌奂膊“切┯赏鈧鹧鄄?，如角膜移植、角膜擦傷，或其他對(duì)眼睛造成的該類物理傷害。因此，本發(fā)明包括使用本發(fā)明所描述的il-6a治療患有il-6相關(guān)疾病的受試者的方法。在一些實(shí)施方案中，il-6相關(guān)疾病是炎性疾病。在一些實(shí)施方案中，該疾病是青光眼。在一些實(shí)施方案中，該疾病是眼部疼痛。在一些實(shí)施方案中，受試者的治療還包括確定受試者是否患有il-6相關(guān)疾病，和任選地，患者是否抵抗其他非il-6抑制治療，如類固醇或抗vegf治療。某些基于抗體治療的一個(gè)問(wèn)題在于抗體在特定位置如眼睛，例如在玻璃體中，是有效的，但全身施用會(huì)導(dǎo)致副作用。一種解決方案是提供一種如本發(fā)明所述的分子為例的治療劑，相對(duì)于全身遞送，該治療劑可以局部遞送。由于一些局部遞送的(如遞送到玻璃體中)的治療劑在一定程度上會(huì)出現(xiàn)全身遞送，因此設(shè)計(jì)將具有相對(duì)快的全身清除(systemicturnover)的分子是有利的。申請(qǐng)人已經(jīng)工程化了被設(shè)計(jì)為例如與親本分子或參考抗體相比能快速全身清除的il-6抗體的實(shí)例。這是通過(guò)突變fc域以修飾分子的fcrn結(jié)合，例如以減少fcrn介導(dǎo)的il-6a的再循環(huán)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。糖尿病黃斑水腫(dme)。糖尿病黃斑水腫(dme)參與視網(wǎng)膜血管的阻塞和滲漏，造成視力下降和潛在的失明。對(duì)dme的標(biāo)準(zhǔn)治療方法包括局部施用類固醇或抗vegf抗體。然而很多病人對(duì)這些療法是難治的。糖尿病黃斑水腫的發(fā)病機(jī)理涉及血管發(fā)生、炎癥和氧化應(yīng)激。il-6由缺氧和高血糖誘導(dǎo)并能增加血管炎癥、血管通透性和病理性血管發(fā)生。il-6可直接誘導(dǎo)vegf的表達(dá)并能在動(dòng)物模型中促進(jìn)脈絡(luò)膜血管新生。在dme患者中，眼睛的il-6水平與黃斑厚度和疾病的嚴(yán)重程度正相關(guān)。il-6水平被報(bào)道在抗vegf療法失敗的患者中升高而在抗vegf響應(yīng)的患者中降低。因此，施用本發(fā)明所描述的il-6a與抗vegf治療劑組合來(lái)治療糖尿病患者或作為抗vegf治療的替代(包括那些對(duì)抗vegf治療不響應(yīng)的患者)是有用的。用il-6a治療黃斑水腫還可通過(guò)去除完全抑制任何一種機(jī)制以抑制病癥的需求來(lái)提高其安全性，從而保留了各細(xì)胞因子的一些需要的生理作用。因此，局部il-6a治療與vegf抑制相組合能夠降低給藥頻率并減輕治療的副作用。在dme中，玻璃體il-6水平與疾病嚴(yán)重程度和vegf難治的受試者兩者正相關(guān)。因此本發(fā)明所記載的il-6a可用于治療對(duì)類固醇療法、抗vegf療法或兩者難治的dme受試者。在一些情況下，il-6a與抗vegf療法或類固醇療法組合使用，如治療dme。本發(fā)明所記載的il-6a還可用于治療病癥例如癌癥，如前列腺癌(prostatecancer)、白血病(leukemia)、多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma)，炎性病(如慢性炎癥增生疾病(chronicinflammatoryproliferativediseases))和自身免疫性疾病(autoimmunedisease)，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis)、卡斯?fàn)柭?castleman'sdisease)(巨大或血管濾泡淋巴結(jié)增生(giantorangiofollicularlymphnodehyperplasia)、淋巴錯(cuò)構(gòu)瘤(lymphoidhamartoma)，血管濾泡性淋巴結(jié)增生(angiofollicularlymphnodehyperplasia))、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(juvenileidiopathicarthritis)(包括多關(guān)節(jié)幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(polyarticularjuvenileidiopathicarthritis)和系統(tǒng)性幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(systemicjuvenileidiopathicarthritis))、斯蒂爾病(still'sdisease)(包括幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(juvenileidiopathicarthritis)和成年型斯蒂爾病(adultonsetstill’sdisease))、成年型斯蒂爾病(adultonsetstill’sdisease)、淀粉樣蛋白a淀粉樣變性病(amyloidaamyloidosis)、風(fēng)濕性多肌痛(polymyalgiarheumatica)、緩解性血清陰性對(duì)稱性滑膜炎伴凹陷性水腫(remittingseronegativesymmetricalsynovitiswithpittingedema)、脊椎關(guān)節(jié)炎(spondyloarthritides)、白塞氏病(disease)(包括治療眼部表現(xiàn)(ocularmanifestations)的治療)、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis)、銀屑病(psoriasis)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosis)、多發(fā)性肌炎(polymyositis)(炎癥性肌病inflammatorymyopathy)、復(fù)發(fā)性多軟骨炎(relapsingpolychondritis)、獲得性血友病a(acquiredhemophiliaa)，多發(fā)性硬化癥(multiplesclerosis)，炎癥性貧血(anemiaofinflammation)，和克羅恩病(crohn’sdisease)。il-6拮抗劑還可用于治療某些神經(jīng)疾病，例如抑郁癥和阿爾茨海默氏病?？捎帽景l(fā)明中所記載的il-6a治療其他疾病，包括但不限于全身性硬化癥(systemicsclerosis)、多發(fā)性大動(dòng)脈炎(takayasuarteritis)、巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎(giantcellarteritis)、移植物抗宿主病(graftversushostdisease)、與腫瘤壞死因子受體相關(guān)周期性綜合癥(tnf-receptor-associatedperiodicsyndrometraps)。劑量可將il-6抗體或其片段施用給受試者(如患者)，所述受試者表達(dá)，例如異常的高水平的il-6。抗體或其片段可一次施用，或可多次施用?？墒┯每贵w，例如，從每天三次到每六個(gè)月一次或更久?？梢园从?jì)劃施用如每天三次、每天兩次、每天一次、每?jī)商煲淮?、每三天一次、每周一次、每?jī)芍芤淮巍⒚吭乱淮?、每?jī)蓚€(gè)月一次、每三個(gè)月一次和每六個(gè)月一次?？贵w或片段可經(jīng)由迷你泵或其他途徑如可植入的緩釋膠囊或通過(guò)生產(chǎn)抗體或其片段的細(xì)胞持續(xù)施用。抗體或其片段可經(jīng)由粘膜、口腔、鼻內(nèi)、吸入、靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腸胃外、眼內(nèi)或腫瘤內(nèi)途徑給藥?？贵w或其片段可施用一次、至少兩次或在至少病癥被治療、減輕或治愈的時(shí)間段內(nèi)施用。一般將施用抗體或其片段，只要病癥存在?？贵w或其片段，一般將其作為本發(fā)明所描述的藥物組合物的一部分施用?？贵w的劑量一般將在0.1到100mg/kg、0.5到50mg/kg,、1到20mg/kg和1到10mg/kg的范圍內(nèi)?？赏ㄟ^(guò)任何合適的方法測(cè)量抗體或其片段的血清濃度。本發(fā)明所描述的某些化合物的一個(gè)特征在于它們需要相對(duì)不頻繁的給藥，例如每周一次、每周兩次、每周三次、每四周一次、每?jī)芍芤淮巍⒚?周一次、每12周一次、每16周一次、每32周一次、每月一次、每?jī)蓚€(gè)月一次、每三個(gè)月一次或每六個(gè)月一次。在一些情況下，在需要的基礎(chǔ)上，確定(例如通過(guò)受試者的狀態(tài))化合物的施用。本發(fā)明所描述的允許相對(duì)不頻繁給藥的il-6拮抗劑的一個(gè)特征在于將高效力(至少部分是通過(guò)一旦結(jié)合到il-6則具有慢解離速率實(shí)現(xiàn)的)和遞送相對(duì)高濃度的化合物的能力相組合。在一些情況下，il-6a作為單一療法施用。在其他實(shí)施方案中，il-6a與甲氨蝶呤或其它疾病改善抗關(guān)節(jié)炎藥物同時(shí)施用?？贵w的產(chǎn)生可使用本領(lǐng)域已知方法如單克隆抗體方法學(xué)(如，參見(jiàn)kohlerandmilstein(1975)nature256:495)生產(chǎn)抗體il-6a或其衍生物或片段。還可采用其他制造單克隆抗體的技術(shù)如b淋巴細(xì)胞的病毒或致癌性轉(zhuǎn)化。可基于使用本領(lǐng)域已知方法制備的小鼠單克隆抗體制備嵌合或人源化抗體。編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的dna可從感興趣的小鼠雜交瘤中獲得，以及所述dna可使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)改造以包含非小鼠(如人)的免疫球蛋白序列。例如，為了制備嵌合抗體，可使用本領(lǐng)域已知技術(shù)(參見(jiàn)例如美國(guó)專利第4,816,567號(hào))將小鼠可變區(qū)與人恒定區(qū)相連接。為了制造人源化抗體，可使用本領(lǐng)域已知技術(shù)(參見(jiàn)例如美國(guó)專利第5,225,539號(hào)和第5,530,101；5,585,089；5,693,762號(hào)；和第6,180,370號(hào))將小鼠cdr區(qū)插入人框架。在實(shí)施方案中，本發(fā)明所描述的il-6a(如抗il-6抗體或其衍生物或片段)能夠特異地結(jié)合人il-6。在實(shí)施方案中，il-6a能夠特異地結(jié)合il-6的位點(diǎn)ii(如人il-6的位點(diǎn)ii)。在一些實(shí)施方案中，il-6a抗體是人單克隆抗體。該抗體可使用包含部分人免疫系統(tǒng)而非小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠來(lái)產(chǎn)生。這些轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體小鼠包括“人ig小鼠”，諸如humab和km參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299和5,770,429號(hào)；美國(guó)專利號(hào)5,545,807；pct公開(kāi)號(hào)wo92/03918,wo93/12227,wo94/25585,wo97/13852,wo98/24884和wo99/45962；和pct公開(kāi)號(hào)wo01/14424號(hào)。在其他方面中，可使用在轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體中攜帶人免疫球蛋白序列的小鼠，如攜帶人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體的小鼠來(lái)生產(chǎn)人抗il-6抗體。這類小鼠在pct公開(kāi)號(hào)wo02/43478中詳細(xì)描述。其他表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物系統(tǒng)是本領(lǐng)域可獲得的，且能被用于生產(chǎn)抗體il-6a。例如可使用稱作xenomousetm(abgenix,inc.)的備選轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)；此類小鼠被描述于例如美國(guó)專利號(hào)5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584；和6,162,963中。此外，表達(dá)人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)染色體動(dòng)物系統(tǒng)是本領(lǐng)域可獲得的，并可用于生產(chǎn)抗體il-6a。例如攜帶人重鏈轉(zhuǎn)染色體和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體兩者的小鼠被描述于tomizuka等中(2000,procnatlacadsciusa97:722-727)。還可以使用scid小鼠制備人單克隆抗體，其中在該小鼠中重建了人免疫細(xì)胞從而可以通過(guò)免疫接種來(lái)產(chǎn)生人抗體應(yīng)答。此類小鼠被描述于例如美國(guó)專利號(hào)5,476,996和5,698,767中。噬菌體展示文庫(kù)在一些情況下，抗體il-6a抗體或其衍生物或片段是在使用噬菌體合成人抗體文庫(kù)、用il-6(例如人il-6)或其片段篩選所述文庫(kù)、分離結(jié)合il-6的噬菌體以及從所述噬菌體獲得抗體的方法中產(chǎn)生的。還可以通過(guò)篩選重組組合抗體文庫(kù)來(lái)分離重組人抗體il-6a。一般來(lái)說(shuō)，所述文庫(kù)是scfv噬菌體文庫(kù)，該文庫(kù)是用人vl和vhcdnas(從分離自b細(xì)胞的mrna中制備)產(chǎn)生的。制備和篩選這類文庫(kù)是本領(lǐng)域已知的。用于產(chǎn)生噬菌體展示文庫(kù)的試劑盒是商業(yè)上可獲得的(如pharmacia公司的重組噬菌體抗體系統(tǒng)，目錄號(hào)27-9400-01；和stratagenesurfzaptm噬菌體展示試劑盒，目錄號(hào)240612)。其他可用于生產(chǎn)和篩選抗體噬菌體文庫(kù)的方法和試劑是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)，例如美國(guó)專利號(hào)5,223,409；pct公開(kāi)號(hào)wo92/18619、wo91/17271、wo92/20791、wo92/15679、wo93/01288、wo92/01047、wo92/09690；fuchs等,bio/technology9:1370-1372(1991)；hay等,humantibodhybridomas3:81-85(1992)；huse等,science246:1275-1281(1989)；mccaffert等,nature348:552-554(1990)；griffiths等,emboj12:725-734(1993)；hawkins等人，,jmolbiol226:889-896(1992)；clackson等,nature352:624-628(1991)；gram等,procnatlacadsciusa89:3576-3580(1992)；garrad等,bio/technology9:1373-1377(1991)；hoogenboom等,nucacidres19:4133-4137(1991)；和barbas等,procnatlacadsciusa88:7978-7982(1991)，作為參考全部并入本文。在一個(gè)分離和生產(chǎn)具有所需要特征的il-6抗體的例子中，首先用人il-6抗體，使用表位印跡法來(lái)選擇相似il-6結(jié)合能力的重鏈和輕鏈序列，所述方法描述于pct公開(kāi)號(hào)wo93/062l3中，作為參考并入本文。這一方法中所使用的抗體文庫(kù)一般為scfv文庫(kù)，該文庫(kù)的制備和篩選描述于pct公開(kāi)號(hào)wo92/01047；mccafferty等,nature348:552-554(1990)；andgriffiths等,emboj12:725-734(1993)，作為參考全部并入本文。一旦選擇了初始人vl和vh結(jié)構(gòu)域，就進(jìn)行“混合并匹配”實(shí)驗(yàn)，在該實(shí)驗(yàn)中篩選不同對(duì)的初始選擇的vl和vh片段的il-6結(jié)合能力以選擇優(yōu)選的vl/vh對(duì)組合物。為了選擇il-6a所需要的特征，可隨機(jī)突變所選對(duì)的vl和/或vh片段。這種體外親和成熟例如可通過(guò)使用與所選擇的vh和vl結(jié)構(gòu)域的一個(gè)或兩者的cdr互補(bǔ)的pcr引物擴(kuò)增vh和vl結(jié)構(gòu)域的方式實(shí)現(xiàn)，其中所述引物包含在某些位點(diǎn)的四個(gè)核苷酸堿基的隨機(jī)組合，從而所產(chǎn)生的pcr產(chǎn)物編碼引入了隨機(jī)突變的vh和/或vl的片段。這類隨機(jī)突變的vh和vl片段可被用來(lái)篩選il-6的結(jié)合片段，例如il-6的位點(diǎn)ii的結(jié)合片段。在從重組的免疫球蛋白展示文庫(kù)中篩選和分離抗體il-6a后，可從展示包裝(displaypackage)(例如從噬菌體基因組)回收編碼選擇的抗體的核酸，并通過(guò)本領(lǐng)域已知的重組dna技術(shù)將其亞克隆入其他表達(dá)載體。可對(duì)這類抗體進(jìn)一步操作以產(chǎn)生抗體片段，如那些在本發(fā)明中記載的抗體片段。藥代動(dòng)力學(xué)(pk)可使用本文描述的方法和/或本領(lǐng)域已知方法進(jìn)行pk測(cè)試。需要使用動(dòng)物進(jìn)行測(cè)定例如測(cè)定pk的一個(gè)障礙在于人類的il-6與那些通常用于此類測(cè)試的一些動(dòng)物的il-6具有小于50％的同源性。因此測(cè)試pk的一種方法是使用表達(dá)人il-6的轉(zhuǎn)基因小鼠。在一些實(shí)施方案中，使用非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物來(lái)測(cè)定pk。在一些實(shí)施方案中，抗il-6抗體是突變的以改變其pk，例如通過(guò)改變fcrn結(jié)合的ph敏感性而改變其pk。獲得這類突變的方法記載于實(shí)施例中。因此，在一些實(shí)施方案中，與親本il-6a或參考分子相比，所述il-6a具有改變的全身pk(systemicpk)。在一些情況下，pk在玻璃體中是不改變的或是改善的。在一些實(shí)施方案中，與親本il-6a或參考分子相比，il-6a具有降低的系統(tǒng)pk(例如，減少的半衰期和/或增加的清除，例如，如在循環(huán)流體如血液，血漿，淋巴或血清中測(cè)定的)。用于測(cè)試il-6拮抗劑的模型可在疾病模型中測(cè)試il-6拮抗劑的il-6相關(guān)遞送，特別是測(cè)試治療效果和有限的針對(duì)il-6有利特性的副作用。例如可以在大鼠或小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎模型中，使用在完全弗氏佐劑(cfa)中的感光細(xì)胞間受體視黃醇類結(jié)合蛋白(irbp)免疫接種來(lái)測(cè)試葡萄膜炎(caspi,investophthalmolvissci52:1873；agarwal等,900:443-69,2012)。其他模型包括那些本領(lǐng)域中已知的樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)的葡萄膜炎、培養(yǎng)的效應(yīng)t細(xì)胞的過(guò)繼轉(zhuǎn)移、在irbptcrtg小鼠中的自發(fā)eau、內(nèi)毒素誘導(dǎo)的葡萄膜炎、自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎(haruta等,investophthalmolvissci53:3264(2011)；yoshimura等,rheumatology48:347-354(2009))。其他能夠用于檢查il-6a在治療il-6相關(guān)疾病的治療中的效果的模型系統(tǒng)是例如，脈絡(luò)膜新生血管(cnv)模型(izumi-nagai等,amjpathol170:6(2007)；krzystolik等,archophthalmol120:338(2002))和糖尿病模型如那些描述于kern等(animalmodelsofdiabeticcomplicationsconsortium(p01dk57733),updatereport(september2001–january2004)的模型。用于測(cè)試il-6a在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的動(dòng)物模型是本領(lǐng)域已知的，例如參見(jiàn)asquith等(eurjimmunol39:2040-4(2009))andkollias等(annrheumdis70:1357-62(2011)。cnv模型代表例如amd和dme的人類狀況。視網(wǎng)膜新血管形成模型是有用的，例如用于研究缺血性視網(wǎng)膜病變，例如糖尿病視網(wǎng)膜病或早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病。各種脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜新血管形成模型在本領(lǐng)域中是已知的(參見(jiàn)，例如，grossniklaus,h.e.等人，progretineyeres.2010nov；29(6):500-19.doi:10.1016/j.preteyeres.2010.05.003.epub2010may19；saisin,y等人，(2003)journalofcellularphysiology,195:241-248；takahashi,k.等人，(2003)investigativeophthalmology&visualscience,44(1):409-415；limaesilva,r.等人，(2007)fasebjournal,21:3219-3230；tobe等人，(1998)americanjournalofpathology,153(5):1641-1646；dong,a等人，(2011)pnas,108(35):14614-14619；dong等人，(2009)jcellphysiol219:544-552；smith,le等人，1994investophthalmolvissci1994；35:101-111；shen,j.等人，(2007)investigativeophthalmology&visualscience,48(9):4335-4341)，并且可用于研究il-6a的功效。脈絡(luò)膜新血管形成(cnv)可以通過(guò)例如激光，光，手術(shù)或遺傳修飾來(lái)誘導(dǎo)。氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜新生血管形成的模型是本領(lǐng)域已知的，并且描述于例如，在smith,le等人，1994investophthalmolvissci1994；35:101-111；shen,j.等人，(2007)investigativeophthalmology&visualscience,48(9):4335-4341中。還可以使用缺血/再灌注模型。參見(jiàn)例如zheng,l等人，investigativeophthalmology&visualscience,vol.48no.1pp.361-367,2007。例如，在第1天，將附接到流體袋的30號(hào)針插入麻醉的小鼠的角膜中，并且將眼內(nèi)壓(iop)升高至約120mmhg以產(chǎn)生缺血。30-90分鐘后，除去針頭，對(duì)iop標(biāo)準(zhǔn)化，并且發(fā)生視網(wǎng)膜循環(huán)回流。包括tnf-α和icam-1在內(nèi)的炎癥標(biāo)志物的表達(dá)可以通過(guò)蛋白質(zhì)印跡和qpcr在第2-6天進(jìn)行評(píng)估。另外，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損失可以通過(guò)組織學(xué)在第3-14天評(píng)估，并且毛細(xì)血管變性通過(guò)胰蛋白酶消化技術(shù)在第10-14天測(cè)量。對(duì)于治療研究，在誘導(dǎo)缺血之前或之后不久，將測(cè)試制品(例如1μl的適當(dāng)濃度，例如20mg/ml的il6a)經(jīng)玻璃體內(nèi)注射。聯(lián)合療法在一些實(shí)施方案中，將il-6a與第二治療性實(shí)體(therapeuticentity)組合施用。例如在包括vegf抑制劑諸如例如蘭尼單抗的治療方案中施用il-6a。在一些實(shí)施方案中，在包括pdgf抑制劑的治療方案中施用il-6a，其中所述pdgf抑制劑諸如例如抗pdgf抗體或抗pdgf受體抗體(例如伊馬替尼)。在一些實(shí)施方案中，il-6a與補(bǔ)體途徑抑制劑,例如洛他珠單抗(lampalizumab)(因子d抑制劑)或c5抑制劑組合施用。il-6拮抗劑的遞送本文所述的il-6拮抗劑或組合物可局部遞送，直接接觸或鄰近進(jìn)行il-6抑制的靶細(xì)胞或組織。這種遞送方法的非限制性的實(shí)例包括注射、輸液或植入含有il-6拮抗劑的物質(zhì)。在實(shí)施方案中，il-6a或組合物經(jīng)眼內(nèi)施用，例如玻璃體內(nèi)，例如通過(guò)玻璃體內(nèi)注射，眼用插入物或基因遞送。在一些實(shí)施方案中，il-6a組合物作為眼用制劑施用。該方法可包括施用il-6a組合物和眼可接受的載體。在某些實(shí)施方案中，眼用制劑是液體、半固體、插入物(insert)、膜、微粒或納米顆粒。il-6a組合物可以例如通過(guò)局部施用或通過(guò)注射(例如，玻璃體內(nèi)注射)施用。在一些實(shí)施方案中，將il-6a組合物配制用于玻璃體內(nèi)施用。在一些實(shí)施方案中，il-6a組合物被配制用于局部施用，如眼睛施用。所述局部制劑可以是液體制劑或半固體，例如，局部制劑可以包括水溶液、水性懸浮液、軟膏或凝膠。眼用的il-6a的制劑可以局部施用于眼睛的前部、上眼瞼下，下眼瞼上和在cul-de-sac內(nèi)。一般地，眼用制劑是無(wú)菌的。il-6a眼用制劑可含有適合于眼用制劑的制備的一種或多種藥物賦形劑。這些賦形劑的例子為防腐劑、緩沖劑、螯合劑、抗氧化劑和用于調(diào)節(jié)滲透壓的鹽。包括軟膏劑和懸浮液的眼用制劑一般具有適合于所選的施用路徑的粘度。在一些實(shí)施方案中，眼用制劑具有從約1,000至約30,000厘泊的粘度。在一些實(shí)施方案中，所述制劑是一種包含聚合物的液體制劑。這類聚合物可用于改善的生物利用度、提高粘度或降低液體制劑從眼睛中排出。合適的聚合物包括但不限于，在wagh等人(asianjpharm,2:12-17,2008)描述的那些聚合物。在非限制性的例子中，聚合物是透明質(zhì)酸酶的鈉鹽、殼多糖、環(huán)糊精(如羥丙基β環(huán)糊精)、聚半乳糖醛酸、木葡聚糖、黃原膠、結(jié)冷膠、硫醇化聚合物、聚(原酸酯)(如einmahl,advdrugdelivrev53:45-73,2001)或羅望子種子多糖(如，ghelardi等,antimicrobagentschemother48:3396-3401,2004)。在一些實(shí)施方案中，包含用于眼部遞送的il-6a制劑可含有一種或多種的表面活性劑、輔助劑，佐劑、抗氧化劑、張力調(diào)節(jié)劑、防腐劑(如edta、bak(苯扎氯銨)、亞氯酸鈉、過(guò)硼酸鈉、聚季銨鹽-1(polyquaterium-1))、增稠劑或粘度調(diào)節(jié)劑(如羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、聚乙烯醇、聚乙二醇、乙二醇400、丙二醇羥甲基纖維素、羥丙基瓜耳豆膠、透明質(zhì)酸和羥丙基纖維素)等。制劑中的添加劑可以包括，但不限于，氯化鈉、碳酸氫鈉、山梨酸、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、氯己定(chlorhexidine)、蓖麻油和過(guò)硼酸鈉。在一些實(shí)施方案中，純水或去離子水可用于組合物中?？赏ㄟ^(guò)添加任何生理和眼用可接受的ph調(diào)節(jié)的酸、堿或緩沖劑將ph調(diào)節(jié)至約5.0至8.5的范圍內(nèi)，如ph7.0、ph7.3、ph7.4或ph7.5。眼用可接受的酸的例子包括乙酸、硼酸、檸檬酸、乳酸、磷酸、鹽酸等，堿的例子包括氫氧化鈉、磷酸鈉、硼酸鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉、乳酸鈉、氨基丁三醇、三羥基甲基氨基甲烷等?？捎糜谥苿┑柠}和緩沖液的例子包括檸檬酸鹽/右旋糖、碳酸氫鈉、氯化銨以及上述酸和堿的混合物。在一些實(shí)施方案中，眼用組合物的滲透壓可以為約10毫滲透摩爾(milliosmolar)(mosm)至約400mosm，例如200至400mosm或220至370mosm。通常，可以用生理上和眼科可接受的鹽或賦形劑來(lái)調(diào)節(jié)滲透壓。在一些實(shí)施方案中，制劑中包括氯化鈉，例如，氯化鈉存在于制劑中的濃度按重量計(jì)為0.01％至1％或按重量計(jì)為0.05％至0.45％，基于組合物的總重量。還可使用由一種或多種等量的由陽(yáng)離子(如鉀，銨等)和陰離子(如氯離子，檸檬酸根，抗壞血酸根，硼酸根，磷酸根，碳酸氫根，硫酸根，硫代硫酸根，硫酸氫鹽，硫酸氫鈉，硫酸銨等)組成的鹽與氯化鈉一同或替代氯化鈉以實(shí)現(xiàn)在需要的范圍內(nèi)的滲透壓。在一些實(shí)施方案中，還可使用糖，如甘露糖醇，右旋糖，山梨糖醇，葡萄糖等，來(lái)調(diào)節(jié)滲透壓。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括形成或提供與眼外表面接觸的藥劑的儲(chǔ)庫(kù)(depotoftheagent)。儲(chǔ)庫(kù)指的是試劑的供給源，所述儲(chǔ)庫(kù)不會(huì)被淚液或其他眼部清除機(jī)制除去。這允許通過(guò)單次應(yīng)用，連續(xù)、持續(xù)高濃度的藥劑存在于眼睛外表面的流體中。在一些實(shí)施方案中，儲(chǔ)庫(kù)可以保持多達(dá)八個(gè)小時(shí)以上。在一些實(shí)施方案中，眼儲(chǔ)庫(kù)制劑包括但不限于，聚合物水性懸浮液、軟膏和固體插入物(solidinserts)。在一些實(shí)施方案中，半固體組合物是一種施用到眼時(shí)增加粘度的液體制劑，所述粘度通常是由于液體制劑中存在聚合物，隨著溫度、ph或電解質(zhì)濃度的變化粘度有所增加。聚合物可以是例如，乙?；彵蕉姿崂w維素(celluloseacetophthalate)、聚丙烯酸，結(jié)冷膠，透明質(zhì)酸酶，殼多糖，藻酸鹽(如藻酸鈉)或環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物(如，basf；泊洛沙姆)。在一些實(shí)施方案中，聚丙烯酸是交聯(lián)的丙烯酸(如，)。在一些實(shí)施方案中，半固體組合物含有卡波姆以及環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物的混合物；甲基纖維素和羥乙基纖維素的混合物；或聚乙二醇以及環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物的混合物。在一些實(shí)施方案中，包含il-6a的眼用制劑是軟膏或凝膠。在一些實(shí)施方案中，眼用制劑是油基遞送載體。例如，制劑可包含加入il-6a組合物(如在0.1％至2％)的石油或羊毛脂基載體和賦形劑。常見(jiàn)的基質(zhì)(base)包括但不限于礦物油、礦脂及其組合。在一些實(shí)施方案中，軟膏作為條帶(ribbon)施用至下眼瞼。在一些情況下，眼用組合物是眼用插入物。在實(shí)施方案中，通過(guò)眼用插入物經(jīng)玻璃體內(nèi)施用組合物。例如所述眼用插入物是生物學(xué)惰性的、柔軟的、生物可腐蝕的、粘彈性的(viscoelastic)、暴露于治療劑后穩(wěn)定滅菌的、對(duì)空氣傳播細(xì)菌感染抗性的、生物可腐蝕的、生物相容的和/或粘彈性的(viscoelastic)。在一些實(shí)施方案中，插入物包含眼用可接受的基質(zhì)，例如，聚合物基質(zhì)。所述基質(zhì)一般是一種聚合物，且il-6a組合物分散在基質(zhì)內(nèi)或結(jié)合到聚合物基質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，藥劑從基質(zhì)通過(guò)溶解或水解共價(jià)鍵而緩慢釋放。在一些實(shí)施方案中，聚合物是生物可腐蝕(溶解)的，且其溶解速度可控制分散在聚合物基質(zhì)中藥劑的釋放速度。在另一種形式中，聚合物基質(zhì)是可生物降解的聚合物，該聚合物例如通過(guò)水解而分解，從而釋放出與其結(jié)合或分散在其中的藥劑。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可用另外的聚合物包衣包圍基質(zhì)和藥劑以進(jìn)一步控制釋放。在一些實(shí)施方案中，插入物包含可生物降解的聚合物，如聚己內(nèi)酯(pcl)、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物(eva)、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚氨酯、尼龍或聚dl-丙交酯-共-乙交酯)(plga)或任意這些的共聚物。在一些情況下，藥劑被分散到基質(zhì)材料或分散在單體組合物中，所述單體組合物用于在聚合前制造基質(zhì)材料。在一些實(shí)施方案中，藥劑的量為約0.1至約50％或從約2至約20％。可使用可生物可降解的或生物可腐蝕的聚合物基質(zhì)，從而不必從眼睛中移除過(guò)的插入物。隨著生物可降解或生物可腐蝕聚合物的降解或溶解，所述藥劑得以釋放。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，眼用插入物包含一種聚合物，包括但不限于，那些在wagh,等,"polymersusedinoculardosageformanddrugdeliverysystems",asianj.pharm.,pages12-17(january2008)中記載的聚合物，通過(guò)全文引用并入本文。在一些實(shí)施方案中，插入物包含聚合物，所述聚合物選自聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯聚合物或共聚物(如，來(lái)自rohm或degussa的聚合物家族)、羥甲基纖維素、聚丙烯酸、聚(酰氨基胺)樹(shù)枝狀聚合物、聚(二甲基硅氧烷)、聚環(huán)氧乙烷、聚(丙交酯共乙交酯)、聚(2-羥乙基甲基丙烯酸酯)、聚乙烯基醇)或聚(丙烯富馬酸酯)。在一些實(shí)施方案中，插入物是450kda的半胱氨酸-聚丙烯酸綴合物。插入物可包括含有il-6a組合物的芯(core)和外套管(如描述于美國(guó)專利公開(kāi)第20040009222號(hào)中)。在一些情況下，外管對(duì)藥物可以是滲透性的，半滲透性的或不滲透的。在一些實(shí)施方案中，芯包括對(duì)il-6a組合物的釋放速度不產(chǎn)生顯著影響的聚合物基質(zhì)。在一些情況下，外套管、芯的聚合物基質(zhì)或兩者是生物可腐蝕的。共擠出產(chǎn)品(co-extrudedproduct)可分割為(segmentedinto)藥物遞送裝置。在一些實(shí)施方案中，所述裝置是未包被的以使各自的端部是開(kāi)放的，或所述裝置用例如膜(layer)包被，所述膜對(duì)il-6a組合物是可滲透的、對(duì)il-6a組合物是半滲透的或生物可腐蝕的。在某些實(shí)施方案中，il-6a組合物和至少一種聚合物以粉末形式混合。在一些實(shí)施方案中，眼用組合物是眼用膜。適合于此類膜的聚合物包括但不限于那些描述于wagh等(同前)的聚合物。在一些實(shí)施方案中，所述膜是軟性隱形眼鏡(soft-contractlens)，例如由n，n-二乙基丙烯酰胺和與乙二醇二甲基交聯(lián)的甲基丙烯酸的共聚物組成的眼鏡。在某些實(shí)施方案中，il-6a位于管狀的插入物中，且可以是分割的(segmented)。在一些實(shí)施方案中，il-6a組合物被配制為治療有效量，由聚合物基質(zhì)包被的或分在聚合物基質(zhì)中，使得il-6a組合物為粒狀或顆粒形式。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)顆粒中的藥物溶解到或在基質(zhì)中，沿基質(zhì)擴(kuò)散，并被釋放到周圍生理性液體中時(shí)，il-6a組合物從配置物中釋放出來(lái)。在一些實(shí)施方案中，釋放速率主要受il-6a組合物從顆粒/微粒溶解到基質(zhì)中的速率的限制；沿基質(zhì)擴(kuò)散和分散到周圍液體中的步驟不是主要的釋放速率限制因素。在某些實(shí)施方案中，聚合物基質(zhì)是非生物可腐蝕的，而在其他實(shí)施方案中其是可生物腐蝕的。示例性的可形成非生物可腐蝕聚合物基質(zhì)可以是聚氨酯、聚硅氧烷、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)(eva)、聚乙烯醇及其衍生物和共聚物。示例性的可形成非生物可腐蝕聚合物基質(zhì)可以是聚酐、聚乳酸、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚氰基丙烯酸烷基酯(polyalkylcyanoacrylate)及其衍生物和共聚物。在一些情況下，在膠原材料中配制il-6a組合物。例如，插入物可以是可溶性眼用藥物插入物(如能夠被引入到上結(jié)膜囊用以藥物遞送的橢圓形聚合物薄膜；橢圓的插入物如由乙烯醋酸乙烯酯制成的(毛果蕓香堿眼部治療系統(tǒng),由alzacorporation開(kāi)發(fā))；由纖維素制成的桿狀插入物；新型眼科藥物輸送系統(tǒng)(nods)，由聚(乙烯醇)制成；或那些描述于fabrizio(advdrugdelivrev16:95-106,1998)中的插入物。在一些情況下，插入物包含膠原、明膠或聚合物，其中所述聚合物選自聚己內(nèi)酯(pcl)、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物(eva)、氰基丙烯酸酯、聚氨酯、尼龍、聚(dl-丙交酯-共-乙交酯(plga)或任何這些的共聚物。在一些情況下，在上眼瞼下植入插入物。在一些情況下，插入物被植入到在眼睛的后段、脈絡(luò)膜空間或鞏膜內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，在玻璃體內(nèi)或視網(wǎng)膜下植入插入物。在一些實(shí)施方案中，視網(wǎng)膜下注射插入物。施用的方法和插入物的制備技術(shù)闡述于remington's:thepracticeofscienceofpharmacy,20thedition(lippincottwilliams&wilkins,2006)中，通過(guò)引用將其全部并入本發(fā)明。在其他實(shí)施方案中，包含的il-6a組合物的插入物提供了藥劑到眼睛玻璃體的持續(xù)釋放。如本發(fā)明所用，“持續(xù)釋放”是指組合物以受控的方式在延長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)釋放藥劑。在一些實(shí)施方案中，插入物以一種的速率釋放藥劑，使得在藥劑的釋放過(guò)程中，水中(aqueousagent)的藥劑的濃度持續(xù)低于玻璃體中藥劑的濃度。在一些實(shí)施方案中，水中(aqueousagent)的藥劑的濃度為從約0.002μg/ml到約0.01μg/ml或從約0.01μg/ml，到約0.05μg/ml或到低于約0.05μg/ml。在一些實(shí)施方案中，以約1μg/天到約50μg/天，或從1μg/天到約10μg/天的速率釋放藥劑。在一些實(shí)施方案中，插入物還包含如上文詳述的額外的治療劑，例如氟輕松(如存在于眼部插入物中)。在一些實(shí)施方案中，眼用組合物包含微球或納米顆粒。在一些實(shí)施方案中，所述微球包含明膠。在一些實(shí)施方案中，微球被注射到眼睛的后段、脈絡(luò)膜空間或鞏膜內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，微球或納米顆粒包含聚合物，包括但不限于那些在wagh,等(asianjpharm2:12-17,2008)中描述的聚合物。在一些實(shí)施方案中，聚合物是殼多糖、聚羧酸，如聚丙烯酸、白蛋白顆粒、透明質(zhì)酸酯、聚衣康酸、聚(丁基)氰基丙烯酸酯、聚己內(nèi)酯、聚(異丁基)己內(nèi)酯、聚(乳酸-共-乙醇酸)或聚(乳酸)。在一些實(shí)施方案中，微球或納米顆粒包含固體脂質(zhì)顆粒。在一些實(shí)施方案中，il-6a組合物包含離子交換樹(shù)脂。在一些實(shí)施方案中，離子交換樹(shù)脂是無(wú)機(jī)沸石樹(shù)脂或合成的有機(jī)樹(shù)脂。在一些實(shí)施方案中，離子交換樹(shù)脂包括但不限于wagh等中描述的樹(shù)脂(同上)，通過(guò)引用將其全部并入本發(fā)明。在一些實(shí)施方案中，離子交換樹(shù)脂為部分中和的聚丙烯酸。可以在水性聚合物懸液中提供il-6a組合物。在一些實(shí)施方案中，il-6a組合物或聚合物懸液懸浮于水性介質(zhì)(如具有前文所述特性的水性水性介質(zhì))中。聚合懸浮試劑的例子包括，但不限于，葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖凝膠、纖維素聚合物如羥丙基甲基纖維素和含羧基的聚合物，如丙烯酸的聚合物或共聚物，以及其它聚合物緩和劑(polymericdemulcents)。在一些實(shí)施方案中，該聚合物緩和劑是水可溶脹的、水不溶性聚合物，特別是交聯(lián)的含羧基的聚合物。在一些實(shí)施方案中，以所存在的單體的總重量為基準(zhǔn)計(jì)，該聚合物懸浮劑包含至少約90重量％到約99.9％，或約95％到約99.9％的一種或多種含羧基的單烯屬不飽和單體。在一些實(shí)施方案中，該含羧基的單烯屬不飽和單體包括丙烯酸、甲基丙烯酸、乙基丙烯酸、甲基丙烯酸(巴豆酸)、順式-α-甲基巴豆酸(當(dāng)歸酸)、反式-α-甲基巴豆酸(α-甲基巴豆酸)、α-丁基巴豆酸、α-苯基丙烯酸、α-芐基丙烯酸、α-環(huán)己基丙烯酸、苯基丙烯酸(肉桂酸)、香豆酸(鄰羥基肉桂酸)以及傘形酸(對(duì)羥基香豆酸)。在一些實(shí)施方案中，該聚合物是通過(guò)多官能團(tuán)交聯(lián)劑(如，雙官能的交聯(lián)劑)來(lái)交聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，以所存在的單體的總重量為基準(zhǔn)計(jì)，該交聯(lián)劑的含量為約0.01％到約5％，或約0.1％到約5.0％，或約0.2％到約1％。在一些實(shí)施方案中，該交聯(lián)劑是非聚烯基聚醚雙官能交聯(lián)用單體，例如二乙烯基乙二醇、2，3-二羥基己-1，5二烯、2，5-二甲基-1，5-己二烯、二乙烯基苯、n,n-二烯丙基丙烯酰胺、n，n-二烯丙基甲基丙烯酰胺；每一分子含有兩個(gè)或更多個(gè)烯基醚基團(tuán)的聚烯基聚醚交聯(lián)劑，如含有末端h2c＝c基團(tuán)的烯基醚基團(tuán)，通過(guò)用鹵代烯烴如烯丙基溴等將含有至少四個(gè)碳原子和至少三個(gè)羥基的多元醇醚化來(lái)制備，如聚烯丙基蔗糖，聚烯丙基季戊四醇等；分子量約400到約8000的二烯屬非親水性大分子交聯(lián)劑，，例如二醇和多元醇的不溶性二丙烯酸酯和多丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯，由聚酯二醇、聚醚二醇或聚硅氧烷二醇與甲基丙烯酸羥烷基酯衍生的異氰酸酯終端的預(yù)聚物的二異氰酸酯丙烯酸或甲基丙烯酸羥烷基酯反應(yīng)產(chǎn)物等在一些實(shí)施方案中，交聯(lián)聚合物可由作為唯一存在的單烯屬不飽和單體的一種或多種含羧基的單烯屬不飽和單體與一種或多種交聯(lián)劑制備。在一些實(shí)施方案中，聚合物是其中至多約40％，優(yōu)選約0％到約20％的一種或多種含羧基的單烯屬不飽和單體被一種或多種不含羧基、僅含生理上和眼科學(xué)無(wú)害的取代基的單烯屬不飽和單體替代的聚合物，所述單體包括丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯，例如甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸辛酯、甲基丙烯酸2-羥乙酯，丙烯酸3-羥丙酯等，乙酸乙烯酯，n-乙烯基吡咯烷酮等(如mueller等，美國(guó)專利第4,548,990號(hào))。在一些實(shí)施方案中，聚合物包括聚卡波非(noveonaa-1)、和在一些實(shí)施方案中，該交聯(lián)聚合物通過(guò)使用常規(guī)自由基聚合催化劑將單體懸浮或乳液聚合至當(dāng)量球徑不超過(guò)約50μm的干燥粒度來(lái)制備。在一些實(shí)施方案中，該平均干燥粒度為當(dāng)量球徑約1到約30μm，或約3約20μm。在一些實(shí)施方案中，聚合物顆粒通過(guò)將較大的聚合物顆粒機(jī)械研磨來(lái)獲得。在其他實(shí)施方案中，此類聚合物具有約250,000到約4,000,000，以及3,000,000,000到4,000,000,000的分子量。在其他實(shí)施方案中，交聯(lián)聚合物的顆粒是單分散的，是指它們所具有的粒度分布應(yīng)使得至少約80％、約90％或約95％的顆粒落入主粒度分布的μm帶內(nèi)。在其他實(shí)施方案中，單分散粒度是指不超過(guò)約20％，約10％，或約5％顆粒的粒度在1μm以下。在一些實(shí)施方案中，聚合物水性懸浮液包括約0.05到約1％、約0.1到約0.5％、或約0.1到約0.5％的治療劑和約0.1到約10％、約0.5到約6.5％、約0.5到約2.0％、約0.5％到約1.2％、約0.6到約0.9％、或約0.6到約0.8％的聚合物懸浮劑。雖然提到的是單種，但應(yīng)該理解，在總量處于規(guī)定范圍的情況下，可以使用一種或多種聚合物懸浮劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，不溶性的輕度交聯(lián)的聚合物顆粒的量、ph和滲透壓能夠彼此相關(guān)，并且與交聯(lián)度相關(guān)，以提供具有約500到約100,000厘泊，優(yōu)選約1,000到約30,000厘泊或約1,000到約10,000厘泊的粘度的組合物，所述粘度使用裝有25號(hào)芯軸和13r小樣品接頭的brookfield數(shù)字lvt粘度計(jì)在12rpm和室溫(約25℃)下測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，該粘度為約10到約400厘泊，約10到約200厘泊或約10到約25厘泊。在一些實(shí)施方案中，可以配制聚合物水性懸浮液，使得它們?cè)谘壑斜３峙c施用于眼睛之前的粘度相同或基本上相同的粘度。在一些實(shí)施方案中，可以配制它們，使得其在與淚液接觸時(shí)凝膠化增強(qiáng)。例如，當(dāng)ph低于約6.7的含有或其他類似聚丙烯酸類聚合物的制劑施用于眼睛時(shí)，該聚合物在與淚液接觸時(shí)可能溶脹，因?yàn)樗哂休^高的ph(大約7)。該凝膠化或凝膠化的增強(qiáng)可能導(dǎo)致懸浮顆粒的夾帶，從而延長(zhǎng)了組合物在眼睛中的停留時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，隨著懸浮顆粒經(jīng)時(shí)溶解，該治療劑慢慢地釋放。在一些實(shí)施方案中，該輸送途徑增加了患者舒適感，增加了治療劑與眼組織的接觸時(shí)間，從而增加了藥物吸收的程度和制劑在眼睛中的作用持續(xù)時(shí)間。在這些藥物輸送系統(tǒng)中含有的治療劑可以取決于諸如藥物本身及其外形、藥物加載的程度和系統(tǒng)的ph以及還可能存在的任何藥物輸送助劑如與眼表相容的離子交換樹(shù)脂之類的因素的速率從凝膠中釋放。在一些實(shí)施方案中，使用基因遞送，如局部遺傳遞送，將il-6拮抗劑提供給受試者。這種遞送可通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)遞送，一種穩(wěn)定的(如整合的)表達(dá)系統(tǒng)(如由bluebirdbio(cambridge,ma)生產(chǎn)的慢病毒遞送系統(tǒng))，或在細(xì)胞工廠中遞送，如那些由neurotech(cumberland,rhodeisland)所生產(chǎn)的細(xì)胞工廠。所有技術(shù)特征可以這些特征的所有可能的組合方式單獨(dú)地組合。等同方案本發(fā)明可用其他不違背其精神或主要特征的其他具體形式來(lái)體現(xiàn)。前述實(shí)施方案因此在所有方面被認(rèn)為是說(shuō)明性的而非對(duì)本發(fā)明所述發(fā)明的限制。實(shí)施例下列非限制性實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明了本發(fā)明所述的本發(fā)明的實(shí)施方案。實(shí)施例1：在脈絡(luò)膜新生血管(cnv)模型中驗(yàn)證局部il-6的阻斷為了確定局部il-6阻斷是否能夠有效治療眼睛疾病，例如糖尿病黃斑水腫(dme)或濕性amd，抗il-6抗體被局部施用到脈絡(luò)膜新生血管模型系統(tǒng)中。激光誘導(dǎo)的cnv模型(eyecro.com/in-vivo/laser-induced-choroidal-neovascularization-cnv/)再現(xiàn)許多dme下的病理過(guò)程，包括炎癥和血管發(fā)生。eyecro(oklahomacity,ok)在大鼠中進(jìn)行了研究。在第0天時(shí)，每組中的6只動(dòng)物進(jìn)行雙側(cè)激光處理以產(chǎn)生每只眼睛3處損傷。在第3天和第10天時(shí)，將3μg多克隆抗大鼠il-6抗體(r&dsystemsaf506；minneapolis,mn)玻璃體(ivt)注射到實(shí)驗(yàn)組中，而將pbs或抗vegf多克隆抗體(r&dsystemsaf564)分別施用到載體和陽(yáng)性對(duì)照組。在第15和22天體內(nèi)造影以測(cè)量病變區(qū)域。在第15天和第22天抗il-6處理組相對(duì)于載體對(duì)照顯著地降低血管發(fā)生?？筰l-6處理組和抗vegf陽(yáng)性對(duì)照之間在應(yīng)答上(response)沒(méi)有顯著差異。圖1示出了該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)表明，ivt施用il-6a，例如抗il6抗體，可以在cnv大鼠模型中降低血管發(fā)生到與抗vegf陽(yáng)性對(duì)照相似的水平(抗il-6對(duì)載體對(duì)照，在第15天p＝0.0054和在第22天p＝0.0005)。這些數(shù)據(jù)表明，局部阻斷il-6對(duì)治療眼病，例如涉及血管滲漏的眼病，如黃斑水腫是有用的。實(shí)施例2：候選抗體il-6拮抗劑使用首先涉及免疫接種的流程開(kāi)發(fā)候選抗體il-6拮抗劑。免疫接種在發(fā)明人的指示下由合同研究組織(cro)實(shí)施。向5只balb/c小鼠皮下注射含80μg人il-6(r&dsystems,cat#206-il/cf,minneapolis,mn)，1mnacl和弗氏佐劑的pbs。用80μg和50μg的il-6進(jìn)行兩次加強(qiáng)免疫。從最高滴度的小鼠中收集脾細(xì)胞并與p3x763ag8.653骨髓瘤細(xì)胞融合以形成雜交瘤。對(duì)雜交瘤上清液篩選il-6結(jié)合和拮抗性。對(duì)于結(jié)合elisa，用含1μg/ml人il-6的pbs包被costar9018板，4℃過(guò)夜。用含有2％bsa的pbs封閉孔，洗滌，然后與50μl每種雜交瘤上清液孵育，所述雜交瘤上清液用含2％bsa的pbs以1:2稀釋。60分鐘后，將孔用含0.1％tween-20的300μlpbs洗滌三次。然后每孔加入于pbs-bsa中以1:3000稀釋的抗小鼠hrp，并孵育30分鐘。板孔作如上的洗滌，然后加入3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)底物，并在450和550nm處測(cè)量信號(hào)。對(duì)于拮抗研究，hek-bluetm-il6報(bào)告細(xì)胞(invivogen,sandiego,ca)在1:10稀釋的雜交瘤上清液的存在下與濃度遞增的人il-6孵育。20-24小時(shí)后，20μl上清液與180μlquantibluetm(invivogen)混合，并在655nm處測(cè)量吸光度?；诮Y(jié)合和拮抗研究，由申請(qǐng)人篩選出作為前導(dǎo)(lead)的雜交瘤64并在cro亞克隆。進(jìn)一步用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(elisa)測(cè)試雜交瘤64(小鼠單克隆)抑制il-6/il-6rα復(fù)合物結(jié)合到gp130的能力。通過(guò)elisa，1.5μg/ml濃度的雜交瘤64顯著地減弱了il-6/il-6rα復(fù)合物結(jié)合到固定化的gp130(圖2)。再篩選所述亞克隆并用5’racepcr擴(kuò)增亞克隆64.58的可變結(jié)構(gòu)域并測(cè)序。小鼠可變結(jié)構(gòu)域的序列(稱為m64)如下：m64vh(可變重鏈)qvqlqqsgaelvrpgtsvkvsckasgyafsnyliewvkqrpgqglewigvitpgsgtinynekfkgkavltadkssstvymqlssltsddsavyfcaksrwdplyyyaleywgqgtsvtvss(seqidno：13)m64vl(可變輕鏈)divltqspaslavslgqratiscrasesvdnygisfmnwfqqkpgqppklliyaasnqgsgvparfsgsgsgtdfslnihpmeeddtamyfcqqskevpltfgagtklelk(seqidno：14)為了創(chuàng)建人源化序列，m64的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)被移植到通過(guò)計(jì)算算法選擇的與小鼠序列相似的人種系框架(germlineframework)中。人源化序列(稱為h64)如下(與m64序列相比改變的殘基用下劃線標(biāo)示)且與小鼠序列具有約79.5％的同一性(vh)和84.4％的同一性(vl)：h64vhqvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgyafsnyliewvrqapgqglewmgvitpgsgtinyaqkfqgrvtitadeststaymelsslrsedtavyycarsrwdplyyyaleywgqgttvtvss(seqidno:15)h64vldivmtqspdslavslgeratincrasesvdnygisfmnwyqqkpgqppklliyaasnqgsgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqskevpltfgqgtkleik(seqidno:16)用dna2.0(menlopark,ca)合成人源化序列，然后將其與人igg1恒定結(jié)構(gòu)域融合一并克隆入pcdna3.1來(lái)源的表達(dá)載體。通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染freestyletm-293細(xì)胞(invitrogen,grandisland,ny)表達(dá)，并通過(guò)蛋白a層析純化igg。在結(jié)合和拮抗研究中，與其m64祖先(predecessor)相比，h64igg表現(xiàn)出相當(dāng)大的效力降低。因此利用酵母展示來(lái)恢復(fù)喪失的親和力。為了實(shí)施目的為恢復(fù)或提高人源化h64igg親和力的親和力成熟(affinitymaturation)，h64抗體序列被重新克隆到pyc2/ct來(lái)源的酵母載體中以生產(chǎn)fab分子，其中所述載體中fabh鏈通過(guò)(g4s)3連接子(seqidno：29)與抗fitcscfv4m5.3融合。然后通過(guò)易錯(cuò)pcr(依照chao等(2006,natureprotocols,1:755-768)的方案)產(chǎn)生h64變體文庫(kù)。表達(dá)h64變體并通過(guò)標(biāo)記有fitc-peg-nhs的酵母在表面捕獲變體，然后與生物素化的人il-6孵育。用親和素-apc檢測(cè)結(jié)合的il-6，且在bdfacsariatm分選儀上選擇結(jié)合有最高量il-6的細(xì)胞，其中結(jié)合的il-6的量與展示的fabs的量相關(guān)。經(jīng)過(guò)四輪篩選，高親和力變體群體被選擇和測(cè)序。由親和力成熟所選擇的克隆序列(稱為h64-1.4)如下，其中所選擇的突變(如與h64的vh和vl序列相比的突變)以粗體顯示，且cdrs用下劃線標(biāo)示。這些是018的可變結(jié)構(gòu)域(以及下述的020和029的il-6a分子)。需要注意的是完整的fabs包括ck和igg1的ch1結(jié)構(gòu)域。在本申請(qǐng)的上下文中，提及的“fab”重鏈或輕鏈氨基酸序列是指序列可以是由輕鏈衍生序列和重鏈衍生的序列組成的起作用的fab的一部分。h64-1.4vh(018vh)(可變結(jié)構(gòu)域)h64-1.4vl(018vl)(可變結(jié)構(gòu)域)h64-1.4可變結(jié)構(gòu)域被重新克隆到pcdna3.1人igg1載體中，并在freestyletm-hek293細(xì)胞(lifetechnologies)中表達(dá)全長(zhǎng)的igg1。所獲得的純化的igg比原來(lái)的h64抗體在結(jié)合及細(xì)胞拮抗研究中是明顯更為有效的。使用酵母系統(tǒng)測(cè)試了親和力，所述親和力從最初的人源化分子的343pm提高到43pm。使用hek-blue細(xì)胞系統(tǒng)測(cè)定的拮抗劑的效力提高了約10倍。將h64-1.4igg重排為fab以在眼部和其他適應(yīng)癥中使用。此外，進(jìn)行另一輪的文庫(kù)生成和基于酵母的篩選，以進(jìn)一步提高親和力。經(jīng)過(guò)四輪篩選，存在具有a76v突變的vh變體的顯著富集。包含a79v的抗體、變體及其片段稱為019il-6a抗體、變體及其片段。實(shí)施例3：形式的選擇為了研究基于抗體的il-6拮抗劑的適合的形式，測(cè)試了如前文所述的選擇出的il-6抗體的瞬時(shí)表達(dá)、穩(wěn)定性、聚集性、結(jié)合親和力和ic50，其中所述抗體使用018序列的fab、scfv(vh-vl)和scfv(vh-vl)形式。候選il-6a分子(包含018可變區(qū)的序列)其中之一的前述實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于表1。表1這些數(shù)據(jù)展示了鑒定基于il-6拮抗劑抗體的各種形式的關(guān)鍵特征的方法，并闡明了對(duì)于包含018可變區(qū)的il-6拮抗劑而言，018fab形式與scfv結(jié)構(gòu)相比，在最多的關(guān)鍵類別(如表達(dá)、穩(wěn)定性、聚集和結(jié)合親和性)中具有最受歡迎的特征。018fab的ic50落在用于治療的合理的范圍內(nèi)。實(shí)施例4：il-6a抗體、片段和衍生物的例子使用本發(fā)明所描述的方法，申請(qǐng)人已鑒定出下述序列。下劃線的序列代表重鏈和輕鏈的cdrs。其它序列可在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中找到。igg1框架中的018重鏈(全長(zhǎng)；fl018hc)多肽序列qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgyalsnyliewvrqapgqglewmgvitpgsgtinyaqkfqgrvtitadeststaymelsslrsedtavyycarsrwdplyyyaleywgqgttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:19)igg1框架中的018重鏈(全長(zhǎng)；fl018hc)核酸序列caagtgcagctggtgcagtcaggggccgaggttaagaagccagggagcagcgtcaaggtatcttgtaaagcgtctggttacgccctttcaaactacctgatcgaatgggtgaggcaggctcccggccaaggcctggaatggatgggagttatcacccctgggagcggcaccattaattacgcccagaaatttcagggacgagtgacgattaccgccgacgagtccaccagtactgcctacatggagctgtcctcactccgcagcgaggacacggcagtttactactgcgcccggagtcgatgggaccctctttactattatgctctggaatactggggccagggaacgaccgttacagtgtcatctgctagcacaaaaggaccatcagtcttcccacttgctccttcatctaagagcacaagtggtggcactgcagcccttggctgcctggtgaaagattatttccccgaacctgttacagtttcttggaactccggtgcactgacatccggagtacacactttcccagctgtgctgcagagctcaggactgtatagcctgtcttcggtggtcactgttccatcgtcgagtcttggcacacagacatatatttgcaacgtcaatcacaagccctccaacacaaaagtggataagaaggtcgagcccaaatcttgtgacaagacccatacgtgtcctccctgtcccgcccctgaactgctgggaggcccttctgtgttcctgttcccacctaagccaaaggacactctgatgatcagccggactcccgaggttacctgtgtggtggtggatgtgtctcatgaagaccctgaggttaagttcaattggtacgtggatggcgtcgaggtgcataacgcaaaaaccaagccgagagaggagcagtacaatagcacctatagagtagtgagcgtcctgactgtcttacatcaggattggctcaatggtaaagaatataagtgcaaggtaagcaacaaggccctacccgcaccaatagagaagaccatctccaaggcgaaaggtcagcccagggagccccaggtttatacactgcctccctcacgcgacgaattaacaaagaatcaggtgtctctcacctgtctcgtcaagggcttttacccttccgacatcgccgtggagtgggaatccaatggccagcctgagaacaattataagacaactcccccagtcctggattcagatgggtcgttctttctatatagtaagttgaccgtggataagtctcgctggcaacaggggaacgtgttctcttgctctgttatgcatgaagcgctgcacaatcattatacccagaagtccctgtccctgagccccgggaag(seqidno：20)igg1框架中的018fab重鏈(018fabhc)多肽序列。cdrs以下劃線標(biāo)示qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgyalsnyliewvrqapgqglewmgvitpgsgtinyaqkfqgrvtitadeststaymelsslrsedtavyycarsrwdplyyyaleywgqgttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepksc(seqidno:1)018全長(zhǎng)輕鏈(fl018lc)多肽序列。cdrs以下劃線標(biāo)示divmtqspdslavslgeratincrasesvdnygipfmnwyqqkpgqppklliyaasnrgsgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqseevpltfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seqidno:2)這也是020和029il-6拮抗劑的輕鏈igg1框架中的018全長(zhǎng)輕鏈(018lc)核酸序列g(shù)acatagtgatgactcaaagtccggacagcctggcggtgtcactcggcgaacgggcaactatcaactgccgagccagcgagagcgtcgataattacggcatccccttcatgaactggtatcagcagaagccaggacagccgcccaagctgcttatctacgccgcttccaaccggggatcaggggtgcccgatcgatttagtggaagcggtagtgggaccgatttcacactgaccatcagctcccttcaggccgaggatgtggctgtctattattgtcagcaatccgaggaagtgccgctcacgtttggtcagggaaccaaactggagatcaagcggaccgtagcggcgcctagtgtcttcatcttcccaccctccgacgaacagctgaagtctggcactgcttccgtcgtgtgcctgctcaacaacttttaccctagagaggcaaaagttcaatggaaagtagacaatgccttgcagtccgggaactcccaggagtctgtcacagagcaggatagtaaggactcaacctacagcctgtccagcacactgaccctctccaaagccgactacgagaagcacaaagtgtacgcttgcgaagttacgcatcaggggctgtcctcacccgttacaaaaagttttaacagaggggagtgc(seqidno:26)019fab重鏈(019fabhc，除a79v(粗體/斜體)外與018fabhc序列相同019vh(可變區(qū)/019hc)019抗體輕鏈(019lc)序列(多肽和核酸)與018lc相同018hc的cdr1(vhcdr1018)：gyalsnylie(seqidno：4)018hc的cdr2(vhcdr2018)：vitpgsgtin(seqidno：5)018hc的cdr3(vhcdr3018)：srwdplyyyaley(seqidno：6)018lc的cdr1(vlcdr1)：rasesvdnygipfmn(seqidno：7)018lc的cdr2(vlcdr2)：aasnrgs(seqidno：8)018lc的cdr3(vlcdr3)：qqseevplt(seqidno：9)019hc的cdr1(vhcdr1019)：gyalsnylie(seqidno：4)019hc的cdr2(vhcdr2019)：vitpgsgtin(seqidno：5)019hc的cdr3(vhcdr3019)：srwdplyyyaley(seqidno：6)實(shí)施例5：表位和結(jié)構(gòu)作圖表位作圖對(duì)所選擇的候選il-6拮抗劑進(jìn)行功能表位作圖。發(fā)現(xiàn)在elisa中候選抗體(小鼠64抗體)沒(méi)有減弱il-6rα對(duì)il-6的結(jié)合，表明該候選抗體不結(jié)合位點(diǎn)i。額外進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)證明表明在elisa中嵌合小鼠64抗體減弱il-6/il-6rα復(fù)合物對(duì)gp130的結(jié)合，說(shuō)明il-6的位點(diǎn)ii或位點(diǎn)iii攜帶該抗體的結(jié)合位點(diǎn)。還發(fā)現(xiàn)小鼠64抗體不顯著阻斷已知的位點(diǎn)iii結(jié)合抗體ah-65(immunotech,marseille,france)與il-6的結(jié)合，說(shuō)明該候選抗體結(jié)合il-6的位點(diǎn)ii。這些數(shù)據(jù)表明可產(chǎn)生針對(duì)位點(diǎn)ii的抗體，以及證明了鑒定該抗體的方法。為了進(jìn)一步定義表位，在酵母中產(chǎn)生了il-6的突變，其與4m5.3(boderetal.,2000,procnatlacadsciusa97,10701–10705；chaoetal.,2006,natprotoc1,755–768)相融合。所表達(dá)的突變體是在人il-6中具有下述單或雙突變的突變體：r24e/d27e、r30e、y31e、d34r、s118r/v121e、w157e、q159e/t162p、k171e和r179e。所述表達(dá)的突變的il-6分子被用于與018(fab)的結(jié)合研究。觀察到018(fab)的r24e/k27e、y31e、d34r和s118r/v121r親和力的降低，其均位于il-6的位點(diǎn)ii中。因此，本發(fā)明所描述的發(fā)明包括抗體，其能夠結(jié)合到人il-6位置24、27、31、34、118和121中的至少一個(gè)，兩個(gè)，三個(gè)，四個(gè)，五個(gè)或六個(gè)氨基酸，或能夠結(jié)合il-6中的等效位點(diǎn)。位點(diǎn)ii表位的結(jié)構(gòu)定義計(jì)算下列距離以在結(jié)構(gòu)上定義位點(diǎn)ii。該計(jì)算基于il-6/il-6α/gp130六聚體的晶體結(jié)構(gòu)，pdb1p9m(boulangeretal.,2003,science300:2101-2104)。il-6的螺旋1位于(runs)位點(diǎn)i和位點(diǎn)ii之間，導(dǎo)致某些殘基接近于位點(diǎn)ii但具有指向位點(diǎn)i的側(cè)鏈，如r30。d2和d3是指il-6rα的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。下列il-6的氨基酸被確定為落入gp130-d2-d3的以內(nèi)：l19、r24、k27、q28、r30、y31、d34、e110、q111、r113、a114、m117、s118、v121、q124、f125和k128。下列il-6的氨基酸被確定為落入gp130-d2-d3的以內(nèi)：l19、e23、r24i25、k27、q28、i29、r30、y31、d34、k41、q102、e109、e110、q111、a112、r113、a114、v115、q116、m117、s118、k120、v121、l122、q124、f125和k128。因此，能夠結(jié)合一個(gè)或多個(gè)il-6中落入位點(diǎn)ii或的氨基酸的分子，如抗體或其片段，可以是il-6a。提供下面的人il-6序列作為參考(下劃線所標(biāo)示的序列是前導(dǎo)序列)。gp130-d2-d3的以內(nèi)的氨基酸用斜體標(biāo)記。氨基酸編號(hào)，如用于定義表位的突變，不含前導(dǎo)序列。人il-6進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)試了h64-1.4人源化抗體的fab片段，并證明該片段由于靶向位點(diǎn)ii，從而能夠阻斷il-6順式和反式信號(hào)?？扇苄詉l-6受體(sil-6r)的存在不改變fab片段的效力。這與抗il-6rigg相反，其在sil6r的存在下效力有所降低，且其僅阻斷順式信號(hào)。這些實(shí)驗(yàn)證明靶向位點(diǎn)ii的抗體或該抗體的片段，如fab片段可用于抑制il-6的順式和反式信號(hào)。實(shí)施例6：靈長(zhǎng)類動(dòng)物研究由于非靈長(zhǎng)類動(dòng)物可以與靈長(zhǎng)類動(dòng)物的活力(activities)具有很大差異，因此一般使用非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物進(jìn)一步評(píng)價(jià)候選il-6拮抗劑的pk和其他參數(shù)。人il-6與食蟹猴和獼猴il-6有7個(gè)位點(diǎn)的不同，其中的一個(gè)位于位點(diǎn)(氨基酸28)ii內(nèi)且與非洲綠猴il-6的位點(diǎn)ii相同。這似乎只降低了含018序列的抗體約3-4倍的結(jié)合能力。結(jié)合到非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物il-6的能力是il-6拮抗劑的一個(gè)有用的特征，其促進(jìn)作為藥物的候選物的開(kāi)發(fā)，如通過(guò)使在非靈長(zhǎng)類動(dòng)物中的測(cè)試，如毒性測(cè)試成為可能。如同大多數(shù)il-6抗體一樣，因?yàn)閕l-6的低序列同源性，本發(fā)明所描述的抗il-6抗體不與嚙齒動(dòng)物、兔或犬的il-6發(fā)生交叉反應(yīng)。然而，在親和力研究中，發(fā)現(xiàn)018fab近似以人親和力結(jié)合食蟹猴和非洲綠猴的il-6(表2)。表2：對(duì)各種物種的各種il-6的單價(jià)親和力(018fab)物種kd人200pm非洲綠猴280pm食蟹猴840pm狗>1μm小鼠>1μm兔>1μm大鼠>1μm這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明了本發(fā)明所描述的il-6a特異性結(jié)合的能力以及在適合的動(dòng)物中形成具有允許檢測(cè)(如毒理學(xué)和生殖研究)的特征的分子的能力。實(shí)施例7：提高il-6a的表達(dá)為了提高018fab和019的fab多肽的表達(dá)，利用本領(lǐng)域已知方法制備了向重鏈ch1/鉸鏈區(qū)引入5個(gè)額外氨基酸(dktht(seqidno：30))的構(gòu)建體。改變了的018fab重鏈的序列示于下面的seqidno：24。改變的018序列在本發(fā)明中稱為020且改變的019序列在本發(fā)明中稱為021。020分子(020fab重鏈和018fab輕鏈)與具有018fab重鏈和018fab輕鏈的親本fab相比具有改善的表達(dá)。019分子與020分子相比未展現(xiàn)出顯著的親和力差異。020和019的表達(dá)分別增加了約2倍，親和力未受改變的影響。020重鏈(在羧基末端具有dktht(seqidno：30)的fab))qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgyalsnyliewvrqapgqglewmgvitpgsgtinyaqkfqgrvtitadeststaymelsslrsedtavyycarsrwdplyyyaleywgqgttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdktht(seqidno:24)使用020fab在hek-bluetmil-6受體細(xì)胞(invivogen,sandiego,ca)中測(cè)量il-6的拮抗作用。在含10pmil-6和各種濃度的020或il-6rα抗體(cellsciences,canton,ma)的混合液(含或不含50nmil-6rα)中孵育細(xì)胞，孵育20-24小時(shí)后，20μl細(xì)胞培養(yǎng)上清液與180μlquantibluetm(invivogen)底物混合并孵育1小時(shí)；在655nm處測(cè)量吸光度。圖3a和圖3b顯示了這些實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，證明了在存在或缺乏il-6r下，020抑制il-6活性的能力。實(shí)施例8：igg2il-6抗體使用本領(lǐng)域已知方法將018重構(gòu)(reformat)入人igg2同種型框架中以與igg1形式的抗體相比減少fcγr的結(jié)合以及減少adcc。另外，預(yù)期018重構(gòu)為全長(zhǎng)形式(如igg2)由于分子的更大大小而降低從玻璃體中的清除率。構(gòu)建/純化抗il-6igg2抗體為了使用如前文所述的抗-il-6序列構(gòu)建人igg2抗體，從cdna中pcr擴(kuò)增出分別在n-和c-末端帶有nhei和m1ui限制性位點(diǎn)的人igg2恒定結(jié)構(gòu)域。純化pcr產(chǎn)物，用nhei和m1ui酶切消化，然后連接入ptt5載體中，所述載體包含抗il6可變結(jié)構(gòu)域，如seqidno：1(見(jiàn)上文)。這樣得到全長(zhǎng)的igg2重鏈序列。含有包含018序列的全長(zhǎng)輕鏈的質(zhì)粒被用于提供輕鏈。為了進(jìn)一步減少fcrn的結(jié)合并因此減少il-6a的再循環(huán)，在重鏈中進(jìn)行了點(diǎn)突變。使用誘變(agilenttechnologies,santaclara,ca)制造突變。使用聚(乙烯亞胺)(pei)將重鏈和輕鏈質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到100mlhek293-6e細(xì)胞的瞬時(shí)培養(yǎng)物中，并培養(yǎng)以允許進(jìn)行約5天的表達(dá)。這種產(chǎn)生的抗體含有抗il-6的位點(diǎn)ii結(jié)合部分和igg2結(jié)構(gòu)。含有018cdrs的這種結(jié)構(gòu)在本發(fā)明中稱為018igg2或029。在殘基i253處制造點(diǎn)突變。所述igg2分子被很好地表達(dá)且在細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)中以與020fab相比略微改善的效力阻斷il-6。029成熟序列(cdrs用下劃線標(biāo)示)029重鏈qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgyalsnyliewvrqapgqglewmgvitpgsgtinyaqkfqgrvtitadeststaymelsslrsedtavyycarsrwdplyyyaleywgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seqidno:11)029輕鏈divmtqspdslavslgeratincrasesvdnygipfmnwyqqkpgqppklliyaasnrgsgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqseevpltfgqgtkleikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seqidno:12)改變的fcrn結(jié)合il-6可以具有某些積極的系統(tǒng)性效應(yīng)。因此改造il-6使其在玻璃體中具有良好的滯留但具有有限的全身半衰期是有利的。減少或消除fcrn結(jié)合應(yīng)當(dāng)減少任何逃入循環(huán)的藥物的系統(tǒng)性積累，從而提高il-6a的安全性。因此，由于fcrn介導(dǎo)的運(yùn)輸可能增加抗體從眼中流出，因此通過(guò)在fc的殘基i254、h311或h436引入突變(參見(jiàn)seqidno：23)編號(hào)根據(jù)martin等,molecularcell,7:4,867-877(2001))，進(jìn)一步修飾020igg2以消除fcrn的結(jié)合。突變的位點(diǎn)在seqidno：23中以粗體標(biāo)明；i254突變?yōu)閍或r；h311突變?yōu)閍或e、h311突變?yōu)閚且d313突變?yōu)閠，以及h436突變?yōu)閍(在前導(dǎo)序列后開(kāi)始編號(hào)，所述前導(dǎo)序列在seqidno：23中以下劃線標(biāo)明。含有該序列的il-6拮抗劑稱為018igg2m?？筰l-6重鏈(igg2)(常規(guī)字體：vh；斜體：ch)(無(wú)前導(dǎo)序列)顯示突變位點(diǎn)(粗體)抗il-6重鏈(igg2)(常規(guī)字體：vh；斜體：ch)有前導(dǎo)序列(下劃線)顯示突變位點(diǎn)(粗體)因此，一些實(shí)施方案中包括具有重鏈序列的抗體，所述重鏈序列描述于seqidno：23中，并具有i254(如a或r)、h311(突變?yōu)閍或e)、h436(突變?yōu)閍)，或d313(突變?yōu)閠)且h311突變?yōu)閚的突變。seqidno：25因此提供了一種序列，當(dāng)在i133(如i133a或i133r)、h190(如h190a或h190e)、h315(h315a)，或d192和h190(如d192t和h190n)處發(fā)生突變時(shí)，該序列可用于抗體、片段或其衍生物以產(chǎn)生在低ph下(如ph5.5)或溶酶體ph下具有減弱fc結(jié)合的多肽，和/或產(chǎn)生與親本或其他不含該序列的參考分子相比具有減弱的全身半衰期的多肽?？筰l-6輕鏈(igg2)(常規(guī)字體：vh；斜體：ch)實(shí)施例9：制劑穩(wěn)定性測(cè)試了抗il-6/igg1fab片段(包含igg1ch1結(jié)構(gòu)域)的穩(wěn)定性，所述測(cè)試通過(guò)使用差示掃描熒光確定最初在pbs中的tm，然后在一系列緩沖液和賦形劑中的tm。發(fā)現(xiàn)檸檬酸鹽緩沖液(ph5.5)將tm提高到超過(guò)80℃。因此，在一些實(shí)施方案中，il-6a提供于檸檬酸鹽緩沖液中且在一些情況下具有至少80℃的tm。使用sec-mals測(cè)試了聚集程度且20mg/ml在磷酸鹽緩沖液(pbs)中未觀察到聚集。實(shí)施例10：適合于增強(qiáng)pk的對(duì)ph敏感的抗體il-6可以具有某些積極的系統(tǒng)性效應(yīng)。因此改造il-6使其在玻璃體中具有良好的滯留但具有有限的全身半衰期是有利的。減少或消除與fcrn的結(jié)合能夠減少任何逃入循環(huán)的藥物在全身的積累，從而提高il-6a的安全性。因此，由于fcrn介導(dǎo)的運(yùn)輸可能增加抗體從眼中流出，因此通過(guò)在fc的殘基i254、h311或h435引入突變(編號(hào)根據(jù)martin等,molecularcell,7:4,867-877(2001))，以進(jìn)一步修飾020igg2以減弱fcrn的結(jié)合。這種抗體在本發(fā)明中稱為il-6ph抗體或抗il-6ph并在下面進(jìn)一步描述。具有ph敏感結(jié)合的抗體的產(chǎn)生組氨酸的pka為約6.0，且在結(jié)合界面上插入的組氨酸能夠在低ph時(shí)在側(cè)鏈質(zhì)子化作用后破壞結(jié)合。使用如本發(fā)明中所述的抗il-6位點(diǎn)ii靶向抗體，從018中產(chǎn)生一個(gè)包含富含組氨酸的cdr變體的文庫(kù)，且使用酵母展示從該文庫(kù)中篩選ph敏感的結(jié)合。產(chǎn)生的文庫(kù)是具有cdrs的組合文庫(kù)，所述cdr是由簡(jiǎn)并密碼子編碼，使得每個(gè)殘基是一個(gè)野生型殘基(即，與親本抗體相同)，或組氨酸殘基。通過(guò)交替排序在生理ph(7.4)下高結(jié)合和在內(nèi)涵體ph(5.5)下低結(jié)合進(jìn)行篩選。鑒定出了一個(gè)酵母-選擇的突變體，其具有在ph7.4下相對(duì)高的結(jié)合(該突變體具有407pm的單價(jià)kd相比親本的192pm的kd)和在ph5.5下相對(duì)低的結(jié)合(該突變體具有2.362nm的單價(jià)kd相比親本的195pm的kd)。這構(gòu)成在ph5.5下親和力約5.8倍的變化。這種突變體包含在輕鏈cdr1處的多個(gè)組氨酸突變。因此，該突變體顯示出在ph7.4下與親本分子相似的結(jié)合能力，以及在ph5.5下親和力的顯著喪失。通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法，使用elisa、facs和spr分析驗(yàn)證了這一觀察。這些數(shù)據(jù)表明，可以創(chuàng)建基于抗體的il-6a，其具有靶向il-6的位點(diǎn)ii的抗il-6的特征，可用于抑制il-6的順式和反式活性，且具有與親本抗體或其他具有野生型fc結(jié)構(gòu)域的抗體相比增加的pk，至少部分通過(guò)在ph5.5下改變的結(jié)合實(shí)現(xiàn)。實(shí)施例11：局部il-6阻斷在小鼠激光脈絡(luò)膜新血管形成(cnv)模型中的功效為了確定局部il-6阻斷是否能有效治療眼病，例如糖尿病黃斑水腫(dme)或濕性amd，在用于脈絡(luò)膜新血管形成的模型系統(tǒng)中局部施用單克隆抗il-6抗體。在此實(shí)施例中利用如saishin等人，journalofcellularphysiology,195:241-248(2003)描述的激光誘導(dǎo)的cnv模型。激光誘導(dǎo)的cnv模型再現(xiàn)了糖尿病黃斑水腫(dme)下的許多病理過(guò)程，包括炎癥和血管新生。通過(guò)玻璃體內(nèi)(ivt)注射將單克隆抗小鼠il-6抗體(mp5-20f3，其是購(gòu)自bioxcell，目錄號(hào)be0046的大鼠igg1同種型抗體)施用于試驗(yàn)組。對(duì)照組接受vegf抑制物(trap)的玻璃體內(nèi)注射或抗-hrp同種型對(duì)照抗體(針對(duì)辣根過(guò)氧化物酶大鼠igg1，克隆hrpn，購(gòu)自bioxcell；目錄號(hào)be0088)的玻璃體內(nèi)注射。對(duì)于所有抗體組，將1μl體積中的20μg蛋白質(zhì)注射到試驗(yàn)眼中，而將對(duì)側(cè)眼作為另外的對(duì)照不進(jìn)行處理。在激光后第7天麻醉小鼠，并用griffoniasimplicifolia(gsa)凝集素染色脈絡(luò)膜平底以測(cè)量病變面積。圖4顯示結(jié)果。與對(duì)照抗體處理組相比，抗il-6抗體處理組顯示出新生血管形成的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著降低(p<0.05)。與抗vegf陽(yáng)性對(duì)照相比，平均來(lái)說(shuō)抗il-6抗體處理組也顯示減少的新血管形成。這些數(shù)據(jù)表明，通過(guò)ivt施用的il-6a，例如單克隆抗il-6抗體可以顯著地降低小鼠cnv模型中的新血管形成。該結(jié)果進(jìn)一步表明，與抗-vegf抗體相比，抗il-6抗體可以產(chǎn)生至少一樣多且有可能更多的新血管形成減少。這些數(shù)據(jù)指示il-6的局部抑制有用于治療眼病，例如涉及血管滲漏的疾病，例如濕性amd或黃斑水腫，例如糖尿病黃斑水腫。實(shí)施例12：改進(jìn)的il-6抗體的開(kāi)發(fā)產(chǎn)生ebi-029抗體的變體。為了更好地表征突變a28v，s30p，i51t和s55g的貢獻(xiàn)，將特定組合引入到野生型ebi-029fab展示載體中并測(cè)量結(jié)合。結(jié)果顯示在圖5中。在與2μmil-6過(guò)夜競(jìng)爭(zhēng)后，與野生型ebi-029fab相比，所有突變體具有顯著更高的相對(duì)于展示保留在其細(xì)胞表面上的生物素化il-6水平。結(jié)合從最高至最低親和力的排列次序是a28v/s30p/i51t/s55g>a28v/i51t/s55g>s30p/i51t/s55g>i51t/s55g>wt。四重突變a28v/s30p/i51t/s55g在本文中也稱為ebi-030。ebi-030的序列顯示如下。030cdr序列030hc的cdr1(vhcdr1030):gyvlpnylie(seqidno:31)030hc的cdr2(vhcdr2030):vttpgggtin(seqidno:32)030hc的cdr3(vhcdr3030):srwdplyyyaley(seqidno:33)030lc的cdr1(vlcdr1030):rasesvdnygipfmn(seqidno:34)030lc的cdr2(vlcdr2030):aasnrgs(seqidno:35)030lc的cdr3(vlcdr3030):qqseevplt(seqidno:36)030重鏈可變區(qū)序列(相對(duì)于029的突變以粗體顯示)：030輕鏈可變區(qū)序列：divmtqspdslavslgeratincrasesvdnygipfmnwyqqkpgqppklliyaasnrgsgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyycqqseevpltfgqgtkleikrtv(seqidno:38)030fab(igg1)重鏈多肽序列(cdr加下劃線，相對(duì)于029的突變顯示為粗體)：在實(shí)施方案中，seqidno：39的羧基端的dktht序列(seqidno：30)不包括在fab序列中。030fab重鏈核酸序列：caagtgcagctggtgcagtcaggggccgaggttaagaagccagggagcagcgtcaaggtatcttgtaaagcgtctggttacgtccttccaaactacctgatcgaatgggtgaggcaggctcccggccaaggcctggaatggatgggagttaccacccctgggggcggcaccattaattacgcccagaaatttcagggacgagtgacgattaccgccgacgagtccaccagtactgcctacatggagctgtcctcactccgcagcgaggacacggcagtttactactgcgcccggagtcgatgggaccctctttactattatgctctggaatactggggccagggaacgaccgttacagtgtcatctgctagcacaaaaggaccatcagtcttcccacttgctccttcatctaagagcacaagtggtggcactgcagcccttggctgcctggtgaaagattatttccccgaacctgttacagtttcttggaactccggtgcactgacatccggagtacacactttcccagctgtgctgcagagctcaggactgtatagcctgtcttcggtggtcactgttccatcgtcgagtcttggcacacagacatatatttgcaacgtcaatcacaagccctccaacacaaaagtggataagaaggtcgagcccaaatcttgtgacaaaacacacaca(seqidno:40)030也可以作為igg2fab重鏈多肽序列產(chǎn)生：qvqlvqsgaevkkpgssvkvsckasgyvlpnyliewvrqapgqglewmgvttpgggtinyaqkfqgrvtitadeststaymelsslrsedtavyycarsrwdplyyyaleywgqgttvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverk(seqidno:54)實(shí)施例13：變體fab片段的表達(dá)和純化通過(guò)用bamhi-hf/nhei-hf進(jìn)行雙重消化，從酵母展示載體產(chǎn)生含有以下突變體組合的vh域插入物：a28v/i51t/s55g，s30p/i51t/s55g和a28v/s30p/i51t/s55g(ebi-030)。插入物通過(guò)1％瓊脂糖凝膠電泳純化，并連接到含有前導(dǎo)序列，人igg1ch1結(jié)構(gòu)域和c端his標(biāo)簽的ptt5衍生的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中。在lb-amp上選擇轉(zhuǎn)化體，小量制備，并通過(guò)測(cè)序證實(shí)插入物。對(duì)于與野生型ebi-029輕鏈(本文公開(kāi)為seqidno：12)配對(duì)的每個(gè)突變型fab重鏈，使用pei作為轉(zhuǎn)染試劑，在hek-6e細(xì)胞(canadianresearchcouncil)中進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。也表達(dá)野生型ebi-029fab為對(duì)照(野生型fab重鏈本文公開(kāi)為seqidno：24)。5天后收獲上清液，使用ni-nta瓊脂糖(lifetechnologies)通過(guò)親和層析純化表達(dá)的fab。通過(guò)幾輪濃度/稀釋將純化的蛋白質(zhì)的緩沖液交換到pbs，ph7.4中，并且通過(guò)吸光度280和sds-page測(cè)定蛋白質(zhì)濃度和純度。實(shí)施例14：如使用表面等離子共振評(píng)價(jià)的變體抗體顯示改善的結(jié)合通過(guò)reichertsr7000dc光譜儀上的表面等離子共振(spr)測(cè)量變體029fab分子對(duì)il-6的親和力。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)胺偶聯(lián)將10mm乙酸鈉(ph4.5)中的20μg/ml的人il-6固定在500-kda羧甲基葡聚糖芯片上。在25℃以25μl/min流速注入10mmhepes，150mmnacl，ph7.3中的每種fab分子的連續(xù)稀釋。4分鐘后，停止加載，并通過(guò)流動(dòng)的運(yùn)行緩沖液(10mmhepes，150mmnacl，ph7)測(cè)量解離5分鐘。傳感圖跡線擬合于1:1結(jié)合模型很差，可能是由于芯片上il-6的混合取向或非特異性抗體結(jié)合。相反，使用tracedrawer軟件將曲線擬合至2種類(低親和力和高親和力種類，在表3中標(biāo)記為“低親和力”和“高親和力”)，其中ka1，kd1和kd1是低親和力種類的締合速率，解離速率，和平衡結(jié)合常數(shù)，并且ka2，kd2和kd2是高親和力種類的締合速率，解離速率和平衡結(jié)合常數(shù)。與wtebi-029fab相比，所有突變體fab具有顯著較慢的解離，其中從最高至最低親和力的排列順序如下-a28v/s30p/i51t/s55g(ebi-030)>s30p/i51t/s55g>a28v/i51t/s55g>wt(ebi-029)。表3：突變體抗體的spr結(jié)果實(shí)施例15：變體抗體在hek-bluetmil6報(bào)告細(xì)胞中顯示出改善的拮抗效力hek-bluetmil6報(bào)告細(xì)胞系(invivogen)用于比較不同突變體ebi-029fab片段之間il6信號(hào)傳遞抑制的效力。hek-bluetmil6細(xì)胞是穩(wěn)定表達(dá)il-6r基因的修飾的hek-293系，并含有處于與四個(gè)stat3結(jié)合位點(diǎn)融合的ifnβ最小啟動(dòng)子的控制下的分泌堿性磷酸酶報(bào)告基因。為了測(cè)定il6拮抗作用，將10μl400pm的人il-6(r&dsystems206-il-010/cf)與10μl濃度范圍內(nèi)的每種fab變體在96孔板中混合，并在室溫下溫育30分鐘。將對(duì)數(shù)期的hek-bluetmil6細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶消化，并以280,000個(gè)細(xì)胞/ml重懸于測(cè)定培養(yǎng)基(dmem，4.5g/l葡萄糖，10％熱滅活fbs，2mml-谷氨酰胺，pen-step)中。將180μl細(xì)胞懸浮液加入到il-6/fab混合物的每個(gè)孔中，使最終的il-6濃度達(dá)到20pm。將細(xì)胞在37℃/5％co2下孵育20小時(shí)。然后將來(lái)自每孔的20μl上清液與180μl的quanti-bluetm試劑(invivogen)混合，并在37℃下溫育40分鐘，之后在spectramaxm5讀板儀上測(cè)量650nm的吸光度。減去來(lái)自沒(méi)有il-6的孔的背景信號(hào)，然后除以用無(wú)抑制劑的il-6處理的細(xì)胞以取得信號(hào)傳遞分?jǐn)?shù)值。與wtebi-029pab相比，所有突變體顯示出顯著更高的效力，其中拮抗效力排列順序如下：a28v/s30p/i51t/s55g(ebi-030)>a28v/i51t/s55g>s30p/i51t/s55g>wt(ebi-029)。這些結(jié)果顯示于圖6中。實(shí)施例16：變體抗體在t1165增殖測(cè)定中顯示出改善的拮抗效力t1165.85.2.1細(xì)胞(r&dsystems)是響應(yīng)于小鼠，大鼠或人il-6而增殖的鼠漿細(xì)胞瘤細(xì)胞系。為了測(cè)定來(lái)自ebi-029fab突變體的拮抗作用，在96孔板中將25μl的2ng/ml人il-6(r&dsystems206-il-010/cf)與25μl在濃度范圍內(nèi)的每種fab變體混合并在室溫下培養(yǎng)30分鐘。將對(duì)數(shù)期的t1165細(xì)胞沉淀并以2x105個(gè)細(xì)胞/ml重懸于測(cè)定培養(yǎng)基(90％rpmi1640,10％fbs，2mml-谷氨酰胺，pen-strep)中。將50μl細(xì)胞懸浮液加入到il-6/fab混合物的每個(gè)孔中，使最終的il-6濃度達(dá)到0.5ng/ml。將細(xì)胞在37℃/5％co2下孵育72小時(shí)。將100μlcell-試劑(promega)加入每個(gè)孔中并在室溫下孵育10分鐘。在spectramaxm5讀板儀上測(cè)量發(fā)光。所有突變體與wtebi-029fab相比顯示出顯著更高的效力，其中在測(cè)試的fab濃度范圍內(nèi)沒(méi)有可測(cè)量的il-6信號(hào)傳遞(參見(jiàn)圖7)。實(shí)施例17：變體抗體的藥物樣性質(zhì)(druglikeproperty)比較通過(guò)差示掃描熒光測(cè)定法(dsf)測(cè)定每個(gè)fab變體的熱穩(wěn)定性。在biorad96孔pcr板中將2μl的2.5或5mg/ml的蛋白質(zhì)與18μlpbs和2μl50xsyproorange混合。該板在bioradcfx96rt-pcr系統(tǒng)中運(yùn)行，其中線性溫度從25℃增加至95℃，并隨時(shí)間測(cè)量熒光。將tm計(jì)算為熔化曲線的一階導(dǎo)數(shù)的最低點(diǎn)。所有變體具有76和78℃之間的測(cè)量tm值，與wtebi-029fab的76℃的測(cè)量tm一致。為了測(cè)量聚集，通過(guò)sec-mals使用agilent1260hplc與wyattminidawntreos光散射儀器和wyattoptilabrex折射儀的組合評(píng)估樣品。注射20-100μg蛋白質(zhì)并以1ml/min的流速運(yùn)行。如通過(guò)光散射測(cè)量的，所有變體的分子量在45000和52000da之間，與野生型ebi-029fab一致。這些結(jié)果指示，與ebi-029相比，ebi-030在其藥物樣性質(zhì)方面表現(xiàn)相似地良好。實(shí)施例18：產(chǎn)生全長(zhǎng)ebi-029和ebi-030igg2抗體，以及具有突變fc域的igg2抗體將ebi-029和ebi-030重構(gòu)(reformat)為igg2和突變體fcigg2使用引入n端ecori位點(diǎn)和c-端nhei位點(diǎn)的引物，從fab載體pcr擴(kuò)增包含前導(dǎo)序列(mdwtwrilflvaaatgahs；seqidno：49)的ebi-029和ebi-030的重鏈可變域。pcr產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上純化，并用ecori-hf和nhei-hf雙重消化。含有野生型igg2重鏈序列的或具有h311a突變(h311對(duì)應(yīng)于seqidno：41中的編號(hào)；這對(duì)應(yīng)于martin等人，molecularcell,7:4,867-877(2001)中提供的編號(hào)中的h310)的變體igg2結(jié)構(gòu)域的基于ptt5的骨架的載體相似地用ecori-fh/nhei-hf消化，并在1％瓊脂糖凝膠上純化。使用quikligase酶(newenglandbiolabs)將插入物連接到消化的骨架中，在top10細(xì)胞(lifetechnologies)中轉(zhuǎn)化，并在lb-amp上選擇。將克隆進(jìn)行小量制備并測(cè)序以確認(rèn)插入物。選擇h311a突變以降低fc對(duì)fcrn的結(jié)合親和力，以便減少?gòu)难劢M織逃逸的分子的系統(tǒng)積累。通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)和純化igg2變體通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染在hek-6e細(xì)胞中表達(dá)ebi-029igg2，ebi-029igg2-h311a，ebi-030igg2和ebi-030igg2-h311a。使用pei作為轉(zhuǎn)染試劑，將含有各重鏈的ptt5載體與ebi-029lc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。5天后收獲上清液，通過(guò)親和層析用蛋白a瓊脂糖純化表達(dá)的igg2分子。通過(guò)幾輪濃度/稀釋將純化的蛋白質(zhì)的緩沖液交換到pbs，ph7.4中，通過(guò)吸光度280和sds-page測(cè)定蛋白質(zhì)濃度和純度。cho穩(wěn)定池生產(chǎn)根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)使用freedomcho-s試劑盒(lifetechnologies)生成產(chǎn)生ebi-029igg2，ebi-030igg2或ebi-030igg2-h311a的穩(wěn)定cho池。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)消化/連接將與ebi-029lc組合的每個(gè)重鏈克隆到pcho1.0載體中。使用freestylemax試劑將構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到cho-s細(xì)胞中，并使用增加濃度的嘌呤霉素和mtx選擇穩(wěn)定池。經(jīng)過(guò)兩輪選擇后，通過(guò)分析蛋白a層析針對(duì)抗體產(chǎn)生篩選池，并選擇最高生產(chǎn)者用于按比例放大和亞克隆。序列顯示如下。030重鏈多肽序列(在igg2框架中，cdr加下劃線)：030輕鏈多肽序列(在igg2框架中,cdr加下劃線):030重鏈核酸序列：caagtgcagctggtgcagtcaggggccgaggttaagaagccagggagcagcgtcaaggtatcttgtaaagcgtctggttacgtccttccaaactacctgatcgaatgggtgaggcaggctcccggccaaggcctggaatggatgggagttaccacccctgggggcggcaccattaattacgcccagaaatttcagggacgagtgacgattaccgccgacgagtccaccagtactgcctacatggagctgtcctcactccgcagcgaggacacggcagtttactactgcgcccggagtcgatgggaccctctttactattatgctctggaatactggggccagggaacgaccgttacagtgtcatctgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaaseqidno:43030輕鏈核酸序列：gacatagtgatgactcaaagtccggacagcctggcggtgtcactcggcgaacgggcaactatcaactgccgagccagcgagagcgtcgataattacggcatccccttcatgaactggtatcagcagaagccaggacagccgcccaagctgcttatctacgccgcttccaaccggggatcaggggtgcccgatcgatttagtggaagcggtagtgggaccgatttcacactgaccatcagctcccttcaggccgaggatgtggctgtctattattgtcagcaatccgaggaagtgccgctcacgtttggtcagggaaccaaactggagatcaagcggaccgtagcggcgcctagtgtcttcatcttcccaccctccgacgaacagctgaagtctggcactgcttccgtcgtgtgcctgctcaacaacttttaccctagagaggcaaaagttcaatggaaagtagacaatgccttgcagtccgggaactcccaggagtctgtcacagagcaggatagtaaggactcaacctacagcctgtccagcacactgaccctctccaaagccgactacgagaagcacaaagtgtacgcttgcgaagttacgcatcaggggctgtcctcacccgttacaaaaagttttaacagaggggagtgcseqidno:44具有h311a突變的030重鏈多肽序列(311a為粗體，cdr加下劃線)，本文也稱為031重鏈多肽序列：031重鏈核酸序列：caagtgcagctggtgcagtcaggggccgaggttaagaagccagggagcagcgtcaaggtatcttgtaaagcgtctggttacgtccttccaaactacctgatcgaatgggtgaggcaggctcccggccaaggcctggaatggatgggagttaccacccctgggggcggcaccattaattacgcccagaaatttcagggacgagtgacgattaccgccgacgagtccaccagtactgcctacatggagctgtcctcactccgcagcgaggacacggcagtttactactgcgcccggagtcgatgggaccctctttactattatgctctggaatactggggccagggaacgaccgttacagtgtcatctgctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgctctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcaacttcggcacccagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagacagttgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcgtggcccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa(seqidno:48)實(shí)施例19：在hek-blue-il6測(cè)定中ebi-030與ebi-029igg2效力的比較使用hek-bluetmil6報(bào)告細(xì)胞系(invivogen)比較在ebi-029與ebi-030igg2抗體之間的il6信號(hào)傳遞抑制的效力。比較了從hek-6e細(xì)胞純化的三種蛋白質(zhì)制劑-ebi-029igg2，ebi-030igg2和ebi-030igg2-h311a(也稱為031或ebi-031)，連同在穩(wěn)定的cho池中產(chǎn)生的ebi-030igg2制劑。另外，也包括批準(zhǔn)的抗il6r抗體托珠單抗作為對(duì)照。為了測(cè)量il6拮抗作用，將400pm的人il-6(r&d系統(tǒng)206-il-010/cf)與不同濃度的各抗體在96孔板中混合，并在室溫下孵育30分鐘。將對(duì)數(shù)期的hek-bluetmil6細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶消化，并以280,000個(gè)細(xì)胞/ml重懸于測(cè)定培養(yǎng)基(dmem，4.5g/l葡萄糖，10％熱滅活fbs，2mml-谷氨酰胺，pen-step)中。將180μl細(xì)胞懸液加入到il-6/fab混合物的每個(gè)孔中，使最終的il-6濃度達(dá)到20pm。將細(xì)胞在37℃/5％co2下孵育20小時(shí)。然后將來(lái)自每個(gè)孔的20μl的上清液與180μl的quanti-bluetm試劑(invivogen)混合，并在37℃下溫育40分鐘，然后在spectramaxm5讀板儀上測(cè)量在650nm的吸光度。結(jié)果顯示于圖8和表5中。與ebi-029相比，ebi-030(包括在hek細(xì)胞中產(chǎn)生的具有或不具有h311a突變的ebi-030和在cho細(xì)胞中產(chǎn)生的ebi-030)顯示了顯著改善的效力(ic50降低約50倍且ic90降低>100倍)。效力的增加大于通過(guò)spr測(cè)量的親和力的增加。表5：ic50和ic90值ebi-031(在本文中也稱為ebi-030igg2-h311a)具有比ebi-029的ic50小75倍的ic50，和比ebi-029的ic90小約350倍的ic90。在hek細(xì)胞中產(chǎn)生的ebi-030具有比ebi-029的ic50小50倍的ic50，和比ebi-029的ic90小約4000倍的ic90。實(shí)施例20：增加的效力對(duì)玻璃體il-6阻斷持續(xù)時(shí)間的的建模分析使用藥物動(dòng)力學(xué)模型模擬在玻璃體內(nèi)施用后增加的效力對(duì)il-6阻斷的程度和持續(xù)時(shí)間的的影響(圖9)。描述游離抗體(a)，游離il-6(il)和抗體/il-6復(fù)合物(ail)的變化的微分方程定義如下：d/dt(a)＝-a*kae–a*il*k1+ail*k2d/dt(il)＝kpi–il*kie–a*il*k1+ail*k2d/dt(ail)＝-ail*kaie+a*il*k1–ail*k2其中kae是游離抗體從玻璃體的清除速率，k1是抗體/il-6結(jié)合的締合速率，k2是抗體/il6復(fù)合物的解離速率，kpi是il-6產(chǎn)生的速率，kei是游離il-6從玻璃體的清除速率，并且kaie是抗體/il-6復(fù)合物從玻璃體的清除速率。啟始參數(shù)值和速率如表6所示限定。表6：起始參數(shù)值和速率基于50μl劑量的50mg/ml抗體至具有5ml玻璃體體積的人眼的假設(shè)計(jì)算a0。基于～200pg/ml的dme患者中的玻璃體內(nèi)il-6的臨床測(cè)量值估算il0。k1基于1e5m-1s-1的典型抗體締合速率估算，而改變k2以模擬范圍從100pm至1pm的效力值。kae源自～11天的在兔中測(cè)量的玻璃體清除半衰期，如先前對(duì)人pk測(cè)量的縮放1.8。以24小時(shí)的清除半衰期間估算kie，且kpi計(jì)算為il0*kie。使用berkeleymadonna軟件在300天的時(shí)間過(guò)程中進(jìn)行游離抗體和游離il-6的模擬(圖10)。選擇95％il-6阻斷的截?cái)鄟?lái)測(cè)量抑制的持續(xù)時(shí)間。該模型預(yù)測(cè)，增加的抗體效力顯著地延長(zhǎng)眼中il-6抑制的持續(xù)時(shí)間，從k2/k1＝100pm的130天延長(zhǎng)至k2/k1＝10pm的200天，至k2/k1＝1pm的225天。實(shí)施例21：il-6a的藥代動(dòng)力學(xué)在pharmoptima(portage，mi)的雄性新西蘭白兔中進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)(pk)實(shí)驗(yàn)。所有動(dòng)物是12-13個(gè)月齡，且體重為2.61-3.42公斤。比較以下蛋白質(zhì)：ebi-029-igg2(seqidno：11和seqidno：12)，ebi-029-igg2-h311a(seqidno：10和seqidno：12)，ebi-030(seqidno：41和seqidno：42)，ebi-030-igg2-h311a(seqidno：47和seqidno：42)，ebi-029fab(seqidno：24和seqidno：12)，(vegf抑制劑)和托珠單抗(tcz；抗il6r抗體)。所有蛋白質(zhì)在ph7.4的pbs中以13.8mg/ml配制。ebi-029-igg2，ebi-029-igg2-h311a，ebi-030，ebi-030-igg2-h311a，ebi-029fab和托珠單抗在兔中不結(jié)合其靶抗原，而確實(shí)結(jié)合兔vegf。對(duì)于玻璃體內(nèi)pk的研究，用50μl的檢品注射9只動(dòng)物的每只眼睛。在注射前，將鹽酸利多卡因(可注射2％)，0.5％丙美卡因(proparacaine)或0.5％丁卡因(tetracaine)施用于眼表面。通過(guò)眼睛的背斜象限插入bd300μl胰島素注射器(31g×5/16英寸針頭)以進(jìn)行中部玻璃體的注射。對(duì)于系統(tǒng)性pk的研究，3只動(dòng)物通過(guò)耳靜脈注射100μl檢品。在0.083、1、4、8、24、72、168、240和336小時(shí)從ivt和iv組的3只動(dòng)物收集連續(xù)血液樣品，并用檸檬酸-磷酸-葡萄糖溶液1:1稀釋并置于冰上。通過(guò)在4℃下以4000rpm離心冷凍血液樣品10分鐘收集血漿，并在-80℃下冷凍儲(chǔ)存。在給藥后0.25、24、168和336小時(shí)，從ivt組的所有動(dòng)物的兩只眼睛中收獲眼組織。動(dòng)物通過(guò)靜脈注射過(guò)量巴比妥鹽安樂(lè)死。為了收獲房水，在安樂(lè)死之后，立即將具有針頭的注射器插入角膜下方，并且緩慢抽出房水。將房水轉(zhuǎn)移到預(yù)先標(biāo)記的管中并置于干冰上或在-80℃冷凍。為了收獲玻璃體液，使用解剖刀將小切片引入到去核眼的鞏膜中，并通過(guò)注射器經(jīng)開(kāi)口取出玻璃體。通過(guò)注射器上的刻度測(cè)量樣品，將其轉(zhuǎn)移到預(yù)先標(biāo)記的管中，并置于干冰上或在-80℃下冷凍。為了收獲視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜，在被摘出眼睛的鞏膜中用解剖刀引入小切片，與角膜緣平行并在其尾部。將剪刀用于繼續(xù)在眼球周圍開(kāi)口，將其分成兩半。放置后眼球使內(nèi)部朝上。使用鰓刀，從眼球小心收集視網(wǎng)膜。一旦從眼球收集視網(wǎng)膜，以類似的方式從剩下的眼球收集脈絡(luò)膜。將兩種樣品分別轉(zhuǎn)移到預(yù)稱重和預(yù)先標(biāo)記的管中，稱重，并置于干冰上或在-80℃下冷凍。在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中將視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜組織稀釋10倍，勻漿，并儲(chǔ)存在-80℃。通過(guò)elisa評(píng)估每個(gè)組織中的蛋白質(zhì)濃度。對(duì)于ebi-029-igg2，ebi-029-igg2-h311a，ebi-030，ebi-030-igg2-h311a和ebi-029bab，用在pbs中的1μg/ml人il-6在室溫下包被costar半容量板1小時(shí)?？子煤?％bsa的pbs封閉，洗滌，然后與使用pbs+5％兔血漿+0.05％吐溫-20作為稀釋劑稀釋的每種樣品的系列稀釋物進(jìn)行溫育。每個(gè)平板上還包括使用純化蛋白質(zhì)獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品在室溫下孵育60分鐘，然后用300μl含有0.05％土溫-20的pbs洗滌三次。然后在每個(gè)孔中加入在pbs，1％bsa，0.05％土溫-20中以1:10,000稀釋的抗kappa-hrp(genwayinc.)并孵育30分鐘。孔如上清洗，然后加入3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)底物，并在spectramax讀板儀上在450和550nm測(cè)量信號(hào)。使用softmaxpro6軟件，基于標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。每個(gè)elisa在至少3個(gè)獨(dú)立平板上重復(fù)并報(bào)告平均半衰期。對(duì)于托珠單抗，除了使用抗托珠單抗fab(bioradhca252)作為捕獲試劑，并使用抗人igg-fc-hrp(sigmaa0170)作為檢測(cè)抗體之外，如上所述通過(guò)elisa測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。使用兩種不同的elisa測(cè)定來(lái)測(cè)量游離和總的對(duì)于游離的用重組vegf(r&d系統(tǒng))包被孔，并用抗人igg-fc-hrp(sigmaa0170)檢測(cè)結(jié)合的蛋白質(zhì)。對(duì)于測(cè)量總將抗人fc抗體(sigmai2136)用于捕獲，并將抗人igg-ch2-hrp(bioradmca647p)用于檢測(cè)。每種elisa在至少3個(gè)獨(dú)立平板上重復(fù)，并報(bào)告平均半衰期。結(jié)果概述在大多數(shù)動(dòng)物中，在240和336小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)觀察到針對(duì)注射的蛋白質(zhì)的穩(wěn)健的抗體形成。因?yàn)檫@種抗體形成可以影響蛋白質(zhì)清除或干擾elisa，所以將數(shù)據(jù)分析限制到直到168小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)并包括168小時(shí)。對(duì)于玻璃體內(nèi)的pk，與(t1/2＝6.3天)，托珠單抗(t1/2＝4.8天)或ebi-029fab片段(t1/2＝3.9天)相比，所有ebi-029和ebi-030igg2蛋白的清除顯著更慢(eb/029，ebi-029-h311a，ebi-030，和ebi-030-h311a分別為t1/2＝9.3,9.0,15.7,和9.8天)(圖11，表7)。在視網(wǎng)膜，脈絡(luò)膜和房水中觀察到相似的趨勢(shì)，其中與和托珠單抗相比，ebi-030和ebi-030-h311a以更高的水平積累(參見(jiàn)圖12和圖13)。在ivt施用后，所有蛋白質(zhì)可在血漿中檢測(cè)到，其中ebi-029，ebi-030和托珠單抗以比或ebi-030-h311a顯著更高的水平積累(參見(jiàn)圖14)。類似地，在iv施用后，和ebi-030-h311a從血漿中更快地清除，其中由于fcrn結(jié)合減少，ebi-030-h311a半衰期約為野生型igg2的一半(表7)。表7：藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果實(shí)施例22：ebi-031在高濃度下的溶解度使用amiconultra-15自旋濃縮器將純化的ebi-031在pbs中從3mg/ml濃縮至142mg/ml。通過(guò)在與wyattminidawntreos光散射儀和wyattoptilabrex折射率儀組合的tosohg3000swxl7.8x30sec柱上運(yùn)行，來(lái)評(píng)估濃縮前和濃縮后的濃度。注射20μg蛋白質(zhì)，并以1ml/min的流速在pbs中運(yùn)行。在預(yù)期的～150kda的分子量下的峰的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大約等于兩個(gè)濃度(3mg/ml為90.9％，142mg/ml制劑為91.3％)，表明濃縮期間蛋白質(zhì)聚集沒(méi)有顯著增加。這些結(jié)果證明ebi-031可以濃縮至高達(dá)142mg/ml，同時(shí)幾乎沒(méi)有可測(cè)量的聚集(<10％聚集)。實(shí)施例23：ebi-031阻斷順式和反式il6信號(hào)使用hek-bluetmil6報(bào)告細(xì)胞系(invivogen)以比較ebi-031和托珠單抗用于阻斷順式和反式il6信號(hào)傳遞的效力。對(duì)于順式信號(hào)傳遞，在96孔板中將游離il-6(終濃度＝20pm)與一系列濃度的ebi-031或托珠單抗混合，并在室溫下孵育30分鐘。胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)期的hek-bluetmil6細(xì)胞，并重懸于測(cè)定培養(yǎng)基(dmem，4.5g/l葡萄糖，10％熱滅活fbs，2mml-谷氨酰胺，pen-step)中，并將50,000個(gè)細(xì)胞加入每個(gè)孔中，最終體積為200μl。將平板在37℃/5％co2下孵育20小時(shí)。然后將來(lái)自每孔的50μl上清液與150μlquanti-bluetm試劑(invivogen)混合，并在37℃下溫育40分鐘，然后在spectramaxm5讀板儀上測(cè)量650nm處的吸光度。減去來(lái)自沒(méi)有il-6的孔的背景信號(hào)，并且然后除以用il-6而沒(méi)有用抑制劑處理的細(xì)胞以得到信號(hào)傳遞分?jǐn)?shù)值。相比于托珠單抗(ic50＝12.9nm)，ebi-031(ic50＝14.2pm)以>900倍更大的效力阻斷游離il-6(圖16a)。為了測(cè)量反式信號(hào)傳遞阻斷，除了使用最終濃度為200pm的超il-6代替游離il-6之外，如上所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。超il-6是il-6和可溶性il-6受體之間的基因融合物(fischer等人，naturebiotechnology15：142-145(1997)。ebi-031有效阻斷了超il-6(ic50＝32pm)，而托珠單抗不能顯著地抑制至1μm濃度的信號(hào)傳遞(圖16b)。這些結(jié)果顯示ebi-031在位點(diǎn)ii或接觸gp130的位點(diǎn)以pm親和力結(jié)合人il-6位點(diǎn)，并在細(xì)胞測(cè)定中以比托珠單抗>900倍更多的效力阻斷il-6和il-6/sil-6rα復(fù)合物的信號(hào)傳遞。實(shí)施例24：玻璃體內(nèi)ebi-031抑制il-6信號(hào)傳遞的計(jì)算模擬如實(shí)施例20所述進(jìn)行計(jì)算模擬，以預(yù)測(cè)在人中的玻璃體內(nèi)施用ebi-031應(yīng)當(dāng)抑制95％il-6信號(hào)傳遞的時(shí)間長(zhǎng)度。k2設(shè)定為0.12d-1，使得在效力測(cè)定中測(cè)得的k2/k1＝14pm?；谠谕米又袦y(cè)量的玻璃體內(nèi)清除半衰期對(duì)于人縮放1.8，將t1/2清除設(shè)定為18天。所有其他參數(shù)在表6中描述。該模型預(yù)測(cè)ebi-031應(yīng)該在玻璃體內(nèi)施用后持續(xù)～150天阻斷95％的il-6信號(hào)傳遞(圖17)。這些建模結(jié)果表明，ebi-031可以在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)(例如高達(dá)約6個(gè)月)基本上阻斷眼睛中的il-6信號(hào)傳遞。實(shí)施例25：ebi-031亞型的表征ebi-031是igg2抗體。如前所述，igg2抗體存在三種不同的結(jié)構(gòu)亞型，igg2-a，igg2-b和igg2-a/b亞型(圖18)。在該實(shí)施例中，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以鑒定ebi-031樣品中的結(jié)構(gòu)亞型。rp-hplc分析將反相高效液相層析(rp-hplc)用于分辨ebi-031的各種結(jié)構(gòu)亞型。優(yōu)化以前已經(jīng)使用的用于分辨igg2二硫化物介導(dǎo)的結(jié)構(gòu)亞型的增強(qiáng)的分析型rp-hplc方法(參見(jiàn)dillon等人，journalofchromatographya，2006,1120：112-120)用于分辨ebi-031。將包含約30μg的ebi-031樣品加載到zorbax300sb-c8柱(150mm×2.1mm,5.0μm,)上。柱溫度設(shè)定在75℃。流動(dòng)相a為含有0.1％tfa的水，并且流動(dòng)相b為55％ipa，40％acn，4.9％水和0.1％tfa。流速為0.5ml/min。該柱首先用90％流動(dòng)相a和10％流動(dòng)相b平衡2分鐘，隨后是10至25％b的2分鐘不連續(xù)梯度。用超過(guò)21分鐘的25-32％b的線性梯度實(shí)現(xiàn)洗脫。在214nm和/或280nm處監(jiān)測(cè)uv吸光度。為了確定分辨率是否與二硫化物有關(guān)，在室溫下用5mmdtt和10mm半胱氨酸處理樣品2分鐘，并且然后用rp-hplc方法分析(圖19)。用有效的還原劑，dtt處理導(dǎo)致igg2抗體的減少，導(dǎo)致洗脫成早期峰(峰0和峰1)(圖19中間圖)。使用與dtt相比較溫和的還原劑，半胱氨酸處理也將亞型分布轉(zhuǎn)移到早期峰(峰0和峰1)，盡管沒(méi)有達(dá)到用dtt處理的樣品所見(jiàn)的程度(圖19，底圖)。數(shù)據(jù)證明，rp-hplc方法可以分辨具有不同二硫鍵連接性的結(jié)構(gòu)亞型。通過(guò)非還原肽定位和質(zhì)譜分析證實(shí)了不同的二硫鍵結(jié)構(gòu)：早期洗脫峰(峰1)含有igg2-a/b亞型，并且晚期洗脫峰(峰2)含有igg2-a亞型。重要的是，在ebi-031樣品中沒(méi)有檢測(cè)到igg2-b亞型b(峰0)(圖19，上圖)。不同ebi-031樣品的比較使用上述rp-hplc分析，分析從不同ebi-031表達(dá)細(xì)胞系收集的ebi-031樣品，以比較產(chǎn)生的抗體的亞型分布。從克隆細(xì)胞系的200l規(guī)模培養(yǎng)物，來(lái)自親本細(xì)胞系的10l規(guī)模培養(yǎng)物和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞池中收集ebi-031樣品。使用三步層析法從克隆和親本ebi-031表達(dá)細(xì)胞系純化ebi-031。使用蛋白a純化從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞池純化ebi-031。通過(guò)上述方法分析樣品。圖20中所示的結(jié)果顯示，所有三種ebi-031樣品都含有亞型igg2-a和igg2-a/b，但沒(méi)有顯著量的igg2-b。該數(shù)據(jù)證明，無(wú)論是從克隆的ebi-031表達(dá)細(xì)胞系，親本ebi-031表達(dá)細(xì)胞系，或是從穩(wěn)定表達(dá)ebi-031的異質(zhì)細(xì)胞群體產(chǎn)生，ebi-031igg2抗體以比其他igg2抗體更少的異質(zhì)混合物產(chǎn)生。圖21顯示來(lái)自克隆ebi-031表達(dá)細(xì)胞系的200l規(guī)模培養(yǎng)物的ebi-031樣品的亞型分布，例如圖20的上圖。還測(cè)量了曲線下面積的區(qū)域，并且亞型之間的分布如圖下的表所示。實(shí)施例26：靈長(zhǎng)類動(dòng)物研究中的藥代動(dòng)力學(xué)在靈長(zhǎng)類動(dòng)物研究中研究了ebi-031的藥代動(dòng)力學(xué)。測(cè)試了兩只雄性非洲綠猴。將50μl50mg/ml的ebi-031經(jīng)玻璃體內(nèi)注射到眼中。madonna軟件用于曲線擬合。使用曲線擬合對(duì)來(lái)自靈長(zhǎng)類動(dòng)物研究的數(shù)據(jù)建模。描述玻璃體中的抗體(a)和玻璃體外的抗體(例如系統(tǒng)性(ap))變化的微分方程定義如下：d/dt(a)＝-a*kaed/dt(ap)＝a*kae(dil)–ap*kape起始參數(shù)值和速率如下表所示定義：表8：起始參數(shù)值和速率參數(shù)值dil-稀釋100kae-玻璃體消除速率0.2kape-系統(tǒng)消除速率1.4初始a-玻璃體中的初始抗體1000000初始ap-玻璃體外的初始抗體0包括的用于擬合的其他考慮因素包括：浮動(dòng)稀釋度和兩種速率常數(shù)以用于擬合。將初始a保持恒定(在5ml眼中為2x50ml的50mg/ml)。如圖22a，22b和23中所示的建模結(jié)果顯示玻璃體消除率常數(shù)對(duì)于兩只猴子分別產(chǎn)生4.6和5.7天得半衰期。平均玻璃體消除速率常數(shù)計(jì)算為5.2天。系統(tǒng)消除建模為1.1天，和0.63天(平均0.85天)。這些結(jié)果證明在靈長(zhǎng)類動(dòng)物中，ebi-031在玻璃體中的半衰期明顯長(zhǎng)于系統(tǒng)半衰期。實(shí)施例27：ebi-031的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行另一項(xiàng)藥代動(dòng)力學(xué)(pk)實(shí)驗(yàn)，其中將50μl的20mg/mlebi-031溶液經(jīng)玻璃體內(nèi)注射到兔子眼中。檢查的時(shí)間點(diǎn)為1,3,7和14天(例如，24,72,168和336小時(shí))。對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分析兩只動(dòng)物(四只眼睛)。如實(shí)施例21所述進(jìn)行施用ebi-031制劑，收獲眼組織和測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的方法。結(jié)果顯示于圖24a-24i中。當(dāng)分析第1-14天玻璃體液中的蛋白質(zhì)濃度時(shí)，ebi-031的半衰期測(cè)定為8.95天(圖24a)。然而，在第14天檢測(cè)到強(qiáng)的抗體應(yīng)答，其可以影響這些結(jié)果。當(dāng)分析第1-7天玻璃體液中的蛋白質(zhì)濃度時(shí)，ebi-031的半衰期測(cè)定為18.88天。玻璃體內(nèi)注射后在眼睛其他部位也檢測(cè)到ebi-031。ebi-031還滲透到房水(圖24b)，脈絡(luò)膜(圖24c)，結(jié)膜(圖24d)，角膜(圖24e)，睫狀體(圖24f)，晶狀體(圖24g)，視網(wǎng)膜(圖24h)和鞏膜(圖24i)中。這些組織中的藥物濃度比玻璃體中檢測(cè)到的濃度低一到兩個(gè)數(shù)量級(jí)。其他實(shí)施方案在以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)12