發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種包含纖溶酶原的藥物組合物和其治療用途。

發(fā)明背景

纖溶酶原為如圖1a中所示的纖溶酶的酶原。圖1b中展示了人類纖溶酶原前體的氨基酸序列。人類纖溶酶原含有791個(gè)氨基酸(前體＝810個(gè)氨基酸)，并且分子量為約90kda并且pi為約7.0，不過差異糖基化和/或n端活化肽的移除可產(chǎn)生6.2至8.0的pi范圍。具有24個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵、5個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)域(kringledomain)(結(jié)合于纖維蛋白和α2-抗纖溶酶抑制劑時(shí)所涉及)、絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域(p)以及活化肽(ap)的單鏈蛋白質(zhì)組成頭77個(gè)氨基酸。存在一個(gè)n-鍵聯(lián)糖基化位點(diǎn)和一個(gè)o-鍵聯(lián)位點(diǎn)，不過已識(shí)別出第二o-鍵聯(lián)位點(diǎn)(goldberg,2006)。循環(huán)中的纖溶酶原約70％僅含有o-鍵聯(lián)糖基化，而其余部分含有n-鍵聯(lián)糖與o-鍵聯(lián)糖兩者。

天然纖溶酶原以兩種主要形式產(chǎn)生，即glu-纖溶酶原(glu-pg)和lys-纖溶酶原(lys-pg)，它們是針對(duì)谷氨酸或賴氨酸的n端氨基酸加以命名。glu-pg由通過基因序列命名的整個(gè)氨基酸序列(排除活化肽)組成，而lys-pg為glu-pg在lys-77與lys-78(在圖1b中加下劃線)之間裂解的結(jié)果。lys-pg的循環(huán)半衰期明顯比glu-pg短(glu-pg為2-2.5天，lys-pg為0.8天)。glu-pg為存在于血漿中的pg的主導(dǎo)形式，并且在循環(huán)中檢測(cè)到極少的lys-pg(violand,b.n.,byrne,r.,castellinof.j.(1978)theeffectofα-,ω-aminoacidsonhumanplasminogenstructureandactivation.jbiolchem.253(15):5395-5401；collend,ongeb,johnsonaj.(1975)humanplasminogen:invitroandinvivoevidenceforthebiologicalintegrityofnh2-terminalglutamicacidplasminogen.thrombosisresearch.7(4):515-529)。

纖溶酶原是在肝臟中合成并且分泌至血漿中。纖溶酶原分布于整個(gè)身體中并且當(dāng)存在活化的條件時(shí)，纖溶酶原(plasminogenpro-enzyme)由纖溶酶原活化劑(t-pa)或由尿激酶纖溶酶原活化劑(u-pa)轉(zhuǎn)化為活性酶纖溶酶。然后，纖溶酶降解纖維蛋白并且將潛伏性基質(zhì)金屬蛋白酶(pro-mmp)轉(zhuǎn)化成活性mmp，活性mmp又進(jìn)一步降解細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)作為組織愈合/重建過程的一部分。纖維蛋白穩(wěn)態(tài)中主要涉及由t-pa介導(dǎo)的纖溶酶原激活，而經(jīng)由u-pa產(chǎn)生纖溶酶，從而與其受體u-par形成復(fù)合物在組織重建中起作用。

現(xiàn)在或曾經(jīng)研究了纖溶酶用于清除人造裝置和血液透析移植物中的血栓性阻塞以及用于治療玻璃體后脫離(pvd)的潛在用途(us6,969,515；us2010/0104551)。

研究了纖溶酶原在治療適應(yīng)癥，諸如傷口愈合、鼓膜穿孔愈合、牙周傷口愈合、傳染性疾病、口腔健康、糖尿病性潰瘍、溶栓適應(yīng)癥(諸如冠狀動(dòng)脈血栓形成)、組織的再灌注損傷、缺血、梗塞、腦水腫；改善微循環(huán)以及調(diào)節(jié)補(bǔ)體途徑中的用途(us8,637,010；us8,679,482；us8,318,661；wo95/12407；ep0,631,786)。迄今為止，當(dāng)前藥物市場(chǎng)上仍沒有作為藥物的纖溶酶原。

歷史上，lys-pg因血液學(xué)目的而在藥學(xué)上商業(yè)化了一段時(shí)間，而自從2000年以來在科學(xué)上或醫(yī)學(xué)上一直未被使用。schott等人,1998,thenewenglandjournalofmedicine,第339卷,第23期,第1679-1686頁)中描述了lys-pg的制劑。同時(shí)，臨床上使用了可獲得的lys-pg并且針對(duì)木樣結(jié)膜炎(基礎(chǔ)病狀低纖溶酶原血癥(纖溶酶原缺乏i型)的臨床表現(xiàn))的治療進(jìn)行了研究。因此，已測(cè)試lys-pg濃縮物的全身性施用。kraft等人(kraftj,liebw,zeitlerp,schusterv.(2000)ligneousconjunctivitisinagirlwithseveretypeiplasminogendeficiency.graefesarchclinexpophthalmol.238(9):797-800)報(bào)導(dǎo)，在具有嚴(yán)重低纖溶酶原血癥的兒童中每天輸注lys-pg使得結(jié)膜假膜部分溶解。schott等人(1998)報(bào)導(dǎo)，在6月齡兒童中，以連續(xù)輸注形式并且隨后以每天快速注射形式用lys-pg制劑治療在4周內(nèi)使得木樣結(jié)膜炎完全消退并且使呼吸道中的高粘分泌正常化并且使皮膚傷口愈合。schuster等人(schusterv,hugleb,tefsk(2007)plasminogendeficiency.jthrombhaemost5(12):2315-2322)報(bào)導(dǎo)，純合或復(fù)合性雜合(在特定基因座存在兩種不同突變等位基因，各自位于一對(duì)染色體的各染色體上)低纖溶酶原血癥患者中的纖溶酶原水平為纖溶酶原抗原血漿水平在<1至9mg/dl范圍內(nèi)并且功能性纖溶酶原活性在<1％至51％范圍內(nèi)。重要的是，注意到這些患者中大部分具有一定的殘余纖溶酶原活性水平。因此，纖溶酶原置換預(yù)期為有效的，因?yàn)樗莾?nèi)源性蛋白質(zhì)并且預(yù)期不具有免疫原性或纖維蛋白溶解活性問題。雖然文獻(xiàn)已明確記錄全身性或局部纖溶酶原濃縮物為有效治療，引起病變的消退并且使其再形成停止(wattsp,sureshp,mezere,ellsa,albisettim,bajzarl,marzinottov,andrewm,massicotlep,rootmand(2002)effectivetreatmentofligneousconjunctivitiswithtopicalplasminogen.amjophthalmol133(4):451-455；heidemanndg,williamsga,hartzerm,ohaniana,citronme(2003)treatmentofligneousconjunctivitiswithtopicalplasminandtopicalplasminogen.cornea22(8):760-762；以及schott,1998)，但不可商購(gòu)獲得用于局部或用于全身性治療的純化的纖溶酶原產(chǎn)品。

僅在最近，才進(jìn)行了利用glu-pg來治療i型纖溶酶原缺乏(clinicaltrials.govidentifier:nct02312180)以及使用glu-pg局部滴眼液治療其臨床表現(xiàn)之一(木樣結(jié)膜炎)(clinicaltrials.govidentifier:nct01554956)的臨床試驗(yàn)。

可通過改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征(內(nèi)部)和/或通過控制與其接觸的組分(外部)來穩(wěn)定蛋白質(zhì)。一些蛋白質(zhì)歸因于其物理化學(xué)特性往往不幸地引起結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定而在處理和藥物制劑的性能方面提出特定挑戰(zhàn)。它們可實(shí)際上經(jīng)歷如下所例示的各種類型的降解：1)導(dǎo)致形成相關(guān)雜質(zhì)的化學(xué)過程，所述化學(xué)過程可涉及水解、氧化反應(yīng)、脫酰胺基作用或結(jié)構(gòu)重排，諸如異asp或分子內(nèi)截短；或2)引起聚集/聚合的物理過程，由此產(chǎn)生結(jié)構(gòu)變化，這可能會(huì)影響生物活性并且潛在地增強(qiáng)免疫原性。

制劑研制泛指在足夠的程度上表征活性藥物成分(api)，使其可轉(zhuǎn)化為藥學(xué)上可接受的原料藥的過程。必須進(jìn)行原料藥的生物物理學(xué)表征以證實(shí)存在恰當(dāng)折疊并且具生物活性的結(jié)構(gòu)?？墒褂萌舾晒庾V技術(shù)(熒光、cd、dsc、dls等)來檢驗(yàn)溶液中的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)并且評(píng)估不同制劑的穩(wěn)定性以及不同配制條件對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的的影響。(volkin,d.b.等人“preformulationstudiesasanessentialguidetoformulationdevelopmentandmanufactureofproteinpharmaceutical.”developmentandmanufactureofproteinpharmaceuticals.stevel.nail和michaelj.akers編,kluweracademic2002第1章,第1-39頁；cheng,w.等人“comparisonofhigh-throughputbiophysicalmethodstoidentifystabilizingexcipientsforamodeligg2monoclonalantibody:conformationalstabilityandkineticaggregationmeasurements”journalofpharmaceuticalsciences,第101卷,第5期,第1701-1720頁,2012)。此外，藥物行業(yè)往往通過針對(duì)原料藥的釋放進(jìn)行生物分析來證實(shí)api的結(jié)構(gòu)完整性?？偟膩碚f，他們確認(rèn)尚未因配制而無意中改變優(yōu)選制劑。纖溶酶原為一種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)主要用于制備纖溶酶，從而用于溶栓適應(yīng)癥(諸如冠狀動(dòng)脈血栓形成)、清除人造裝置和血液透析移植物中的血栓性阻塞并且用于組織的再灌注損傷、治療缺血、梗塞、腦水腫，或用于改善微循環(huán)(wo95/12407；us6,969,515；ep0,631,786)。

還已發(fā)現(xiàn)施用纖溶酶原適合用于許多治療適應(yīng)癥(諸如溶栓適應(yīng)癥，諸如冠狀動(dòng)脈血栓形成)、治療組織的再灌注損傷、治療缺血、梗塞、腦水腫或用于改善微循環(huán)、傷口愈合、鼓膜穿孔愈合、牙周傷口愈合、傳染性疾病、口腔健康、糖尿病性潰瘍、纖溶酶原缺陷型受試者以及調(diào)節(jié)補(bǔ)體途徑(wo95/12407；ep0,631,786；us8,637,010；us8,679,482；us8,318,661)。

在配制纖溶酶原時(shí)遇到若干挑戰(zhàn)。一些問題起因于纖溶酶原制劑的纖溶酶污染，其降解纖溶酶原。已使用多種方法來避免纖溶酶原的降解，包括添加抑肽酶、賴氨酸、苯基甲磺酰氟、大豆胰蛋白酶抑制劑或絲氨酸蛋白酶抑制劑(us4,177,262；us4,361,653；us5,304,383)。

其他困難由當(dāng)纖溶酶原溶解于水性溶劑中時(shí)的濁度或存在絲狀物質(zhì)代表。為克服此缺點(diǎn)，已提出將纖溶酶原與例如非離子表面活性劑或與蔗糖、氨基酸以及白蛋白的混合物組合(wo94/15631)。

不存在已知用于人類治療用途的glu-pg商業(yè)制劑。僅有的已知glu-pg制劑僅用于研究。

對(duì)研制纖溶酶原的藥物組合物存在需要。

本說明書提到許多文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)的內(nèi)容以全文引用的方式并入本文中。

發(fā)明概要

本發(fā)明涉及一種包含纖溶酶原的藥物組合物和其用途。

本發(fā)明涉及以下第1項(xiàng)至第61項(xiàng)：

1.一種藥物組合物，其包含：

-纖溶酶原，或其生物活性變體；

-張力調(diào)節(jié)劑；以及

-穩(wěn)定劑；

其中所述組合物具有約3.0至約10.0的ph值。

2.如第1項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述ph值為5.0至8.0；或6.0至8.0；或6.5至7.5。

3.如第1項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述纖溶酶原或其生物活性變體的濃度為約0.01mg/ml至約80mg/ml，或約5mg/ml至約60mg/ml。

4.如第3項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述纖溶酶原或其生物活性變體的濃度為約40、30、20、10或5mg/ml。

5.如第1項(xiàng)至第4項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述纖溶酶原或其生物活性變體占所述組合物的總蛋白含量的至少80％或所述組合物的總蛋白含量的90％以上。

6.如第5項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述纖溶酶原或其生物活性變體占所述組合物的總蛋白含量的95或98％以上。

7.如第1項(xiàng)至第6項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述穩(wěn)定劑包含(i)氨基酸，(ii)氨基酸鹽，(ii)氨基酸類似物，或(iv)(i)、(ii)和/或(iii)的任何混合物。

8.如第7項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述氨基酸、氨基酸鹽或氨基酸類似物為精氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、賴氨酸類似物或ε-氨基己酸。

9.如第8項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述穩(wěn)定劑為精氨酸。

10.如第1項(xiàng)至第9項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述穩(wěn)定劑的濃度為約20mm至約200mm。

11.如第10項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述穩(wěn)定劑的濃度為約25mm至約75mm。

12.如第1項(xiàng)至第11項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述張力調(diào)節(jié)劑為氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇、甘露糖醇、甘油、乳糖、山梨糖醇、右旋糖、環(huán)糊精、棉子糖、聚乙二醇、羥乙基淀粉、甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、右旋糖酐、pvp(聚乙烯吡咯烷酮)或其任何組合。

13.如第12項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述張力調(diào)節(jié)劑為氯化鈉。

14.如第1項(xiàng)至第13項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述張力調(diào)節(jié)劑以約30mm至約250mm的濃度存在。

15.如第14項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述張力調(diào)節(jié)劑以約25mm至約50mm或約35mm的濃度存在。

16.如第1項(xiàng)至第15項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其進(jìn)一步包含填充劑。

17.如第16項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述填充劑為甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘露糖醇、山梨糖醇、羥乙基淀粉、右旋糖酐、pvp(聚乙烯吡咯烷酮)、甘露糖醇、聚乙二醇、山梨糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、麥芽三糖醇、木糖醇或其任何組合。

18.如第17項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述填充劑為甘露糖醇或山梨糖醇。

19.如第16項(xiàng)至第18項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述填充劑的濃度為約50mm至約300mm。

20.如第19項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述填充劑的濃度為約50至約125mm。

21.如第1項(xiàng)至第20項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其進(jìn)一步包含還原糖。

22.如第21項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述還原糖為果糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖或其任何組合。

23.如第1項(xiàng)至第22項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其進(jìn)一步包含非還原糖。

24.如第23項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述非還原糖為蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖、棉子糖或其任何組合。

25.如第1項(xiàng)至第24項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物具有約180mosm與約350mosm之間的滲透壓。

26.如第1項(xiàng)至第25項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其進(jìn)一步包含防腐劑。

27.如第26項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述防腐劑為間甲酚、苯甲醇、甲醇、乙醇、異丙醇、對(duì)羥基苯甲酸丁酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、苯酚、甘油、木糖醇、間苯二酚、兒茶酚、2,6-二甲基環(huán)己醇、2-甲基-2,4-戊二醇、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、2-氯酚、芐索氯銨、硫柳汞(硫汞撒)、苯甲酸(對(duì)羥苯甲酸丙酯)mw180.2、苯甲酸mw122.12、苯扎氯銨、氯丁醇、苯甲酸鈉、丙酸鈉、氯化十六烷基吡啶或其任何組合。

28.如第26項(xiàng)或第27項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述防腐劑的濃度為約0.005至約10％(w/v)。

29.如第1項(xiàng)至第28項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述纖溶酶原或其生物活性變體為人類纖溶酶原。

30.如第1項(xiàng)至第29項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述纖溶酶原或其生物活性變體由80％以上的glu-纖溶酶原構(gòu)成。

31.如第1項(xiàng)至第29項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述纖溶酶原或其生物活性變體為glu-纖溶酶原。

32.如第1項(xiàng)至第31項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述組合物含有低于每100ml6000個(gè)粒子的量的等于或大于10μm的粒子。

33.如第32項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述粒子量低于每100ml2000或1000個(gè)粒子。

34.如第1項(xiàng)至第33項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其適合用于經(jīng)靜脈內(nèi)、皮下、局部、真皮內(nèi)、眼部和/或肌肉內(nèi)施用。

35.如第1項(xiàng)至第34項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其為液體組合物、適合于凍干的液體組合物、適合于冷凍的液體組合物、凍干組合物、冷凍組合物或復(fù)原組合物。

36.如第1項(xiàng)至第34項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其為液體、凝膠、乳膏或軟膏。

37.如第1項(xiàng)至第36項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其用作藥劑。

38.一種包含纖溶酶原或其生物活性變體的藥物組合物，其含有低于每100ml6000個(gè)粒子的量的等于或大于10μm的粒子。

39.如第38項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述粒子量低于每100ml2000或1000個(gè)粒子。

40.如第38項(xiàng)或第39項(xiàng)所述的藥物組合物，其進(jìn)一步包含穩(wěn)定劑。

41.如第40項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述穩(wěn)定劑包含(i)氨基酸，(ii)氨基酸鹽，(ii)氨基酸類似物，或(iv)(i)、(ii)和/或(iii)的任何混合物。

42.如第41項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述氨基酸、氨基酸鹽或氨基酸類似物為精氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、賴氨酸類似物或ε-氨基己酸。

43.如第42項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述穩(wěn)定劑為精氨酸。

44.如第40項(xiàng)至第43項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述穩(wěn)定劑的濃度為約25mm至約75mm。

45.如第38項(xiàng)至第44項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述纖溶酶原或其生物活性變體的濃度為約0.01mg/ml至約80mg/ml。

46.如第45項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述纖溶酶原或其生物活性變體的濃度為約5mg/ml至約60mg/ml。

47.如第38項(xiàng)至第46項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述纖溶酶原或其生物活性變體占所述組合物的總蛋白含量的約95％以上或所述組合物的總蛋白含量的約98％以上。

48.如第38項(xiàng)至第47項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其進(jìn)一步包含張力調(diào)節(jié)劑。

49.如第48項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述張力調(diào)節(jié)劑為氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇、甘露糖醇、甘油、乳糖、山梨糖醇、右旋糖、棉子糖、聚乙二醇、羥乙基淀粉、甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、右旋糖酐、pvp(聚乙烯吡咯烷酮)或其任何組合。

50.如第49項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述張力調(diào)節(jié)劑為氯化鈉。

51.如第48項(xiàng)、第49項(xiàng)或第50項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述張力調(diào)節(jié)劑以約30mm至約250mm的濃度存在。

52.如第38項(xiàng)至第51項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其進(jìn)一步包含填充劑。

53.如第52項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述填充劑為甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘露糖醇、山梨糖醇、羥乙基淀粉、右旋糖酐、pvp(聚乙烯吡咯烷酮)、甘露糖醇、聚乙二醇、山梨糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、麥芽三糖醇、木糖醇或其任何組合。

54.如第53項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述填充劑為甘露糖醇或山梨糖醇。

55.如第52項(xiàng)、第53項(xiàng)或第54項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述填充劑的濃度為約50mm至約300mm。

56.如第38項(xiàng)至第55項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物具有約180mosm與約350mosm之間的滲透壓。

57.如第38項(xiàng)至第61項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物具有約6.5至約8.0的ph值。

58.如第38項(xiàng)至第57項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中纖溶酶原或其生物活性變體為人類纖溶酶原。

59.如第38項(xiàng)至第58項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述纖溶酶原或其生物活性變體由80％以上的glu-纖溶酶原構(gòu)成。

60.如第38項(xiàng)至第58項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述纖溶酶原或其生物活性變體為glu-纖溶酶原。

61.如第38項(xiàng)至第60項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其用作藥劑。

由以下描述、權(quán)利要求以及本文的概述本發(fā)明的其他方面對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將顯而易見。

附圖簡(jiǎn)單說明

圖1a為纖溶酶原的一級(jí)結(jié)構(gòu)的示意圖，示出其環(huán)狀結(jié)構(gòu)域、纖溶酶裂解位點(diǎn)和鏈激酶結(jié)合位點(diǎn)。

圖1b示出了人類纖溶酶原前體的氨基酸序列。以粗體示出成熟形式的序列，并且將存在裂解以產(chǎn)生lys-pg的兩個(gè)賴氨酸殘基加下劃線。

圖2為含有凍干之后的制劑1的安慰劑(不含pg)的小瓶的圖片。

圖3為含有凍干之后的制劑1(表1a中所描述)的小瓶的圖片。

圖4為含有凍干之后的制劑2的安慰劑(不含pg)的小瓶的圖片。

圖5為含有凍干之后的制劑2(表1a中所描述)的小瓶的圖片。

圖6為含有凍干之后的制劑3的安慰劑(不含pg)的小瓶的圖片。

圖7為含有凍干之后的制劑3(表1a中所描述)的小瓶的圖片。

圖8為含有凍干之后的制劑4的安慰劑(不含pg)的小瓶的圖片。

圖9為含有凍干之后的制劑4(表1a中所描述)的小瓶的圖片。

圖10為含有凍干之后的制劑5的安慰劑(不含pg)的小瓶的圖片。

圖11為含有凍干之后的制劑5(表1a中所描述)的小瓶的圖片。

圖12第f0498號(hào)凍干組合物的小瓶的圖片，所述凍干組合物含有于10mmtris-hcl、35mmnacl(ph8.0)以及28.5mm(0.5％)精氨酸中的20mg/ml纖溶酶原。

圖13第f0449號(hào)凍干組合物的小瓶的圖片，所述凍干組合物含有于10mm磷酸鈉、35mmnacl(ph7.2)、28.5mm(0.5％)精氨酸以及54mm(1％)甘露糖醇中的10mg/ml纖溶酶原。

圖14第f0459號(hào)凍干組合物的小瓶的圖片，所述凍干組合物含有于10mm磷酸鈉、35mmnacl(ph7.2)、28.5mm(0.5％)精氨酸以及54mm(1％)甘露糖醇中的20mg/ml纖溶酶原。

圖15為在0.02、20、100、800ntu的濁度標(biāo)準(zhǔn)液旁邊的分別含有于水(樣品0)、10mm檸檬酸鈉緩沖液(ph6.5)(樣品1)、10mm磷酸鈉緩沖液(ph7.2)(樣品2)以及10mmtris-hcl緩沖液(ph8.0)(樣品3)中的5mg/ml纖溶酶原的小瓶的圖片。

圖16為與圖12中所示相同的小瓶的圖片，除了已向樣品1、2以及3中添加35mmnacl和28.5mm(0.5％)arg。

圖17、18以及19為示出了含有10mg纖溶酶原、35mmnacl加上0.5％甘氨酸、精氨酸、丙氨酸而不含氨基酸的組合物在ph6.5下在檸檬酸鈉緩沖液中(圖17)、在ph7.2下在磷酸鈉緩沖液中(圖18)以及在ph8.0下在tris緩沖液中(圖19)歷經(jīng)4小時(shí)的時(shí)間的濁度的圖。

圖20、21以及22為示出了含有10mg纖溶酶原、35mmnacl、0.5％甘露糖醇加上0.5％甘氨酸、精氨酸、丙氨酸而不含氨基酸的組合物在ph6.5下在檸檬酸鈉緩沖液中(圖20)、在ph7.2下在磷酸鈉緩沖液中(圖21)以及在ph8.0下在tris緩沖液中(圖22)歷經(jīng)4小時(shí)的時(shí)間的濁度的圖。

發(fā)明詳述

本文公開一種包含纖溶酶原或其生物活性變體的藥物組合物。

本文還公開一種包含以下組分的藥物組合物：

-纖溶酶原，或其生物活性變體；

-張力調(diào)節(jié)劑；以及

-穩(wěn)定劑；

組合物具有約3.0至約10.0；優(yōu)選約5.0至約8.0；更優(yōu)選約6.0至約8.0；且進(jìn)一步優(yōu)選約6.5至約7.5的ph值。

本發(fā)明涉及一種具有增加的穩(wěn)健性的包含纖溶酶原或其生物活性變體的藥物組合物。本發(fā)明涉及一種包含纖溶酶原或其生物活性變體的藥物組合物，所述藥物組合物具有計(jì)數(shù)低于每100ml組合物6000個(gè)粒子或低于每100ml組合物5000個(gè)粒子或低于每100ml組合物4000個(gè)粒子或低于每100ml組合物3000個(gè)粒子或低于每100ml組合物2000個(gè)粒子或低于每100ml組合物1000個(gè)粒子的10μm或更大的粒子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在凍干和復(fù)原之后粒子的計(jì)數(shù)仍較低。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，相同組合物的重復(fù)制備未提供粒子計(jì)數(shù)改變。

如本文所用的術(shù)語“纖溶酶原”是指來自任何動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物，例如人類)的任何形式的天然纖溶酶原多肽(例如glu-纖溶酶原或lys-纖溶酶原)。纖溶酶原為由組織型纖溶酶原活化劑(t-pa)或由尿激酶纖溶酶原活化劑(u-pa)轉(zhuǎn)化為活性酶纖溶酶的酶原。然后，纖溶酶降解纖維蛋白并且將潛伏性基質(zhì)金屬蛋白酶(pro-mmp)轉(zhuǎn)化成活性mmp，活性mmp又進(jìn)一步降解細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)作為組織愈合/重建過程的一部分。如本文所用的術(shù)語“生物活性變體”是指保留天然纖溶酶原的生物活性(即轉(zhuǎn)化為能夠降解纖維蛋白并且將潛伏性基質(zhì)金屬蛋白酶(pro-mmp)轉(zhuǎn)化成活性mmp的纖溶酶多肽(由t-pa和或u-pa)的能力)的突變纖溶酶原多肽。變體可包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失/截短(n端、c端和/或內(nèi)部氨基酸缺失/截短)、添加(n端、c端和/或內(nèi)部氨基酸添加)。生物活性變體可展現(xiàn)更低、更高或類似于天然纖溶酶原多肽的生物活性(例如所得纖溶酶的酶活性)。在實(shí)施方案中，變體與天然纖溶酶原多肽具有至少60、70、75、80、85、90或95％氨基酸序列同一性。例如wo2012/093132、wo2013/024074以及wang等人(1995,proteinscience4,1758-1767)中描述了生物活性纖溶酶原變體，并且包括通常稱為“中型纖溶酶原(midiplasminogen)”、“小型纖溶酶原(miniplasminogen)”、“微型纖溶酶原(microplasminogen)”以及“δ-纖溶酶原”纖溶酶原的缺少一個(gè)或多個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)域和/或其部分的截短變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，纖溶酶原為人類纖溶酶原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含天然人類纖溶酶原。纖溶酶原可獲自若干來源。它可通過重組合成來獲得，或從血液、血漿或血液衍生溶液萃取/純化?？赏ㄟ^科恩分級(jí)分離(cohnfractionation)或通過沉淀從血液或血漿萃取纖溶酶原。可通過結(jié)合親和色譜(諸如wo2006/120423中所描述的方法)從血漿或血液衍生的溶液純化，或者重組產(chǎn)生纖溶酶原。

在一個(gè)實(shí)施方案中，纖溶酶原或其生物活性變體以約0.01mg/ml至約80mg/ml；優(yōu)選約1mg/ml至約60mg/ml；優(yōu)選約5mg/ml至約60mg/ml；優(yōu)選約5mg/ml至約40mg/ml；優(yōu)選約2mg/ml至約30mg/ml，更優(yōu)選約2mg/ml至約20mg/ml并且進(jìn)一步優(yōu)選約80、70、60、50、40、30、25、20、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.1、0.05或0.01mg/ml的濃度存在。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物中所含的纖溶酶原或其生物活性變體具有超過約80％或超過約90％或超過約95％或超過約98％的純度。術(shù)語“約”是指值偏差大約10％。

本發(fā)明組合物的ph值可為約3.0至約10.0；約5.0至約8.0；約6.0至約8.0；或約6.5至約7.5。在實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物的ph值為約3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、8.0、8.5、9.0或10.0。為使組合物維持在此類ph值，本發(fā)明組合物優(yōu)選包含緩沖液。視所需ph值而定，在本發(fā)明范圍內(nèi)可使用許多緩沖液，包括以下緩沖液：

在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖液包含兩種緩沖液的組合；諸如檸檬酸鹽/磷酸鹽、檸檬酸鹽/組氨酸、乙酸鹽/組氨酸或琥珀酸鹽/組氨酸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖液不包含檸檬酸鹽緩沖液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖液為檸檬酸鹽、磷酸鹽(k2hpo4/nahpo4)、組氨酸或琥珀酸鹽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖液為磷酸鹽(k2hpo4/nahpo4)、組氨酸或琥珀酸鹽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖液的濃度為約10mm至約50mm，或約10mm至約30mm，例如約2mm或約10mm。

如本文所用，“張力調(diào)節(jié)劑”是指用于調(diào)節(jié)藥物組合物的張力的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，張力調(diào)節(jié)劑以使得組合物等張的量存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，張力調(diào)節(jié)劑以使得組合物高張或低張的量存在。在一個(gè)實(shí)施方案中，張力調(diào)節(jié)劑為氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀、na2so4、zncl2、硼酸鹽、藥學(xué)上可接受的單價(jià)鹽、藥學(xué)上可接受的二價(jià)鹽、藥學(xué)上可接受的三價(jià)鹽、藥學(xué)上可接受的四價(jià)鹽、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇、甘露糖醇、甘油、乳糖、山梨糖醇、右旋糖、環(huán)糊精、棉子糖、糖醇、聚乙二醇、羥乙基淀粉、甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、右旋糖酐、pvp(聚乙烯吡咯烷酮)或其任何組合。“等張”意味著本發(fā)明的組合物具有與人類血液的滲透壓基本上相同的滲透壓。等張組合物通常具有約250至約330mosm的滲透壓。滲透壓可使用例如蒸氣壓或冰凍型滲透壓計(jì)來測(cè)量。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含兩種張力調(diào)節(jié)劑的混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含三種張力調(diào)節(jié)劑的混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，張力調(diào)節(jié)劑為糖或包含糖，或?yàn)樘堑幕旌衔?。在一個(gè)實(shí)施方案中，張力調(diào)節(jié)劑為氯化鈉。在一個(gè)實(shí)施方案中，張力調(diào)節(jié)劑濃度的濃度為約30mm至約250mm，或約20mm至約150mm，或約30mm至約100mm。在一個(gè)實(shí)施方案中，張力調(diào)節(jié)劑濃度的濃度為約約34mm，或約35mm，或約68mm，或約75mm。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)張力調(diào)節(jié)劑的濃度，使得組合物的所得滲透壓屬于所需范圍內(nèi)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物進(jìn)一步包含填充劑。如本文所用，“填充劑”是指增加組合物的體積量(bulkmass)的化合物/試劑。填充劑的實(shí)例包括但不限于甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘露糖醇、羥乙基淀粉、右旋糖酐、pvp(聚乙烯吡咯烷酮)、甘露糖醇、山梨糖醇、寡糖源生的糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、麥芽三糖醇、木糖醇、聚乙二醇、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、山梨糖醇、nacl或其任何組合。這些試劑還可充當(dāng)張力調(diào)節(jié)劑。在實(shí)施方案中，填充劑的濃度為約50mm至約300mm；或約100mm至約200mm，或約150mm，或約50mm至約150mm，或約108mm，或約54mm。

在一個(gè)實(shí)施方案中，張力調(diào)節(jié)劑和填充劑的濃度使得張力調(diào)節(jié)劑/填充劑比率為約1.0至約15.0(wt/wt)；約1.0至約10.0、約3.0至約10.0、約5.0至約10.0(例如約5.0、約8.0或約10.0)。在一個(gè)實(shí)施方案中，基于張力調(diào)節(jié)劑的濃度調(diào)節(jié)填充劑的濃度，使得張力調(diào)節(jié)劑/填充劑比率在所需范圍內(nèi)。

在實(shí)施方案中，組合物進(jìn)一步包含一種或多種其他藥學(xué)上可接受的成分，諸如載體、賦形劑、稀釋劑、穩(wěn)定劑、緩沖液等。

在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物進(jìn)一步包含糖，例如還原和/或非還原糖。如本文所用，“還原糖”為含有可還原金屬離子或與蛋白質(zhì)中的賴氨酸和其他氨基共價(jià)反應(yīng)的半縮醛基的糖，而“非還原糖”為不具有還原糖的這些性質(zhì)的糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，還原糖為果糖、甘露糖、麥芽糖、乳糖、阿拉伯糖、木糖、核糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖或其任何組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，非還原糖為蔗糖、海藻糖、山梨糖、松三糖、棉子糖或其任何組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的藥物組合物在還原糖存在下凍干。在一個(gè)實(shí)施方案中，將本發(fā)明的藥物組合物在非還原糖存在下凍干。

在實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物具有約180mosm至約350mosm；或約250mosm至約350mosm或約200mosm至約300mosm的滲透壓。在某些實(shí)施方案中，例如當(dāng)制備本發(fā)明組合物用于凍干時(shí)，它可具有高于350mosm的滲透壓。在此類情況下，復(fù)原溶液可具有超過組合物的體積的體積，以稀釋組分并且降低滲透壓。另外，當(dāng)將組合物設(shè)計(jì)成用于小體積施用時(shí)，組合物的滲透壓可高于350mosm。

如本文所用，“穩(wěn)定劑”是指使溶液中的纖溶酶原穩(wěn)定的試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，穩(wěn)定劑包含氨基酸、氨基酸鹽、氨基酸類似物或其任何混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，氨基酸、氨基酸鹽、氨基酸類似物或其混合物為精氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、賴氨酸類似物(諸如ε-氨基己酸)或其任何組合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述氨基酸可呈諸如精氨酸鹽酸鹽及賴氨酸鹽酸鹽等氨基酸堿的形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含兩種氨基酸、氨基酸鹽和/或氨基酸類似物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含三種氨基酸、氨基酸鹽和/或氨基酸類似物。在實(shí)施方案中，氨基酸的濃度為約10mm至約300mm、約20mm至約200mm或約10mm至約100mm或約25mm至約75mm或約10mm或約25mm或約50mm或約75mm或約100mm、約150mm、約200mm、約250mm或約300mm。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物進(jìn)一步包含抗氧化劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗氧化劑為甲硫氨酸、氧化型谷胱甘肽(glu-cys-gly)2(613kda)、抗壞血酸、n-乙?；?l-半胱氨酸/高半胱氨酸、谷胱甘肽、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色滿-2-甲酸硫辛酸、硫代硫酸鈉、鉑、甘氨酸-甘氨酸-組氨酸(三肽)、丁基化羥基甲苯(bht)或其任何組合。在實(shí)施方案中，抗氧化劑的濃度為約10mm至約200mm，例如約10mm、約50mm、約100mm、約150mm或約200mm。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物進(jìn)一步包含抗表面活性劑。如本文所用，“表面活性劑”是指降低液體與固體(當(dāng)溶解于溶液中時(shí))之間的界面張力的化合物/試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，表面活性劑為80、20、f-68或35；泊洛沙姆(例如泊洛沙姆188或f-68)；十二烷基硫酸鈉(sds)；月桂基硫酸鈉；辛基糖苷鈉；月桂基-磺基甜菜堿、肉豆寇基-磺基甜菜堿、亞油烯基-磺基甜菜堿或硬脂基-磺基甜菜堿；月桂基-肌氨酸、肉豆寇基-肌氨酸、亞油烯基-肌氨酸或硬脂基-肌氨酸；亞油烯基-甜菜堿、肉豆寇基-甜菜堿或鯨蠟基-甜菜堿；月桂酰胺丙基-甜菜堿、椰油酰胺丙基-甜菜堿、亞油酰胺丙基-甜菜堿、肉豆蔻酰胺丙基-甜菜堿、棕櫚酰胺丙基-甜菜堿或異硬脂酰胺丙基-甜菜堿(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰胺丙基-二甲胺、棕櫚酰胺丙基-二甲胺或異硬脂酰胺丙基-二甲胺；甲基椰油?；??；撬徕c或甲基油烯基-牛磺酸二鈉；以及monaquat^tm系列(monaindustries,inc.,paterson,n.j.)、聚乙二醇、聚丙二醇或乙二醇以及丙二醇的共聚物或其任何組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)表面活性劑的濃度以減少纖溶酶原、其生物活性變體或片段的聚集并且/或者使組合物中微粒的形成降至最低程度并且/或者減少吸附。在一個(gè)實(shí)施方案中，表面活性劑以約0.001-1％(w/v)、約0.002％至約0.02％(w/v)或約0.002％至約0.006％(w/v)的濃度存在于組合物中。在一些實(shí)施方案中，組合物包含表面活性劑，所述表面活性劑為泊洛沙姆。在一些實(shí)施方案中，組合物包含f68。在特定實(shí)施方案中，組合物包含約0.01％(w/v)至約1％(w/v)的f68，例如約0.1％(w/v)的f68。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物大體上不含或不含非離子表面活性劑，例如組合物包含低于約0.02％、0.01％、0.006％或0.004％(w/v)的非離子表面活性劑。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物進(jìn)一步包含聚合穩(wěn)定劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚合穩(wěn)定劑為肝素(6至30kda)；聚氨基酸(2至100kda)，諸如聚(glu)、聚(asp)以及聚(glu，phe)；羧甲基纖維素(10-800cp)環(huán)糊精；右旋糖酐硫酸鹽或其任何組合。在實(shí)施方案中，聚合穩(wěn)定劑的濃度為約0.001％至約0.50％，或約0.001％至約0.25％。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物進(jìn)一步包含聚乙二醇，例如peg200、peg400、peg1000、peg4000、peg8000、peg10000或其任何組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，聚乙二醇的濃度為約0.5％至約10％(w/w)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物進(jìn)一步包含防腐劑。如本文所用，“防腐劑”是指可添加至藥物組合物中以使其中的細(xì)菌活性基本上降低，由此促進(jìn)例如多用途藥物組合物的制備的化合物/試劑。防腐劑的實(shí)例包括間甲酚、苯甲醇、甲醇、乙醇、異丙醇、對(duì)羥基苯甲酸丁酯、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、苯酚、甘油、木糖醇、間苯二酚、兒茶酚、2,6-二甲基環(huán)己醇、2-甲基-2,4-戊二醇、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮、2-氯酚、芐索氯銨、硫柳汞(硫汞撒)、苯甲酸(對(duì)羥苯甲酸丙酯)mw180.2、苯甲酸mw122.12、苯扎氯銨、氯丁醇、苯甲酸鈉、丙酸鈉或氯化十六烷基吡啶。選擇與緩沖液和藥物組合物的其他組分相容(即溶液透明)的防腐劑。舉例來說，當(dāng)緩沖液為乙酸鈉或磷酸鈉時(shí)，相容防腐劑包括甲醇、乙醇、異丙醇、甘油、間苯二酚、2-甲基-2,4-戊二醇、硫柳汞(硫汞撒)、苯扎氯銨、苯甲酸鈉或氯化十六烷基吡啶?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的判斷來確定本發(fā)明組合物中所用的防腐劑的濃度。在一些實(shí)施方案中，防腐劑的濃度為約0.005至約10％(w/v)、約0.1至約1.0％(w/v)或約0.3至約0.7％(w/v)。在一些實(shí)施方案中，防腐劑的濃度為約0.005、0.1、0.3、0.5、0.7或1.0％(w/v)。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物不含防腐劑。

本發(fā)明組合物中可包括一種或多種其他藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，諸如描述于remington'spharmaceuticalsciences第19版,genarro,a.編(1995)中的那些，前提條件是它們不顯著不利影響本發(fā)明的藥物組合物的所需特征。本發(fā)明的組合物的其他組成元素可包括水(例如注射用水)、植物油、增稠劑(諸如甲基纖維素)、抗吸附劑、潤(rùn)濕劑、抗氧化劑(包括抗壞血酸和甲硫氨酸)、螯合劑(諸如edta)、金屬絡(luò)合物(例如zn-蛋白質(zhì)絡(luò)合物)、可生物降解聚合物(諸如聚酯)和/或鹽形成反離子(諸如鈉)等?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑以使得它們?cè)谒褂玫膭┝亢蜐舛认聦?duì)受試者無毒的量存在。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物在凍干時(shí)具有約3.5％至約8％、優(yōu)選約3.5％至約6％并且更優(yōu)選約3.8％至約5.5％的固體總重量。增加本發(fā)明的藥物組合物中的組分的濃度使得凍干組合物中的總固體百分比增加并且改善凍干組合物的餅狀物外觀。

在一個(gè)實(shí)施方案中，纖溶酶原或其變體為lys-纖溶酶原或glu-纖溶酶原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，纖溶酶原或其變體為glu-纖溶酶原。在一個(gè)實(shí)施方案中，纖溶酶原或其變體由各種類型的纖溶酶原和/或變體組成。優(yōu)選地，glu-纖溶酶原的含量占纖溶酶原或其變體的總含量的50％以上，或60％以上，或70％以上，或80％以上，或90％以上。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案為包含纖溶酶原或其變體的藥物組合物，其中組合物中除纖溶酶原或其變體以外的蛋白質(zhì)總量小于約10％，小于約5％或小于約2％。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案為包含纖溶酶原或其變體的藥物組合物，其中組合物不包含或大體上不含另一蛋白質(zhì)(即除纖溶酶原或其變體之外)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，組合物不包含或大體上不含白蛋白。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，組合物不包含或大體上不含抑肽酶。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，組合物不包含或大體上不含胰蛋白酶抑制劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，組合物不包含或大體上不含絲氨酸蛋白酶抑制劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，組合物不包含或大體上不含纖溶酶。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，組合物大體上不含或不含表面活性劑，即表面活性劑的濃度小于0.01mm。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的包含纖溶酶原的藥物組合物在室溫下穩(wěn)定至少2小時(shí)、24小時(shí)、一周或一個(gè)月。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的包含纖溶酶原的藥物組合物在低于0℃的溫度下穩(wěn)定至少3個(gè)月、至少6個(gè)月、至少12個(gè)月或至少24個(gè)月。所述低于0℃的溫度為約-20℃、約-30℃、約-60℃、約-70℃或約-80℃。

在實(shí)施方案中，包含纖溶酶原的藥物組合物為液體組合物、適合于凍干的液體組合物、適合于冷凍的液體組合物、凍干組合物、冷凍組合物或復(fù)原組合物。

術(shù)語“藥物組合物”命名用于藥物、醫(yī)療或治療目的的組合物。

本公開具體考慮本文所描述的組分的所有組合(ph、緩沖液、張力調(diào)節(jié)劑、填充劑、穩(wěn)定劑等)以及其在本發(fā)明的藥物組合物中的相應(yīng)濃度。表1a中呈現(xiàn)了根據(jù)本發(fā)明的纖溶酶原(pg)的藥物組合物的代表性實(shí)例。

下表1b中呈現(xiàn)了根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物關(guān)于具有約0.01mg/ml至約80mg/ml并且優(yōu)選5至60mg/ml的纖溶酶原或其變體并且具有6.5至8.0的ph值的組合物的其他代表性實(shí)例。在所有這些實(shí)例中，纖溶酶原的含量?jī)?yōu)選主要由glu-纖溶酶原組成，并且纖溶酶原或變體的總含量為5mg/ml至60mg/ml。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的包含纖溶酶原的藥物組合物適合用于經(jīng)靜脈內(nèi)、皮下、局部、真皮內(nèi)、眼部和/或肌肉內(nèi)施用。

根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的藥物組合物用于在人類受試者中施用。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物用于經(jīng)靜脈內(nèi)、皮下、局部、肌肉內(nèi)或眼部施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物呈液體、凝膠、乳膏或軟膏形式。

可從若干來源獲得配制于本發(fā)明的組合物中的纖溶酶原。它可通過重組合成來獲得，或從血液、血漿或血液衍生的溶液萃取/純化?？赏ㄟ^科恩分級(jí)分離或通過沉淀從血液或血漿萃取纖溶酶原?？赏ㄟ^結(jié)合親和色譜(諸如wo2006/120423中所描述的方法)從血漿或血液衍生的溶液純化纖溶酶原。纖溶酶原的變體包括但不限于對(duì)氨基酸序列的任何修飾或向其添加任何基團(tuán)或向其添加任何氨基酸或氨基酸序列。纖溶酶原的片段包括但不限于其氨基酸或氨基酸序列的任何缺失。

如本文所用，術(shù)語“約”旨在覆蓋對(duì)應(yīng)值+或-10％。

術(shù)語“受試者”包括可受益于纖溶酶原、其變體或其片段的施用的活有機(jī)體。術(shù)語“受試者”包括諸如哺乳動(dòng)物或鳥的動(dòng)物。優(yōu)選地，受試者為哺乳動(dòng)物。更優(yōu)選地，受試者為人類。最優(yōu)選地，受試者為需要治療的人類患者。

如本文所用，“預(yù)防(preventing/prevention)”旨在指至少降低獲得疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)的可能性(或?qū)膊』虿“Y的敏感性)(即使得在可能暴露于或傾向于患所述疾病但尚末經(jīng)歷或展現(xiàn)所述疾病的癥狀的患者中所述疾病的臨床癥狀中的至少一者不發(fā)生)。本文中提供了用于識(shí)別此類患者的生物和生理參數(shù)且其還為醫(yī)師熟知的。

術(shù)語“治療(treatment/treating)”受試者包括向受試者應(yīng)用或施用本發(fā)明的組合物(或向受試者的組織或器官應(yīng)用或施用本發(fā)明的組合物)，目的為延遲、穩(wěn)定、治愈、愈合、緩解、減輕、改變、得到補(bǔ)救、更少惡化、改善、改進(jìn)或影響疾病或病狀、疾病或病狀的癥狀或疾病或病狀的風(fēng)險(xiǎn)(或?qū)膊』虿畹拿舾行?。術(shù)語“治療”是指在治療或改善外傷、病變或病狀時(shí)成功的任何指示，包括任何客觀或主觀參數(shù)，諸如消除；緩解；惡化速率減??；疾病嚴(yán)重性減輕；癥狀穩(wěn)定、削弱或使得損傷、使受試者更能耐受病變或病狀；退變或衰退速率減慢；使得退變終點(diǎn)衰弱程度更低；或改進(jìn)受試者的身體或心理健康。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語“治療”可包括增加受試者的預(yù)期壽命和/或延遲對(duì)其他治療的需要。

如本文所用，術(shù)語“治療有效量”意味在向受試者施用化合物以治療或預(yù)防特定病癥、疾病或病狀時(shí)足以實(shí)現(xiàn)對(duì)病癥、疾病或病狀的此類治療或預(yù)防作用的量。如本文所用，術(shù)語“治療有效量”進(jìn)一步意味在受試者中纖溶酶原、其變體或其片段有效愈合傷口、愈合鼓膜穿孔、愈合牙周傷口、治療傳染性疾病、提高或維持口腔健康、治療玻璃體后脫離(pvd)、糖尿病性潰瘍和纖溶酶原缺陷型受試者溶栓適應(yīng)癥(諸如冠狀動(dòng)脈血栓形成)、治療組織的再灌注損傷、治療缺血、梗塞、腦水腫、用于改善微循環(huán)、治療纖溶酶原缺陷型受試者以及調(diào)節(jié)補(bǔ)體途徑的量。劑量和治療有效量可例如視包括以下的多種因素而不同：的活性受試者的年齡、體重、總體健康、性別以及膳食；施用次數(shù)、施用途徑、排泄速率以及任何藥物組合(如果適用)、從業(yè)者希望化合物對(duì)受試者具有的作用以及受試者罹患的特定病癥。此外，治療有效量可取決于受試者的血液參數(shù)(例如脂質(zhì)型態(tài)、胰島素水平、血糖)、疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性、器官功能或基礎(chǔ)疾病或并發(fā)癥。此類適當(dāng)劑量可使用包括本文所描述的分析的任何可獲得的分析來確定。當(dāng)向人類施用本發(fā)明的藥物組合物時(shí)，醫(yī)師可例如首先開出相對(duì)低劑量，隨后增加劑量直至獲得適當(dāng)反應(yīng)。所要施用的劑量將最終由醫(yī)師決定。

試劑盒

可將本發(fā)明的化合物作為任選包括容器(例如包裝、盒子、小瓶等)的試劑盒的一部分加以包裝?？稍谏虡I(yè)上根據(jù)本文所描述的方法使用試劑盒并且其可包括關(guān)于在本發(fā)明的方法中使用的說明。

可能或可能不與另一活性成分同時(shí)、在其之前或之后并且通過相同施用途徑或通過另一施用途徑向患者施用本發(fā)明的組合物。因此，本發(fā)明還涵蓋試劑盒，當(dāng)執(zhí)業(yè)醫(yī)師使用所述試劑盒時(shí)可使向患者單獨(dú)或與另一活性成分組合施用適當(dāng)量的本發(fā)明組合物簡(jiǎn)化。

本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步包含用于凍干組合物的復(fù)原的藥學(xué)上可接受的液體。舉例來說，如果以在腸胃外施用時(shí)必須加以復(fù)原的固體形式提供活性成分，那么試劑盒可包含密封可溶解活性成分以形成適合用于腸胃外施用的不含微粒的無菌溶液的適合的藥學(xué)上可接受的液體的容器。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物含于用于單次或多次施用的小瓶、瓶子、管子、注射器或其他容器中。此類容器可例如由玻璃或諸如以下的聚合物材料制成：聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙烯或聚烯烴。在一些實(shí)施方案中，容器可包括密封件，或其他閉合系統(tǒng)，諸如針可穿透的橡膠塞，以抽出單次劑量并且然后在將針移除后再密封。目前所公開的組合物和方法中預(yù)期使用所有此類用于可注射液體、凍干組合物、復(fù)原凍干組合物或本領(lǐng)域中已知用于復(fù)原和注射的粉末的容器。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，容器為包含單次劑量或多次劑量的筆型傳送設(shè)備。此類筆型遞送設(shè)備可為永久性的，例如容納含有單次劑量或多次劑量的一次性藥筒的永久性筆，或者整個(gè)設(shè)備可為一次性的，例如含有單次劑量或多次劑量的一次性筆。在某些實(shí)施方案中，其中筆型遞送設(shè)備包含多次劑量，劑量可為預(yù)置的，即，固定的。在其他實(shí)施方案中，劑量可為靈活劑量，即，由用戶撥入。在一些實(shí)施方案中，筆型遞送設(shè)備包含魯爾鎖(luer-lock)、魯爾錐(luer-cone)或促進(jìn)連接一次性針頭的其他針頭配合連接件。在其他實(shí)施方案中，筆型遞送設(shè)備包含押針(stakedneedle)，即永久性針頭。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，容器為注射器。在一些實(shí)施方案中，注射器包含魯爾鎖、魯爾錐或促進(jìn)連接一次性針頭的其他針頭配合連接件。在其他實(shí)施方案中，注射器包含押針，即永久性針頭。在一些實(shí)施方案中，用單次劑量或多次劑量預(yù)裝填注射器。

穩(wěn)定性分析

“穩(wěn)定”組合物包括如下組合物，在所述組合物中在儲(chǔ)存后其中的蛋白質(zhì)(纖溶酶原或其變體)基本上保留其物理穩(wěn)定性和/或化學(xué)穩(wěn)定性和/或生物活性。用于測(cè)量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的各種分析技術(shù)為本領(lǐng)域中可獲得的并且在例如lee,v.,1991,peptideandproteindrugdelivery,247-301(marceldekker,inc.,newyork,n.y.)以及jones,a.1993,adv.drugdeliveryrev.10:29-90中進(jìn)行了綜述?？稍谒x溫度下在所選時(shí)間段內(nèi)測(cè)量穩(wěn)定性。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物在室溫(約25℃)下或在40℃下穩(wěn)定至少1、2、3、4、5或6個(gè)月以及/或者在約2-8℃下穩(wěn)定至少1、2、3、4、5或6個(gè)月。此外，在某些實(shí)施方案中，組合物在冷凍(例如-30℃)后穩(wěn)定。在某些實(shí)施方案中，穩(wěn)定性準(zhǔn)則如下：(1)通過目視分析組合物保留透明；(2)組合物的濃度、ph值以及滲透壓改變不超過約±10％；(3)如通過sec-hplc所測(cè)量，不超過約10％、不超過約5％或不超過約1％的聚集物形成；以及(4)如通過本領(lǐng)域中已知并且沿用已久的分析法所測(cè)量，不超過10％、不超過約5％或不超過3％的纖溶酶原分解。

熱變性：可使用來自pall的optim2^tm；或用于監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)的去折疊的其他替代生物物理學(xué)技術(shù)(標(biāo)準(zhǔn)pcr(具有加熱塊)、熒光計(jì)或cd分光光度計(jì)(具有溫度控制件)來進(jìn)行針對(duì)纖溶酶原或其變體或其片段對(duì)hts制劑進(jìn)行篩選的熱變性實(shí)驗(yàn)。作為實(shí)例，optim2系統(tǒng)同時(shí)測(cè)量一系列蛋白質(zhì)穩(wěn)定性指示參數(shù)，包括去折疊轉(zhuǎn)變溫度(tm)、聚集發(fā)生溫度(tagg)以及聚集速率。

賦形劑對(duì)熱穩(wěn)定性的影響：在更高熔融溫度(tm)和聚集發(fā)生溫度(tagg)情況下在最佳ph值范圍內(nèi)確定窄ph值。如果在6.5-7.5的生理范圍內(nèi)獲得更高tm；那么接下來的測(cè)試為使用至少3種緩沖系統(tǒng)進(jìn)行篩檢。

另外，可測(cè)試ief(等電聚焦)或cief(毛細(xì)管等電聚焦)以評(píng)估溶液中纖溶酶原的物理構(gòu)象。

穩(wěn)定化百分比基于在60℃下孵育1-8小時(shí)之后針對(duì)各緩沖液/賦形劑并且針對(duì)僅含有纖溶酶原的參比溶液的纖溶酶原酶活性測(cè)量。在另一測(cè)試中，可在37℃下在1-8小時(shí)內(nèi)評(píng)估穩(wěn)定化。如下計(jì)算穩(wěn)定化的百分比：

穩(wěn)定化的百分比＝100x[s-t]/[t]

其中s為在35℃下10天之后所要測(cè)試的含賦形劑的酶溶液的殘余酶活性；并且t為在相同條件下儲(chǔ)存的在不存在任何賦形劑情況下的參考物的活性。

聚集和粒子測(cè)量計(jì)數(shù)(pmc)：通過光線遮蔽粒子計(jì)數(shù)測(cè)試(lightobscurationparticlecounttest)來計(jì)算pmc。分析員應(yīng)使用適合的儀器，所述儀器是基于光阻斷原理并且允許自動(dòng)測(cè)定粒度和粒子數(shù)目。所選傳感器必須適合于預(yù)期粒度范圍和預(yù)期粒子計(jì)數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)粒度范圍通常在2與100mm之間。分析員應(yīng)使用分散于適當(dāng)體積的不含粒子的水中的usp粒子計(jì)數(shù)rs驗(yàn)證設(shè)備的性能。必須小心操作以避免在校準(zhǔn)過程中在分散期間發(fā)生粒子聚結(jié)。

方法：將產(chǎn)物樣品以最適當(dāng)代表遞送(例如排出的注射器內(nèi)容物)的方式進(jìn)行測(cè)試。對(duì)于具有足夠的體積(即體積大到足以促進(jìn)測(cè)試)的腸胃外物質(zhì)，測(cè)試單個(gè)單元往往有助于判斷。對(duì)于不具有足夠的體積的腸胃外產(chǎn)物，小心并且徹底地混合各單元，然后將適當(dāng)數(shù)目的單元的內(nèi)容物在單獨(dú)的容器中組合以獲得為單一測(cè)試所需的體積(通常為0.2-5.0ml)。如果進(jìn)行稀釋，那么確?？瞻兹萜鲗?duì)于產(chǎn)物和稀釋劑來說具有足夠的體積并且在所述過程中引進(jìn)極少(如果有的話)粒子。小心打開各單元，移除密封閉合件，并且在取樣、稀釋或(必要時(shí))匯集之前避免污染內(nèi)容物。當(dāng)指定產(chǎn)物溶劑時(shí)，例如對(duì)于用于腸胃外用途的凍干固體或粉末，必須用適當(dāng)量的指定溶劑進(jìn)行復(fù)原或稀釋。在這種情況下，可測(cè)試溶劑本身以確保它不為顯著粒子來源。不允許從總計(jì)數(shù)中扣除溶劑粒子計(jì)數(shù)。消除氣泡為關(guān)鍵步驟，尤其對(duì)于容易夾帶氣體的蛋白質(zhì)產(chǎn)物來說。建議使用兩種方法：要么允許產(chǎn)物流忍受環(huán)境壓力，要么施加溫和(例如75托(torr))真空。當(dāng)被證實(shí)適合時(shí)，還可使用其他方法。應(yīng)避免超聲處理。在樣品已脫氣后，必須通過適當(dāng)手段(例如用手緩慢攪動(dòng)容器)輕輕地但充分地混合樣品的內(nèi)容物來將其輕輕地再混合以懸浮所有粒子。任何時(shí)候都不建議將混合產(chǎn)物流倒置。在混合之后，立即抽出不少于四個(gè)等分試樣，各自的體積適合于儀器的容量(通常0.2-5.0ml)。計(jì)算所選尺寸范圍內(nèi)的粒子的數(shù)目，包括等于或大于10和25mm的粒子。不管第一等分試樣所獲得的結(jié)果，并且計(jì)算正在測(cè)試的制劑的剩余等分試樣在各尺寸范圍內(nèi)的平均粒子數(shù)目。皮體積還可適用于對(duì)照取樣，其應(yīng)代表傳感器動(dòng)態(tài)范圍和針頭體積。

評(píng)估：像fda(食品和藥物管理局)等管理機(jī)構(gòu)以及usp/ep/jp(美國(guó)藥典)章節(jié)(787、788以及789)、ep歐洲藥典(2.9.20particulatecontamination)以及jp日本藥典jp(16:6.06.6.07foreigninsolublemattertest)對(duì)微粒物質(zhì)的要求如下規(guī)定了供人類使用的液體制劑中可接受的粒子水平。對(duì)于作為供應(yīng)于標(biāo)稱含量小于或等于100ml的容器中的用于輸注或注射的治療性蛋白質(zhì)注射劑的腸胃外產(chǎn)品：存在于所測(cè)試單元中的平均粒子數(shù)目不應(yīng)超過每個(gè)容器6000個(gè)等于或大于10μm，并且不應(yīng)超過每個(gè)容器600個(gè)等于或大于25μm。對(duì)于供應(yīng)于標(biāo)稱含量超過100ml的容器中的治療性蛋白質(zhì)注射劑，以及標(biāo)稱含量超過100ml的腸胃外輸注制劑或注射劑：存在于所測(cè)試單元中的平均粒子數(shù)目不應(yīng)超過每毫升25個(gè)等于或大于10μm，并且不應(yīng)超過每毫升3個(gè)等于或大于25μm。另外，總粒子負(fù)荷不應(yīng)超過每個(gè)容器6000個(gè)等于或大于10μm，并且不應(yīng)超過每個(gè)容器600個(gè)等于或大于25μm。在施用期間在最終過濾器(串聯(lián))情況下使用的產(chǎn)品免于受這些要求限制，條件是可獲得科學(xué)數(shù)據(jù)證明免于受限制。然而，期望濾液符合所述準(zhǔn)則。對(duì)于所供應(yīng)或首先于<100ml中復(fù)原并且然后于>100ml的體積中稀釋以用于輸注的產(chǎn)品，應(yīng)在稀釋之前與之后均評(píng)估粒子含量并且基于其最終體積進(jìn)行評(píng)估。因此，在此文件中在本文中包括usp/ep/jp方法。因此，術(shù)語“粒子”是指“微?！辈⑶曳粗嗳唬贿@些術(shù)語可互換使用。

使用optim-2^tm在476nm/600nm下通過光散射或通過標(biāo)準(zhǔn)uv分光光度計(jì)在uv下在350nm下測(cè)量的動(dòng)力學(xué)研究：選擇諸如高溫(65℃)和酸性溶液ph值(4.5)或堿性溶液ph值(9.5)的加速條件以更快速地篩選不同穩(wěn)定化賦形劑。組合物的組分被評(píng)估為在1至4小時(shí)內(nèi)在固定溫度(55-60℃)下隨時(shí)間變化增加tagg。在55-60℃下在長(zhǎng)達(dá)4h內(nèi)測(cè)量纖溶酶原溶液的聚集動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，裝備有溫度控制件(測(cè)定發(fā)生tm)。針對(duì)賦形劑對(duì)如通過光散射在267nm、467nm或350nm下所測(cè)量的纖溶酶原聚集的抑制的影響對(duì)賦形劑進(jìn)行篩選(cheng,w.等人“comparisonofhigh-throughputbiophysicalmethodstoidentifystabilizingexcipientsforamodeligg2monoclonalantibody:conformationalstabilityandkineticaggregationmeasurements”journalofpharmaceuticalsciences,第101卷,第5期,第1701-1720頁,2012)。

蛋白質(zhì)濃度對(duì)熱穩(wěn)定性的影響：optim-2^tm或雙重掃描熒光計(jì)(dsf，使用sypro染料)的優(yōu)點(diǎn)之一為在高度濃縮的蛋白質(zhì)溶液中進(jìn)行tm和tagg測(cè)量的能力。無論是研究潛在候選物的相對(duì)穩(wěn)定性還是針對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定化對(duì)不同配制條件進(jìn)行篩選，在可獲得的表征方法的數(shù)量有限的情況下，識(shí)別在高濃度下蛋白質(zhì)溶液的性質(zhì)均可能為重要的。

制劑組成對(duì)最終滲透壓的影響：在最終藥物組合物中，緩沖液、賦形劑以及鹽濃度歸因于親本注射劑的實(shí)際限制而優(yōu)選不非常高。替代地，為獲得在240至400mosm范圍內(nèi)的滲透壓，更適度的濃度(諸如更生理)為優(yōu)選的。因此，計(jì)算滲透壓以在最初確定此范圍；然而，對(duì)于靜脈注射，如果在復(fù)原之后將纖溶酶原或其變體或片段用用于復(fù)原的溶液稀釋，那么在開發(fā)冷凍干燥方法期間還可使用更高滲透壓濃度。

應(yīng)注意，術(shù)語“制劑”和“組合物”在本文中可替換使用，并且旨在命名相同對(duì)象。

本文中包括標(biāo)題供參考并且用于幫助定位某些部分。這些標(biāo)題不旨在限制其中所描述概念的范圍，并且這些概念可在整個(gè)說明書通篇中的其他部分中具適用性。因此，本發(fā)明不旨在限于本文所示的實(shí)施方案，而是與符合本文所公開的原理和新穎特征的最寬范圍相一致。

除非上下文另外明確指示，否則單數(shù)形式“一(a/an)”和“所述”包括相應(yīng)復(fù)數(shù)參考物。

除非另外指出，否則本說明書和權(quán)利要求中所用的所有表示成分的量、反應(yīng)條件、濃度、性質(zhì)等的數(shù)字應(yīng)理解為在所有情況下由術(shù)語“約”修飾。最低限度地，各數(shù)值參數(shù)至少應(yīng)根據(jù)具有所報(bào)導(dǎo)有效數(shù)字的數(shù)字并且通過應(yīng)用一般舍入技術(shù)來理解。因此，除非指示為相反，否則本說明書和所附權(quán)利要求中所闡述的數(shù)值參數(shù)為近似值，所述近似值可視設(shè)法獲得的性質(zhì)而變化。盡管闡述實(shí)施方案的廣泛范圍的數(shù)值范圍和參數(shù)為近似值，但特定實(shí)例中所闡述的數(shù)值為盡可能精確報(bào)導(dǎo)的。然而，任何數(shù)值固有地含有因?qū)嶒?yàn)、測(cè)試測(cè)量、統(tǒng)計(jì)分析以及此類因素的變化而產(chǎn)生的某些誤差。

應(yīng)了解，本文所描述的實(shí)例和實(shí)施方案僅用于說明性目的，并且將向本領(lǐng)域技術(shù)人員建議對(duì)其作出的各種修改或變化，并且它們應(yīng)包括在本發(fā)明和隨附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

實(shí)施例

以下實(shí)施例進(jìn)一步說明對(duì)本發(fā)明的實(shí)踐，但不旨在限制本發(fā)明。

實(shí)施例1：冷凍制劑中的纖溶酶原的穩(wěn)定性

包含根據(jù)wo2006/120423中所描述的結(jié)合親和力技術(shù)從血漿萃取的5mg/ml人類纖溶酶原、10mm檸檬酸鹽、150mmnacl的在ph6.5下的藥物組合物(批號(hào)：2002.pc02_pg140210.01)的穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果是在-20℃、-30℃以及-80℃下儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月。穩(wěn)定性數(shù)據(jù)表明纖溶酶原在這些冷凍條件下穩(wěn)定。在-20℃、-30℃以及-80℃下測(cè)試?yán)w溶酶原批號(hào)：2002.pc02_pg140210.01。通過sec-hplc研究聚集水平，在還原和非還原條件下通過sds-page研究純度水平，通過bcs活性研究活性水平，并且通過在280nm下的吸光度(abs280)研究蛋白質(zhì)濃度。6個(gè)月之后的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)的結(jié)果證實(shí)所有穩(wěn)定性指示分析均實(shí)現(xiàn)所需規(guī)格。

實(shí)施例2：滲透壓分析和總固體百分比分析

表2中報(bào)導(dǎo)了制劑1至6的滲透壓和制劑1-9在凍干之后的總固體百分比。表1a中規(guī)定了制劑1-9的內(nèi)容物。

表2

滲透壓在240-400mosm的生理范圍內(nèi)。所測(cè)試組合物的所得滲透壓有利地屬于或非常接近于生理范圍的滲透壓。對(duì)于所有組合物和安慰劑來說，總固體餅狀物百分比(每100ml凍干前液體組合物在凍干之后的固體組合物的克數(shù))為約4％，這在3.5至8％的優(yōu)選范圍內(nèi)。

實(shí)施例3：纖溶酶原的分子量

純化過并且配制于本發(fā)明的藥物組合物中的纖溶酶原的分子量具有87,000(mw)的分子量，這是通過計(jì)算纖溶酶原的一級(jí)氨基酸序列來確定并且通過質(zhì)譜法加以驗(yàn)證。

實(shí)施例4：凍干之后的餅狀物的外觀研究

已遵循表5中詳述的循環(huán)過程將制劑1至5凍干。表1a中規(guī)定了制劑1-5的內(nèi)容物。

表5

圖2至11為分別含有12.5ml制劑1至5或其相應(yīng)安慰劑(在不存在纖溶酶原的情況下)的小瓶的圖片。因此，已研究了纖溶酶原的存在對(duì)組合物穩(wěn)定性的影響。對(duì)已通過凍干過程形成的餅狀物的外觀的物理檢查。所有餅狀物均一直維持均勻密度，沒有任何變色。制劑2、3以及5的安慰劑的測(cè)試小瓶的小于10％已提供熔融回縮。制劑1的安慰劑的測(cè)試小瓶的小于10％已崩潰。制劑1-5的安慰劑以及制劑4的安慰劑的測(cè)試小瓶的小于10％已顯示底部收縮。餅狀物的外觀總體令人滿意。

組合物的內(nèi)容物指示崩潰溫度。各純無定形賦形劑具有特征tg’和崩潰溫度；制劑的崩潰溫度為無定形相中所有組合物的質(zhì)量平均溫度。設(shè)計(jì)一種具有最高崩潰溫度的制劑是重要的，因?yàn)樵趦龈善陂g干燥速率與樣品溫度成正比。

最后，如果鹽(nacl)和賦形劑未最大限度地結(jié)晶，那么崩潰溫度將降低。舉例來說，甘氨酸具有-45℃的tg’，并且其對(duì)無定形相的貢獻(xiàn)可使崩潰溫度降至低得不適當(dāng)?shù)闹怠?/p>

實(shí)施例5：氨基酸對(duì)溶液中的纖溶酶原聚集的影響

單獨(dú)纖溶酶原于水中產(chǎn)生fda不可接受的大量纖溶酶原聚集物，即10μm或更大者高于每100ml組合物6000個(gè)粒子(參見表6中的樣品f0406)。已研制出各種基于蔗糖的制劑來配制纖溶酶原。雖然這些制劑大多數(shù)繼續(xù)達(dá)到每100ml6000個(gè)10μm或更大的粒子的閾值，但已研制出含有更低粒子含量的制劑并且本文中研究了氨基酸穩(wěn)定纖溶酶原的作用。這些其他制劑含有10mg的纖溶酶原和35mmnacl，并且已測(cè)試三種緩沖液/ph值，即10mm檸檬酸鈉(ph6.5)、10mm磷酸鈉(ph7.2)以及10mmtrishcl(ph8.0)。已比較存在與不存在0.5％濃度的選自精氨酸、丙氨酸以及甘氨酸的氨基酸的情況。所測(cè)試制劑為新鮮的，即在凍干之前。表6報(bào)導(dǎo)了10μm或更大以及25μm或更大的粒子的pmc計(jì)數(shù)。氨基酸的存在已證實(shí)穩(wěn)定作用有助于降低聚集水平。

表6

實(shí)施例6：甘露糖醇與氨基酸組合對(duì)纖溶酶原聚集的影響

已測(cè)試在存在和不存在氨基酸(0.5％精氨酸鹽酸鹽、丙氨酸或甘氨酸)的情況下，填充劑(0.5％甘露糖醇)的存在對(duì)含有10mg纖溶酶原和35mmnacl加上10mm檸檬酸鈉(ph6.5)、10mm磷酸鈉(ph7.2)或10mmtrishcl(ph8.0)的制劑并且在表7中進(jìn)行了報(bào)導(dǎo)。在此研究中測(cè)試新鮮制劑(凍干之前)。一般來說，甘露糖醇的存在使粒子計(jì)數(shù)降低。一般來說，甘露糖醇與氨基酸的組合有助于降低粒子計(jì)數(shù)，并且尤其在精氨酸與甘露糖醇組合的情況下。

表7

實(shí)施例7：防腐劑對(duì)纖溶酶原聚集的影響

已在含有9或10mg纖溶酶原和35mmnacl加上10mm檸檬酸鈉(ph6.5)、10mm磷酸鈉(ph7.2)或10mmtrishcl(ph8.0)加上0.5％精氨酸鹽酸鹽或0.5％精氨酸鹽酸鹽與0.5％甘露糖醇的組合的制劑中測(cè)試了防腐劑(諸如0.1％苯酚)的存在。在此研究中測(cè)試新鮮制劑(凍干之前)。表8中已報(bào)導(dǎo)了粒子物質(zhì)計(jì)數(shù)(pmc)。有利地，苯酚的存在未顯著影響粒子計(jì)數(shù)。

表8

比較了若干防腐劑。表9報(bào)導(dǎo)了對(duì)在含有10mg纖溶酶原和35mmnacl加上10mm檸檬酸鈉(ph6.5)、10mm磷酸鈉(ph7.2)或10mmtrishcl(ph8.0)以及0.5％精氨酸鹽酸鹽的制劑內(nèi)的0.5％cmc、0.1％苯酚以及0.5％右旋糖酐的比較。在此研究中測(cè)試新鮮制劑(凍干之前)。右旋糖酐或苯酚的存在未顯著影響聚集。然而，cmc使聚集顯著增加。這不令人驚訝，因?yàn)橐阎猚mc增加溶液的粘度并且經(jīng)常用于制備滴眼劑制劑。

表9

實(shí)施例8：氨基酸和其濃度對(duì)纖溶酶原聚集的影響

在纖溶酶原10mg/ml、35mmnacl、10mm磷酸鈉(napi)(ph7.2)的制劑中在凍干和復(fù)原之后測(cè)試了0.5％和1％的精氨酸。表10中報(bào)導(dǎo)了粒子計(jì)數(shù)(pmc)，表10表明兩種濃度的精氨酸用于維持低pmc值非常好。

表10

在纖溶酶原10mg/ml、35mmnacl、10mm磷酸鈉(napi)(ph值7.2)的制劑中在凍干和復(fù)原之后，對(duì)1％的精氨酸、甘氨酸以及丙氨酸進(jìn)行了比較。表11中報(bào)導(dǎo)了粒子計(jì)數(shù)(pmc)，表11表明精氨酸在測(cè)試條件下用于維持低pmc值優(yōu)于丙氨酸和甘氨酸，不過所有這三種氨基酸均提供可接受的pmc值，即每100ml不到6000個(gè)等于或大于10μm的粒子。

表11

實(shí)施例9：總固體百分比和滲透壓

表12中報(bào)導(dǎo)了10mg/ml纖溶酶原的若干制劑的滲透壓以及用于制備所述制劑的固體物質(zhì)的百分比。表13中報(bào)導(dǎo)了20mg/ml纖溶酶原的若干制劑的滲透壓以及用于制備所述制劑的固體物質(zhì)的百分比。所測(cè)試制劑的所得滲透壓有利地屬于或非常接近于生理范圍的滲透壓?？偣腆w物質(zhì)百分比是由纖溶酶原、其中的張力調(diào)節(jié)劑以及填充劑的含量來計(jì)算，并且為凍干之后所得餅狀物的尺寸的良好指示。

表12

表13

實(shí)施例10：粒子計(jì)數(shù)(pmc)

表14中報(bào)導(dǎo)了表12中所描述的制劑的關(guān)于等于或大于10μm的粒子的粒子計(jì)數(shù)(pmc)；并且表15中報(bào)導(dǎo)了表13中所描述的制劑的關(guān)于等于或大于10μm的粒子的粒子計(jì)數(shù)(pmc)。

表14

表15

圖12、13以及14中示出了分別含有制劑f0498、f0449以及f0459的小瓶的圖片，作為表12-15中報(bào)導(dǎo)的凍干制劑的外觀的代表性實(shí)例。

實(shí)施例10：可逆纖溶酶原聚集

如由此研究所證實(shí)，纖溶酶原聚集為可逆的。將在dh2o中滲析并且嚴(yán)重沉淀的冷凍纖溶酶原樣品(pg原液)5mg/ml解凍，經(jīng)由1.2μm注射器過濾器過濾，并且用作對(duì)照(pg對(duì)照對(duì)照)的起始物質(zhì)。將2mlpg對(duì)照的等分試樣添加至玻璃小瓶中，分別預(yù)先外加1m檸檬酸鈉ph6.5(樣品1)、0.5m磷酸鈉ph7.2(樣品2)或1mtris-hclph8.0(樣品3)緩沖儲(chǔ)備液以在各ph值下獲得最終10mm緩沖液濃度。圖15中示出了樣品1、2以及3，其中未外加pg對(duì)照為樣品0。樣品1、2以及3進(jìn)一步外加5mnacl和0.8m精氨酸的儲(chǔ)備溶液，以在各樣品中獲得35mmnacl和28.5mm(0.5％)arg的最終濃度并且在圖16中示出。在圖15和16中分別使用0.02、20、100、800ntu的濁度標(biāo)準(zhǔn)液作為參考。由圖15可注意到ph值調(diào)節(jié)已溶解大量聚集物。在圖16中，通過添加精氨酸和nacl使得樣品1、2以及3透明，并且視覺不可檢測(cè)到聚集物。

使用標(biāo)準(zhǔn)校正使用圖15和16中所示的濁度參考標(biāo)準(zhǔn)液通過讀出550nm下的光密度(od)來測(cè)量圖16的樣品0、1、2以及3的濁度。在表16中以比濁法濁度單位(nephelometricturbidityunit，ntu)報(bào)導(dǎo)了濁度。在對(duì)樣品1、2以及3外加緩沖液、nacl以及精氨酸之前(t＝0)和之后在0.1小時(shí)、17小時(shí)、21小時(shí)以及24小時(shí)時(shí)測(cè)量1ml各樣品的等分試樣。解聚作用為快速的，因?yàn)樗鼉H可在外加之后0.1小時(shí)時(shí)被注意到，并且它維持歷時(shí)24小時(shí)。

表16

實(shí)施例11：氨基酸隨時(shí)間推移對(duì)組合物濁度的影響

已在含有10mg纖溶酶原和35mmnacl加上0.5％甘氨酸、精氨酸、丙氨酸而不含氨基酸的組合物中在ph6.5下在檸檬酸鈉緩沖液中(圖17)、在ph7.2下在磷酸鈉緩沖液中(圖18)以及在ph8.0下在tris緩沖液中(圖19)對(duì)濁度進(jìn)行了測(cè)量。

在存在0.5％甘露糖醇作為填充劑的情況下重新制備圖17、18以及19中所測(cè)試的組合物，并且分別在圖20、21以及22中進(jìn)行報(bào)導(dǎo)。

在所有情況下，氨基酸的存在提供穩(wěn)定化作用并且維持或降低濁度。比較氨基酸的類型，精氨酸顯示最佳穩(wěn)定化作用并且在所有所測(cè)試的ph值下并且在存在和不存在填充劑(即0.5％甘露糖醇)的情況下均降低濁度。

實(shí)施例12：具有升高濃度的纖溶酶原的組合物

已研究了含有高濃度的纖溶酶原的組合物。對(duì)于在存在及不存在1％精氨酸的情況下，20mg/ml纖溶酶原于10mm或100mm檸檬酸鈉、35mmnacl(ph6.5)中的組合物，以及在存在1％精氨酸的情況下，37和56mg/ml纖溶酶原于100mm檸檬酸鈉、35mmnacl(ph6.5)中的組合物，表17中已報(bào)導(dǎo)了10μm或更大以及25μm或更大的粒子的pmc計(jì)數(shù)。

表17表明本發(fā)明的制劑有利地允許制備包含升高濃度的纖溶酶原(37和56mg/ml)的組合物而不會(huì)引起不可接受的粒子水平。

表17

實(shí)施例13：纖溶酶原活性

對(duì)本文所例示的各制劑的纖溶酶原活性進(jìn)行測(cè)試并且與初始制劑或原液制劑(pg原液)的纖溶酶原活性相比較。已注意到纖溶酶原活性不受這些制劑中任一者的影響。

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