本發(fā)明涉及一種含有在菌體表面具有來自人乳頭狀瘤病毒(hpv，humanpapillomavirus)e7蛋白質(zhì)的多肽的乳酸菌的組合物、以及包含所述含有乳酸菌的組合物的hpv感染癥及hpv相關(guān)腫瘤中的至少任一種疾病的治療用口服醫(yī)藥組合物及粘膜免疫誘導(dǎo)劑。

背景技術(shù)：

人乳頭狀瘤病毒(hpv)是dna病毒，迄今已報告有100種以上的不同類型。所述hpv通過感染皮膚(例如hpv1、hpv2)或粘膜表面(例如hpv6、hpv11)，而形成以數(shù)月至數(shù)年為單位存在的良性腫瘤(疣)。

此外，所述hpv中有15種分型(例如hpv16、hpv18、hpv31、hpv33、hpv52、hpv58等)通過長期感染粘膜，而引發(fā)惡性腫瘤，因此被稱為高危型hpv。

關(guān)于作為女性特有癌的患病率僅次于乳腺癌的宮頸癌，幾乎100％的宮頸癌是因所述hpv長期感染生殖器而發(fā)病，全世界每年報告有53萬名新增患者，日本每年報告有1萬5千名新增患者。

因?qū)m頸癌導(dǎo)致的一年的死亡人數(shù)在全世界達(dá)到27萬人，在日本達(dá)到3,500人。

理論上，只要能夠?qū)⑺鰄pv的全部感染防范于未然，則可以完全根除所述宮頸癌。

已明確所述hpv的感染除所述宮頸癌以外，還關(guān)系到外陰癌、肛門癌、口腔癌、陰道癌、陰莖癌、咽喉癌、以及尖銳濕疣(生殖器疣)，為了預(yù)防這些癌及性傳播疾病，認(rèn)為有效的是針對所述hpv感染的預(yù)防疫苗。但是，現(xiàn)有的hpv預(yù)防疫苗只能預(yù)防高危型hpv中的2種分型。

所述hpv中，特別是hpv16與hpv18在日本女性的所述宮頸癌的發(fā)病原因中約占65％，尤其對于20～30歲的女性而言hpv16與hpv18在宮頸癌的發(fā)病原因中約占90％。

已知所述hpv16與所述hpv18在被視為所述外陰癌前期病變的外陰上皮內(nèi)瘤變的高度病變中也占據(jù)將近50％的發(fā)病原因，還與有可能發(fā)展為所述陰道癌的陰道上皮內(nèi)瘤變的85％的發(fā)病有關(guān)。

因所述hpv感染導(dǎo)致的所述宮頸癌的癌前病變、即宮頸上皮內(nèi)瘤變(cin，cervicalintraepithelialneoplasia)發(fā)生在子宮陰道部(宮頸部的下半部分、突出至陰道的部分)的粘膜上皮。hpv感染癥是因性行為引起的微細(xì)損傷導(dǎo)致hpv侵入粘膜上皮(復(fù)層扁平上皮)的基底細(xì)胞，而在扁平上皮內(nèi)進(jìn)行病毒增殖的病毒感染癥。如果hpv在上皮內(nèi)長期持續(xù)增殖，則上皮細(xì)胞產(chǎn)生永生化、癌化。認(rèn)為這是宮頸癌的起源。

在所述宮頸癌的產(chǎn)生過程中，如果所述hpv在基底細(xì)胞中持續(xù)增殖，則認(rèn)為會產(chǎn)生如下變化：一部分hpv的病毒基因被插入至上皮細(xì)胞基因，而使低水平的e6蛋白質(zhì)與e7蛋白質(zhì)的表達(dá)持續(xù)亢進(jìn)。

所述e6蛋白質(zhì)與所述e7蛋白質(zhì)的表達(dá)在作為病毒感染像的cin1(輕度非典型增生)中非常低，相對于此，在已形成腫瘤的cin2(中度非典型增生)與cin3(高度非典型增生)中確認(rèn)到高度表達(dá)，因此認(rèn)為所述e6蛋白質(zhì)與所述e7蛋白質(zhì)的表達(dá)的持續(xù)亢進(jìn)是發(fā)生在所述cin2之后。

所述hpv的所述e6蛋白質(zhì)與所述e7蛋白質(zhì)中，特別是所述e7蛋白質(zhì)被認(rèn)為是在針對hpv相關(guān)癌癥的治療用疫苗的開發(fā)中非常有吸引力的標(biāo)靶。其原因在于，e7蛋白質(zhì)在人體內(nèi)的抗原性高。

目前為止，雖然已經(jīng)開發(fā)出若干以所述hpve7蛋白質(zhì)作為抗原的所述治療用疫苗(例如參照非專利文獻(xiàn)1、專利文獻(xiàn)1)，但并未揭示這些治療用疫苗排除患者宮頸部的癌前病變(所述cin)或癌細(xì)胞，強(qiáng)烈期待開發(fā)出實(shí)際具有治療效果的疫苗。

本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，在所述hpv16的所述e7蛋白質(zhì)中將和與所述rb蛋白質(zhì)結(jié)合相關(guān)的第21號asp、第24號cys及第26號glu全部被置換為gly，使所獲得的變異型e7蛋白質(zhì)(序列編號2)在干酪乳酸桿菌(lactobacilluscasei)中進(jìn)行表達(dá)，并通過熱處理而死菌化，并且進(jìn)行干燥、粉末化而獲得疫苗(lace7)，對小鼠口服給藥所獲得的疫苗(lace7)，由此顯示出不僅在脾臟，而且在粘膜中也可以誘導(dǎo)e7特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答(參照非專利文獻(xiàn)2)。

另外，本發(fā)明人等也推進(jìn)研究有關(guān)hpv的e7多肽與具有營養(yǎng)強(qiáng)化作用的中藥的組合作為hpv感染癥治療用口服醫(yī)藥組合物(參照專利文獻(xiàn)2)。

根據(jù)迄今為止本發(fā)明人等的研究，正在開發(fā)起到一定程度臨床效果的疫苗。

然而，所述治療疫苗僅限于從cin3(高度非典型增生)消退為cin2(中度非典型增生)的消退效果，難以實(shí)現(xiàn)正?；榱诉M(jìn)一步提高宮頸部上皮內(nèi)瘤變及早期宮頸癌中的至少任一種疾病的患者的臨床效果而實(shí)現(xiàn)正?；?，強(qiáng)烈要求盡快提供具有更優(yōu)異的粘膜免疫誘導(dǎo)能力的hpv感染癥及hpv相關(guān)腫瘤中的至少任一種疾病的治療用口服醫(yī)藥組合物。

[現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)]

[專利文獻(xiàn)]

專利文獻(xiàn)1：日本專利特表2012-514469號公報

專利文獻(xiàn)2：國際公開第2013/191225號

[非專利文獻(xiàn)]

非專利文獻(xiàn)1：h.pooetal.,intj.cancer,2006,vol.119,pp.1702-1709

非專利文獻(xiàn)2：k.adachietal.,vaccine,2010,vol.28,pp.2810-2817

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

[發(fā)明所要解決的問題]

本發(fā)明的課題在于解決現(xiàn)有的所述各種問題而達(dá)成以下目的。即，本發(fā)明的目的在于提供具有優(yōu)異的粘膜免疫誘導(dǎo)能力的含有乳酸菌的組合物、以及包含所述含有乳酸菌的組合物的hpv感染癥及hpv相關(guān)腫瘤中的至少任一種疾病的治療用口服醫(yī)藥組合物及粘膜免疫誘導(dǎo)劑。

[解決問題的技術(shù)手段]

解決所述問題的技術(shù)手段如下所述。即，

＜1＞一種含有乳酸菌的組合物，其特征在于：其是含有在菌體表面具有來自人乳頭狀瘤病毒(hpv)e7蛋白質(zhì)的多肽的乳酸菌的組合物，并且

所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽的含量為每1×10⁸個乳酸菌菌體0.03μg～1.0μg。

＜2＞一種hpv感染癥及hpv相關(guān)腫瘤中的至少任一種疾病的治療用口服醫(yī)藥組合物，其特征在于：包含所述＜1＞所記載的含有乳酸菌的組合物。

＜3＞一種粘膜免疫誘導(dǎo)劑，其特征在于：包含所述＜1＞所記載的含有乳酸菌的組合物。

[發(fā)明的效果]

根據(jù)本發(fā)明，能夠解決現(xiàn)有的所述各問題，從而達(dá)成所述目的，可以提供具有優(yōu)異的粘膜免疫誘導(dǎo)能力的含有乳酸菌的組合物、以及包含所述含有乳酸菌的組合物的hpv感染癥及hpv相關(guān)腫瘤中的至少任一種疾病的治療用口服醫(yī)藥組合物及粘膜免疫誘導(dǎo)劑。

附圖說明

圖1a是制造例1中的pqe31：：ca＝e7rb的示意圖。

圖1b是表示制造例1的facs分析結(jié)果的圖-1。

圖1c是表示制造例1的facs分析結(jié)果的圖-2。

圖1d是表示通過蛋白質(zhì)印跡(westernblot)法對各種蛋白質(zhì)進(jìn)行確認(rèn)后的結(jié)果的一例的圖。

圖2a是制造例2中的pigm2：：e7rb＝prtp錨定序列的示意圖。

圖2b是表示制造例2的facs分析結(jié)果的圖。

圖3a是表示試驗(yàn)例1的facs分析(測定條件為電壓(voltage)：525)結(jié)果的圖。

圖3b是表示試驗(yàn)例1的facs分析(測定條件為電壓：600)結(jié)果的圖。

圖4是表示試驗(yàn)例2的elispot分析結(jié)果的圖表。

圖5是表示試驗(yàn)例3的elispot分析結(jié)果的圖表。

具體實(shí)施方式

(含有乳酸菌的組合物)

本發(fā)明的含有乳酸菌的組合物至少包含在菌體表面具有來自人乳頭狀瘤病毒(hpv)e7蛋白質(zhì)的多肽的乳酸菌，且根據(jù)需要還包含其他成分。

＜乳酸菌＞

所述乳酸菌沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，優(yōu)選乳酸桿菌(lactobacillus)屬的乳酸菌，就確認(rèn)到1型輔助t細(xì)胞(th1)的誘導(dǎo)能力的方面而言，更優(yōu)選干酪乳酸桿菌(lactobacilluscasei)。所述乳酸菌可以單獨(dú)使用1種，也可以將2種以上并用。

所述含有乳酸菌的組合物也可以含有在菌體表面不具有所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽的乳酸菌，但在菌體表面具有所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽的乳酸菌的含有比率優(yōu)選80％以上，更優(yōu)選90％以上，特別優(yōu)選95％以上。

＜＜來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽＞＞

作為所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽，只要具有抗原性，則沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇。所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽可以單獨(dú)使用1種，也可以將2種以上并用。

所述hpv的分型沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，優(yōu)選屬于癌癥相關(guān)的高危型群的hpv16、hpv18、hpv31、hpv33、hpv35、hpv39、hpv45、hpv51、hpv52、hpv56、hpv58、hpv59、hpv68、hpv73、hpv82、hpv26、hpv53、hpv63，更優(yōu)選hpv16、hpv18，特別優(yōu)選hpv16。所述hpv16的e7蛋白質(zhì)是在以宮頸癌為代表的hpv相關(guān)癌(肛門癌、咽喉癌、陰莖癌、外陰癌、陰道癌等)中進(jìn)行組成型表達(dá)(constitutiveexpression)的癌抗原。

所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽可以是所述hpve7蛋白質(zhì)的全長蛋白質(zhì)，也可以是缺失、置換或添加了1個至多個氨基酸的蛋白質(zhì)。

另外，所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽可以是來自野生型e7蛋白質(zhì)的多肽，也可以是來自變異型e7蛋白質(zhì)的多肽。

所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽中，優(yōu)選將相當(dāng)于hpv16的野生型e7蛋白質(zhì)(序列編號1)中的第21號asp、第24號cys及第26號glu的和e7蛋白質(zhì)與rb蛋白質(zhì)的結(jié)合相關(guān)的氨基酸殘基置換為其他氨基酸殘基的變異型e7蛋白質(zhì)，更優(yōu)選將hpv16的野生型e7蛋白質(zhì)(序列編號1)的第21號asp、第24號cys及第26號glu全部置換為gly的變異型e7蛋白質(zhì)(序列編號2)。

-含量-

作為所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽在菌體表面的含量，只要為每1×10⁸個乳酸菌菌體0.03μg～1.0μg，則沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，優(yōu)選0.03μg～0.3μg，更優(yōu)選0.06μg～0.3μg，特別優(yōu)選0.09μg～0.3μg。如果在所述優(yōu)選的范圍內(nèi)，則能夠發(fā)揮更優(yōu)異的藥理效果(粘膜免疫誘導(dǎo)能力)，在該方面有利。

測定所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽在菌體表面的含量的方法沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，例如可以列舉通過使用對hpve7蛋白質(zhì)具有特異性的抗體的流式細(xì)胞儀(flowcytometer)(facs(fluorescenceactivatedcellsorting，熒光激活細(xì)胞分選))進(jìn)行測定的方法等。

在利用所述facs進(jìn)行測定的方法中，通過在與所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽在菌體表面的含量已知的樣品相同的條件下進(jìn)行測定，能夠測定所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽在菌體表面的含量未知的樣品含量。

＜＜形態(tài)＞＞

所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽可以是結(jié)合在乳酸菌的菌體表面的多肽(以下有時稱為“e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌”)，也可以是在乳酸菌的菌體表面被表達(dá)的多肽(以下有時稱為“e7蛋白質(zhì)表達(dá)型乳酸菌”)。另外，也可以是將兩者組合而成的形態(tài)。

另外，所述乳酸菌可以是活菌，也可以是死菌。

制成所述死菌的方法沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，例如可以列舉利用高壓釜在80℃下加熱處理5分鐘的方法等。

-e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌-

所述e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌可以通過如下方式進(jìn)行制造：使通過使用轉(zhuǎn)化細(xì)菌的基因重組方法或化學(xué)合成方法等所制造的所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽結(jié)合在乳酸菌的菌體表面。

關(guān)于所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽，就成本等方面而言，優(yōu)選為使用轉(zhuǎn)化細(xì)菌的基因重組方法。

用作所述基因重組方法的宿主的細(xì)菌沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行選擇，例如可以列舉：酵母、大腸桿菌、枯草桿菌、乳酸菌等。

作為適于所述細(xì)菌中所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽的表達(dá)的表達(dá)載體，沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，例如可以列舉pqe31等。

所述轉(zhuǎn)化的方法沒有特別限制，可以適當(dāng)選擇公知方法。

由所述轉(zhuǎn)化菌生產(chǎn)的所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽可以適當(dāng)選擇公知方法進(jìn)行精制。

作為使所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽結(jié)合在所述乳酸菌的菌體表面的方法，沒有特別限制，可以適當(dāng)選擇共價鍵結(jié)合、電性結(jié)合等公知方法，優(yōu)選經(jīng)由錨定蛋白質(zhì)電性結(jié)合在所述乳酸菌的菌體表面的方法。

所述錨定蛋白質(zhì)沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，例如可以列舉來自acma的作為細(xì)胞壁結(jié)合蛋白的ca等，該acma是乳酸乳球菌(lactococcuslactis)的肽聚糖水解酶。

在經(jīng)由所述錨定蛋白質(zhì)將所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽結(jié)合在所述乳酸菌的菌體表面的情況下，所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽優(yōu)選設(shè)為與所述錨定蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)。

所述融合蛋白質(zhì)中的所述錨定蛋白質(zhì)與所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽的順序沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，優(yōu)選依序融合所述錨定蛋白質(zhì)與所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽的形態(tài)。作為所述優(yōu)選形態(tài)的具體例，可以列舉序列編號3所表示的序列。

所述電性結(jié)合(以下有時稱為“固定化”)的方法沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，例如可以列舉對所述乳酸菌添加包含所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽的溶液并進(jìn)行混合的方法等。

所述混合時間沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，例如可以列舉1小時左右等。

所述電性結(jié)合的方法中，也可以進(jìn)行預(yù)處理。

所述預(yù)處理沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，例如可以列舉加熱處理等。通過所述加熱處理，使所述乳酸菌成為死菌。

所述加熱處理的條件沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，例如可以列舉在100℃下加熱30分鐘等。

所述加熱處理可以在使所述乳酸菌懸浮在三氯乙酸(tca，trichloroaceticacid)的狀態(tài)下進(jìn)行，也可在使所述乳酸菌懸浮在pbs(phosphatebuffersaline，磷酸鹽緩沖生理鹽水)的狀態(tài)下進(jìn)行。

-e7蛋白質(zhì)表達(dá)型乳酸菌-

所述e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌可以通過對如下乳酸菌進(jìn)行培養(yǎng)而制造，該乳酸菌是使用包含編碼所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽的核酸的表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化而成。

所述表達(dá)載體沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，例如可以列舉pigm2等。所述pigm2在短乳酸桿菌(lactobacillusbrevis)atcc1559的s-層蛋白質(zhì)的啟動子序列的下游具有短乳酸桿菌atcc1559的prtp基因的分泌信號，且在這些序列的下游具有來自干酪乳酸桿菌的錨定基因(干酪乳酸桿菌的蛋白酶序列(proteinasesequenceofl.casei))。

作為所述表達(dá)載體的其他例，可以列舉：包含repe變異基因、來自乳酸菌的醛縮酶啟動子(aldolasepromoter，pald)以及選自由pgsb、pgsc及pgsa所組成的族群中的聚谷氨酸合成酶復(fù)合體基因的載體(參照日本專利特表2012-514468號公報、日本專利特表2012-514469號公報)等。

所述轉(zhuǎn)化的方法沒有特別限制，可以適當(dāng)選擇公知的方法。

在設(shè)為所述e7蛋白質(zhì)表達(dá)型乳酸菌的情況下，編碼所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽的核酸優(yōu)選設(shè)為與錨定基因結(jié)合的核酸。

所述錨定基因沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，優(yōu)選來自干酪乳酸桿菌的錨定基因(干酪乳酸桿菌的蛋白酶序列(proteinasesequenceofl.casei))。

編碼所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽的核酸與所述錨定基因的順序沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，優(yōu)選依序結(jié)合編碼所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽的核酸與所述錨定基因的形態(tài)。作為所述優(yōu)選形態(tài)的具體例，可以列舉序列編號4所表示的序列。

所述e7蛋白質(zhì)表達(dá)型乳酸菌所使用的乳酸菌沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，優(yōu)選干酪乳酸桿菌igm393株、干酪乳酸桿菌igm394株。所述干酪乳酸桿菌igm394株是所述干酪乳酸桿菌igm393株的繼代衍生株，是轉(zhuǎn)化效率高的變異株。所述干酪乳酸桿菌igm393株及干酪乳酸桿菌igm394株在干酪乳酸桿菌bl23株的全基因組序列中同源性最高。

所述e7蛋白質(zhì)表達(dá)型乳酸菌的培養(yǎng)方法沒有特別限制，可以適當(dāng)選擇公知的方法。

作為將所述e7蛋白質(zhì)表達(dá)型乳酸菌中的所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽在菌體表面的表達(dá)量加以調(diào)節(jié)的方法，沒有特別限制?？梢愿鶕?jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，例如可以列舉調(diào)整培養(yǎng)液的ph值的方法等。

如下述制造例2所示，通過使用改變碳酸氫鈉的濃度而調(diào)整了培養(yǎng)液的ph值的培養(yǎng)液，可以調(diào)節(jié)所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽在菌體表面的表達(dá)量。

所述培養(yǎng)液的ph值有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，ph值優(yōu)選7左右。

在所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽為與所述錨定蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的情況下，所述融合蛋白質(zhì)在菌體表面的含量沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，每1×10⁸個乳酸菌菌體，優(yōu)選0.1μg～3.3μg，更優(yōu)選0.1μg～1.0μg，進(jìn)而優(yōu)選0.2μg～1.0μg，特別優(yōu)選0.3μg～1.0μg。如果在所述優(yōu)選的范圍內(nèi)，則可以發(fā)揮更優(yōu)異的藥理效果(粘膜免疫誘導(dǎo)能力)，在該方面有利。

＜其他成分＞

作為所述含有乳酸菌的組合物中的其他成分，只要無損本發(fā)明的效果則沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，例如可以列舉醫(yī)藥上允許的載體等。這些可以單獨(dú)使用1種，也可以將2種以上并用。

所述含有乳酸菌的組合物中的其他成分的含量沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇。

(hpv感染癥及hpv相關(guān)腫瘤中的至少任一種疾病的治療用口服醫(yī)藥組合物)

本發(fā)明的hpv感染癥及hpv相關(guān)腫瘤中的至少任一種疾病的治療用口服醫(yī)藥組合物至少包含含有乳酸菌的組合物，根據(jù)需要還可以包含其他成分。

＜含有乳酸菌的組合物＞

所述含有乳酸菌的組合物為上述的本發(fā)明的含有乳酸菌的組合物。

所述含有乳酸菌的組合物在所述hpv感染癥及hpv相關(guān)腫瘤中的至少任一種疾病的治療用口服醫(yī)藥組合物中的含量沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇。

＜其他成分＞

所述hpv感染癥及hpv相關(guān)腫瘤中的至少任一種疾病的治療用口服醫(yī)藥組合物中的其他成分沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，例如可以列舉具有營養(yǎng)強(qiáng)化作用(免疫增強(qiáng)作用)的中藥、粘膜佐劑、醫(yī)藥上允許的載體等。這些可以單獨(dú)使用1種，也可以將2種以上并用。

-具有營養(yǎng)強(qiáng)化作用(免疫增強(qiáng)作用)的中藥-

所述具有營養(yǎng)強(qiáng)化作用(免疫增強(qiáng)作用)的中藥沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，例如可以列舉：葛根湯、十全大補(bǔ)湯、補(bǔ)中益氣湯、小柴胡湯、小青龍湯等。這些可以單獨(dú)使用1種，也可以將2種以上并用。

-粘膜佐劑-

所述粘膜佐劑沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，例如優(yōu)選與所述具有營養(yǎng)強(qiáng)化作用(免疫增強(qiáng)作用)的中藥配合來進(jìn)一步增強(qiáng)所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽等口服疫苗的特異性體液性免疫和細(xì)胞性免疫的粘膜佐劑。

作為所述粘膜佐劑的例子，可以列舉：來自細(xì)菌毒素的佐劑、合成神經(jīng)酰胺(αgalcer)、cpg寡核苷酸、sp-c(表面活性劑)、sp-b、ifn-α(野生型或變異型)、雙鏈rna、活性擴(kuò)增型tnf(tumornecrosisfactor，腫瘤壞死因子)變異體等。這些可以單獨(dú)使用1種，也可以將2種以上并用。

所述來自細(xì)菌毒素的佐劑沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，例如可以列舉：來自霍亂毒素(ct，choleratoxin)的多肽、來自大腸桿菌不耐熱毒素(lt，heatlabileenterotoxin)的多肽、來自vero毒素(vt)的多肽、來自白喉毒素(dt，diphtheriatoxin)的多肽、來自百日咳毒素(pt，pertussistoxin)的多肽等。

所述來自細(xì)菌毒素的佐劑可以是來自野生型細(xì)菌毒素的佐劑，也可以是來自變異型細(xì)菌毒素的佐劑，優(yōu)選來自如下變異型細(xì)菌毒素的佐劑，該變異型細(xì)菌毒素為了防止在口服給藥人時產(chǎn)生嚴(yán)重副作用而預(yù)先導(dǎo)入有變異。

-醫(yī)藥上允許的載體-

所述醫(yī)藥上允許的載體沒有特別限制，可以根據(jù)劑型適當(dāng)選擇公知的載體。

作為所述hpv感染癥及hpv相關(guān)腫瘤中的至少任一種疾病的治療用口服醫(yī)藥組合物中的其他成分的含量，沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇。

＜使用＞

所述hpv感染癥及hpv相關(guān)腫瘤中的至少任一種疾病的治療用口服醫(yī)藥組合物可以單獨(dú)使用，也可以與以其他成分作為有效成分的醫(yī)藥并用。另外，所述hpv感染癥及hpv相關(guān)腫瘤中的至少任一種疾病的治療用口服醫(yī)藥組合物可以在調(diào)配到以其他成分作為有效成分的醫(yī)藥中的狀態(tài)下使用。

＜劑型＞

所述hpv感染癥及hpv相關(guān)腫瘤中的至少任一種疾病的治療用口服醫(yī)藥組合物的劑型只要為能夠口服給藥的劑型，則沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，例如可以列舉口服固體制劑(片劑、包衣片劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑等)、口服液劑(內(nèi)服液劑、糖漿劑、酏劑等)等。這些劑型的所述hpv感染癥及hpv相關(guān)腫瘤中的至少任一種疾病的治療用口服醫(yī)藥組合物可以依據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行制造。

＜給藥＞

所述hpv感染癥及hpv相關(guān)腫瘤中的至少任一種疾病的治療用口服醫(yī)藥組合物的給藥量、給藥時期、及給藥對象沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇。

所述給藥量沒有特別限制，可以考慮給藥對象個體的年齡、體重、體質(zhì)、癥狀、是否已給藥以其他成分作為有效成分的醫(yī)藥或藥劑等各種因素而適當(dāng)選擇。

所述給藥對象可以適宜地列舉人。

所述hpv相關(guān)腫瘤沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，例如可以列舉：宮頸癌、外陰癌、肛門癌、口腔癌、陰道癌、陰莖癌、咽喉癌、及該等癌的癌前病變等。

所述hpv感染癥及hpv相關(guān)腫瘤中的至少任一種疾病的治療用口服醫(yī)藥組合物可以適宜地用于宮頸部上皮內(nèi)瘤變及早期宮頸癌中的至少任一種疾病的治療用途。

所述早期宮頸癌包括微小型浸潤癌的狀態(tài)。

所述hpv感染癥及hpv相關(guān)腫瘤中的至少任一種疾病的治療用口服醫(yī)藥組合物適于通過對hpv感染癥的患者給藥，而用作其治療用疫苗。

(治療hpv感染癥及hpv相關(guān)腫瘤中的至少任一種疾病的方法)

所述hpv感染癥及hpv相關(guān)腫瘤中的至少任一種疾病的治療用口服醫(yī)藥組合物可以通過對個體口服給藥而治療個體的hpv感染癥及hpv相關(guān)腫瘤中的至少任一種疾病。因此，本發(fā)明也涉及一種治療hpv感染癥及hpv相關(guān)腫瘤中的至少任一種疾病的方法，其特征在于：對個體口服給藥所述hpv感染癥及hpv相關(guān)腫瘤中的至少任一種疾病的治療用口服醫(yī)藥組合物。

(粘膜免疫誘導(dǎo)劑)

本發(fā)明的粘膜免疫誘導(dǎo)劑至少包含含有乳酸菌的組合物，根據(jù)需要還包含其他成分。

＜含有乳酸菌的組合物＞

所述含有乳酸菌的組合物是上述的本發(fā)明的含有乳酸菌的組合物。

所述含有乳酸菌的組合物在所述粘膜免疫誘導(dǎo)劑中的含量沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇。

＜其他成分＞

所述粘膜免疫誘導(dǎo)劑中的其他成分沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，例如可以設(shè)為與所述hpv感染癥及hpv相關(guān)腫瘤中的至少任一種疾病的治療用口服醫(yī)藥組合物的其他成分的項(xiàng)目中所記載的成分相同。

所述粘膜免疫誘導(dǎo)劑中的其他成分的含量沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇。

＜使用＞

所述粘膜免疫誘導(dǎo)劑可以單獨(dú)使用，也可以與以其他成分作為有效成分的醫(yī)藥并用。另外，所述粘膜免疫誘導(dǎo)劑也可以在調(diào)配到以其他成分作為有效成分的醫(yī)藥中的狀態(tài)下使用。

＜劑型＞

所述粘膜免疫誘導(dǎo)劑的劑型只要能夠口服給藥，則沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇，例如可以列舉：口服固體制劑(片劑、包衣片劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑等)、口服液劑(內(nèi)服液劑、糖漿劑、酏劑等)等。這些劑型的所述粘膜免疫誘導(dǎo)劑可以根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行制造。

＜給藥＞

所述粘膜免疫誘導(dǎo)劑的給藥量、給藥時期、及給藥對象沒有特別限制，可以根據(jù)目的進(jìn)行適當(dāng)選擇。

所述給藥量沒有特別限制，可以考慮給藥對象個體的年齡、體重、體質(zhì)、癥狀、是否已給藥以其他成分作為有效成分的醫(yī)藥或藥劑等各種因素而適當(dāng)選擇。

所述給藥對象可以適宜地列舉人。

所述粘膜免疫誘導(dǎo)劑可以誘導(dǎo)粘膜上的hpve7蛋白質(zhì)特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。

(誘導(dǎo)粘膜免疫的方法)

所述粘膜免疫誘導(dǎo)劑通過對個體口服給藥，能夠誘導(dǎo)個體的粘膜免疫。因此，本發(fā)明也涉及一種誘導(dǎo)粘膜免疫的方法，其特征在于：對個體口服給藥所述粘膜免疫誘導(dǎo)劑。

實(shí)施例

以下，說明本發(fā)明的制造例及試驗(yàn)例，但本發(fā)明不受這些制造例及試驗(yàn)例的任何限定。

(比較制造例1：公知的lace7制劑的制造)

依據(jù)pooh.etal.,int.j.immunol.,2006,vol.119,pp.1,702-1,709中所記載的方法，制造作為公知制劑的lace7制劑。

簡言之，使用表達(dá)載體，將來自hpv16的變異型e7蛋白質(zhì)(由序列編號2所表示的氨基酸序列構(gòu)成的將與野生型e7蛋白質(zhì)與rb蛋白質(zhì)結(jié)合相關(guān)的第21號asp、第24號cys及第26號glu全部置換為gly的變異型e7蛋白質(zhì))導(dǎo)入至確認(rèn)有1型輔助t細(xì)胞(th1細(xì)胞)的誘導(dǎo)能力的干酪乳酸桿菌。利用熱使培養(yǎng)后的重組體(lace7)成為死菌。用蒸餾水將從培養(yǎng)基精制而獲得的lace7清洗數(shù)次，然后進(jìn)行干燥、粉體化(lace7制劑)，在使用之前保存在4℃下。所述lace7制劑不溶于水性溶劑。

(制造例1：變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌的制造)

通過如下方式制造變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌，其是在乳酸菌的菌體表面結(jié)合有作為來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽的變異型e7蛋白質(zhì)(序列編號2)。

＜變異型e7蛋白質(zhì)的制作＞

-插入了ca與變異型e7蛋白質(zhì)的融合序列的蛋白質(zhì)表達(dá)用質(zhì)粒的構(gòu)建-

所述ca是錨定蛋白質(zhì)，且用作將所述變異型e7蛋白質(zhì)固定在乳酸菌的菌體表面的工具。所述ca可以通過電荷與特定的模體而固定在陽性菌肽聚糖上，并且是來自乳酸乳球菌的肽聚糖水解酶acma的細(xì)胞壁結(jié)合蛋白(tjibbebosma,rolfkanninga,jolandaneef,sandrinea.l.audouy,maartenl.vanroosmalen,antonsteen,girbebuist,jankok,oscarp.kuipers,georgerobillard,andkeesleenhouts(2006)novelsurfacedisplaysystemforproteinsonnon-geneticallymodifiedgram-positivebacteria.appl.environ.microbiol.p.880-889)。

通過常規(guī)方法，將所述ca與變異型e7蛋白質(zhì)的融合序列(參照序列編號3)插入到作為載體質(zhì)粒的pqe31(以下有時稱為“pqe31：：ca＝e7rb”，參照圖1a)。

-轉(zhuǎn)化-

作為表達(dá)所述ca與變異型e7蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的宿主，使用clearcoli(注冊商標(biāo))(大腸桿菌bl21de3lps改型株，lucigen)。

首先，為了導(dǎo)入prep4(invitrogen)，通過電穿孔法進(jìn)行clearcoli(注冊商標(biāo))的轉(zhuǎn)化。

接著，通過氯化鈣法將pqe31：：ca＝e7rb導(dǎo)入轉(zhuǎn)化體中，獲得了表達(dá)所述ca與變異型e7蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)的大腸桿菌(以下有時稱為“clearcoli(注冊商標(biāo))pqe31：：ca＝e7rb,prep4”)。

-融合蛋白質(zhì)的表達(dá)及精制-

在包含氨芐西林(最終濃度100μg/ml)及卡那霉素(最終濃度25μg/ml)的luria-bertani(lb)液體培養(yǎng)基(difco實(shí)驗(yàn)室公司(difcolaboratories))中接種一白金環(huán)的所述菌體，在37℃下振蕩培養(yǎng)一夜。

對所述培養(yǎng)物進(jìn)行集菌并清洗后，利用與培養(yǎng)時相同量的pbs進(jìn)行定容，以成為包含氨芐西林(最終濃度100μg/ml)及卡那霉素(最終濃度25μg/ml)的主培養(yǎng)用lb液體培養(yǎng)基的1/20量的方式進(jìn)行接種。

主培養(yǎng)是在37℃下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，當(dāng)o.d.600達(dá)到0.5時以最終濃度成為1mm的方式添加iptg(isopropylthiogalactoside，異丙基硫代半乳糖苷)，在37℃下振蕩培養(yǎng)4小時，進(jìn)行所述融合蛋白質(zhì)的表達(dá)誘導(dǎo)。

對所述誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液進(jìn)行集菌，對每1g菌體添加5ml的裂解緩沖液(lysisbuffer)(100mm的nah2po4、10mm的tris-cl(三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液)、8m尿素(urea)、ph值8)，在室溫下平穩(wěn)地攪拌1小時。在4℃下以10,000×g離心分離30分鐘，并回收上清液。

在室溫下，對所回收的上清液4ml以40分鐘平穩(wěn)地混合利用裂解緩沖液進(jìn)行過平衡化的talon(注冊商標(biāo))金屬親和性樹脂(metalaffinityresin)1ml(clontech)。將上清液與樹脂的混合液移至聚丙烯柱(polypropylenecolumns)(qiagen)并去除上清液。利用4ml的清洗緩沖液(washbuffer)(100mm的nah2po4、10mm的tris-cl、8m尿素(urea)、ph值6.3)清洗2次，并利用洗脫緩沖液(elutionbuffer)1(100mm的nah2po4、10mm的tris-cl、8m尿素(urea)、150mm咪唑(imidazole)、ph值5.9)及洗脫緩沖液(elutionbuffer)2(100mm的nah2po4、10mm的tris-cl、8m尿素(urea)、300mm咪唑(imidazole)、ph值4.5)使his標(biāo)簽融合蛋白質(zhì)溶出。

所回收的蛋白質(zhì)溶液是通過透析進(jìn)行脫鹽，并通過使用ultracel(注冊商標(biāo))-10k(merkmillipore)的超濾進(jìn)行濃縮。

濃縮后的蛋白質(zhì)溶液在利用quickstart^tmbradfordproteinassay(bradford蛋白濃度測定)(bio-rad)測定濃度后，在使用之前保存在-80℃下。

-通過蛋白質(zhì)印跡法而確認(rèn)融合蛋白質(zhì)-

在所述-融合蛋白質(zhì)的表達(dá)及精制-中的主培養(yǎng)過程中，添加iptg，將在37℃下振蕩培養(yǎng)4小時后的培養(yǎng)液以10,000×g離心3分鐘，并進(jìn)行集菌。棄去上清液，使顆粒懸浮在100ml的1×sds-page(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)樣品緩沖液中。將所述懸浮的懸浮液在100℃下加熱5分鐘。

對加熱后的懸浮液利用sds-page進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)印到pvdf膜(edmmillipore)上。

將所述轉(zhuǎn)印后的膜于室溫下在一級抗體溶液(含1％bsa、0.05％tween20的pbs(-)，小鼠抗hisigg(anti-his-tagmab，醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所股份有限公司)(1：2,000))中培養(yǎng)1小時。

然后，將所述膜利用pbst清洗2次。

接著，于室溫下在二級抗體溶液(含1％bsa、0.05％tween20的pbs(-)，山羊抗小鼠igghrp(anti-mouseigg(完整分子(wholemoledule))-山羊過氧化物酶抗體(peroxidaseantibodyproducedingoat)、西格瑪奧德里奇(sigma-aldrich)公司)(1：10,000))中培養(yǎng)1小時。

然后，將所述膜利用pbst清洗2次。

接著，使用eclplus(ge醫(yī)療生命科學(xué)(gehealthcarelifescience))，利用chemidoc(bio-rad實(shí)驗(yàn)室公司(bio-radlaboratories))檢測條帶，而確認(rèn)到目標(biāo)融合蛋白質(zhì)的表達(dá)。

＜向乳酸菌菌體表面的結(jié)合＞

所述ca與變異型e7蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)在乳酸菌的菌體表面的結(jié)合(以下也有時稱為“固定化”)是參考tjibbebosma,rolfkanninga,jolandaneef,sandrinea.l.audouy,maartenl.vanroosmalen,antonsteen,girbebuist,jankok,oscarp.kuipers,georgerobillard,andkeesleenhouts(2006)novelsurfacedisplaysystemforproteinsonnon-geneticallymodifiedgram-positivebacteria.appl.environ.microbiol.p.880–889，通過如下方式進(jìn)行。

-乳酸菌的培養(yǎng)-

作為乳酸菌，使用已作為抗原運(yùn)輸載體確認(rèn)到佐劑效果的干酪乳酸桿菌igm393(kajikawaa,igimis(2010)innateandacquiredimmuneresponsesinducedbyrecombinantlactobacilluscaseidisplayingflagellin-fusionantigenonthecell-surface.vaccine28：3409-3415)。

將所述乳酸菌利用mann-rogosa-sharp(mrs)液體培養(yǎng)基(difco實(shí)驗(yàn)室公司(difcolaboratories))在37℃下靜置培養(yǎng)一夜。對培養(yǎng)液進(jìn)行集菌，利用pbs清洗2次。

-固定化的預(yù)處理-

作為所述固定化的預(yù)處理，準(zhǔn)備“利用三氯乙酸(tca)處理過的所述乳酸菌”(以下有時稱為“有tca處理”)及“利用pbs處理過的所述乳酸菌”(以下有時稱為“無tca處理”)這兩種。

所述利用tca所進(jìn)行的處理是將菌體再懸浮在培養(yǎng)液的0.2倍量的10％tca中，在100℃下加熱30分鐘后，利用pbs清洗3次。

所述利用pbs所進(jìn)行的處理是將菌體再懸浮在培養(yǎng)液的0.2倍量的pbs中，在100℃下加熱30分鐘后，利用pbs清洗3次。

-固定化-

每1.0×10⁸個所述預(yù)處理后的乳酸菌菌體，添加所述融合蛋白質(zhì)1.0μg、0.3μg、0.1μg或0.03μg(分別以所述變異型e7蛋白質(zhì)量計相當(dāng)于0.3μg、0.09μg、0.03μg、或0.009μg)，并在包含所述融合蛋白質(zhì)的pbs溶液中混合1小時。由此，使所述融合蛋白質(zhì)電性結(jié)合在乳酸菌的表面。

所述混合后，利用pbs清洗3次，并保存在-80℃下。

通過以上方式，獲得了下述變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌。

(1)每1.0×10⁸個乳酸菌菌體，結(jié)合有0.3μg所述變異型e7蛋白質(zhì)的變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌(有tca處理)。

(2)每1.0×10⁸個乳酸菌菌體，結(jié)合有0.09μg所述變異型e7蛋白質(zhì)的變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌(有tca處理)。

(3)每1.0×10⁸個乳酸菌菌體，結(jié)合有0.03μg所述變異型e7蛋白質(zhì)的變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌(有tca處理)。

(4)每1.0×10⁸個乳酸菌菌體，結(jié)合有0.009μg所述變異型e7蛋白質(zhì)的變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌(有tca處理)。

(5)每1.0×10⁸個乳酸菌菌體，結(jié)合有0.3μg所述變異型e7蛋白質(zhì)的變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌(無tca處理)。

(6)每1.0×10⁸個乳酸菌菌體，結(jié)合有0.09μg所述變異型e7蛋白質(zhì)的變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌(無tca處理)。

(7)每1.0×10⁸個乳酸菌菌體，結(jié)合有0.03μg所述變異型e7蛋白質(zhì)的變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌(無tca處理)。

(8)每1.0×10⁸個乳酸菌菌體，結(jié)合有0.009μg所述變異型e7蛋白質(zhì)的變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌(無tca處理)。

＜facs分析＞

針對所述(1)～(8)的變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌，使用對hpve7蛋白質(zhì)具有特異性的抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后利用流式細(xì)胞儀(facs，bd公司制造)確認(rèn)到固定化。

具體而言，將所述變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌在0.5ml的一級抗體溶液(含1％bsa、0.05％tween20的pbs(-)，抗hpv16e7小鼠igg(hpv16型e7蛋白質(zhì)抗體(proteinantibody)[289-17013(tvg-701y)]，genetex公司)(1：1000))中進(jìn)行倒置混合(室溫、60分鐘)。然后，進(jìn)行離心(15,000×g，3分鐘)后，利用pbs(-)清洗2次。接著，一邊進(jìn)行遮光，一邊在0.5ml的二級抗體溶液(含1％bsa、0.05％tween20的pbs(-)，抗小鼠iggalexafluor488(alexafluor(r)488山羊抗小鼠igg(h+l)，美國生命技術(shù)公司(lifetechnologies))(1：500))中進(jìn)行倒置混合(室溫、60分鐘)。然后，進(jìn)行離心(15,000×g，3分鐘)后，利用pbs(-)清洗2次。

然后，利用pbs(-)定容至0.6ml，并利用facs檢測熒光。

此外，使用除不使用所述融合蛋白質(zhì)以外經(jīng)過相同操作的乳酸菌作為陰性對照。

將結(jié)果示于圖1b及圖1c。

圖1b中，“n”表示陰性對照的結(jié)果，“(1)”表示每1.0×10⁸個乳酸菌菌體結(jié)合有0.3μg所述變異型e7蛋白質(zhì)的變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌(有tca處理)的結(jié)果，“(2)”表示每1.0×10⁸個乳酸菌菌體結(jié)合有0.09μg所述變異型e7蛋白質(zhì)的變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌(有tca處理)的結(jié)果，“(3)”表示每1.0×10⁸個乳酸菌菌體結(jié)合有0.03μg所述變異型e7蛋白質(zhì)的變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌(有tca處理)的結(jié)果，“(4)”表示每1.0×10⁸個乳酸菌菌體結(jié)合有0.009μg所述變異型e7蛋白質(zhì)的變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌(有tca處理)的結(jié)果。

圖1c中，“n”表示陰性對照的結(jié)果，“(5)”表示每1.0×10⁸乳酸菌個菌體結(jié)合有0.3μg所述變異型e7蛋白質(zhì)的變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌(無tca處理)的結(jié)果，“(6)”表示每1.0×10⁸個乳酸菌菌體結(jié)合有0.09μg所述變異型e7蛋白質(zhì)的變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌(無tca處理)的結(jié)果，“(7)”表示每1.0×10⁸個乳酸菌菌體結(jié)合有0.03μg所述變異型e7蛋白質(zhì)的變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌(無tca處理)的結(jié)果，“(8)”表示每1.0×10⁸個乳酸菌菌體結(jié)合有0.009μg所述變異型e7蛋白質(zhì)的變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌(無tca處理)的結(jié)果。

由圖1b及圖1c的結(jié)果顯示出，隨著變異型e7蛋白質(zhì)的量增加，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。

此外，也得知在將所述變異型e7蛋白質(zhì)的量設(shè)為每1.0×10⁸個乳酸菌菌體0.9μg的情況下，結(jié)果與每1.0×10⁸個乳酸菌菌體0.3μg的情況相同，能夠結(jié)合在乳酸菌的菌體表面的所述變異型e7蛋白質(zhì)的量在0.3μg左右達(dá)到飽和。

此外，圖1d中表示通過蛋白質(zhì)印跡法對以下的蛋白質(zhì)進(jìn)行了確認(rèn)的一例。

[蛋白質(zhì)]

·帶有his標(biāo)簽的ca與變異型e7蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)(48kda)

·帶有his標(biāo)簽的ca(33kda)

·帶有his標(biāo)簽的變異型e7蛋白質(zhì)(15kda)

圖1d中，“1”表示“帶有his標(biāo)簽的ca與變異型e7蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)”的結(jié)果，“2”表示“帶有his標(biāo)簽的ca”的結(jié)果，“3”及“5”表示“由誘導(dǎo)帶有his標(biāo)簽的ca表達(dá)前的大腸桿菌所制備的樣品”的結(jié)果，“4”及“6”表示“由誘導(dǎo)帶有his標(biāo)簽的ca表達(dá)后的大腸桿菌所制備的樣品”的結(jié)果，“7”表示“帶有his標(biāo)簽的變異型e7蛋白質(zhì)”的結(jié)果，“8”及“10”表示“由誘導(dǎo)帶有his標(biāo)簽的變異型e7蛋白質(zhì)表達(dá)前的大腸桿菌所制備的樣品”的結(jié)果，“9”及“11”表示“由誘導(dǎo)帶有his標(biāo)簽的變異型e7蛋白質(zhì)表達(dá)后的大腸桿菌所制備的樣品”的結(jié)果。

(制造例2：變異型e7蛋白質(zhì)表達(dá)型乳酸菌的制造)

通過如下方式制造在乳酸菌的菌體表面表達(dá)了作為來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽的變異型e7蛋白質(zhì)(序列編號2)的變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌。

作為載體質(zhì)粒，使用pigm2(kajikawaakinobu,eikoichikawa,andshizunobuigimi(2010)developmentofahighlyefficientprotein-secretingsysteminrecombinantlactobacilluscasei.j.microbiol.biotechnol.,20(2),375-382)，制作插入有如下序列(序列編號4)的載體質(zhì)粒(以下有時稱為“pigm2：：e7rb＝prtp錨定序列”)，該序列(序列編號4)中依序結(jié)合有編碼變異型e7蛋白質(zhì)(序列編號2)的序列與來自干酪乳酸桿菌的錨定基因(干酪乳酸桿菌的蛋白酶序列(proteinasesequenceofl.casei))的序列(參照圖2a)。

去除所述載體質(zhì)粒的終止子序列，通過電穿孔法導(dǎo)入至干酪乳酸桿菌igm394(以下有時稱為“干酪乳酸桿菌igm394[pek7：：e7rb]”)。

另外，作為陰性對照，使用未插入如下序列(序列編號4)的載體質(zhì)粒，除此以外以相同的方式制作將載體質(zhì)粒導(dǎo)入至干酪乳酸桿菌igm394的株(以下有時稱為“l(fā).caseiigm394[plpempty]”)，該序列(序列編號4)中依序結(jié)合有編碼變異型e7蛋白質(zhì)(序列編號2)的序列與來自干酪乳酸桿菌的錨定基因(干酪乳酸桿菌的蛋白酶序列(proteinasesequenceofl.casei))的序列。

將所述乳酸菌接種到向mann-rogosa-sharp(difco實(shí)驗(yàn)室公司)中添加有5μg/ml的em的液體培養(yǎng)基(mrse)中，在37℃下培養(yǎng)一夜(約14小時)。對培養(yǎng)液進(jìn)行集菌(5,000g×10分鐘)，利用pbs清洗1次(5,000g×10分鐘)。添加pbs，將細(xì)胞懸浮液濃度調(diào)整為1×10⁹cfu/ml。

向1l的mrse((i)未添加nahco3、ph值6.4，(ii)添加10mm的nahco3、ph值6.8，或(iii)添加25mm的nahco3、ph值7.1)中接種10％所述調(diào)整的細(xì)胞懸浮液(1×10⁸cfu/ml)，在37℃下一邊平穩(wěn)攪拌約5小時一邊在厭氧條件下(使用anaeropack)進(jìn)行培養(yǎng)。

此外，陰性對照的乳酸菌是使用(i)未添加nahco3的mrse進(jìn)行培養(yǎng)。

對培養(yǎng)液進(jìn)行集菌(5,000g×10分鐘)，利用pbs清洗1次(5,000g×10分鐘)。添加pbs30ml，將細(xì)胞懸浮液濃度調(diào)整為最終濃度7.5×10⁹cells/ml(od≈7.5)。此外，使用血球計算出乳酸菌數(shù)。

將所述細(xì)胞懸浮液在高壓釜中在80℃下加熱處理5分鐘，使之成為死菌。

另外，將未進(jìn)行所述加熱處理的細(xì)胞懸浮液設(shè)為活菌樣品。

通過以上方式，獲得了下述變異型e7蛋白質(zhì)表達(dá)型乳酸菌。

(i-1)由未添加nahco3的mrse(ph值6.4)進(jìn)行培養(yǎng)并設(shè)為死菌的變異型e7蛋白質(zhì)表達(dá)型乳酸菌。

(i-2)由未添加nahco3的mrse(ph值6.4)進(jìn)行培養(yǎng)并設(shè)為活菌的變異型e7蛋白質(zhì)表達(dá)型乳酸菌。

(ii-1)由添加了10mmnahco3的mrse(ph值6.8)培養(yǎng)并設(shè)為死菌的變異型e7蛋白質(zhì)表達(dá)型乳酸菌。

(ii-2)由添加了10mmnahco3的mrse(ph值6.8)培養(yǎng)并設(shè)為活菌的變異型e7蛋白質(zhì)表達(dá)型乳酸菌。

(iii-1)由添加了25mmnahco3的mrse(ph值7.1)培養(yǎng)并設(shè)為死菌的變異型e7蛋白質(zhì)表達(dá)型乳酸菌。

(iii-2)由添加了25mmnahco3的mrse(ph值7.1)培養(yǎng)并設(shè)為活菌的變異型e7蛋白質(zhì)表達(dá)型乳酸菌。

＜facs分析＞

針對所述(i-1)、(ii-1)、及(iii-1)的變異型e7蛋白質(zhì)表達(dá)型乳酸菌以及陰性對照的乳酸菌，通過與所述制造例1相同的方式進(jìn)行facs分析，確認(rèn)到每1.0×10⁸個乳酸菌菌體的菌體表面的變異型e7蛋白質(zhì)的表達(dá)程度。將結(jié)果示于圖2b。

圖2b中，“n”表示陰性對照(死菌)的結(jié)果，“(i-1)”表示由未添加nahco3的mrse(ph值6.4)培養(yǎng)并設(shè)為死菌的變異型e7蛋白質(zhì)表達(dá)型乳酸菌的結(jié)果，“(ii-1)”表示由添加了10mm的nahco3的mrse(ph值6.8)培養(yǎng)并設(shè)為死菌的變異型e7蛋白質(zhì)表達(dá)型乳酸菌的結(jié)果，“(iii-1)”表示由添加了25mm的nahco3的mrse(ph值7.1)培養(yǎng)并設(shè)為死菌的變異型e7蛋白質(zhì)表達(dá)型乳酸菌的結(jié)果。

由圖2b的結(jié)果顯示，通過調(diào)整培養(yǎng)液的ph值，能夠調(diào)節(jié)變異型e7蛋白質(zhì)在菌體表面的表達(dá)量。

(試驗(yàn)例1：菌體表面的變異型e7蛋白質(zhì)量的比較)

針對以下的樣品，通過與所述制造例1相同的方式進(jìn)行facs分析，對每1.0×10⁸個乳酸菌菌體的變異型e7蛋白質(zhì)在菌體表面的量進(jìn)行比較。將結(jié)果示于圖3a及圖3b。

＜樣品＞

(i)…所述制造例2中的陰性對照(死菌)。

(ii)…所述比較制造例1中所制造的lace7制劑。

(iii)…所述制造例1中的(3)每1.0×10⁸個乳酸菌菌體結(jié)合有0.03μg所述變異型e7蛋白質(zhì)的變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌(有tca處理)。

(iv)…所述制造例2中的(iii-1)由添加了25mmnahco3的mrse(ph值7.1)培養(yǎng)并設(shè)為死菌的變異型e7蛋白質(zhì)表達(dá)型乳酸菌。

圖3a及圖3b中，“(i)”表示所述樣品(i)的結(jié)果，“(ii)”表示所述樣品(ii)的結(jié)果，“(iii)”表示所述樣品(iii)的結(jié)果，“(iv)”表示所述樣品(iv)的結(jié)果。

由圖3a(測定條件為電壓(voltage)：525)的結(jié)果顯示，對于現(xiàn)有的lace7制劑，表現(xiàn)出變異型e7蛋白質(zhì)在菌體表面的表達(dá)的乳酸菌與未顯示出該表達(dá)的乳酸菌的偏差大。另外，由圖3b(測定條件為電壓(voltage)：600)的結(jié)果顯示，對于現(xiàn)有的lace7制劑，變異型e7蛋白質(zhì)在菌體表面的表達(dá)量低。

另一方面，對于所述制造例2中的(iii-1)由添加了25mmnahco3的mrse(ph值7.1)培養(yǎng)并設(shè)為死菌的變異型e7蛋白質(zhì)表達(dá)型乳酸菌，推測出每1.0×10⁸個乳酸菌菌體的變異型e7蛋白質(zhì)的表達(dá)量為0.3μg左右。

(試驗(yàn)例2：抗hpv粘膜免疫誘導(dǎo)能力試驗(yàn)-1)

使用比較制造例1中所制造的lace7制劑，通過如下方式進(jìn)行抗hpv粘膜免疫誘導(dǎo)能力試驗(yàn)。

＜小鼠的免疫＞

利用lace7制劑對小鼠所進(jìn)行的口服免疫是依據(jù)k.adachietal.,vaccine,2010,vol.28,pp.2810-2817中所記載的方法進(jìn)行。

＜＜對小鼠口服給藥lace7制劑＞＞

通過對6周齡的雌spfc67bl小鼠(cleajapan股份有限公司)口服給藥所述lace7制劑，而進(jìn)行免疫。

對每只小鼠，在第1周、第2周、第4周、及第6周分別給藥0.1mg、0.3mg、或1.0mg的所述lace7制劑，共計給藥4個療程。所有的給藥均使用灌胃管，在禁食3小時后，給藥使所述lace7制劑懸浮在200mlpbs中的懸浮液，1天1次，每周連續(xù)5天。

＜腸的回收＞

在所述lace7制劑的最后一次接種起經(jīng)過1周后(接種開始后的第7周)，對接種過所述lace7制劑的5只小鼠進(jìn)行解剖，并采集腸。對于所述腸，在除去排泄物后，利用10ml加入了蛋白酶抑制劑的hbss將腸道內(nèi)部加以清洗。

＜小鼠的粘膜淋巴球的制備＞

將腸沿縱向切開，在添加了10質(zhì)量％fbs、100units/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的prmi1640(含有10質(zhì)量％滅活胎牛血清、2mml-谷酰胺、1mm丙酮酸鈉、1×非必需氨基酸、50mm的2-巰基乙醇)培養(yǎng)基中，在37℃下劇烈振蕩30分鐘。將回收的細(xì)胞懸浮液利用bdfalcon(商標(biāo))streiner(美國bd生物科學(xué)股份有限公司)去除組織殘屑，接著使用層疊有70質(zhì)量％和40質(zhì)量％的percollplus的15ml試管進(jìn)行不連續(xù)濃度梯度離心。在上面層疊約10⁷個～10⁸個細(xì)胞，在室溫下以600×g離心20分鐘，由此在70質(zhì)量％和40質(zhì)量％的percollplus的界面聚集有粘膜淋巴球(存活率95％)。從各小鼠獲得了約5×10⁶個～10×10⁶個粘膜淋巴球。

＜elispot分析＞

將腸粘膜淋巴球(5×10⁶個細(xì)胞/ml)的懸浮液50μl在37℃下與抗原遞呈細(xì)胞一起培養(yǎng)24小時。

依據(jù)小鼠ifn-γ用elispot試劑盒(mabtecab，瑞典)的廠商協(xié)議，將hpv16的e7蛋白質(zhì)(序列編號1)中被報告為ctl表位的由e7蛋白質(zhì)的第49號至第57號的氨基酸序列構(gòu)成的10μl合成肽(1μg/ml)、分裂素(佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯40ng/ml+離子霉素4μg/ml)、或僅培養(yǎng)基(對照)滴至涂有抗小鼠ifn-γ抗體的96孔培養(yǎng)板(eliip培養(yǎng)板，美國密理博(millipore)股份有限公司)。對96孔培養(yǎng)板上的ifn-γ陽性的點(diǎn)數(shù)進(jìn)行分析。此時，使用kselispot(德國卡爾蔡司光學(xué)(carlzeissvision)公司)的計算機(jī)完全輔助視頻成像分析系統(tǒng)。

＜統(tǒng)計分析＞

以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示elispot分析的數(shù)據(jù)。在免疫組(各組有5只小鼠)間，將這些值或相對值加以比較。此時，進(jìn)行雙側(cè)學(xué)生t-檢驗(yàn)。p值＜0.05時視為顯著差異。

將試驗(yàn)例2的結(jié)果示于圖4。

由圖4明確得知，每10⁶個細(xì)胞的ifn-γ產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)依賴于給藥量而增加。

另外，根據(jù)圖4，算出在給藥0.5mg的lace7制劑的情況下每10⁶個細(xì)胞的ifn-γ產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)為65.8細(xì)胞(圖4中的箭頭部分)。

(試驗(yàn)例3：抗hpv粘膜免疫誘導(dǎo)能力試驗(yàn)-2)

使用以下的樣品，將樣品的給藥量設(shè)為0.5mg/小鼠，除此以外，通過與試驗(yàn)例2相同的方式進(jìn)行抗hpv粘膜免疫誘導(dǎo)能力試驗(yàn)。

＜樣品＞

·樣品-1：制造例1中的(1)每1.0×10⁸個乳酸菌菌體結(jié)合有0.3μg所述變異型e7蛋白質(zhì)的變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌(有tca處理)。

·樣品-2：制造例1中的(6)每1.0×10⁸個乳酸菌菌體結(jié)合有0.09μg所述變異型e7蛋白質(zhì)的變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌(無tca處理)。

·樣品-3：制造例1中的(5)每1.0×10⁸個乳酸菌菌體結(jié)合有0.3μg所述變異型e7蛋白質(zhì)的變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌(無tca處理)。

·樣品-4：制造例2中的(iii-2)由添加了25mmnahco3的mrse(ph值7.1)培養(yǎng)并設(shè)為活菌的變異型e7蛋白質(zhì)表達(dá)型乳酸菌。

·樣品-5：制造例2中的(iii-1)由添加了25mmnahco3的mrse(ph值7.1)培養(yǎng)并設(shè)為死菌的變異型e7蛋白質(zhì)表達(dá)型乳酸菌。

將結(jié)果示于圖5。圖5中，橫軸的1～5表示所述樣品的編號。

另外，在圖5中還一并披露所述試驗(yàn)例2的結(jié)果。圖5中，a表示試驗(yàn)例2中l(wèi)ace7制劑的給藥量為0.1mg/小鼠的結(jié)果，b表示試驗(yàn)例2中l(wèi)ace7制劑的給藥量為0.3mg/小鼠的結(jié)果，c表示試驗(yàn)例2中l(wèi)ace7制劑的給藥量為1.0mg/小鼠的結(jié)果。

圖5的箭頭表示根據(jù)所述試驗(yàn)例2的結(jié)果算出的在以0.5mg/小鼠給藥lace7制劑的情況下每10⁶個細(xì)胞的ifn-γ產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)。

根據(jù)圖5的結(jié)果，在使用本發(fā)明的變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌或變異型e7蛋白質(zhì)表達(dá)型乳酸菌、即樣品-1～5的情況下，與給藥量相同的作為公知制劑的lace7制劑的情況相比，顯示出具有優(yōu)異的抗hpv免疫誘導(dǎo)能力。

其中，在使用樣品-2～5的情況下，與給藥量相同的作為公知制劑的lace7制劑的情況相比，顯示出具有約2倍左右的非常優(yōu)異的抗hpv免疫誘導(dǎo)能力。

在本發(fā)明等人所進(jìn)行的利用作為公知制劑的lace7制劑的人cin3患者的臨床試驗(yàn)中，如果對治愈組與未治愈組的ifn-γ產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)加以比較，則顯示出前者的ifn-γ產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)比后者多2倍左右(k.kawanaetal.,“oralvaccinationagainsthpve7fortreatmentofcervicalintraepithelialneoplasiagrade3(cin3)elicitse7-specificmucosalimmunityinthecervixofcin3patients.”,vaccine,2014oct29；32(47)：6233-9.)。

因此，預(yù)測本發(fā)明的變異型e7蛋白質(zhì)結(jié)合型乳酸菌或變異型e7蛋白質(zhì)表達(dá)型乳酸菌在相同給藥量下，ifn-γ產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)比作為公知制劑的lace7制劑多2倍左右，顯著地提高臨床效果(有效率)。

作為本發(fā)明的形態(tài)，例如可以列舉以下形態(tài)。

＜1＞一種含有乳酸菌的組合物，其特征在于：其是含有在菌體表面具有來自人乳頭狀瘤病毒(hpv)e7蛋白質(zhì)的多肽的乳酸菌的組合物，

所述來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽的含量為每1×10⁸個乳酸菌菌體0.03μg～1.0μg。

＜2＞根據(jù)所述＜1＞所記載的含有乳酸菌的組合物，其中來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽結(jié)合在乳酸菌的菌體表面。

＜3＞根據(jù)所述＜1＞所記載的含有乳酸菌的組合物，其中來自hpve7蛋白質(zhì)的多肽在乳酸菌的菌體表面被表達(dá)。

＜4＞根據(jù)所述＜1＞至＜3＞中任一項(xiàng)所記載的含有乳酸菌的組合物，其中乳酸菌為干酪乳酸桿菌。

＜5＞一種hpv感染癥及hpv相關(guān)腫瘤中的至少任一種疾病的治療用口服醫(yī)藥組合物，其特征在于：包含所述＜1＞至＜4＞中任一項(xiàng)所記載的含有乳酸菌的組合物。

＜6＞根據(jù)所述＜5＞所記載的hpv感染癥及hpv相關(guān)腫瘤中的至少任一種疾病的治療用口服醫(yī)藥組合物，其用于治療宮頸部上皮內(nèi)瘤變及早期宮頸癌中的至少任一種疾病。

＜7＞一種粘膜免疫誘導(dǎo)劑，其特征在于：包含所述＜1＞至＜4＞中任一項(xiàng)所記載的含有乳酸菌的組合物。

序列表

<110>國立大學(xué)法人東京大學(xué)

公益財團(tuán)法人日本健康科學(xué)振興財團(tuán)

<120>含有乳酸菌的組合物、hpv感染癥及hpv相關(guān)腫瘤中的至少任一種疾病的治療用口服醫(yī)藥組合物及粘膜免疫誘導(dǎo)劑

<130>n-st016-15p

<150>jp2015-017407

<151>2015-01-30

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>98

<212>prt

<213>人乳頭狀瘤病毒16型

<400>1

methisglyaspthrprothrleuhisglutyrmetleuaspleugln

151015

progluthrthraspleutyrcystyrgluglnleuasnaspserser

202530

gluglugluaspgluileaspglyproalaglyglnalagluproasp

354045

argalahistyrasnilevalthrphecyscyslyscysaspserthr

505560

leuargleucysvalglnserthrhisvalaspileargthrleuglu

65707580

aspleuleumetglythrleuglyilevalcysproilecyssergln

859095

lyspro

<210>2

<211>98

<212>prt

<213>人乳頭狀瘤病毒16型

<400>2

methisglyaspthrprothrleuhisglutyrmetleuaspleugln

151015

progluthrthrglyleutyrglytyrglyglnleuasnaspserser

202530

gluglugluaspgluileaspglyproalaglyglnalagluproasp

354045

argalahistyrasnilevalthrphecyscyslyscysaspserthr

505560

leuargleucysvalglnserthrhisvalaspileargthrleuglu

65707580

aspleuleumetglythrleuglyilevalcysproilecyssergln

859095

lyspro

<210>3

<211>975

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列

<400>3

tcttctgctggtacttctaattccggtggttcaacagctacaaataccaataataattca60

aatacaagctcaaccacttatacagttaaatctggcgatacactttggggaatttcgcaa120

aaatatggaattagtgttgctcaaattcaaagcgcaaacaatcttaaaagtacagtcatc180

tatattgggcaaaagcttgtattgacaacttcaagttcttcgtctaatacaaatagttca240

acttcttcaggaaattctgccggaactacaacgcctactacttcggtcactcctgccaaa300

ccagcttcacagacgacgattaaggttaaatctggtgatacgctttggggactctctgtc360

aaatataaaacgacgattgctcaactcaagagttggaatcatttgaattctgatacaatt420

ttcattggacaaaacttgattgtttcacaatctgccggttcttcaagttcttcaacaggt480

tcaagctcagcctctacgagttcaacttctaactcttctgcagcttcaaatacctctatc540

cataaggttgttaaaggagatacgctttggggactttcacaaaaatctggtagcccaatt600

gcttcaattaaggcttggaatcatttatcaagtgataccattttaattggtcaatatctt660

cgtattaaagaggatccgatgcatggagatacacctacattgcatgaatatatgttagat720

ttgcaaccagagacaactggtctctacggttatgggcaattaaatgacagctcagaggag780

gaggatgaaatagatggtccagctggacaagcagaaccggacagagcccattacaatatt840

gtaaccttttgttgcaagtgtgactctacgcttcggttgtgcgtacaaagcacacacgta900

gacattcgtactttggaagacctgttaatgggcacactaggaattgtgtgccccatctgt960

tctcagaaaccataa975

<210>4

<211>624

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列

<400>4

atgcatggagatacacctacattgcatgaaatatgttagatttgcaaccagagacaactg60

gtctctacggttatgggcaattaaatgacagctcagaggaggaggatgaaatagatggtc120

cagctggacaagcagaaccggacagagcccattacaatattgtaaccttttgttgcaagt180

gtgactctacgcttcggttgtgcgtacaaagcacacacgtagacattcgtactttggaag240

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cagctgccgttgaagcggccaagacagctggtaaaggcgacgatacaagcggtactagcg360

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cattacccaagacagcagagacaactgagcggccagcgtttggcttcttgggtgtcattg600

tggtcagtctgatgggggtattag624