利用l-乳酸生物合成s-1,2-丙二醇的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備S-1,2-丙二醇的方法。本發(fā)明所提供的制備S-1,2-丙二醇的方法具體包括用重組生物細(xì)胞將L-乳酸或其鹽轉(zhuǎn)化為S-1,2-丙二醇的步驟；所述重組生物細(xì)胞表達(dá)具有將L-乳酸或其鹽轉(zhuǎn)化為S-1,2-丙二醇功能的酶系統(tǒng)。所述酶系統(tǒng)包括如下（a1）-（a3）：（a1）具有將L-乳酸或其鹽轉(zhuǎn)化為L-乳酰輔酶A功能的酶1；（a2）具有將所述L-乳酰輔酶A轉(zhuǎn)化為L-乳醛功能的酶2；（a3）具有將所述L-乳醛轉(zhuǎn)化為S-1,2-丙二醇功能的酶3。本發(fā)明對建立擁有自主產(chǎn)權(quán)的、原料價(jià)格低廉的、合成途徑全新的、轉(zhuǎn)化效率較高的S-1,2-丙二醇的生物合成方法具有重要意義。
【專利說明】利用L-乳酸生物合成S-1 ’ 2-丙二醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種制備S-1，2-丙二醇的方法，特別涉及一種利用重組大腸桿菌將L-乳酸及其鹽形式轉(zhuǎn)化為S-1，2-丙二醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]丙二醇的結(jié)構(gòu)區(qū)別將其區(qū)分為1，2-丙二醇和1，3-丙二醇。1，2-丙二醇主要用來生產(chǎn)不飽和聚酯樹脂、防凍劑、增塑劑替代乙二醇用于防凍飛行器及在食品中作冷卻劑和熱載體等，它還可用于非離子洗滌劑或保濕劑。丙二醇還是良好的溶劑，可用于食品調(diào)味品和香料，或醫(yī)藥工業(yè)的軟膏油膏等。
[0003]光學(xué)活性1，2-丙二醇具有活性基團(tuán)，可作為手性起始物用于藥物、除草劑、信息素和液晶的合成，具有很高的研究價(jià)值。大腸桿菌中自身存在有生成1，2_丙二醇的代謝通路。在代謝L-鼠李糖和L-巖藻糖途徑中，磷酸化后的糖由醛縮酶催化生成L-乳醛和二羥丙酮磷酸(DHAP)，后在厭氧的條件和NADH存在下L-乳醛被催化為L-1，2-丙二醇，即S-1.2-丙二醇。但由于原料價(jià)格過高，此通路并沒有很好經(jīng)濟(jì)效益，所以沒有很好的研究價(jià)值。在嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)中也有從甲基乙二醒(methylglyoxal)分別生成乳醒(Lactaldehyde)或丙酮醒(Acetol)最終生成1，2_丙二醇的路徑，但其中有些路徑只是猜想的，目前并沒有證據(jù)表明存在實(shí)際的酶去催化。
[0004]關(guān)于生物催化合成R-1，2-丙二醇的研究，目前，國外已有關(guān)于生物催化合成R-1，2-丙二醇的報(bào)道，Tadashi等采用氣升式發(fā)酵罐對酵母還原丙酮醇生成R_l，2-丙二醇和酵母氧化拆分外消旋1，2-丙二醇進(jìn)行了研究，但仍未得到工業(yè)化應(yīng)用，而國內(nèi)少有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種制備S-1，2-丙二醇的方法，具體為利用L-乳酸生物合成S-1，2-丙二醇的方法。
[0006]本發(fā)明所提供的一種制備S-1，2-丙二醇的方法，包括用重組生物細(xì)胞將L-乳酸或其鹽轉(zhuǎn)化為s-l，2-丙二醇的步驟；所述重組生物細(xì)胞表達(dá)具有將L-乳酸或其鹽轉(zhuǎn)化為S-1, 2-丙二醇功能的酶系統(tǒng)。
[0007]在上述方法中，所述將L-乳酸或其鹽轉(zhuǎn)化為S-1，2-丙二醇，具體包括如下(O- (3)的步驟:
[0008](1)將L-乳酸或其鹽轉(zhuǎn)化為L-乳酰輔酶A ；
[0009](2 )將所述L-乳酰輔酶A轉(zhuǎn)化為L-乳醛；
[0010](3)將所述L-乳醛轉(zhuǎn)化為S-12-丙二醇。
[0011]在上述方法中，所述酶系統(tǒng)具體包括如下(al) - (a3):
[0012](al)具有將L-乳酸或其鹽轉(zhuǎn)化為L-乳酰輔酶A功能的酶I ;
[0013](a2)具有將所述L-乳酰輔酶A轉(zhuǎn)化為L-乳醛功能的酶2 ；[0014](a3)具有將所述L-乳醛轉(zhuǎn)化為S_l，2_丙二醇功能的酶3。
[0015]在本發(fā)明中，所述酶I為丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶；所述酶2為輔酶A依賴型琥珀酸半醛脫氫酶；所述酶3為3-羥基丙酸脫氫酶。
[0016]進(jìn)一步,所述丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶為丙酸梭菌(Clostridium propionicum)的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的點(diǎn)突變蛋白，其氨基酸序列具體如序列表中序列I所示；所述輔酶A依賴型琥拍酸半醒脫氫酶為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)的輔酶A依賴型琥珀酸半醛脫氫酶，其氨基酸序列具體如序列表中序列2所示；所述3-羥基丙酸脫氫酶為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的3_羥基丙酸脫氫酶，其氨基酸序列具體如序列表中序列3所示。
[0017]其中，序列I由524個(gè)氨基酸組成；序列2由462個(gè)氨基酸組成；序列3由292個(gè)
氨基酸組成。
[0018]所述重組生物細(xì)胞是將如下編碼基因?qū)肽康纳锛?xì)胞后得到的表達(dá)所述酶系統(tǒng)的重組生物細(xì)胞: [0019]如序列表中序列4所示的所述丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的編碼基因；
[0020]如序列表中序列5所示的所述輔酶A依賴型琥珀酸半醛脫氫酶的編碼基因；
[0021]如序列表中序列6所示的所述3-羥基丙酸脫氫酶的編碼基因。
[0022]其中，序列4由1575個(gè)核苷酸組成，編碼序列表中序列I所示的蛋白；序列5由1389個(gè)核苷酸組成，編碼序列表中序列2所示的蛋白；序列6由879個(gè)核苷酸組成，編碼序列表中序列3所示的蛋白。
[0023]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，將所述酶系統(tǒng)的編碼基因?qū)肽康纳锛?xì)胞，具體為通過將攜帶并表達(dá)所述酶系統(tǒng)的編碼基因的重組質(zhì)粒導(dǎo)入所述目的生物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)的。所述重組質(zhì)粒具體為下述重組質(zhì)粒A和下述重組質(zhì)粒B。
[0024]在上述方法中，所述生物細(xì)胞可為微生物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。
[0025]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述生物細(xì)胞具體為大腸桿菌，如大腸桿菌Origami(DE3)。
[0026]進(jìn)一步，所述重組生物細(xì)胞為下述的重組大腸桿菌I。
[0027]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述方法中，所述“用重組生物細(xì)胞將L-乳酸或其鹽轉(zhuǎn)化為S-1，2-丙二醇”具體為用所述重組生物細(xì)胞將L-乳酸鈉轉(zhuǎn)化為S-1，2-丙二醇。
[0028]在所述方法中，所述“用重組生物細(xì)胞將L-乳酸或其鹽(如L-乳酸鈉)轉(zhuǎn)化為S-12-丙二醇”具體包括如下(A)和(B)的步驟:
[0029](A)向0D600=0.6的所述重組大腸桿菌I的培養(yǎng)液中加入終濃度為0.2%(0.2g/100mL)的L-阿拉伯糖，37°C 180rpm震蕩培養(yǎng)，Ih后加入終濃度為0.05mM的IPTG，轉(zhuǎn)至20°C 180rpm震蕩培養(yǎng)16_18h ；
[0030](B)收集菌體，先用濃度為0.9% (0.9g/1OOmL)的NaCl水溶液洗兩次，后用IOOmM磷酸鹽緩沖液(PH7.4)重懸至0D600=30，加入終濃度為IOOmM的L-乳酸或其鹽(如L-乳酸鈉)，370C，200rpm,培養(yǎng)48h，從培養(yǎng)液中獲得S-1，2-丙二醇。
[0031]本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供如下(I)或(II)或(III)的生物材料。
[0032](I)如下DNA片段中的全部或部分:
[0033](bI)核苷酸序列為序列表中序列4所示的DNA片段(丙酸梭菌(Clostridiumpropionicum)的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的點(diǎn)突變優(yōu)化后核苷酸序列)；
[0034](b2)核苷酸序列為序列表中序列5所示的DNA片段(小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)的輔酶A依賴型琥拍酸半醒脫氫酶的優(yōu)化后核苷酸序列)；
[0035](b3)核苷酸序列為序列表中序列6所示的DNA片段(蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)的3_羥基丙酸脫氫酶的優(yōu)化后核苷酸序列)；
[0036]以上所述優(yōu)化為在不改變相應(yīng)酶的氨基酸序列的前提下，將野生型基因的密碼子替換為大腸桿菌偏好(高頻使用)的密碼子。
[0037](II)重組質(zhì)粒A和/或重組質(zhì)粒B:
[0038]所述重組質(zhì)粒A為攜帶并表達(dá)(bl)中所述DNA片段的重組表達(dá)載體；所述重組質(zhì)粒B為攜帶并表達(dá)(b2)中所述DNA片段和(b3)中所述DNA片段的重組表達(dá)載體。
[0039]在所述重組質(zhì)粒A中，啟動(dòng)(bl)中所述DNA片段轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為araBAD啟動(dòng)子；在所述重組質(zhì)粒B中，啟動(dòng)(b2)中所述DNA片段和(b3)中所述DNA片段轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子均為T7啟動(dòng)子。
[0040]具體的，所述重組質(zhì)粒A為在pBAD43載體的多克隆位點(diǎn)(如EcoR I和Hind III)處插入序列表中序列4所示DNA片段后得到的重組質(zhì)粒(pBAD-pct);所述重組質(zhì)粒B為在pETDUET-Ι載體的多克隆位點(diǎn)I (如Nco I和Hind III)處插入序列表中序列5所示DNA片段，同時(shí)在多克隆位點(diǎn)2 (如Nde I和Xho I)處插入序列表中序列6所示DNA片段后得到的重組質(zhì)粒(pETDUET-pm)。
[0041](III)重組大腸桿菌I或/和重組大腸桿菌2或/和重組大腸桿菌3:
[0042]所述重組大腸桿菌I為攜帶`(II)中所述重組質(zhì)粒A和所述重組質(zhì)粒B，并表達(dá)(bl)中所述DNA片段、(b2)中所述DNA片段和(b3)中所述DNA片段的大腸桿菌；
[0043]所述重組大腸桿菌2為攜帶(II)中所述重組質(zhì)粒A，并表達(dá)(bl)中所述DNA片段的大腸桿菌；
[0044]所述重組大腸桿菌3為攜帶(II)中所述重組質(zhì)粒B，并表達(dá)b2)中所述DNA片段和(b3)中所述DNA片段的大腸桿菌。
[0045]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述重組大腸桿菌I為采用所述重組質(zhì)粒A和所述重組質(zhì)粒B共轉(zhuǎn)化大腸桿菌Origami (DE3)后，得到的表達(dá)所述酶1_酶3的大腸桿菌。
[0046]當(dāng)然，只要是采用本發(fā)明所提供的利用L-乳酸生物合成S-1，2-丙二醇的三步反應(yīng)，或是其中的若干步反應(yīng)，來合成s-l，2-丙二醇，則含有(bl)- (b3)所述DNA片段，或是其中的若干DNA片段的表達(dá)盒、重組細(xì)胞系，以及除上述重組大腸桿菌外的其他重組菌也均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0047]所述生物材料在利用L-乳酸或其鹽(如L-乳酸鈉)合成S-1，2-丙二醇中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。
[0048]本發(fā)明建立了全新的以L-乳酸或其鹽(如L-乳酸鈉)為原料，通過生物合成途徑制備S-1, 2-丙二醇的方法。本發(fā)明對建立擁有自主產(chǎn)權(quán)、原料價(jià)格低廉、合成途徑全新、轉(zhuǎn)化效率較高的S-1，2-丙二醇生物合成方法具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0049]圖1為重組表達(dá)載體pBAD-pct、中間質(zhì)粒pETDUET-pdcd和重組表達(dá)載體pETDUET-pm的酶切鑒定圖譜。其中，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道I和3為重組表達(dá)載體pBAD-pct的BamH I單酶切結(jié)果；泳道2和4為未經(jīng)酶切的重組質(zhì)粒pBAD-pct對照；泳道5和6為中間質(zhì)粒pETDUET-pdcd的Sph I單酶切結(jié)果；泳道7和8為重組表達(dá)載體pETDUET-pm的BsaA I單酶切結(jié)果。
[0050]圖2 為 S-1, 2-丙二醇標(biāo)準(zhǔn)品和重組菌株 Origami (DE3) /pBAD-pct/pETDUET-pm的發(fā)酵濾液的HPLC圖譜的HPLC圖譜。其中，a)為S-1，2-丙二醇標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜；b)為重組菌株Origami (DE3) /pBAD-pct/pETDUET-pm的發(fā)酵濾液的HPLC圖譜。
[0051]圖3 為 S-1, 2-丙二醇標(biāo)準(zhǔn)品和重組菌株 Origami (DE3) /pBAD-pct/pETDUET-pm的發(fā)酵濾液的質(zhì)譜鑒定結(jié)果圖譜。其中，A為S-1，2-丙二醇標(biāo)準(zhǔn)品；B為重組菌株Origami(DE3) /pBAD-pct/pETDUET-pm的發(fā)酵濾液由乙酸乙酯萃取后樣品
【具體實(shí)施方式】
[0052]本發(fā)明中制備S-1，2-丙二醇的方法，是在生物細(xì)胞中通過酶系統(tǒng)將L-乳酸或其鹽(如L-乳酸鈉)轉(zhuǎn)化為S-1，2-丙二醇。具體包括如下三步驟:
[0053](I)將L-乳酸或其鹽轉(zhuǎn)化為L-乳酰輔酶A ；
[0054](2 )將所述L-乳酰輔酶A轉(zhuǎn)化為L-乳醛；
[0055](3)將所述L-乳醛轉(zhuǎn)化為S-1, 2-丙二醇。
[0056]以上6步反應(yīng)順次所·對應(yīng)的酶為如下(al) - (a3):
[0057](al)具有將L-乳酸或其鹽轉(zhuǎn)化為L-乳酰輔酶A功能的酶1，如丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶；
[0058](a2)具有將所述L-乳酰輔酶A轉(zhuǎn)化為L-乳醛功能的酶2，如輔酶A依賴型琥珀酸半醛脫氫酶；
[0059](a3)具有將所述L-乳醛轉(zhuǎn)化為S-1，2-丙二醇功能的酶3，如3-羥基丙酸脫氫酶。
[0060]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0061]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0062]pBAD43載體:Addgene公司，產(chǎn)品目錄號為VYA0258。
[0063]pETDUET-Ι載體:Novagen公司，產(chǎn)品目錄號為71146。
[0064]大腸桿菌Origami (DE3):Novagen公司，產(chǎn)品目錄號為70627。
[0065]實(shí)施例1、用于生物合成S-1，2-丙二醇的重組大腸桿菌的構(gòu)建
[0066]一、重組表達(dá)載體pBAD-pct和pETDUET-pm的構(gòu)建
[0067]1、3步催化反應(yīng)中步驟(1)所用酶基因的選擇及優(yōu)化
[0068]針對3步反應(yīng)中步驟(1)的催化反應(yīng),選取丙酸梭菌(Clostridium propionicum)的丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的基因(pet)的CDS全序列(GenBank:AJ276553.1的第485-2059位)，經(jīng)過設(shè)計(jì)和反復(fù)驗(yàn)證得到適合于在大腸桿菌中表達(dá)的優(yōu)化型丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因序列，即將野生型丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因序列在不改變氨基酸序列的前提下轉(zhuǎn)變成大腸桿菌偏好(高頻使用)的密碼子優(yōu)化序列，從而提高丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌培養(yǎng)環(huán)境中的表達(dá)水平。
[0069]接著，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道(TaekHo Yang, Tae Wan Kim, Hye Ok Kang, Sang-HyunLee，Eun Jeong Lee, Sung-Chul Limj Sun Ok 0h，Ae-Jin Song, Si Jae Park, Sang Yup Lee.Biosynthesis of polylactic acid and its copolymers using evolved propionateCoA transferase and PHA synthase.Biotechnology and Bioengineering,2010，105，I50-160.)，將以上所得的優(yōu)化型丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因序列中對應(yīng)于丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶蛋白氨基酸序列第193位Val的三個(gè)核苷酸改為大腸桿菌偏好(高頻使用)的編碼Ala的密碼子，旨在減小蛋白表達(dá)過程中外源蛋白對宿主大腸桿菌的抑制作用(參考文獻(xiàn)“TaekHo Yang, Tae Wan Kim, Hye 0k Kang, Sang-Hyun Lee, Eun Jeong Lee, Sung-Chul Lim, Sun0k Oh, Ae-Jin Song, Si Jae Park, Sang Yup Lee.Biosynthesis of polylactic acidand its copolymers using evolved propionate CoA transferase and PHA synthase.Biotechnology and Bioengineering, 2010, 105, 150-160.” 中有報(bào)道)。
[0070]根據(jù)上述方法，最終獲得按大腸桿菌偏好設(shè)計(jì)的優(yōu)化型點(diǎn)突變丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶編碼基因，其基因序列為序列表中序列4，共由1575個(gè)核苷酸組成。該基因編碼的蛋白為序列表中序列I所示氨基酸序列組成的蛋白(即點(diǎn)突變丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶)，與野生型丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因(GenBank:AJ276553.1的第485-2059位)編碼的蛋白相比，其中第193位的 Val 突變?yōu)?Ala (V193A)。
[0071]針對步驟(2)的催化反應(yīng),選取小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)的輔酶A依賴型琥珀酸半醛脫氫酶的基因(pcdD)，對其采用同上的方式進(jìn)行密碼子優(yōu)化。優(yōu)化后的所述輔酶A依賴型琥珀酸半醛脫氫酶基因的核苷酸序列如序列表中序列5所示，共由1388個(gè)核苷酸組成。該基因編碼序列表中的序列2所示的蛋白質(zhì)。
[0072]針對步驟(3)的催化反應(yīng),選取臘樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)的3_羥基丙酸脫氫酶的基因(_sB)，對其采 用同上的方式進(jìn)行密碼子優(yōu)化。優(yōu)化后的所述3-羥基丙酸脫氫酶基因的核苷酸序列如序列表中序列6所示，共由879個(gè)核苷酸組成。該基因編碼序列表中的序列3所示的蛋白質(zhì)。
[0073]2、重組表達(dá)載體pBAD-pct的構(gòu)建
[0074]以序列表中序列4所示DNA片段為模板，用引物I和引物2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0075]引物1:5’ -GAGGAATTCATGCGCAAAGTTCCGATTA-3，(下劃線部分為限制件內(nèi)切酶EcoRI的識(shí)別序列，其后的序列為序列4的第1-19位)；
[0076]引物2:5’ -CCGGAAGCTTAGCTTTTCATTTCTTTCAGG-3> (下劃線部分為限制性內(nèi)切酶Hind III的識(shí)別序列，該序列的第9-30位為序列4的第1554-1575位的反向互補(bǔ)序列)。
[0077]用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind III雙酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，膠回收后與經(jīng)過同樣雙酶切的PBAD43載體骨架大片段相連，得到重組質(zhì)粒。將經(jīng)過限制性內(nèi)切酶BamH I單酶切初步鑒定正確(目的條帶752bp和6956bp，圖1中的泳道I和3)的重組質(zhì)粒送樣測序。將經(jīng)測序表明在PBAD43載體的多克隆位點(diǎn)EcoR I和Hind III之間插入序列表中序列4所示DNA片段后得到的重組質(zhì)粒命名為pBAD-pct。在重組表達(dá)載體pBAD-pct中，啟動(dòng)序列4所示DNA片段轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為araBAD啟動(dòng)子。
[0078]3、重組表達(dá)載體pETDUET-pm的構(gòu)建
[0079]以序列表中序列5所示DNA片段為模板，用引物3和引物4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物I。以序列表中序列6所示DNA片段為模板，用引物5和引物6進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物2。
[0080]引物3:5’-GAGTCATGAACACCAACGATCTGGAATC-3，(下劃線部分為限制性內(nèi)切酶BspHI的識(shí)別序列，該序列的第6-28位為序列5的第1-23位)；[0081 ]引物4:5’-CGCAAGCTTAACGGATAGAAAAACCATT-3’ (下劃線部分為限制性內(nèi)切酶HindIII的識(shí)別序列，該序列的第8-28為序列5的第1369-1389位的反向互補(bǔ)序列)。[0082]引物5:5 ’ -CGCGCTAGATGGAACATAAAACTTTATCA-3，(下劃線部分為限制性內(nèi)切酶Bfa I的識(shí)別序列，其后的序列為序列6的第1-21位)；[0083]引物6:5，-GCGCTCGAGTTACCCCCTTATATATTTT-3，(下劃線部分為限制性內(nèi)切酶 XhoI的識(shí)別序列，其后的序列為序列6的第861-879位的反向互補(bǔ)序列)。[0084]用限制性內(nèi)切酶BspH I (與Nco I為同尾酶)和Hind III雙酶切PCR產(chǎn)物1，膠回收后與經(jīng)過Nco I和Hind III雙酶切的pETDUET-Ι載體骨架大片段相連，得到中間質(zhì)粒pETDUET-pdcd。將中間質(zhì)粒pETDUET-pdcd用限制性內(nèi)切酶Sph I單酶切，結(jié)果得到大小約為1222bp和5513bp的兩個(gè)目的條帶(圖1中的泳道5和泳道6)，與預(yù)期結(jié)果一致，證明中間質(zhì)粒pETDUET-pdcd構(gòu)建正確。[0085]再用限制性內(nèi)切酶Bfa I和Xho I雙酶切PCR產(chǎn)物2，膠回收后與經(jīng)過Nde I (與Bfa I為同尾酶)和Xho I雙酶切的中間質(zhì)粒pETDUET-pdcd骨架大片段相連，得到重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BsaA I單酶切，結(jié)果得到大小約為1708bp、2270bp和3584bp的三個(gè)目的條帶(圖1中的泳道7和泳道8)，與預(yù)期結(jié)果一致。[0086]將以上經(jīng)酶切鑒定初步證實(shí)構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒送樣測序，將經(jīng)測序表明在pETDUET-Ι載體的多克隆位點(diǎn)Nco I和Hind III和之間插入序列表中序列5所示DNA片段，同時(shí)在多克隆位點(diǎn)Nde I和Xho I之間插入序列表中序列6所示DNA片段后得到的重組質(zhì)粒命名為pETDUET-pm。在重組表達(dá)載體pETDUET-pm中，啟動(dòng)序列5所示DNA片段轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子和啟動(dòng)序列6所示DNA片段轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子均為T7啟動(dòng)子。[0087]二、用于從L-乳酸或其鹽合成S-1，2-丙二醇的重組大腸桿菌的構(gòu)建[0088]將步驟一中的重組表達(dá)載體pBAD-pct和pETDUET-pm共轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌0rigami(DE3)中，轉(zhuǎn)化后涂布到含有100 μ g/mL氨芐霉素和100 μ g/mL壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行壓力篩選，挑取若干個(gè)單菌落，接種到含100 μ g/mL氨芐霉素和100 μ g/mL壯觀霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C劇烈振蕩培養(yǎng)過夜。以菌液為模板，分別用引物對I(引物I/引物2)、引物對2 (引物3/引物4)、引物對3 (引物5/引物6)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別能擴(kuò)增得到大小約為1580bp、1396bp和885bp的目的條帶的單克隆菌株為陽性重組菌株，命名為 0rigami(DE3)/pBAD-pct/pETDUET-pm。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置將pBAD43 空載體和 pETDUET-1空載體共轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌Origami (DE3)的對照,所得重組菌株命名為Origami (DE3)/pBAD43/pETDUET-l。[0089]實(shí)施例2、以L-乳酸鈉為底物生物合成S-1，2-丙二醇[0090]一、通過生物發(fā)酵將L-乳酸鈉轉(zhuǎn)化為S-12-丙二醇[0091]將實(shí)施例1構(gòu)建的重組大腸桿菌Origami (DE3) /pBAD-pct/pETDUET-pm過夜培養(yǎng)，得到種子液，按體積比1%的比例接種到新的LB培養(yǎng)基中，37°C 180rpm震蕩培養(yǎng)。當(dāng)0D600至0.6左右時(shí)加入終濃度為0.2% (0.2g/100mL)的L-阿拉伯糖，Ih后加入終濃度為0.05mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)至20°C 180rpm震蕩培養(yǎng)16_18h。[0092]誘導(dǎo)過后收菌,4°C,5000rpm,離心 lOmin。后用 0.9% (0.9g/100mL)NaCl 洗兩次。后用100mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)重懸至0D600約為30左右。加入終濃度為100mM的L-乳酸鈉作為底物，37°C，200rpm反應(yīng)24小時(shí)進(jìn)行全細(xì)胞反應(yīng)。之后，取發(fā)酵液，用于進(jìn)行產(chǎn)物檢測。對照菌株Origami (DE3)/pBAD43/pETDUET_l以相同方法進(jìn)行發(fā)酵測試。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。其中，IOOmM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)的配方如下=K2HPO4.3H2018.3g，ΚΗ2Ρ042.7g，定容至IL去離子水中。
[0093]二、目標(biāo)產(chǎn)物S-1，2-丙二醇的檢測
[0094]1、高效液相色譜檢測
[0095]S-1, 2-丙二醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備:取S-1，2-丙二醇標(biāo)準(zhǔn)品(sigma，目錄號540250)，用去離子水配制成適當(dāng)濃度的溶液。
[0096]待測樣品溶液的制備:將步驟一所獲得的發(fā)酵液，12000rpm, 2min離心后取上清，用0.22 μ m濾膜過濾，得到待上機(jī)的待測樣品溶液。
[0097]將S-1，2-丙二醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測樣品溶液均按照如下條件進(jìn)行HPLC檢測:色譜柱為有機(jī)酸柱 300mmX7.8mm Aminex HPX-87H(Bio-Rad);流動(dòng)相為 6mM H2SO4 ;流速為
0.5ml/min ;上樣量為10微升；柱溫55°C ;示差折光檢測器。根據(jù)S-1，2-丙二醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測樣品的HPLC圖譜判定步驟一所獲得的發(fā)酵液中是否含有S-1，2-丙二醇。
[0098]實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置對照菌株Origami (DE3)/pBAD43/pETDUET_l作為對照。
[0099]結(jié)果顯示，S-1，2-丙二醇標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜如圖2中a)所示，從圖中可以看出，S-1, 2-丙二醇標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為19.722min。重組菌株Origami (DE3)/pBAD-pct/pETDUET-pm的發(fā)酵濾液的 HPLC圖譜如圖2中b)所示，在與S-1，2-丙二醇標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間一致的位置也出現(xiàn)了目標(biāo)峰。而對照菌株Origami (DE3)/pBAD43/pETDUET_l的發(fā)酵濾液中則沒有該目標(biāo)峰。根據(jù)以上結(jié)果，初步判定步驟一所獲得的發(fā)酵液中含有S-1，2-丙二醇，L-乳酸至S-1, 2-丙二醇的途徑已打通。
[0100]2、質(zhì)譜鑒定
[0101]S-1，2-丙二醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備:取S-1，2-丙二醇標(biāo)準(zhǔn)品(sigma，目錄號540250)，用乙酸乙酯配制成適當(dāng)濃度的溶液。
[0102]待測樣品溶液的制備:將步驟一所獲得的發(fā)酵液，12000rpm, 10min，4°C離心，收集上清，調(diào)節(jié)PH〈2.0，后加入0.5倍體積的乙酸乙酯，萃取收集有機(jī)相。
[0103]將S-1，2-丙二醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測樣品溶液(乙酸乙酯萃取后的有機(jī)相)，分別用
0.22微米有機(jī)濾膜過濾,分別進(jìn)行GC/MS測定。具體條件如下:儀器型號=ThermoFisher公司生產(chǎn)的Trace ISQ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(氣相=Tracel300)。GC條件:色譜柱:TG-WAXMS毛細(xì)柱(30mX0.25mmX0.25 μ m)。載氣:氦氣,流速lml/min。程序升溫:80°C維持Imin,后5°C /min升溫至200°C,維持5min。進(jìn)樣方式:分流進(jìn)樣，220°C,分流比1:10,1 μ I進(jìn)樣。檢測器:ΕΙ源，質(zhì)譜離子源溫度200°C，傳輸線溫度250°C，從9.5min開始質(zhì)譜檢測，質(zhì)量掃描范圍:35-300m/z。
[0104]S-l, 2-丙二醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測樣品溶液(乙酸乙酯萃取后的有機(jī)相)在氣相檢測的同一保留時(shí)間的出峰物質(zhì)的質(zhì)譜圖分別如圖3中A和B所示，從圖中可以看出，兩質(zhì)譜圖相吻合，證明是同一物質(zhì)。根據(jù)以上結(jié)果，進(jìn)一步判定步驟一所獲得的發(fā)酵液中含有S-1, 2-丙二醇，L-乳酸至S-1，2-丙二醇的途徑已打通。
【權(quán)利要求】
1.一種制備s-l，2-丙二醇的方法，包括用重組生物細(xì)胞將L-乳酸或其鹽轉(zhuǎn)化為S-1, 2-丙二醇的步驟；所述重組生物細(xì)胞表達(dá)具有將L-乳酸或其鹽轉(zhuǎn)化為S-1，2-丙二醇功能的酶系統(tǒng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述酶系統(tǒng)包括如下(al)_(a3): (al)具有將L-乳酸或其鹽轉(zhuǎn)化為L-乳酰輔酶A功能的酶I ; (a2)具有將所述L-乳酰輔酶A轉(zhuǎn)化為L-乳醛功能的酶2 ； (a3)具有將所述L-乳醛轉(zhuǎn)化為S-1，2-丙二醇功能的酶3。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述酶I為丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶； 所述酶2為輔酶A依賴型琥珀酸半醛脫氫酶； 所述酶3為3-羥基丙酸脫氫酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列如序列表中序列I所示； 所述輔酶A依賴型琥珀酸半醛脫氫酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示； 所述3-羥基丙酸脫氫酶的氨基酸序列如序列表中序列3所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述重組生物細(xì)胞是將如下編碼基因?qū)肽康纳锛?xì)胞后得到的表達(dá)所述酶系統(tǒng)的重組生物細(xì)胞: 如序列表中序列4所示的所述丙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的編碼基因； 如序列表中序列5所示的所述輔酶A依賴型琥珀酸半醛脫氫酶的編碼基因； 如序列表中序列6所示的所述3-羥基丙酸脫氫酶的編碼基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述生物細(xì)胞為微生物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述生物細(xì)胞為大腸桿菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于:所述重組生物細(xì)胞為權(quán)利要求9中所述的重組大腸桿菌I。
9.如下(I)或(II)或(III)的生物材料: (I)如下DNA片段中的全部或部分: (bl)核苷酸序列為序列表中序列4所示的DNA片段； (b2)核苷酸序列為序列表中序列5所示的DNA片段； (b3)核苷酸序列為序列表中序列6所示的DNA片段； (II)重組質(zhì)粒A和/或重組質(zhì)粒B: 所述重組質(zhì)粒A為攜帶并表達(dá)(bl)中所述DNA片段的重組表達(dá)載體；所述重組質(zhì)粒B為攜帶并表達(dá)(b2)中所述DNA片段和(b3)中所述DNA片段的重組表達(dá)載體。 (III)重組大腸桿菌I或/和重組大腸桿菌2或/和重組大腸桿菌3: 所述重組大腸桿菌I為攜帶(II)中所述重組質(zhì)粒A和所述重組質(zhì)粒B，并表達(dá)(bl)中所述DNA片段、(b2)中所述DNA片段和(b3)中所述DNA片段的大腸桿菌； 所述重組大腸桿菌2為攜帶(II)中所述重組質(zhì)粒A，并表達(dá)(bl)中所述DNA片段的大腸桿菌； 所述重組大腸桿菌3為攜帶(II)中所述重組質(zhì)粒B，并表達(dá)b2)中所述DNA片段和(b3)中所述DNA片段的大腸桿菌。
10.權(quán)利要求9所述的生物材料在利用L-乳酸或其鹽合成S-1，2-丙二醇中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/19GK103589756SQ201310573064
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月15日
【發(fā)明者】管祥辰, 王麗敏, 于波, 馬延和 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所