本發(fā)明涉及包括蛋白酶體抑制劑和含有暴露的arg-gly-asp(rgd)部分的環(huán)肽的組合。具體地，本發(fā)明涉及包括選自由硼酸酯、環(huán)氧酮、肽醛和β-內(nèi)酯蛋白酶抑制劑組成的組的蛋白酶體抑制劑；和含有暴露的arg-gly-asp(rgd)部分的環(huán)肽的組合。更具體地，本發(fā)明涉及包含選自由硼替佐米(bortezomib)、德蘭佐米(delanzomib)、艾沙佐米(ixazomib)、卡非佐米(carfilzomib)、奧普佐米(oprozomib)、mg132和麻日佐米(marizomib)組成的組的蛋白酶體抑制劑；和含有暴露的arg-gly-asp(rgd)部分的環(huán)肽的組合。

本發(fā)明涉及用作例如在如癌癥等過度增殖性疾病的治療中的藥劑的組合。

本發(fā)明還涉及包括所述組合的藥物組合物以及包括所述組合的各組分的試劑盒。

背景技術(shù)：

硼替佐米(btz)是靜脈注射(iv)或皮下(sc)使用的抗腫瘤劑。硼替佐米的結(jié)構(gòu)為：

硼替佐米是哺乳動物細(xì)胞中26s蛋白酶體的糜蛋白酶樣活性的可逆抑制劑。26s蛋白酶體是一種大的蛋白質(zhì)復(fù)合物，可以使泛素化的蛋白質(zhì)降解。泛素-蛋白酶體通路在調(diào)節(jié)特定蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)濃度方面發(fā)揮重要作用，從而維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。26s蛋白酶體的抑制可以防止這種靶向的蛋白水解，這可以影響細(xì)胞內(nèi)的多個(gè)信號級聯(lián)。這種正常穩(wěn)態(tài)機(jī)制的破壞可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡。實(shí)驗(yàn)證實(shí)硼替佐米對體外各種癌細(xì)胞類型具有細(xì)胞毒性。硼替佐米在包括多發(fā)性骨髓瘤在內(nèi)的非臨床腫瘤模型中導(dǎo)致體內(nèi)腫瘤生長的延遲。

來自利用硼替佐米的體外、離體和動物模型的數(shù)據(jù)表明其增加成骨細(xì)胞分化和活性并抑制破骨細(xì)胞功能。已經(jīng)在受到晚期溶骨性疾病的影響并用硼替佐米治療的多發(fā)性骨髓瘤患者中觀察到這些作用。

德蘭佐米(dlz)，([(1r)-1-[[(2s,3r)-3-羥基-2-[[(6-苯基吡啶-2-基)羰基]氨基]-1-氧丁基]氨基]-3-甲基丁基]硼酸)，是靜脈注射(iv)、口服或皮下(sc)使用的抗腫瘤劑。德蘭佐米的結(jié)構(gòu)為：

德蘭佐米也是哺乳動物細(xì)胞中26s蛋白酶體的糜蛋白酶樣活性的可逆抑制劑。實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明德蘭佐米在體外對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系具有細(xì)胞毒性(piva等人，blood2008；111:2765–75，dorsey等人，j.medchem2008；51:1068-72)。德蘭佐米在包括多發(fā)性骨髓瘤在內(nèi)的非臨床腫瘤模型中導(dǎo)致體內(nèi)腫瘤生長減少(sanchez等，br.j.haematol2010；148:569-81)。

艾沙佐米(ixz)是靜脈注射(iv)、口服或皮下(sc)使用的抗腫瘤劑。艾沙佐米用檸檬酸配制用于臨床用途：檸檬酸鹽與血漿或水溶液一接觸即刻水解(kupperman等人，cancerres.2010；70:1970-80)。最終制劑稱為檸檬酸艾沙佐米，開始被命名為‘mln9708’，其含有活性藥物組分‘mln2238’(艾沙佐米)和檸檬酸部分。

艾沙佐米(mln2238)([(1r)-1-[[2-[(2,5-二氯苯甲?；?氨基]乙?；鵠氨基]-3-甲基-丁基]硼酸)的結(jié)構(gòu)如下示出：

檸檬酸艾沙佐米(mln9708)(2,2'-{2-[(1r)-1-{[n-(2,5-二氯苯甲?；?甘氨酰]氨基}-3-甲基丁基]-5-氧-1,3,2-二氧雜硼雜環(huán)戊烷(dioxaborolane)-4,4-二基}二乙酸)的結(jié)構(gòu)如下示出：

艾沙佐米也是哺乳動物細(xì)胞中26s蛋白酶體的糜蛋白酶樣活性的可逆抑制劑。

kupperman及其同事(kupperman等人，cancerres.2010；70:1970-80)描述了與硼替佐米相比，艾沙佐米與蛋白酶體的生理化學(xué)、藥代動力學(xué)、藥效學(xué)、抗腫瘤活性和相互作用。硼替佐米和艾沙佐米優(yōu)先與20s蛋白酶體的β5位點(diǎn)結(jié)合，也與較高濃度的β2和β1位點(diǎn)結(jié)合。盡管艾沙佐米和硼替佐米對蛋白酶體中的活性位點(diǎn)的親和力大致相同，但發(fā)現(xiàn)艾沙佐米保持與蛋白酶體結(jié)合較短的時(shí)間。艾沙佐米的蛋白酶體解離半衰期約為18分鐘，而硼替佐米的解離半衰期為約110分鐘，即艾沙佐米比硼替佐米的釋放快約6倍。艾沙佐米在體外對各種癌細(xì)胞系包括黑素瘤、肺癌和結(jié)直腸癌細(xì)胞系等具有細(xì)胞毒性。艾沙佐米在幾種臨床前模型中也表現(xiàn)出體內(nèi)抗腫瘤活性。在cwr22人前列腺癌異種移植物中，硼替佐米和艾沙佐米均以其最大耐受劑量(mtd)顯示出有效的抗腫瘤活性。艾沙佐米在一半mtd時(shí)證明比硼替佐米更有效。在wsu-dlcl2淋巴瘤異種移植模型中，艾沙佐米顯示出顯著的抗腫瘤活性，而硼替佐米在其mtd時(shí)無效。類似地，在代表彌漫性淋巴瘤的oci-ly7-luc模型中，與硼替佐米相比，用艾沙佐米治療的動物表現(xiàn)出改善的抗腫瘤作用。還發(fā)現(xiàn)艾沙佐米具有口服生物利用度，這意味著口服給藥可以是包括艾沙佐米的治療的方案(kupperman等人，cancerres.,2010；70:1970-80)。lee及其同事將此分析擴(kuò)展到包括幾種另外的淋巴瘤模型，基于異種移植物的淋巴瘤模型(oci-ly10和phtx22l)和基因工程小鼠模型imyc^cα/bcl-xl，均設(shè)計(jì)成更多地代表人類癌癥的臨床進(jìn)展。在各情況下，使用艾沙佐米的mtd水平治療與使用硼替佐米的mtd-水平治療至少一樣有效。在phtx22l異種移植物的情況下，僅發(fā)現(xiàn)艾沙佐米顯示抗腫瘤作用。艾沙佐米在dp54-luc模型中也有效緩解溶骨性骨病(lee等，clin.cancerres.,2011；17：7313-23)。應(yīng)注意的是，由于艾沙佐米在動物模型中表現(xiàn)出較高的mtd，所以在kupperman和lee等人的研究中，艾沙佐米以比硼替佐米高出十倍以上的濃度遞送，因此所觀察到的改善可能與遞送的較高劑量有關(guān)，而不是與艾沙佐米的化學(xué)性質(zhì)有關(guān)。然而，與硼替佐米相比，降低的毒性是艾沙佐米的一個(gè)重要特征，定義了其潛在的臨床適用性(意味著艾佐佐米與硼替佐米相比增加的劑量在臨床上是可行的)。

在臨床試驗(yàn)中評估時(shí)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)檸檬酸艾沙佐米通過口服和靜脈途徑均耐受性良好，其mtd值通常大于硼替佐米所顯示的值。檸檬酸艾沙佐米已被試驗(yàn)用于各種實(shí)體瘤和非霍奇金淋巴瘤的靜脈內(nèi)治療，以及多發(fā)性骨髓瘤的口服治療(參見allegra等人，leukemiaresearch2014；38:1-9)。計(jì)劃iii期臨床試驗(yàn)用于評價(jià)檸檬酸艾沙佐米與(來那度胺)和地塞米松組合用于治療骨髓瘤或全身性輕鏈淀粉樣變性，在各情況下口服遞送(clintrials.gov標(biāo)識符nct01564537，nct01659658，nct01850524和nct0218141)。

卡非佐米(cfz)具有如下結(jié)構(gòu)：

卡非佐米在i期試驗(yàn)中使用的最高劑量下，對患者血液中蛋白酶體的糜蛋白酶樣活性的抑制作用比硼替佐米高88％，其中尚未達(dá)到最大耐受劑量(o'conner等人，2009clin.cancerres.15,7085-7091)。在ii期試驗(yàn)中，卡非佐米在嚴(yán)重的預(yù)先治療的患者群體中獲得24％的部分反應(yīng)率(partialresponserate)，為多藥療法的五種以前治療的中值(kisselev等，化學(xué)與生物學(xué)19，2012年1月27日，99-115)。與硼替佐米相比，外周神經(jīng)病變的發(fā)生率大大降低(molineaux,s.m.(2012),clin.cancerres.18,15–20)。

奧普佐米(opz)具有如下結(jié)構(gòu)：

奧普佐米是卡非佐米的口服可用類似物(zhou,h.j.等人(2009).j.med.chem.52,3028–3038)。

mg-132具有如下結(jié)構(gòu)：

mg-132是一種快速可逆的、有效抑制劑，其通過與活性位點(diǎn)蘇氨酸的羥基形成半縮醛來阻斷蛋白酶體(kisselev等人，chemistry&biology19,27january2012,99–115)。

麻日佐米具有如下結(jié)構(gòu)：

麻日佐米源自海洋微生物熱帶鹽孢菌(salinisporatropica)(chauhan等人，cancercell8,407–419)。麻日佐米通過將起催化作用的蘇氨酸羥基酯化來使蛋白酶體失活。由于抑制劑的氯原子的親核取代，β-內(nèi)酯環(huán)的打開之后形成四氫呋喃環(huán)(groll等人，j.am.chem.soc.128,5136-5141)。所有β-內(nèi)酯加成物被水緩慢水解，導(dǎo)致蛋白酶體的再活化(dick等人，j.biol.chem.272,182-188)。麻日佐米是目前正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)的所有蛋白酶體抑制劑中最有效的。它產(chǎn)生更強(qiáng)(高達(dá)100％)和更持久的糜蛋白酶樣位點(diǎn)的抑制，并且還靶向胰蛋白酶樣和半胱天冬酶樣位點(diǎn)(potts等人，curr.cancerdrugtargets11,254–284)。

已知含有暴露的rgd(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)氨基酸序列的肽結(jié)合整聯(lián)蛋白，并已經(jīng)對靶向藥物遞送進(jìn)行了大量研究(參見temming等人，drugresistanceupdates8(2005)381-402)。由于它們與在某些癌癥特別是腫瘤血管中過度表達(dá)的αvβ3整聯(lián)蛋白結(jié)合，所以含rgd的肽也已被直接用作抗癌劑。一個(gè)這樣的例子是西侖吉肽或emd121974，一種含有rgd序列的5個(gè)氨基酸的環(huán)化肽，已在黑色素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和前列腺癌的臨床試驗(yàn)中試驗(yàn)。雖然三個(gè)氨基酸rgd基序本身是不可變的，但是通過改變側(cè)翼氨基酸序列的數(shù)量和組成可以改變靶向的特異性和親和力(avidity)。將核心rgd序列維持在含有d-氨基酸的環(huán)狀結(jié)構(gòu)中表現(xiàn)出增加的穩(wěn)定性和對α整聯(lián)蛋白的結(jié)合親和力。

西侖吉肽已被列入美國和歐洲至少38項(xiàng)臨床試驗(yàn)(14項(xiàng)i期，5項(xiàng)i/ii期，17項(xiàng)ii期和2項(xiàng)iii期)的研究對象，其中該藥物已對患有非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、腦腫瘤、乳腺腫瘤、頭頸部轉(zhuǎn)移性鱗狀細(xì)胞癌、前列腺癌、白血病、黑素瘤、淋巴瘤和晚期實(shí)體瘤、卡波西肉瘤的患者進(jìn)行了試驗(yàn)。就組合療法而言，已經(jīng)測試了西侖吉肽與貝伐單抗、丙卡巴肼、放化療(標(biāo)準(zhǔn)放射療法和基于順鉑和長春瑞濱的化學(xué)療法)、替莫唑胺、皮質(zhì)類固醇、放射療法、馬來酸西地那非、紫杉醇、西妥昔單抗、5-氟尿嘧啶(5-fu)、蘋果酸舒尼替尼、異長春花堿(venorelbine)和吉西他濱的組合。然而，這些組合并沒有得到美國或歐洲機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)。

我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體抑制劑與含有暴露的arg-gly-asp(rgd)部分的環(huán)肽的組合相對于各單獨(dú)組分的總和產(chǎn)生協(xié)同治療效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)方面，提供一種包括：(i)蛋白酶體抑制劑及其藥學(xué)上可接受的鹽；和(ii)環(huán)肽的組合，其中所述環(huán)肽含有暴露的arg-gly-asp(rgd)部分。

本發(fā)明的另一方面，提供一種包括：(i)蛋白酶體抑制劑及其藥學(xué)上可接受的鹽；和(ii)環(huán)肽的組合，其中所述環(huán)肽含有暴露的arg-gly-asp(rgd)部分，其用作藥劑。

本發(fā)明的另一方面，提供一種包括：(i)蛋白酶體抑制劑及其藥學(xué)上可接受的鹽；和(ii)環(huán)肽的組合，其中所述環(huán)肽含有暴露的arg-gly-asp(rgd)部分，其用于治療腫瘤疾病，例如過度增殖性疾病，如癌癥。

本發(fā)明的另一方面，提供一種腫瘤疾病例如過度增殖性疾病如癌癥的治療方法，所述方法包括向需要其的受試者施用包括：(i)蛋白酶體抑制劑及其藥學(xué)上可接受的鹽；和(ii)環(huán)肽的組合，其中所述環(huán)肽含有暴露的arg-gly-asp(rgd)部分。

本發(fā)明的另一方面，提供一種藥物組合物，其包括本發(fā)明的組合與藥學(xué)上可接受的賦形劑。

本發(fā)明的另一方面，提供一種試劑盒，其包括作為獨(dú)立組分的：(i)蛋白酶體抑制劑及其藥學(xué)上可接受的鹽；和(ii)環(huán)肽，其中所述環(huán)肽含有暴露的arg-gly-asp(rgd)部分。

本發(fā)明的另一方面，提供一種環(huán)肽用于改善蛋白酶體抑制劑及其藥學(xué)上可接受的鹽的治療活性的用途，其中所述環(huán)肽含有暴露的arg-gly-asp(rgd)部分。

這些和其他實(shí)施方案通過詳細(xì)的描述公開或根據(jù)其中包括的內(nèi)容是顯而易見的。

附圖說明

在下文中將參考附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明的實(shí)施例，其中：

圖1：含半胱氨酸的環(huán)狀rgd肽對蛋白酶體抑制劑硼替佐米的增強(qiáng)。示出當(dāng)用10μmbtz、與10μmrgdfc(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-d-苯丙氨酸-半胱氨酸)肽組合的10μmbtz、或無btz的10μmrgdfc(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-d-苯丙氨酸-半胱氨酸)肽處理時(shí)，與未處理的hek293細(xì)胞相比的％相對細(xì)胞生長值的直方圖。結(jié)果以在分析中包括的五次實(shí)驗(yàn)重復(fù)的平均值的±標(biāo)準(zhǔn)誤差示出。將對照細(xì)胞生長賦予100％的相對細(xì)胞生長值，并且相對于該數(shù)值計(jì)算所有細(xì)胞生長值。

圖2：含賴氨酸的環(huán)狀rgd肽對各種蛋白酶體抑制劑的增強(qiáng)。相對于對照的生長(即，負(fù)值代表細(xì)胞殺傷，正值<100％代表細(xì)胞生長抑制)。在hek293和cos7細(xì)胞中進(jìn)行初始單劑量評估(±10μm各蛋白酶體抑制劑，±10μmc(rgdfk)(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-d-苯丙氨酸-賴氨酸))。(btz-硼替佐米；ixz-艾沙佐米；dlz-德蘭佐米；cfz-卡非佐米；opz-奧普佐米；mg132)。

圖3：西侖吉肽對硼替佐米和卡非佐米蛋白酶體抑制劑的增強(qiáng)。相對于對照的生長(即，負(fù)值代表細(xì)胞殺傷，正值<100％代表細(xì)胞生長抑制)。在hek293中進(jìn)行初始單劑量評估(±10μm硼替佐米或卡非佐米，±1或10μm西侖吉肽)。(btz-硼替佐米；cfz-卡非佐米)。

圖4：西侖吉肽和btz對t47d乳腺癌細(xì)胞系的影響。相對于對照(未處理)細(xì)胞的細(xì)胞生長。該圖示出了磺酰羅丹明b測定的結(jié)果，繪制為od570nm(測試)/od570nm(對照)。對照＝僅用稀釋劑處理的孔(＝'無添加物')。

圖5：btz和西侖吉肽組合療法對體內(nèi)骨髓瘤異種移植物的影響。在給藥：(1)媒介物+媒介物；(2)媒介物+西侖吉肽(45mg/kg)；(3)0.2mg/kgbtz+媒介物；(4)0.2mg/kgbtz+西侖吉肽(45mg/kg)；(5)1mg/kgbtz+媒介物；和(6)1mg/kgbtz+西侖吉肽(45mg/kg)的第4天，植入有1×10⁷個(gè)nci-h929腫瘤細(xì)胞的cb.17scid小鼠的平均腫瘤大小。

圖6：示出硼替佐米和西侖吉肽在各種摩爾比下的協(xié)同作用的等效線圖(isobologram)。評估與兩種藥劑的期望劑量相比導(dǎo)致生存力降低50％的兩種藥劑的組合，如果組合效果是相加的，預(yù)測其顯示出相同的生存力降低。劑量對(等效點(diǎn))的位置表示兩種藥劑是否相加(落在或接近線上)，次加性/拮抗(落在線上方/右側(cè))或超加性/協(xié)同(落在線下方/左側(cè))。

圖7：btz(0.2、0.5、0.7或0.9mg/kg每兩周一次靜脈內(nèi)注射)和西侖吉肽或媒介物(每日腹膜內(nèi)注射45mg/kg)的作用。在研究中的主要終點(diǎn)評估腫瘤生長抑制(tgi)(第21天或媒介物處理的對照動物達(dá)到平均腫瘤體積為2000mm³的那一天-在該情況下，在第18天達(dá)到該終點(diǎn))。

圖8：btz(0.2、0.5、0.7或0.9mg/kg每兩周一次靜脈內(nèi)注射)和西侖吉肽或媒介物(每日腹膜內(nèi)注射45mg/kg)的作用。結(jié)合圖7中的所有組的數(shù)據(jù)，而不考慮硼替佐米濃度，并且分為兩組處理，n＝40只小鼠/組(即加或減西侖吉肽)。使用非參數(shù)kruskal-wallis檢驗(yàn)來評估這些組顯示的腫瘤體積之間的差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＝3.465×10^-7)。

圖9：0.2mg/kgbtz(每兩周一次靜脈內(nèi)注射)±45mg/kg西侖吉肽(每日腹膜內(nèi)注射)至第31天的kaplan-meier圖，提供時(shí)間對終點(diǎn)(timetoendpoint,tte)的差異。tte計(jì)算為tte＝[log(終點(diǎn)體積)-b]/m，其中tte以天表示，終點(diǎn)體積以mm³表示，b為截距，m為通過對數(shù)轉(zhuǎn)化的腫瘤生長數(shù)據(jù)集的線性回歸得到的線的斜率。

圖10：0.5mg/kgbtz(每兩周一次靜脈內(nèi)注射)±45mg/kg西侖吉肽(每日腹膜內(nèi)注射)直到第31天的kaplan-meier圖，提供時(shí)間對終點(diǎn)(tte)的差異。tte計(jì)算為tte＝[log(終點(diǎn)體積)-b]/m，其中tte以天表示，終點(diǎn)體積以mm³表示，b為截距，m為通過對數(shù)轉(zhuǎn)化的腫瘤生長數(shù)據(jù)集的線性回歸得到的線的斜率。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施方式同樣適用于本發(fā)明的任何上述方面。

蛋白酶體抑制劑:

在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑為硼酸酯化合物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑為環(huán)氧酮化合物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑為肽醛化合物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑為β-內(nèi)酯蛋白酶抑制劑化合物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑為選自由硼替佐米、德蘭佐米和艾沙佐米組成的組的硼酸酯化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑為硼替佐米。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑為德蘭佐米。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑為艾沙佐米。

在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑為環(huán)氧酮化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑為卡非佐米。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑為奧普佐米。

在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑為肽醛化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑為mg132。

在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑為β-內(nèi)酯蛋白酶抑制劑化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑為麻日佐米。

環(huán)肽組分：

在一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)肽具有如下結(jié)構(gòu):

其中：

r^a、r^b和r^c為氨基酸側(cè)鏈殘基；

r^d各自獨(dú)立地選自由h、c1烷基、c2烷基和c3烷基組成的組；

m為0、1或2；

n為0、1或2；

條件是n+m的值為0、1或2。

在一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)肽具有如下結(jié)構(gòu)：

其中：

r^a、r^b和r^c為氨基酸側(cè)鏈殘基；

m為0、1或2；

n為0、1或2；

條件是n+m的值為0、1或2。

在一個(gè)實(shí)施方案中，r^a、r^b和r^c為丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸、硒代半胱氨酸或吡咯賴氨酸的氨基酸側(cè)鏈殘基。

在一個(gè)實(shí)施方案中，m為0且n為0。在替代的實(shí)施方案中，m為1且n為0。在一個(gè)實(shí)施方案中，m為0且n為1。在替代的實(shí)施方案中，m為1且n為1。在替代的實(shí)施方案中，m為0且n為2。在替代的實(shí)施方案中，m為2且n為0。優(yōu)選，m為0且n為1。

在一個(gè)實(shí)施方案中，r^a為賴氨酸的氨基酸側(cè)鏈殘基。

在一個(gè)實(shí)施方案中，r^b為苯丙氨酸的氨基酸側(cè)鏈殘基。

在一個(gè)實(shí)施方案中，m為0且n為1；r^a為賴氨酸的氨基酸側(cè)鏈殘基；和r^b為苯丙氨酸的氨基酸側(cè)鏈殘基。

在一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)肽組分的氨基酸殘基的氨基酸的各胺氮可以獨(dú)立地單烷基化。在其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的胺氮為單烷基化的實(shí)施方案中，烷基為甲基或乙基，優(yōu)選甲基。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)肽組分的氨基酸殘基的至少之一為n-甲基氨基酸殘基。

在一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)肽組分：

具有如下結(jié)構(gòu)：

其中r^d各自獨(dú)立地選自由h、c1烷基、c2烷基和c3烷基組成的組。

在一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)肽組分：

具有如下結(jié)構(gòu)：

在一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)肽組分為西侖吉肽，即具有如下結(jié)構(gòu)：

蛋白酶體抑制劑和環(huán)肽組分的組合

在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑與環(huán)肽組分之比在1:20000至20000:1w/w的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑與環(huán)肽組分之比在1:20000至1000:1w/w的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑與環(huán)肽組分之比在1:20000至10:1w/w的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑與環(huán)肽組分之比在1:10000至1000:1w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑與環(huán)肽組分之比在1:10000至10:1w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑與環(huán)肽組分之比在1:5000至1000:1w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑與環(huán)肽組分之比在1:5000至10:1w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑與環(huán)肽組分之比在1:2000至10:1w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑與環(huán)肽組分之比在1:1000至1000:1的范圍內(nèi)，優(yōu)選1:100至1:100，更優(yōu)選1:10至10:1和仍更優(yōu)選1:1w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑與環(huán)肽組分之比在1:1000至1:1；1:900至1:1；1:800至1:1；1:700至1:1；1:600至1:1；或1:500至1:1w/w的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶體抑制劑與環(huán)肽組分之比在1:400至1:1的范圍內(nèi)；1:450至1:1；1:400至1:1；1:350至1:1；1:300至1:1；或1:250至1:1w/w。在一個(gè)實(shí)施方案中，環(huán)肽:蛋白酶體抑制劑之比在50:1和200:1w/w之間，在60:1和190:1w/w之間，在70:1和180:1w/w之間或在70:1和170:1w/w之間。

本發(fā)明提供蛋白酶體抑制劑和含有暴露的arg-gly-asp(rgd)部分的環(huán)肽的組合，其相對于蛋白酶體抑制劑和含有暴露的arg-gly-asp(rgd)部分的環(huán)肽的每一個(gè)表現(xiàn)出協(xié)同的治療效果。例如，本發(fā)明組合的治療效果相對于蛋白酶體抑制劑和含有暴露的arg-gly-asp(rgd)部分的環(huán)肽的每一個(gè)至少是相加的。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合的治療效果大于相加。例如，在本文的實(shí)施例中說明了協(xié)同效應(yīng)。

可使用本發(fā)明的組合治療的疾病

在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用本發(fā)明的組合治療的疾病包括選自包括多發(fā)性骨髓瘤和套細(xì)胞淋巴瘤的組的病癥。

在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用本發(fā)明的組合治療的疾病包括選自包括彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤、前列腺癌、肺癌、非特異性實(shí)體瘤和復(fù)發(fā)/難治性骨髓瘤的組的病癥。

在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用本發(fā)明的組合治療的疾病包括腫瘤疾病。

在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用本發(fā)明的組合治療的疾病涉及腫瘤形成的治療。

在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用本發(fā)明的組合治療的疾病包括選自由以下組成的組的病癥：多發(fā)性骨髓瘤(例如轉(zhuǎn)移性多發(fā)性骨髓瘤)；肺癌；非小細(xì)胞肺癌(例如轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺上皮癌或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌)；小細(xì)胞肺上皮癌；實(shí)體瘤；淋巴瘤(例如淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤，彌漫性大b細(xì)胞淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，濾泡性淋巴瘤或外周t細(xì)胞淋巴瘤)；慢性淋巴樣白血病；t細(xì)胞幼淋巴細(xì)胞白血??；乳腺癌(例如轉(zhuǎn)移性乳腺癌)；宮頸癌；結(jié)直腸癌；結(jié)腸癌；黑色素瘤；前列腺癌(例如激素難治性前列腺癌)；胰腺癌(例如轉(zhuǎn)移性胰腺癌)；卵巢癌；成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(例如多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)；頭鱗狀細(xì)胞癌；頸鱗狀細(xì)胞癌；淀粉樣變性(例如原發(fā)性系統(tǒng)性淀粉樣變性)；骨病癥；血液惡性腫瘤(haematologicalmalignancies)；移植物抗宿主病，或其組合。

在一個(gè)實(shí)施方案中，可使用本發(fā)明的組合治療的疾病包括選自由以下組成的組的病癥：華氏巨球蛋白血癥(macroglobulinaemia)，冒煙性骨髓瘤(smolderingmyeloma)和未知意義的單克隆丙種球蛋白病(monoclonalgammopathyofunknownsignificance,mgus)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合對于表達(dá)rgd敏感性整聯(lián)蛋白如αvβ3或αvβ5整聯(lián)蛋白的細(xì)胞表現(xiàn)出改善的細(xì)胞毒性和/或改善的抗粘附性(相對于蛋白酶體抑制劑的作用和/或含有暴露的arg-gly-asp(rgd)部分的環(huán)肽的作用)。整聯(lián)蛋白的表達(dá)是腫瘤血管生成和細(xì)胞附著的因素。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合對于由rgd敏感性整聯(lián)蛋白如αvβ3或αvβ5整聯(lián)蛋白調(diào)節(jié)的癌癥表現(xiàn)出改善的細(xì)胞毒性和/或改善的抗粘附性(相對于蛋白酶體抑制劑的作用和/或含有暴露的arg-gly-asp(rgd)部分的環(huán)肽的作用)。整聯(lián)蛋白可以直接在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)，或者在不是腫瘤細(xì)胞但與腫瘤細(xì)胞相互作用(例如通過粘附或血管發(fā)生)的細(xì)胞上表達(dá)。

定義：

本發(fā)明包括具體公開的化合物的互變異構(gòu)體，以及其中化學(xué)上可能的幾何和光學(xué)異構(gòu)體。因此，當(dāng)具體公開的化合物包括烯烴雙鍵(例如，具有部分的化合物)時(shí)，所述結(jié)構(gòu)意欲包括e-和z-幾何異構(gòu)體二者。

術(shù)語“氨基酸側(cè)鏈殘基”包括天然和合成氨基酸的殘基。天然氨基酸類包括蛋白氨基酸和天然存在的非蛋白氨基酸。這些天然存在的非蛋白氨基酸是可以在例如體內(nèi)或菜肴食品中發(fā)現(xiàn)但不參與蛋白質(zhì)生物合成的氨基酸。存在二十二種蛋白氨基酸，并且這二十二種中只有二十種直接由通用遺傳密碼編碼。剩余的兩種，硒代半胱氨酸和吡咯賴氨酸，通過獨(dú)特的合成機(jī)制摻入蛋白質(zhì)中。本發(fā)明意欲涵蓋二十種通用編碼的氨基酸加上上述剩余的兩種。因此，術(shù)語“氨基酸側(cè)鏈殘基”包括以下氨基酸的側(cè)鏈：丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸、硒代半胱氨酸和吡咯賴氨酸。

上述氨基酸的側(cè)鏈可以為(r)或(s)構(gòu)型。因此，l-和d-氨基酸均在本發(fā)明的范圍內(nèi)，盡管d-氨基酸當(dāng)然不是天然存在的。

如上所述，術(shù)語“氨基酸側(cè)鏈殘基”還包括非蛋白氨基酸，例如可以在翻譯期間摻入蛋白質(zhì)中的氨基酸(包括吡咯賴氨酸、鳥氨酸和硒代半胱氨酸)。術(shù)語“非蛋白氨基酸”還包括蛋白氨基酸的同系物，例如但不限于高精氨酸。術(shù)語“非蛋白氨基酸”還包括β氨基酸，例如但不限于β-丙氨酸。術(shù)語“氨基酸”還包括天然氨基酸的內(nèi)酰胺類似物，例如但不限于焦谷氨酰胺(pyroglutamine)。

“非蛋白氨基酸”是有機(jī)化合物，其是氨基酸，但不在由標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼編碼的那些中，或在翻譯過程中摻入蛋白質(zhì)中。因此，非蛋白氨基酸包括除20種蛋白氨基酸以外的氨基酸或氨基酸類似物，并且包括但不限于蛋白氨基酸的d-立體異構(gòu)體(isostereomers)。非蛋白氨基酸的實(shí)例包括但不限于：瓜氨酸、高瓜氨酸、羥脯氨酸、高精氨酸、高絲氨酸、高酪氨酸、高脯氨酸、鳥氨酸、4-氨基-苯丙氨酸、肌氨酸、聯(lián)苯丙氨酸、高苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氟-苯丙氨酸、2,3,4,5,6-五氟-苯丙氨酸、正亮氨酸、環(huán)己基丙氨酸、n-乙酸、o-甲基絲氨酸(即具有式的氨基酸側(cè)鏈)、乙酰氨基丙氨酸(即具有式的氨基酸側(cè)鏈)、β-丙氨酸、β-(乙酰氨基)丙氨酸、β-氨基丙氨酸、β-氯代丙氨酸、α-氨基異丁酸、n-甲基-丙氨酸、n-甲基-甘氨酸、n-甲基谷氨酸、叔丁基甘氨酸、α-氨基丁酸、α-氨基異丁酸、醋酸(acedicacid)、2-氨基異丁酸、2-氨基茚滿-2-羧酸、硒代甲硫氨酸、羊毛硫氨酸(lanthionine)、脫氫丙氨酸、γ-氨基丁酸、萘基丙氨酸、氨基己酸、苯基甘氨酸、哌啶酸、2,3-二氨基丙酸、四氫異喹啉-3-羧酸、叔亮氨酸、叔丁基丙氨酸、環(huán)己基甘氨酸、二乙基甘氨酸、二丙基甘氨酸、及它們的其中胺氮已被單烷基化或二烷基化的衍生物。非蛋白氨基酸的其他實(shí)例包括對氨基苯甲酸(paba)、5-氨基水楊酸(5-asa)和4-氨基水楊酸(4-asa)。

術(shù)語“氨基”包括–nh2基團(tuán)。

術(shù)語“載體”包括與活性化合物一起施用的稀釋劑、賦形劑和/或媒介物。本發(fā)明的藥物組合物可以含有多于一種載體的組合。這樣的藥物載體可以是無菌液體，例如水，鹽水溶液，葡萄糖水溶液，甘油水溶液，和油類，包括石油，動物、植物或合成來源的那些，例如花生油，大豆油，礦物油和芝麻油等。在某些情況下，有機(jī)溶劑如乙醇、dma(二甲基乙酰胺)、nmp(n-甲基吡咯烷)、dmso(二甲基亞砜)等可以單獨(dú)或與水組合作為載體使用。優(yōu)選采用水或水溶液鹽水溶液和葡萄糖水溶液和甘油水溶液作為載體，特別用于可注射溶液。合適的藥物載體記述于e.w.martin的“remington'spharmaceuticalsciences”第18版中。

術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”包括通常認(rèn)為是安全的分子實(shí)體(molecularentities)和組合物。特別地，在本發(fā)明的實(shí)踐中使用的藥學(xué)上可接受的載體在生理上是可耐受的，并且在向患者施用時(shí)通常不會產(chǎn)生過敏或類似的不良反應(yīng)(例如，胃不適和頭暈等)。優(yōu)選地，如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”意指由適當(dāng)?shù)恼畽C(jī)構(gòu)的管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)或在美國藥典或其他公認(rèn)的藥典中列出的，用于動物、更特別是人的。

“藥學(xué)上可接受的賦形劑”包括賦形劑，其用于制備藥物組合物，通常是安全和無毒的并且沒有生物學(xué)或其他方面的不良作用，并且包括對于獸醫(yī)用途以及人體藥物用途是可接受的賦形劑。本申請中使用的“藥學(xué)上可接受的賦形劑”包括一種和多于一種這樣的賦形劑。

術(shù)語“治療”包括：(1)在可能患有或易患于狀態(tài)、病癥或病況但尚未經(jīng)歷或顯示該狀態(tài)、病癥或病況的臨床或亞臨床癥狀的動物中防止該狀態(tài)、病癥或病況的臨床癥狀的出現(xiàn)；(2)抑制該狀態(tài)、病癥或病況(例如阻止、減少或延緩疾病的發(fā)展，或在維持治療的情況下其至少一種臨床或亞臨床癥狀的復(fù)發(fā))；和/或(3)緩解病況(即導(dǎo)致狀態(tài)、病癥或病況或其至少一種臨床或亞臨床癥狀的消退)。對于待治療患者的益處在于對患者或醫(yī)生統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性或者至少可感知的。

術(shù)語“受試者”包括人類和其他哺乳動物，例如家畜(如狗和貓)。

“有效量”意指足以產(chǎn)生所需治療反應(yīng)的本發(fā)明組合的量。治療反應(yīng)可以是使用者(例如，臨床醫(yī)生)將認(rèn)識到對治療的有效反應(yīng)的任何反應(yīng)。基于治療反應(yīng)的評價(jià)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員進(jìn)一步確定適當(dāng)?shù)闹委煶掷m(xù)時(shí)間、適當(dāng)劑量和任何潛在的組合治療。

術(shù)語“鹽”可以包括酸加成鹽或游離堿的加成鹽。合適的藥學(xué)上可接受的鹽(例如，氨基酸或肽的羧基末端的)包括但不限于金屬鹽如鈉鉀和銫鹽；堿土金屬鹽如鈣和鎂鹽；有機(jī)胺鹽如三乙胺、胍、n-取代胍鹽、乙脒和n-取代乙脒、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、三乙醇胺、二環(huán)己胺和n,n'–二芐基乙二胺鹽。藥學(xué)上可接受的鹽(堿性氮中心的)包括但不限于無機(jī)酸鹽如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽；有機(jī)酸鹽如三氟乙酸鹽和馬來酸鹽；磺酸鹽如甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、樟腦磺酸鹽和萘磺酸鹽；和氨基酸鹽如精氨酸鹽、葡萄糖酸鹽、半乳糖醛酸鹽、丙氨酸鹽、天冬氨酸鹽和谷氨酸鹽(參見，例如berge等人，“pharmaceuticalsalts,”j.pharma.sci.1977；66:1)。

本發(fā)明還包括本發(fā)明的所有藥學(xué)上可接受的同位素標(biāo)記的化合物，其中一個(gè)或多個(gè)原子被具有相同原子數(shù)、但原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)不同于自然界中最常見的原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)的原子代替。

適用于包含在本發(fā)明化合物中的同位素的實(shí)例包括氫的同位素，例如²h和³h，碳的同位素如¹¹c、¹³c和¹⁴c，氯的同位素，如³⁶cl，氟的同位素，如¹⁸f，碘的同位素，如¹²³i和¹²⁵i，氮的同位素，如¹³n和¹⁵n，氧的同位素，如¹⁵o、¹⁷o和¹⁸o，磷的同位素，如³²p，和硫的同位素，如³⁵s。適于包含在本發(fā)明化合物中的同位素的其它實(shí)例包括硼的同位素，例如¹¹b和¹⁰b。

某些同位素標(biāo)記的化合物如摻入放射性同位素的化合物用于藥物和/或底物組織分布研究。鑒于其容易摻入和現(xiàn)成的檢測手段，放射性同位素氚(即³h)和碳-14(即¹⁴c)對于此目的特別有用。

用較重的同位素如氘(即²h)取代可以提供由于更大的代謝穩(wěn)定性例如增加的體內(nèi)半衰期或降低的劑量需求而產(chǎn)生的某些治療優(yōu)點(diǎn)，因此在一些情況下可以是優(yōu)選的。

用正電子發(fā)射同位素(如¹¹c，¹⁸f，¹⁵o和¹³n)進(jìn)行取代可用于正電子發(fā)射成像(pet)研究中以供檢查底物受體占有率。

通常可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)或通過類似于使用適當(dāng)?shù)耐凰貥?biāo)記的試劑代替先前使用的非標(biāo)記試劑所記述的方法來制備同位素標(biāo)記的化合物。

本發(fā)明的用途和方法

本發(fā)明包括的組合可以與其它療法組合施用和/或與其它補(bǔ)充活性劑進(jìn)一步組合施用。在這種組合療法中，本發(fā)明所涵蓋的組合可以在其它療法和/或活性劑之前、同時(shí)或之后施用。本發(fā)明和(一種或多種)其它活性劑的組合也可以摻入單一劑型中。

本發(fā)明所涵蓋的組合可以作為唯一療法應(yīng)用，或者可以涉及除了本發(fā)明組合之外的常規(guī)手術(shù)或放射療法或化學(xué)療法。此類化學(xué)療法可以包括以下類別的抗腫瘤劑中的一種或多種：-

(i)在醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)中使用的其它抗增殖/抗腫瘤藥物及其組合，諸如烷化劑(例如順鉑、奧沙利鉑、卡鉑、環(huán)磷酰胺、氮芥、美法侖、苯丁酸氮芥、白消安、替莫唑胺和亞硝基脲)；抗代謝物(例如吉西他濱和抗葉酸劑如5-氟尿嘧啶和替加氟(tegafur)等氟嘧啶，雷替曲塞，甲氨蝶呤，阿糖胞苷和羥基脲)；抗腫瘤抗生素(例如蒽環(huán)類抗生素，如阿霉素、博來霉素、多柔比星、道諾霉素、表柔比星、伊達(dá)比星、絲裂霉素-c、更生霉素和光輝霉素)；抗有絲分裂藥物(例如長春花生物堿類如長春新堿、長春花堿、長春地辛和長春瑞濱，紫杉烷類如紫杉醇和紫衫特爾，以及polokinase抑制劑)；和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(例如表鬼臼毒素，如依托泊苷和替尼泊苷，胺苯吖啶，托泊替康和喜樹堿)；

(ii)細(xì)胞生長抑制劑，如抗雌激素(例如他莫昔芬，氟維司群，托瑞米芬，雷洛昔芬，屈洛昔芬和碘氧芬)，抗雄激素(例如比卡魯胺，氟他胺，尼魯米特和醋酸環(huán)丙孕酮)，lhrh拮抗劑或lhrh激動劑(例如戈舍瑞林，亮丙瑞林和布舍瑞林)，孕激素(例如醋酸甲地孕酮)，芳香酶抑制劑(例如阿那曲唑，來曲唑，伏立唑和依西美坦)和5α-還原酶抑制劑如非那雄胺；

(iii)抗入侵劑[例如c-src激酶家族抑制劑如4-(6-氯-2,3-亞甲二氧基苯胺基)-7-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]-5-四氫吡喃-4-基氧基喹唑啉(azd0530；國際專利申請wo01/94341)，a-(2-氯-6-甲基苯基)-2-{6-[4-(2-羥基乙基)哌嗪-1-基]-2-甲基嘧啶-4-基氨基}噻唑-5-甲酰胺(達(dá)沙替尼,bms-354825；j.med.chem.,2004,47,6658-6661)和波舒替尼(ski-606)，和金屬蛋白酶抑制劑如馬馬司他(marimastat)，尿激酶纖溶酶原激活受體功能抑制劑或抗類肝素酶的抗體]；

(iv)生長因子功能抑制劑：例如此類抑制劑包括生長因子抗體和生長因子受體抗體(例如抗erbb2抗體曲妥珠單抗[herceptin(tm)]，抗egfr抗體帕尼單抗，抗erbb1抗體西妥昔單抗[erbitux，c225]以及stern等人criticalreviewsinoncology/haematology,2005,vol.54,pp11-29)公開的任何生長因子或生長因子受體抗體；此類抑制劑還包括酪氨酸激酶抑制劑，例如表皮生長因子家族的抑制劑(例如egfr家族酪氨酸激酶抑制劑，例如a/-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-嗎啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼，zd1839)，a/-(3-乙炔基苯基)-6,7-雙(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(厄洛替尼，osi-774)和6-丙烯酰氨基-n-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-嗎啉代丙氧基)-喹唑啉-4-胺(ci1033)，erbb2酪氨酸激酶抑制劑如拉帕替尼)；肝細(xì)胞生長因子家族的抑制劑；胰島素生長因子家族的抑制劑；血小板衍生生長因子家族的抑制劑，如伊馬替尼和/或尼洛替尼(amn107)；絲氨酸/蘇氨酸激酶的抑制劑(例如ras/raf信號傳導(dǎo)抑制劑，如法呢基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，例如索拉非尼(bay43-9006)，替伐非尼(r115777)和洛卡非尼(sch66336))，通過mek和/或akt激酶的細(xì)胞信號傳導(dǎo)抑制劑，c-kit抑制劑，abl激酶抑制劑，pi3激酶抑制劑，plt3激酶抑制劑，csf-1r激酶抑制劑，igf受體(胰島素樣生長因子)激酶抑制劑；極光激酶抑制劑(例如azd1152、ph739358、vx-680、mln8054、r763、mp235、mp529、vx-528和ax39459)，和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑如cdk2和/或cdk4抑制劑；

(v)抗血管生成劑，例如抑制血管內(nèi)皮生長因子的作用的那些，(例如抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子抗體貝伐珠單抗(avastin(tm))，和例如vegf受體酪氨酸激酶抑制劑如凡德他尼(zd6474)，瓦他拉尼(ptk787)，舒尼替尼(sui1248)，阿昔替尼(ag-013736)，帕唑帕尼(gw786034)和4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(azd2171；wo00/47212中的實(shí)施例240)，化合物如國際專利申請wo97/22596、wo97/30035、wo97/32856和wo98/13354中公開的化合物和通過其他機(jī)制工作的化合物(例如利諾胺、整聯(lián)蛋白αvβ3功能抑制劑和血管抑素)]；

(vi)血管損傷劑如康普瑞汀a4和國際專利申請wo99/02166、wo00/40529、wo00/41669、wo01/92224、wo02/04434和wo02/08213中公開的化合物；

(vii)內(nèi)皮素受體拮抗劑，例如齊泊他坦(zibotentan)(zd4054)或阿曲斯坦(atrasentan)；

(viii)反義治療，例如針對上述靶標(biāo)的那些，例如isis2503，抗ras反義；

(ix)基因治療方法，包括例如取代異?；蛉绠惓53或異常brca1或brca2的方法，gdept(基因定向酶前藥治療)方法，例如使用胞嘧啶脫氨酶、胸苷激酶或細(xì)菌硝基還原酶的方法，和增加患者對化療或放療的耐受性的方法，如多藥耐藥基因治療；

(x)免疫治療方法，包括例如離體和體內(nèi)方法來增加患者腫瘤細(xì)胞的免疫原性，例如用細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素2、白細(xì)胞介素4或粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子轉(zhuǎn)染的方法，降低t細(xì)胞無反應(yīng)性的方法，使用轉(zhuǎn)染的免疫細(xì)胞如細(xì)胞因子轉(zhuǎn)染的樹突狀細(xì)胞的方法，使用細(xì)胞因子轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞系的方法和使用抗獨(dú)特型抗體的方法；

(xi)免疫調(diào)節(jié)劑(imid)，包括例如沙利度胺、來那度胺或泊馬度胺；

(xii)類固醇，包括例如地塞米松或潑尼松；

(xiii)組蛋白脫乙酰酶(hdac)抑制劑，包括例如帕比司他或伏立諾他；和

(xiv)單克隆抗體，包括例如達(dá)雷木單抗(daratumumab)或埃羅妥珠單抗(elotuzumab)。

此類組合產(chǎn)物采用在上文所述的劑量范圍內(nèi)的本發(fā)明組合和在其批準(zhǔn)的劑量范圍內(nèi)的其它藥物活性劑。

根據(jù)本發(fā)明的該方面，提供了適用于治療癌癥(例如涉及實(shí)體瘤或白血病的癌癥)的組合，所述組合包括如上文定義的本發(fā)明的組合、或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，以及另一種抗腫瘤劑。

根據(jù)本發(fā)明的該方面，提供了適用于治療癌癥(例如涉及實(shí)體腫瘤或白血病的癌癥)的組合，所述組合包括如上文定義的本發(fā)明的組合或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，以及上述(i)-(xiv)中列出的任何一種抗腫瘤劑。

在本發(fā)明的另一方面，提供了本發(fā)明的組合或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，其與選自本文上述(i)-(xiv)中所列的抗腫瘤劑組合。

在這里，當(dāng)使用術(shù)語“組合”時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解，這是指同時(shí)、單獨(dú)或順次施用。在本發(fā)明的一個(gè)方面，“組合”是指同時(shí)施用。在本發(fā)明的另一方面，“組合”是指單獨(dú)施用。在本發(fā)明的另一方面，“組合”是指順次施用。在施用為順次或單獨(dú)的情況下，第二組分的施用延遲不應(yīng)當(dāng)使得失去組合的有益效果。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的組合或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，其與選自本文上述(i)-(xiv)所列的抗腫瘤劑組合，并與藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體聯(lián)合。

本發(fā)明組合的鹽、溶劑合物和衍生物

本發(fā)明的組合、組合物和方法還涵蓋本文所述組合的組分的鹽和溶劑合物的使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文公開的發(fā)明旨在涵蓋組合的組分的所有藥學(xué)上可接受的鹽(包括氨基酸的任何羧基末端的那些以及任何堿性氮的那些)。

通常，本發(fā)明組合的組分的藥學(xué)上可接受的鹽是通過將該組分與所需的酸或堿(如適用)反應(yīng)來制備的。鹽可以從溶液中沉淀出來并通過過濾收集，或者可以通過蒸發(fā)溶劑來回收。例如，可將酸如鹽酸的水溶液加入到組分的水性懸浮液中，并將所得混合物蒸發(fā)至干燥(凍干)，從而得到固體酸加成鹽?；蛘撸M分可以溶解在合適的溶劑例如醇如異丙醇中，并且酸可以加入到相同的溶劑或其它合適的溶劑中。然后可將所得酸加成鹽直接沉淀，或通過加入極性較小的溶劑如二異丙基醚或己烷沉淀，并過濾分離。

本發(fā)明的組合的組分的酸加成鹽可以通過使游離堿形式與足量的所需酸接觸、以常規(guī)方式生產(chǎn)鹽來制備?？梢酝ㄟ^使鹽形式與堿接觸并以常規(guī)方式分離游離堿而再生游離堿形式。游離堿形式在某些物理性質(zhì)例如在極性溶劑中的溶解性方面與它們各自的鹽形式不同，但在其他方面，出于本發(fā)明的目的，鹽與其各自的游離堿相當(dāng)。

藥學(xué)上可接受的堿加成鹽利用金屬或胺，例如堿金屬和堿土金屬或有機(jī)胺形成。用作陽離子的金屬的實(shí)例是鈉、鉀、鎂和鈣等。合適的胺的實(shí)例是n,n’-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、二環(huán)己胺、乙二胺、n-甲基葡糖胺和普魯卡因。

酸性化合物的堿加成鹽通過使游離酸形式與足量的所需堿接觸、以常規(guī)方式生產(chǎn)鹽來制備。可以通過使鹽形式與酸接觸并分離游離酸來再生游離酸形式。

用于本發(fā)明實(shí)踐的化合物可以具有堿性和酸性中心，因此可以是兩性離子的形式。

有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，許多有機(jī)化合物可以與它們在其中反應(yīng)的或者它們從其中沉淀或結(jié)晶的溶劑形成配合物，即溶劑合物，例如與水形成的水合物。用于本發(fā)明的化合物的鹽可以形成溶劑合物，例如本文使用的水合物。用于制備溶劑合物的技術(shù)在本領(lǐng)域中是公知的(參見例如brittain(1999).polymorphisminpharmaceuticalsolids.marceldecker,newyork)。用于本發(fā)明實(shí)踐的化合物可以具有一個(gè)或多個(gè)手性中心，并且根據(jù)各取代基的性質(zhì)，它們也可以具有幾何異構(gòu)體。

本發(fā)明的藥物組合物

盡管對于本發(fā)明方法的使用中，本發(fā)明的組合(或本發(fā)明的組合的各組分)可以作為散裝物質(zhì)(bulksubstance(s))施用，但優(yōu)選呈現(xiàn)藥物制劑中的各活性成分，例如，其中各藥劑與根據(jù)預(yù)期給藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)實(shí)踐選擇的藥學(xué)上可接受的載體混合。

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供本發(fā)明的組合的組合物(即，包括(i)選自由硼替佐米、德蘭佐米、艾沙佐米、卡非佐米、奧普佐米、mg132和麻日佐米組成的組的蛋白酶體抑制劑及其藥學(xué)上可接受的鹽；和(ii)環(huán)肽二者的組合物，其中所述環(huán)肽含有暴露的arg-gly-asp(rgd)部分)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物以單位劑型呈現(xiàn)。

在替代的實(shí)施方案中，提供一種試劑盒，其包括包含本發(fā)明組合的一種組分的組合物(即，包括(i)選自由硼替佐米、德蘭佐米、艾沙佐米、卡非佐米、奧普佐米、mg132和麻日佐米組成的組的蛋白酶體抑制劑，及其藥學(xué)上可接受的鹽；和(ii)環(huán)肽(其中所述環(huán)肽含有暴露的arg-gly-asp(rgd)部分)中的一個(gè)的組合物)以及包含本發(fā)明組合的其它組分的組合物(即，包括(i)選自由硼替佐米、德蘭佐米、艾沙佐米、卡非佐米、奧普佐米、mg132和麻日佐米組成的組的蛋白酶體抑制劑，及其藥學(xué)上可接受的鹽；和(ii)環(huán)肽(其中所述環(huán)肽含有暴露的arg-gly-asp(rgd)部分)中另一個(gè)的組合物)。

所述組合物包括本發(fā)明的組合的至少一種組分，和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合的至少一種組分以治療有效量存在于組合物中。

本發(fā)明的組合物可以是即釋劑型，即在吸收部位立即釋放組合(或組合的各組分)的劑型，或控釋劑型，即組合(或組合的各組分)在預(yù)定時(shí)間段內(nèi)釋放的劑型?？蒯寗┬涂梢允侨魏纬Ｒ?guī)類型，例如以貯庫或基質(zhì)型擴(kuò)散控制劑型的形式；基質(zhì)、包封或腸溶衣溶解控制劑型；或滲透劑型。例如在remington，thescienceandpracticeofpharmacy，第20版，2000，第858-914頁中公開了這些類型的劑型。

根據(jù)劑型和劑量，本發(fā)明的組合物可以每天施用一至六次。在一個(gè)實(shí)施方案中，期望每天施用本發(fā)明的組合的環(huán)肽部分。例如，本發(fā)明的組合可以涉及西侖吉肽的每日施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，期望每周或每兩周一次地施用本發(fā)明組合的蛋白酶體抑制劑部分。

本發(fā)明中采用的組合本身可以與其它療法和/或活性劑組合使用。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于本發(fā)明實(shí)踐的如上所述的藥物組合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑合物，另外的活性劑，和任選的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。

當(dāng)在相同的制劑中結(jié)合時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的組合的兩種組分優(yōu)選在彼此以及制劑的其它組分的存在下穩(wěn)定并且與彼此以及與制劑的其它組分相容。當(dāng)分開配制時(shí)，它們可方便地依照本領(lǐng)域?qū)@樣的化合物的已知方法，以任何方便的制劑提供。

本文提供的組合(或組合的各組分)可以用方便應(yīng)用于人或獸醫(yī)學(xué)的任何方式配制用于施用。因此，本發(fā)明包括藥物組合物，其包含適于在人或獸醫(yī)學(xué)中使用的本發(fā)明的組合(或組合的各組分)。借助于一種或多種合適的載體，此類組合物可以以常規(guī)方式使用。用于治療用途的可接受的載體在制藥領(lǐng)域中是公知的，并且記述于例如remington'spharmaceuticalsciences，mackpublishingco.(a.r.gennaro編，1985)中。藥物載體的候選可以根據(jù)預(yù)期的施用途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)實(shí)踐來選擇。藥物組合物除了載體之外還可以包含任何合適的粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、包衣劑和/或增溶劑。

蛋白酶體抑制劑可以口服、靜脈內(nèi)或皮下施用。環(huán)肽可以靜脈內(nèi)或皮下施用。

可以在藥物組合物中提供防腐劑、穩(wěn)定劑、染料和甚至是調(diào)味劑。防腐劑的實(shí)例包括苯甲酸鈉、抗壞血酸和對羥基苯甲酸的酯。還可以使用抗氧化劑和懸浮劑。

本發(fā)明的組合(或本發(fā)明的組合的各組分)可以使用已知的研磨程序如濕研磨來研磨，以獲得適合于片劑形成和其它制劑類型的粒度。化合物的細(xì)分的(納米顆粒)制劑可以通過本領(lǐng)域已知的方法制備，參見例如國際專利申請wo02/00196(smithklinebeecham)。

用于本文的藥學(xué)上可接受的緩沖劑的合適實(shí)例包括但不限于檸檬酸、檸檬酸鈉、碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉、氧化鎂、碳酸鈣和氫氧化鎂。

用于本文的藥學(xué)上可接受的表面活性劑的合適實(shí)例包括但不限于十二烷基硫酸鈉和聚山梨醇酯。

藥學(xué)上可接受的防腐劑的合適實(shí)例包括但不限于各種抗細(xì)菌和抗真菌劑如溶劑，例如乙醇、丙二醇、芐醇、氯丁醇、季銨鹽和對羥基苯甲酸酯(例如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯等)。

藥學(xué)上可接受的穩(wěn)定劑和抗氧化劑的合適實(shí)例包括但不限于乙二胺三乙酸(edta)、硫脲、生育酚和丁基羥基茴香醚(butylhydroxyan)。

本發(fā)明的藥物組合物可以含有0.01至99％重量/體積的本發(fā)明包括的組合(或本發(fā)明的組合的各組分)。

劑量

根據(jù)本發(fā)明的方法治療的合適的患者包括需要此類治療的任何人或動物。用于疾病病況的診斷和臨床評估(包括其在動物或人體中的嚴(yán)重性)的方法在本領(lǐng)域中是公知的。因此，確定患者是否需要治療在本領(lǐng)域的普通從業(yè)者(例如，醫(yī)生或獸醫(yī))的技能范圍內(nèi)?；颊邇?yōu)選為哺乳動物，更優(yōu)選為人，但可以是任何受試者或動物，包括臨床試驗(yàn)、篩選或使用動物模型的活動實(shí)驗(yàn)的背景下的實(shí)驗(yàn)室動物。因此，如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地理解的，本發(fā)明的方法和組合物特別適合于施用于任何動物或受試者，特別是哺乳動物，并且包括但不限于家畜如貓科或犬科受試者，農(nóng)場動物例如但不限于牛、馬、山羊(caprine)、綿羊(caprine)和豬受試者，研究動物如小鼠、大鼠、兔、山羊(goats)、綿羊(goats)、豬、狗、貓等，禽類如雞、火雞、鳴禽等。

通常，醫(yī)生將確定最適合個(gè)體受試者的實(shí)際劑量。任何特定個(gè)體的具體劑量水平和劑量頻率可以變化，并且將取決于多種因素，包括所用特定化合物的活性、該化合物的代謝穩(wěn)定性和作用時(shí)間、年齡、體重、總體健康狀況、性別、飲食、施用方式和時(shí)間、排泄率、藥物組合、特定病況的嚴(yán)重程度以及個(gè)體正接受的治療。

根據(jù)要治療的病況的嚴(yán)重性，可以將本領(lǐng)域技術(shù)人員容易確定的合適的治療有效和安全的劑量施用于受試者。對于人的口服施用，組合物的日劑量可以是單劑量或分劑量。治療的持續(xù)時(shí)間可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定，并且應(yīng)當(dāng)反映病況的性質(zhì)和/或?qū)χ委煹闹委熜苑磻?yīng)的速率和程度。通常，醫(yī)生將確定最適合個(gè)體受試者的實(shí)際劑量。

任何特定個(gè)體的具體劑量水平和劑量頻率可以變化，并且將取決于多種因素，包括所用特定化合物的活性、該化合物的代謝穩(wěn)定性和作用時(shí)間、年齡、體重、總體健康狀況、性別、飲食、施用方式和時(shí)間、排泄率、藥物組合、特定病況的嚴(yán)重程度以及個(gè)體正接受的治療。

在治療方法中，本發(fā)明包括的組合本身可以與其它療法組合施用，和/或與其它活性劑組合施用。例如，本發(fā)明包括的組合可以與用于治療該病況的其它活性劑組合施用于患者?；钚詣⑴c本發(fā)明包括的組合組合施用。在這種組合療法中，本發(fā)明包括的組合可以在其它治療和/或活性劑之前、同時(shí)或之后施用。

當(dāng)本發(fā)明包括的組合連同另一種活性劑一起施用時(shí)，這種組合的單獨(dú)組分可以通過任何方便的途徑依次或同時(shí)以單獨(dú)或組合的藥物制劑施用。當(dāng)施用是順次時(shí)，可以首先施用本發(fā)明包括的組合或第二活性劑。例如，在與另一種活性劑的組合療法情況下，本發(fā)明包括的組合可以在將提供藥物組合的有益作用的方案中以順次方式施用。當(dāng)同時(shí)施用時(shí)，組合可以以相同或不同的藥物組合物施用。例如，本發(fā)明包括的組合與另一種活性劑可以以基本上同時(shí)的方式施用，例如在具有這些藥劑的固定比例的單個(gè)膠囊或片劑中，或以每種藥劑的多種分開的劑型施用。

當(dāng)將本發(fā)明的組合與用于治療該病況的方法中有活性的另一種藥劑組合使用時(shí)，各化合物的劑量可能與單獨(dú)使用該化合物時(shí)的劑量不同。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易理解適當(dāng)?shù)膭┝俊?/p>

實(shí)施例

通過參考以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。然而，應(yīng)當(dāng)注意的是，這些實(shí)施例，如上所述的實(shí)施方案，是說明性的而不應(yīng)被解釋為以任何方式限制本發(fā)明的實(shí)施范圍。

實(shí)施例1-當(dāng)硼替佐米和環(huán)狀rgd肽組合時(shí)相對于這些組分的單獨(dú)作用的總和表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。

零假設(shè)：10μmbtz與10μmrgdfc(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-d-苯丙氨酸-半胱氨酸)肽的組合對hek293細(xì)胞不比只有btz時(shí)更有毒。

方法

使用建立的方法學(xué)在t75燒瓶中制備80-100％融合的單層hek293細(xì)胞。將細(xì)胞在補(bǔ)充有10％fbs(gibco)、2mml-谷氨酰胺、100u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的dmem(lonza)(“完全dmem”)中培養(yǎng)。

將t75燒瓶中的細(xì)胞用胰蛋白酶消化并重懸于完全dmem中。使用neubauer室計(jì)數(shù)細(xì)胞，并在96孔平底組織培養(yǎng)板(corning)中以約3×10⁴個(gè)細(xì)胞/cm²和7500個(gè)細(xì)胞/cm²的密度接種細(xì)胞，每孔0.1ml細(xì)胞懸液。將細(xì)胞在37℃/5％co2(加濕)下孵育24小時(shí)。

將硼替佐米(fluorochem)在dmso中制備成30mm，并且直至需要之前儲存在-70℃以下。為了提供工作原料，將btz在dmso中稀釋至10mm。

將凍干肽(anaspecinc.,fremontca，產(chǎn)品63785-1)溶解在1mg/ml的磷酸鹽緩沖鹽水ph7.5(pbs)中制備肽貯液(stock)。將等分試樣儲存在-70℃以下，解凍并在pbs中稀釋至500μm的工作濃度。

將一體積btz與479體積的完全dmem和20體積的500μm肽(或pbs用于陰性對照)組合。這產(chǎn)生大約等摩爾量(20μm)的btz:肽的混合物。

除了使用pbs代替肽貯液和/或dmso代替btz之外，以類似的方式制備對照混合物。

在使用的各細(xì)胞接種密度下，將三個(gè)0.1ml等分試樣加入各混合物(btz+肽和btz+pbs，dmso+肽，dmso+pbs‘僅稀釋劑’)的各板的三個(gè)孔中。

在添加btz-肽/pbs混合物之前，通過用skehan等人改進(jìn)的方法(j.nat.cancerinst.1990,82：1107-1112)，通過磺酰羅丹明b染色分析在所用各接種密度下的含有細(xì)胞的一個(gè)平板，以便在時(shí)間＝零時(shí)建立細(xì)胞密度。簡言之：從孔中取出培養(yǎng)基并用等體積的pbs代替。輕輕加入四分之一體積的50％三氯乙酸，將板在4℃下孵育1-3小時(shí)。將孔用自來水洗滌4次并使其風(fēng)干。將磺酰羅丹明b(sigmaaldrich，0.4％w/v，1％v/v乙酸)加入到各孔中并孵育15-30分鐘。將孔用1％v/v乙酸洗滌4次并使其風(fēng)干。通過加入10mm無緩沖的tris堿溶液(0.1ml/孔)溶解染料。使用elisa板讀數(shù)器(dynexmrx，dynextechnologies)測定光密度(od570nm)。

總共進(jìn)行了5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。用肽/btz混合物或?qū)φ栈旌衔锾幚淼募?xì)胞在37℃/5％co2(加濕)下孵育24小時(shí)，然后通過磺酰羅丹明b測定法分析。

根據(jù)http://web.archive.org/web/20150414025026/http://www.dtp.nci.nih.gov/branches/btb/ivclsp.html.中給出的美國國家研究所的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。從各讀數(shù)中減去背景測量(即，沒有細(xì)胞，僅培養(yǎng)基)的平均值。“ti”為用藥物處理24小時(shí)后的od570nm。tz是時(shí)間＝0(減去背景)的od570nm的平均值?！癱”是用pbs/dmso處理的對照孔(無肽或btz)給出的od570nm的平均值。

％相對細(xì)胞生長由下式給出：

[(ti-tz)/(c-tz)]x100(對于ti≥tz的結(jié)果)

[(ti-tz)/(tz)]x100(對于ti<tz的結(jié)果)

使用這些方程，將對照細(xì)胞生長賦予100％的相對細(xì)胞生長值，并相對于該數(shù)值計(jì)算所有細(xì)胞生長值。當(dāng)時(shí)間＝零時(shí)的od大于藥物孵育后的od時(shí)，返回負(fù)值。

進(jìn)行學(xué)生t檢驗(yàn)以確定是否有證據(jù)拒絕零假設(shè)(見上文)。從五次實(shí)驗(yàn)重復(fù)返回的最終相對細(xì)胞生長值用于通過實(shí)驗(yàn)重復(fù)配對的雙尾t檢驗(yàn)，返回p值。p值小于0.05被認(rèn)為是足以拒絕零假設(shè)。

結(jié)果

顯示在btz或btz+肽存在下平均百分比細(xì)胞生長的直方圖示于圖1。學(xué)生t檢驗(yàn)的結(jié)果返回p值為0.0042，意味著在這種情況下，零假設(shè)的拒絕是有效。

結(jié)論

圖1中示出的結(jié)果清楚地說明了當(dāng)用10μmbtz、10μmbtz與10μmrgdfc(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-d-苯丙氨酸-半胱氨酸)肽的組合、或無btz的10μmrgdfc(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-d-苯丙氨酸-半胱氨酸)肽處理時(shí)，與未處理的hek293細(xì)胞相比的％相對細(xì)胞生長值。該圖表明，與btz組合的肽在10μm濃度下比無btz的肽或無肽的btz的毒性更大。

實(shí)施例2-環(huán)肽(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-d-苯丙氨酸-賴氨酸)+蛋白酶體抑制劑對αvβ3整聯(lián)蛋白陽性細(xì)胞vsαvβ3整聯(lián)蛋白陰性細(xì)胞的作用

總結(jié)：

在hek293細(xì)胞中(可能是αvβ3整聯(lián)蛋白陽性，stonehamca等人，clathrin-mediatedendocytosisandsubsequentendo-lysosomaltraffickingofadeno-associatedvirus/phage.j.biol.chemistry2012287(43)35849-35859。przystaljm等人，proteasomeinhibitionincancerisassociatedwithenhancedtumortargetingbytheadeno-associatedvirus/phage.molecularoncology2013,7(1)；55-66)，對于測試的各蛋白酶體抑制劑，相對于單獨(dú)的肽或單獨(dú)的蛋白酶體抑制劑，肽+蛋白酶體抑制劑導(dǎo)致增加的抑制/殺傷。結(jié)果見圖2。

使用指定的蛋白酶體抑制劑代替btz，以與實(shí)施例1相同的方式進(jìn)行該分析。艾沙佐米(mln2238)源自stratechscientificltd.(oaksdrive，newmarket,suffolk)。德蘭佐米(cep-18770)是從sourcebioscience(orchardplace，nottingham)獲得的。卡非佐米和奧普佐米購自cambridgebioscience。mg132(z-leu-leu-al)購自sigma-aldrich。將所有抑制劑溶解于dmso中，以10μm的最終濃度使用。

同時(shí)，評估混合物對cos7細(xì)胞的毒性，據(jù)報(bào)道cos7細(xì)胞以極低的水平表達(dá)癌癥相關(guān)的整聯(lián)蛋白(xu等人，scientificreports20133：2679，neffs等人，high-efficiencyutilizationofthebovineintegrinαvβ3asareceptorforfoot-and-mouthdiseasevirusisdependentonthebovineβ3subunit.jvirol.2000aug；74(16):7298–7306)。除了cos7細(xì)胞以1.2×10⁴個(gè)細(xì)胞/cm²和3000個(gè)細(xì)胞/cm²的密度接種以外，以與hek293細(xì)胞相同的方式處理cos7細(xì)胞。在hek293細(xì)胞中，與單獨(dú)的肽相比，rgd肽的存在顯著增加細(xì)胞殺傷的水平，而在cos7細(xì)胞中，rgd肽對毒性沒有可感知的影響。這表明rgd環(huán)肽和蛋白酶體抑制劑之間的協(xié)同作用對于以較高水平表達(dá)癌癥相關(guān)整聯(lián)蛋白的細(xì)胞是特異性的，并且不會在每種細(xì)胞類型上起作用。

詳細(xì)說明：

細(xì)胞系hek293(αvβ3+ve)或cos-7(αvβ3-ve)用10μm濃度的各種蛋白酶體抑制劑±10μm的環(huán)肽crgdfk(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-d-苯丙氨酸-賴氨酸)處理。相對于未處理的對照細(xì)胞(歸一化至100％)的生長示于圖2。進(jìn)行了三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，顯示的值是平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。正值<100％代表細(xì)胞生長抑制，而負(fù)值代表細(xì)胞殺傷(-100％表示全部細(xì)胞死亡)。(btz-硼替佐米；ixz-艾沙佐米；dlz-德蘭佐米；cfz-卡非佐米；opz-奧普佐米；mg132)。

可以看出，與未處理的對照細(xì)胞相比，10μm濃度的各蛋白酶體抑制劑引起細(xì)胞生長的抑制。對于αvβ3-ve細(xì)胞(cos-7)和αvβ3+ve細(xì)胞(hek293)，單獨(dú)的各蛋白酶體抑制劑的抑制效果大致相同。也清楚的是，在10μm濃度下，一些蛋白酶體抑制劑比其他蛋白酶體抑制劑更有活性，不管細(xì)胞的αvβ3狀態(tài)如何，是否存在crgdfk(在沒有crgdfk的情況下兩種細(xì)胞類型中卡非佐米和硼替佐米比艾沙佐米、德蘭佐米和奧普佐米示出更大的活性)。

與未處理的對照細(xì)胞相比，10μm濃度的各蛋白酶體抑制劑本身導(dǎo)致細(xì)胞生長的延遲而不是細(xì)胞死亡。相比之下，當(dāng)rgd環(huán)肽crgdfk也以10μm濃度加入時(shí)，在αvβ3+ve細(xì)胞(hek293)中觀察到明顯更大的細(xì)胞毒性作用，但在αvβ3-ve細(xì)胞(cos-7)中未見。這時(shí)蛋白酶體抑制劑不是簡單地延緩細(xì)胞生長而是導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞死亡的數(shù)量取決于具體的蛋白酶體抑制劑，但其范圍從18％的細(xì)胞死亡(mg132+rgdfk，在αvβ3+ve細(xì)胞(hek293)中)多至高達(dá)30％以上的細(xì)胞死亡(卡非佐米或硼替佐米+rgdfk，在αvβ3+ve細(xì)胞中)。

在αvβ3-ve細(xì)胞(cos-7)中沒有觀察到這種增強(qiáng)，表明將rgd肽加入表達(dá)αvβ3整聯(lián)蛋白的細(xì)胞是特異性作用。

實(shí)施例3-當(dāng)(i)硼替佐米或卡非佐米；和(ii)西侖吉肽肽組合時(shí)相對于這些組分的單獨(dú)作用的總和顯示協(xié)同作用。

零假設(shè)：10μmbtz或10μmcfz與1μm或10μm西侖吉肽組合對hek293細(xì)胞，不比單獨(dú)的btz或cfz更有毒性。

方法

將hek293細(xì)胞按照[0124]段接種在96孔板中，并按照實(shí)施例2用蛋白酶體抑制劑(pi)硼替佐米(btz)或卡非佐米(cfz)(10μm)±西倫吉肽(1μm或10μm)處理24小時(shí)。

西倫吉肽得自bioquoteltd.(產(chǎn)品代碼a8660)，并在加入培養(yǎng)基之前制備成pbs(ph7.5)中的500μm，以達(dá)到所需的最終濃度。進(jìn)行5次實(shí)驗(yàn)重復(fù)(僅在4次實(shí)驗(yàn)重復(fù)中含有較低濃度的西侖吉肽)。注意，所顯示的數(shù)據(jù)來自較低的細(xì)胞接種密度(7500個(gè)細(xì)胞/cm²)。

結(jié)果

在圖3中示出了在btz、cfz、btz+西侖吉肽肽、或cfz+西侖吉肽的存在下平均百分比細(xì)胞生長的直方圖。

相對于未處理的對照細(xì)胞(歸一化至100％)的生長示于圖3。進(jìn)行了三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，顯示的值是平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。正值<100％代表細(xì)胞生長抑制，而負(fù)值代表細(xì)胞殺傷(-100％表示全部細(xì)胞死亡)。

結(jié)論

圖3中顯示的結(jié)果清楚地示出了當(dāng)用10μmbtz、10μmbtz與1μm西侖吉肽肽組合、10μmbtz與10μm西侖吉肽肽組合、10μmcfz、10μmcfz與1μm西侖吉肽肽組合、10μmcfz與10μm西侖吉肽肽組合、1μm無btz或cfz的西侖吉肽肽、10μm無btz或cfz的西侖吉肽肽、以及無西侖吉肽和無btz或cfz處理時(shí)，與未處理的hek293細(xì)胞相比的％相對細(xì)胞生長值。該圖說明，與btz或cfz組合的肽比無肽的btz或cfz、或者無btz或cfz的肽的毒性更大。

實(shí)施例4：西侖吉肽和btz對t47d乳腺癌細(xì)胞系的作用。

t47d細(xì)胞如hek293和cos7細(xì)胞一樣培養(yǎng)(實(shí)施例1)。為了評估組合的btz和西侖吉肽的毒性，將t47d細(xì)胞以7500個(gè)細(xì)胞/cm²的密度接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中并孵育24小時(shí)。西侖吉肽在完全dmem中稀釋至20μm，然后在完全dmem中進(jìn)行3次連續(xù)十倍稀釋(2μm、200nm和20nm)。提供不含西侖吉肽的完全dmem用于陰性對照。

在dmso中制備連續(xù)十倍稀釋的硼替佐米(3mm至300nm)。將這些稀釋液(或不含btz的孔的dmso)加入含有0-20μm西侖吉肽的完全dmem等分試樣中，1/150稀釋。將各混合物的等分試樣(0.1ml)加入已經(jīng)含有0.1ml培養(yǎng)基的孔中(一式兩份)，得到西侖吉肽(10nm-10μm)和/或btz(1nm-10μm)或沒有藥劑(僅稀釋劑)的基質(zhì)。

將板孵育24小時(shí)，然后根據(jù)實(shí)施例1通過磺酰羅丹明b測定進(jìn)行分析。將od570nm讀數(shù)除以由陰性對照(僅稀釋劑)孔產(chǎn)生的讀數(shù)，并以百分比表示。進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)的三次獨(dú)立重復(fù)。

結(jié)果示于圖4，其示出使用西侖吉肽(1μm)和/或硼替佐米(10nm)獲得的數(shù)據(jù)。相對于未處理的對照細(xì)胞(歸一化至100％)的生存力示于圖4。

雖然當(dāng)以10nm濃度單獨(dú)施用時(shí)，t47d乳腺癌細(xì)胞對硼替佐米顯示非常邊緣的敏感性(與未處理的對照相比為80％生存力)，然而當(dāng)與1μm西侖吉肽共同施用時(shí)，觀察到極大增加的敏感性(與對照相比小于20％的生存力)。

實(shí)施例5：t47d乳腺細(xì)胞中硼替佐米和西侖吉肽的體外協(xié)同測定(合用指數(shù)(combinationindex))。

為了鑒定兩種藥劑的組合作用是否是相加或超加的(即協(xié)同作用)，將導(dǎo)致生存力降低50％的濃度對繪制在等效線圖中(tallarida:jpharmacolexpther.2001；298:865-72)，從而將各藥劑的濃度列于x和y軸上，并且在各藥劑的導(dǎo)致作為單個(gè)藥劑遞送的生存力降低50％(即，ic50)的濃度之間繪制線。通過由％生存力相對于藥劑濃度的線圖外推代表生存力降低50％的點(diǎn)來估算單個(gè)藥劑的ic50。類似地，通過由％生存力相對于濃度(一種藥劑濃度可變而另一種藥劑供以固定濃度)的線圖外推代表生存力降低50％的點(diǎn)來獲得等效線(isobole)。

該圖上的點(diǎn)的位置(圖6)表示組合效應(yīng)是否是協(xié)同的(落在線的下方/左側(cè))、拮抗的(落在線的上方/右側(cè))或相加的(落在線上或接近線)。根據(jù)zhao等人給出的方程式(clin.cancerres.2004；10:7994-8004)，計(jì)算該等效線圖上所有點(diǎn)的合用指數(shù)(combinationindices,ci)，并示于下表1中。

ca,x和cb,x是組合使用以達(dá)到x％藥物作用的藥物a和藥物b的濃度。ica,x和icb,x是單個(gè)藥劑達(dá)到相同效果的濃度。這些指數(shù)表明當(dāng)西侖吉肽:btz的摩爾比在70:1(ci＝0.22)和170:1(ci＝0.23)之間時(shí)，顯示出最顯著的協(xié)同作用。

表1：使用不同比例的西侖吉肽:btz獲得的合用指數(shù)(ci)。合用指數(shù)<1表示協(xié)同作用，>1表示拮抗作用，ci＝1表示相加作用。

因此，乳腺癌細(xì)胞系t47d中西侖吉肽和硼替佐米之間可見明顯的協(xié)同作用。

實(shí)施例6：btz和西侖吉肽組合療法對體內(nèi)骨髓瘤異種移植物的作用：

雌性(8-12周齡)cb.17scid小鼠在側(cè)肋通過皮下注射植入在50％matrigel中的1×10⁷個(gè)nci-h929腫瘤細(xì)胞。使腫瘤達(dá)到90-130mm³的平均大小，將小鼠分組，每組n＝10，然后開始給藥(第1天)。動物在第1天用硼替佐米(btz)或媒介物(0.9％鹽水)靜脈給藥。在第1、2和3天腹膜內(nèi)注射西侖吉肽(45mg/kg)或媒介物(0.9％鹽水)。

腫瘤體積計(jì)算為＝[長度*(寬度²)]/2

繪制的數(shù)據(jù)是第4天每組的平均腫瘤大小。治療組為：(1)媒介物+媒介物；(2)媒介物+西侖吉肽；(3)0.2mg/kgbtz+媒介物；(4)0.2mg/kgbtz+西侖吉肽；(5)1mg/kgbtz+媒介物；(6)1mg/kgbtz+西侖吉肽。結(jié)果示于圖5。

實(shí)施例7：西侖吉肽和硼替佐米組合治療ncih-929多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系的體內(nèi)皮下腫瘤研究。

使用ncih-929人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞在scid小鼠皮下異種移植模型中進(jìn)行范圍界定研究以在體內(nèi)比較硼替佐米與硼替佐米/西侖吉肽組合方案的功效。測試的硼替佐米的劑量為1mg/kg。植入h929細(xì)胞并使其生長，直到在第1天達(dá)到101-103mm³的平均腫瘤體積，然后開始治療。然后繼續(xù)進(jìn)行到第21天。

雖然大多數(shù)給予“僅硼替佐米”的小鼠對該藥物反應(yīng)良好，總體反應(yīng)率為90％，但給予硼替佐米+西侖吉肽組合的小鼠在幾個(gè)方面顯示出明顯改善(表2)。反應(yīng)率和反應(yīng)的速度都得到提高。到第4天，30％的僅硼替佐米治療小鼠顯示出反應(yīng)；組合療法組為60％。到第8天，只有10％的僅硼替佐米治療小鼠顯示出完全反應(yīng)，組合療法組的數(shù)字為50％。給予組合療法的所有小鼠在第12天作出反應(yīng)，而在最后一個(gè)治療日(第21天)，一個(gè)(10％)的僅硼替佐米組仍完全無反應(yīng)。

在第21天停止治療，并且將所有小鼠再追加3周以監(jiān)測腫瘤再現(xiàn)的速率和發(fā)生率。在第42天，在兩組中60％的動物保持“治愈”(即在此期間腫瘤沒有再生長)。對于每組中剩余的4只動物，結(jié)果如下。對于僅用硼替佐米治療的組，3只動物顯示完全復(fù)發(fā)(即，根據(jù)表2中詳述的標(biāo)準(zhǔn)，腫瘤未顯示部分或全部反應(yīng))，而1只動物達(dá)到終點(diǎn)并被剔除(腫瘤體積>2000mm³)。對于用組合療法治療的組，2只動物復(fù)發(fā)，而2只仍然表現(xiàn)出部分反應(yīng)。組合療法組中沒有動物達(dá)到終點(diǎn)。

表2在“高”硼替佐米劑量下，在nci-h929皮下異種移植小鼠腫瘤模型中硼替佐米和硼替佐米+西侖吉肽的療效結(jié)果總結(jié)

部分反應(yīng)(pr)被定義為對于在研究過程中三次連續(xù)測量，第一次測量的腫瘤體積為第一天體積的50％以下，并且對于這三次測量的一次或多次，腫瘤體積等于或大于13.5mm³。在完全反應(yīng)(cr)中，在研究過程中三次連續(xù)測量的腫瘤體積小于13.5mm³?？偡磻?yīng)率(rr)是pr+cr的總和。治療開始于第1天，并在第21天停止。硼替佐米以velcade(每兩周一次靜脈注射1mg/kg)與西侖吉肽(45mg/kgip,qd)一起給予。

實(shí)施例8：組合西侖吉肽和硼替佐米治療ncih-929多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系的體內(nèi)皮下腫瘤研究

為了確認(rèn)和擴(kuò)展實(shí)施例7中所述的觀察結(jié)果，進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)，其中改變了btz劑量(通過每兩周一次靜脈內(nèi)注射0.2、0.5、0.7和0.9mg/kg)。西侖吉肽或媒介物以每日腹膜內(nèi)注射(45mg/kg)提供。在研究的主要終點(diǎn)(第21天或媒介物處理的對照動物達(dá)到平均腫瘤體積為2000mm³的那一天-在該情況下，在第18天達(dá)到該終點(diǎn))，評估腫瘤生長抑制(tgi)。

此后，接受0.2mg/kg和0.5mg/kgbtz±西侖吉肽的組持續(xù)給藥直到第31天，以允許比較腫瘤生長延遲(即到達(dá)終點(diǎn)的時(shí)間(timetoendpoint,tte)的差異)。終點(diǎn)體積定義為2000mm³，達(dá)到或超過該體積后將動物處死，tte計(jì)算為tte＝[log(終點(diǎn)體積)-b]/m，其中tte以天數(shù)表示，終點(diǎn)體積以mm³表示，b為截距，m是通過對數(shù)轉(zhuǎn)化腫瘤生長數(shù)據(jù)集的線性回歸獲得的線的斜率，將tte值繪制在kaplan-meier圖中(圖9和10)。

btz表現(xiàn)出尖銳的劑量效應(yīng)曲線，表明其狹窄的治療窗口。0.7mg/kg以上的劑量達(dá)到幾乎完全的tgi，因此為檢測tgi而延長給藥不太可能是具有信息性的。0.5mg/kg及以下的btz濃度，在無西侖吉肽的情況下，實(shí)際上是無效的，導(dǎo)致沒有明顯的腫瘤生長抑制作用。

組間個(gè)體的tgi差異由于在組內(nèi)高水平的變化性而無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在西侖吉肽存在下觀察到腫瘤生長抑制趨勢(圖7)。無論硼替佐米濃度如何，當(dāng)將來自所有組的數(shù)據(jù)組合并分為兩組，即n＝40只小鼠/組(即加或減西侖吉肽)時(shí)，這種趨勢更加明顯。使用非參數(shù)kruskal-wallis檢驗(yàn)來評估該發(fā)現(xiàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(p＝3.465×10^-7，圖8)。西侖吉肽也增加了用0.2或0.5mg/kgbtz治療的動物的tte(圖9和10)。