相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求2014年9月25日提交的南非臨時(shí)專利申請2014/06975的優(yōu)先權(quán)，其通過引證并入本文。

本發(fā)明提供了用于乳腺癌治療的植物提取物。

背景技術(shù)：

乳腺癌是全球女性中最常見的癌癥，占2012年診斷的新病例總數(shù)的25％以上(ferlay等，2013)。在南非，到2050年，發(fā)病率預(yù)計(jì)將達(dá)到目前水平的六倍，非洲的總死亡率是世界上最高的(bateman，2012)。

然而，目前使用的標(biāo)準(zhǔn)癌癥療法大大損害了正常細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，從而限制了其臨床有效性(gerl，2005)。蒽環(huán)霉素多柔比星(dox)是用于治療乳腺癌和各種其他癌癥的最有效的抗腫瘤藥物之一(octavia等，2012)。然而，其臨床有效性由于其副作用而受限，其副作用包括累積的和劑量依賴性心臟毒性(gharib和burnett，2001；takemura和fijuwara，2007；zhang等，2009)。此外，癌細(xì)胞對常規(guī)治療變得越來越耐抗。

因此，需要開發(fā)具有靶向乳腺癌腫瘤細(xì)胞而不傷害正常細(xì)胞的能力并且規(guī)避化學(xué)抗性表型的新型治療策略。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

根據(jù)本發(fā)明的第一實(shí)施方式，提供了用于乳腺癌治療的車桑子(dodonaeaviscosa)提取物。

提取物可以來自植物的葉子或根部。

植物提取物可以使用水和/或如二氯甲烷、己烷、石油醚、氯仿、己烷、丙酮、甲醇、乙醇、異丙醇、乙酸乙酯、二甲基亞砜、丁醇、甲苯、甲酸或乙腈的有機(jī)溶劑得到。例如，可以使用水/乙腈/甲酸混合物作為溶劑得到提取物。

提取物可以是植物的全部提取物?；蛘?，提取過程可以進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)分離步驟，以便從提取物中去除對乳腺腫瘤細(xì)胞沒有活性的化合物。

提取物可以與其他抗癌劑一起使用，例如藥物組合物(例如化學(xué)治療劑)。提取物可以是其他抗癌劑的輔助物。提取物和其它抗癌劑可以單獨(dú)或一起施用。

提取物可以來自車桑子l.jacq.、車桑子亞種angustifolia、車桑子亞種angustissima、車桑子亞種burmanniana、車桑子亞種cuneata、車桑子亞種mucronata或車桑子亞種spatulata。更優(yōu)選地，車桑子是車桑子l.jacq.，甚至更優(yōu)選地，車桑子植物來自斯泰倫博斯地區(qū)。

根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方式，提供了一種用于乳腺癌治療的組合物，該組合物包含如上所述來自車桑子的提取物和一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或佐劑。

組合物可以是口服給藥制劑的形式，例如膠囊、片劑或液體。

根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)實(shí)施方式，提供了如上所述提取物在制備用于乳腺癌治療的藥物的方法中的用途。

藥物可以包括提取物和一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或佐劑。

根據(jù)本發(fā)明的第四個(gè)實(shí)施方式，提供了一種用于制備用于乳腺癌治療的具有抗乳腺腫瘤細(xì)胞活性的植物提取物的方法，該方法包括以下步驟：

干燥車桑子的材料；

粉碎干燥的材料；

將粉碎的材料與溶劑混合，使得來自所述材料的化合物溶解到溶劑中；和

將粉碎的材料從溶劑中去除，使得植物提取物保留在溶劑中。

材料可以是車桑子的葉或根材料。

溶劑可以選自水和/或有機(jī)溶劑，例如二氯甲烷、己烷、石油醚、氯仿、己烷、丙酮、甲醇、乙醇、異丙醇、乙酸乙酯、二甲基亞砜、丁醇、甲苯、甲酸或乙腈。例如，可以使用水/乙腈/甲酸混合物作為溶劑來得到提取物。

提取物可以配制成口服劑型，例如膠囊、片劑或液體。

根據(jù)本發(fā)明的第五實(shí)施方式，提供了一種治療乳腺癌的方法，該方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的如上所述提取物或組合物。

提取物或組合物可以口服給藥到受試者。

提取物或組合物可以與如化學(xué)治療劑或其它藥物組合物的其他抗癌劑一起施用。

附圖說明

圖1示出從斯泰倫博斯(左)、德霍普(中間)和賽德堡(右)收集的車桑子照片。由carlorandall先生拍攝；

圖2示出了(a)德霍普收集的樣品的種群內(nèi)化學(xué)變異的分級(jí)聚類和(b)來自德霍普、斯泰倫博斯和賽德堡的樣品的種群內(nèi)化學(xué)變異。來自德霍普樣本1到6的種群內(nèi)研究的數(shù)據(jù)的pca評分(c)和載荷圖(d)。來自德霍普、賽德堡和斯泰倫博斯的種群內(nèi)研究的數(shù)據(jù)的pca評分(e)和載荷圖(f)。d＝德霍普；s＝斯泰倫博斯；c＝賽德堡；s＝樣品；r＝重復(fù)；

圖3示出了來自德霍普的樣品5(a)、4(b)和1(c)的色譜圖，說明導(dǎo)致簇形成的代謝物分布差異。

圖4示出了來自德霍普(a)、賽德堡(b)和斯泰倫博斯(c)樣品的色譜圖，說明導(dǎo)致簇形成的代謝物分布差異。

圖5示出了斯泰倫博斯中細(xì)胞毒性研究的mtt測定，顯示了經(jīng)下列濃度2.1、4.2、8.3、16.7、25和41.6mg/ml的提取物和dox(1μm)處理24小時(shí)后，不同濃度(2.1、4.2、8.3、16.7、25和41.6mg/ml)車桑子提取物和dox(1μm)對mda-mb-231細(xì)胞(a)和mcf-12a細(xì)胞(b)的mtt還原能力的影響。來自代謝組學(xué)研究的mtt測定顯示2.1mg/ml取自不同群的車桑子提取物對mcf-12a細(xì)胞(c)和mcf-7細(xì)胞(d)mtt還原能力的影響。dmem用作對照，乙醇用作載體對照。所有值均表示為平均值±sem(n＝3)，相對于對照*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。dox＝多柔比星；s4＝來自德霍普的樣品4；ss1＝來自斯泰倫博斯的樣品1；cs2＝來自賽德堡的樣品2；ds1＝來自德霍普的樣品1；

圖6示出了dox和車桑子處理7天對腫瘤體積(a)和接種處理后小鼠體重(b)的影響。數(shù)值表示為平均值±sem(n＝3)，p<0.05；

圖7示出mda-mb-231細(xì)胞中相對量化的裂解半胱天冬酶-3(a)、裂解parp(b)、磷酸-p53(c)的體外蛋白質(zhì)印跡分析。用dox或車桑子處理小鼠7天后的phospho-ser15-p53(d)(表示為phospho-ser15-p53與總p53的比例)。數(shù)值表示為相對于對照組(n＝3)的成倍增加。ns-不顯著(p>0.05)，與對照組相比*p<0.05。

具體實(shí)施方式

本文描述了用于治療乳腺癌的車桑子，其獨(dú)立地或在其它乳腺癌治療之外使用。例如，提取物可以用作癌癥治療(例如化療處理)的輔助物。

車桑子是南非西開普省的研究較少的植物之一。它屬于無患子科(getie等，2003)。有七種已識(shí)別的亞種，即車桑子亞種angustifolia、車桑子亞種angustissima、車桑子亞種burmanniana、車桑子亞種cuneata、車桑子亞種mucronata、車桑子亞種spatulata和車桑子亞種viscosa(車桑子l.jacq).。亞種之間存在的主要差異是形態(tài)和葉子特征和地理分布(圖1)(mcdowell，2009)。該植物是熱帶和亞熱帶地區(qū)沙壤土中常見的常綠灌木(naidoo，2012)。一般來說車桑子含有皂苷、二萜和三萜、類黃酮和其他酚類化合物的復(fù)雜混合物。鑒于此，這種藥草中觀察到的任何治療活性很可能與來自許多組分的協(xié)同組合而不是任何單獨(dú)的孤立組分的多價(jià)藥理作用相關(guān)(wagner，2005)。

來自車桑子l.jacq的根提取物已經(jīng)用于治療各種疾病的傳統(tǒng)藥物。澳大利亞土著居民已經(jīng)使用車桑子作為傳統(tǒng)治療方法來治療牙痛、割傷和黃貂魚刺傷(mcdowell，2009)。車桑子的最近研究還表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)(jagtap等，2011)和對a2780人類卵巢癌細(xì)胞系的抗增殖活性(cao等，2009)。最近，rashed等人(2013)發(fā)現(xiàn)車桑子的石油醚提取物具有潛在的抗hiv-1藥劑活性。

在這項(xiàng)研究中，代謝組學(xué)方法用于評估車桑子種群內(nèi)差異，因?yàn)椴菟幪崛∥锏幕钚允墉h(huán)境的影響。植物提取物的作用在非侵入性雌激素受體陽性人類癌細(xì)胞系(mcf-7)、轉(zhuǎn)移性雌激素受體陰性人類癌細(xì)胞系(mda-mb-231)和正常乳腺上皮細(xì)胞系(mcf-12a)中表征，然后在荷瘤小鼠模型中體內(nèi)檢測其抗腫瘤作用。

提取物可以來自植物的任何部分，例如葉、根、果實(shí)或種子。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，提取物來自葉?？梢允褂糜袡C(jī)溶劑和/或水來得到植物材料的提取物。合適的有機(jī)溶劑包括二氯甲烷、己烷、石油醚、氯仿、己烷、丙酮、甲醇、乙醇、異丙醇、乙酸乙酯、二甲基亞砜、丁醇、甲苯、甲酸和乙腈。

提取物可來自任何車桑子亞種，即車桑子l.jacq.、車桑子亞種angustifolia、車桑子亞種angustissima、車桑子亞種burmanniana、車桑子亞種cuneata、車桑子亞種mucronata或車桑子亞種spatulata。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，提取物來自車桑子l.jacq.。在另一個(gè)實(shí)施方式中，提取物來自南非(開普省酒鄉(xiāng)直轄市)的斯泰倫博斯地理區(qū)域。

現(xiàn)在將參考以下非限制性實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。

實(shí)施例

方法和材料

植物材料和野外采集

對于細(xì)胞毒性研究，由開普省灌木醫(yī)生協(xié)會(huì)(cbd)的成員在2012年4月20日從斯泰倫博斯山(33°93'614”s，18°，86'，019”e)的最高斜坡收集了車桑子樣品。cbd是交易、管理和/或利用植物藥物的集體代表成員的非營利組織。他們自己的本地知識(shí)(i.k.)基于khoi-san實(shí)踐(philander，2012)。

對于代謝組學(xué)研究，樣品在2013年4月至5月期間在三個(gè)不同部點(diǎn)從車桑子種群收集。該研究與開普省灌木醫(yī)生協(xié)會(huì)合作，且該組織成員協(xié)助植物收集。在第一個(gè)種群中，收集了6個(gè)樣本以測試種群內(nèi)的變異：將樣品等分，以在兩個(gè)不同高度取樣。使用三個(gè)種群中的九個(gè)樣本來分析種群間變異。從開普自然協(xié)會(huì)(capenature)獲得收獲瀕危植物的許可證(許可證號(hào)：0028-aaa008-00095)，以在斯泰倫博斯山、賽德堡山流域和德霍普自然保護(hù)區(qū)采集植物。

鑒定植物物種并將它作為憑證標(biāo)本在斯泰倫博斯大學(xué)植物標(biāo)本館存放。樣品在40℃干燥后保存，并在植物學(xué)和動(dòng)物學(xué)系(斯泰倫博斯大學(xué))避光保存。

提取步驟

種群化學(xué)型代謝組學(xué)研究

在初始篩選中，將二十克植物粉碎并用三種不同的溶劑萃?。杭状?，水，49.5％水：49.5％乙腈：1％甲酸混合物(w:a:f；v/v)。許多溶劑因?yàn)槠涮岣咛崛∥锂a(chǎn)率的能力而被廣泛使用，且水提取是制備傳統(tǒng)藥物的常規(guī)方法。每克植物材料加入10ml溶劑。將每個(gè)提取物置于超聲浴中45分鐘，然后用whatman1號(hào)濾紙過濾這些提取物。提取過程重復(fù)兩次。然后將提取物在真空離心蒸發(fā)器中烘干直到完全干燥。將水提取物冷凍干燥24小時(shí)。對于種群內(nèi)和種群間分析，采用與初始篩選實(shí)驗(yàn)相同的方法，但每次提取僅粉碎一克植物材料且w：a：f用作溶劑。

體外和體內(nèi)細(xì)胞毒性研究

提取過程與代謝組學(xué)研究相同，但為了本研究的目的，使用乙醇作為溶劑。萃取后，將樣品冷凍干燥。冷凍干燥得到3.35g提取物，將其儲(chǔ)存在干燥器中。將提取物溶于100％乙醇中并懸浮于生長培養(yǎng)基中以得到50mg/ml的物料濃度(naidoo，2012；pengelly，2008：4)。提取物制劑中的乙醇濃度限制在1.7％，以盡量減少溶劑對細(xì)胞生長的潛在影響。

植物提取物的代謝物分析

將干燥的提取物重懸于100％(v/v)甲醇中以得到50mg/ml的物料濃度(naidoo，2012；pengelly，2008：4)，然后交替渦旋1分鐘，超聲處理10分鐘直到完全重懸。

用液相色譜質(zhì)譜(lc/ms)測定不同溶劑提取作用，來評價(jià)這些溶劑。對于種群內(nèi)變異分析，對來自德霍普的六個(gè)樣本進(jìn)行了近親種群個(gè)體變異測試。對于種群間變異分析，從每個(gè)種群抽取了三個(gè)樣本，總共9個(gè)樣本用于測試種群間化學(xué)變異。色譜分離和測定是在裝有watersacquity超高效液相色譜(uplclg50nm)、acquity光電二極管陣列(pda)檢測器和自動(dòng)采樣器的waterssynaptg2四極飛行時(shí)間質(zhì)譜(milford,ma,usa)上進(jìn)行的。在watersbehc18，2.1×100mm柱上以0.4ml/min流速的watersuplc，使用具有0.1％甲酸(溶劑a)和乙腈(溶劑b)的h2o梯度分離代謝物。每個(gè)樣品重復(fù)注射三次，每次運(yùn)行15分鐘。采用15v的錐電壓和2.5kv的毛細(xì)管電壓下的正負(fù)模式用于分析物的質(zhì)量分離。4.1軟件用于數(shù)據(jù)分析。使用主成分分析(pca-x)和分級(jí)聚類分析(hca)對各植物代謝物分布之間的相互關(guān)系進(jìn)行評估。

生理學(xué)研究

細(xì)胞系

對于斯泰倫博斯種群的細(xì)胞毒性研究，使用人類轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系(americantypeculturecollection，rockville，usa)mda-mb-231和人非致瘤性乳腺上皮細(xì)胞系(universityofcapetown)mcf-12a。細(xì)胞系在補(bǔ)充有10％胎牛血清(invitrogengibco，10270-106)和1％penstrep(invitrogengibco，15140-122)的無菌dulbecco改進(jìn)的eagle培養(yǎng)基(dmem)(sigma-aldrich，d5796)中在37℃和5％co2下培養(yǎng)。將細(xì)胞等分至50ml離心管中。在mcf-12a細(xì)胞系中進(jìn)一步補(bǔ)充(一天用量)50％營養(yǎng)物ham-f12(invitrogengibco，21765-029)、500ng/ml氫化可的松(sigma-aldrich，h0888)、10μg/ml胰島素(藥用)、100ng/ml霍亂毒素(sigma-aldrich，c8052)和20ng/ml表皮生長因子(egf)(invitrogengibco，10450-013)。細(xì)胞系最初在t75燒瓶中的5ml生長培養(yǎng)基中生長，達(dá)到所需的融合(70-80％)后，通過與tryple^tmexpress(invitrogengibco，12604-013)培養(yǎng)來傳代細(xì)胞。

對于種群化學(xué)型研究，使用人乳腺癌細(xì)胞系(americantypeculturecollection，rockville，usa)mcf-7和mcf-12a。按照與上述相同的過程將這兩種細(xì)胞系培養(yǎng)在24孔板中。一旦達(dá)到所需的融合(70-80％)，通過與胰蛋白酶edta^tm(lifetechnologies)培養(yǎng)來傳代細(xì)胞。

分裂和接種細(xì)胞

當(dāng)達(dá)到約80％的融合時(shí)(20倍物鏡下觀察)，細(xì)胞分裂。生長培養(yǎng)基、trypleexpress/胰蛋白酶edta和pbs在37℃水浴中加熱。棄去舊的培養(yǎng)基，細(xì)胞單層用pbs沖洗一次。然后棄去pbs，加入4mltrypleexpress，將細(xì)胞置于震蕩培養(yǎng)箱中約4分鐘。對于胰蛋白酶，用兩倍量的培養(yǎng)基中和細(xì)胞。一旦細(xì)胞松動(dòng)，將容納物轉(zhuǎn)移到離心管中，然后以1500rpm離心3分鐘。傾析出上清液，只剩下一團(tuán)細(xì)胞。將4ml溫培養(yǎng)基加入細(xì)胞團(tuán)中并輕輕重懸(使用1000μl移液管)。使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)重懸細(xì)胞。分裂和播種后，將細(xì)胞粘附48小時(shí)，然后再更換培養(yǎng)基。

細(xì)胞系的處理

一旦達(dá)到所需的融合，重新更換培養(yǎng)基。將提取物溶解在100％etoh和完全培養(yǎng)基中至50mg/ml的終濃度。將溶液渦旋，然后以1500rpm離心3分鐘，然后將上清液轉(zhuǎn)移到新管中，棄去沉淀。對于斯泰倫博斯種群的細(xì)胞毒性研究，用不同濃度的提取物(2.1、4.2、8.3、16.7、25和41.6mg/ml)處理細(xì)胞，并在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。此外，將1m多柔比星(dox)(sigma-aldrich，d1515)加入到mcf-12a和mcf-7細(xì)胞中，并用作比較性癌癥治療。使用含有乙醇的載體對照物來確定溶劑是否對細(xì)胞生長和/或活力有任何影響。種群化學(xué)型的代謝組學(xué)研究遵循了相同的過程，但是以2.1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)濃度(最終濃度為0.7％的etoh)處理細(xì)胞。

mtt細(xì)胞活性測定-體內(nèi)和體外細(xì)胞毒性研究

將細(xì)胞在96孔板中以約8×10³個(gè)mcf-12a細(xì)胞和5×10³個(gè)mda-mb-231細(xì)胞的密度進(jìn)行培養(yǎng)，并使其在100μl生長培養(yǎng)基中增殖。一旦融合，棄去舊的培養(yǎng)基，用pbs沖洗細(xì)胞單層，在處理開始后更換培養(yǎng)基。處理后，棄去培養(yǎng)基，向各孔中加入50μl的mtt(sigma-aldrich，m2128)工作溶液(0.01gmtt/500μlpbs)和150μlpbs，并在37℃下培養(yǎng)1小時(shí)。培養(yǎng)后，小心吸出上清液，并向每個(gè)孔中加入200μl異丙醇-hcl/triton-x-100(50:1)溶液。將樣品在振蕩器上輕輕攪拌5分鐘以溶解甲晶體。使用微量滴定板讀數(shù)器在540nm處測定吸光度，細(xì)胞活性表示為活細(xì)胞的分?jǐn)?shù)，已處理細(xì)胞對比未處理(對照)細(xì)胞。對于種群化學(xué)型的代謝組學(xué)研究，選擇四個(gè)樣品進(jìn)行mtt測定，以測試治療后正常非致瘤性乳腺上皮細(xì)胞系(mcf-12a)和乳腺癌細(xì)胞系(mcf-7)的細(xì)胞活性。使用用于細(xì)胞毒性研究的相同的方案，但將細(xì)胞以約5×10⁴個(gè)mcf-12a細(xì)胞和5×10⁴個(gè)mcf-7細(xì)胞的密度在24孔板中培養(yǎng)，并使其在100μl生長培養(yǎng)基中增殖。然后向每個(gè)孔中加入125μlmtt(sigma-aldrich，m2128)工作溶液(0.01gmtt/500μlpbs)和375μlpbs。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

體內(nèi)模型

重16-21g的八周齡雌性c57bl6小鼠(tygerbergbreedingfacility)在斯泰倫博斯大學(xué)生理系的動(dòng)物舍中的ehret籠子(emmedingen，德國)中以6-8只一組飼養(yǎng)。環(huán)境溫度和濕度可控，且伴隨12小時(shí)明/暗循環(huán)。這部分研究按照斯泰倫博斯大學(xué)的用于護(hù)理和使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指南進(jìn)行。小鼠喂食標(biāo)準(zhǔn)食物且可隨意飲食。將小鼠隨機(jī)分為(i)對照組、(ii)dox組和(iii)植物提取物組，記錄初始重量。

腫瘤構(gòu)建

鼠轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系(e0771)由fengzhili(roswellparkcancerinstitute，newyork，usa)贈(zèng)送。以與mda-mb-231細(xì)胞相同的方式維持這些細(xì)胞。一旦達(dá)到70％融合，使用23號(hào)針將體積為200μl的2.5×10⁵個(gè)細(xì)胞皮下注射到下腹部，接近或在每只小鼠的第四個(gè)乳腺脂肪墊(方案來自ewens等人，2006)中。三周后腫瘤變得明顯，此時(shí)測量腫瘤大小。

小鼠治療

在給小鼠稱重和分組后，開始使用車桑子提取物進(jìn)行處理。每兩天通過使用數(shù)字卡尺在兩個(gè)垂直維度上進(jìn)行測量來測量腫瘤大小。車桑子提取物通過覆盆子風(fēng)味的果凍塊施用。小鼠在治療開始前四天適應(yīng)果凍的味道。使用人體用量(5.24mg/kg/天)和km因子，基于體表面積的劑量轉(zhuǎn)化以計(jì)算待施用的動(dòng)物劑量(reagan-shaw等人，2007)。在治療當(dāng)天，將小鼠放在單獨(dú)的籠中，并在每天黃昏時(shí)給予1厘米×1厘米的果凍塊，每塊果凍注射有146μl提取物(0.065毫克/克平均體重)，持續(xù)7天。在最后一次治療后的第二天，通過斬首處死小鼠，之后獲得腫瘤并在-80℃冷凍直至需要。

蛋白質(zhì)印記分析

在24小時(shí)治療期后，從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)。吸出培養(yǎng)基并將燒瓶置于冰上。用冰冷的pbs沖洗細(xì)胞單層三次。通過將細(xì)胞在300μl經(jīng)改變的放射免疫沉淀(ripa)緩沖液(ph7.4)中培養(yǎng)±10分鐘來提取全細(xì)胞蛋白質(zhì)，緩沖液(t25)含有：tris-hcl2.5mm、edta1mm、naf50mm、nappi50mm、二硫蘇糖醇1mm、苯甲基磺酰氟(pmsf)0.1mm、苯甲脒1mm、4mg/mlsbti、10mg/ml亮抑酶肽、1％np40、0.1％sds和0.5％脫氧膽酸鈉。使用無菌橡膠淀帚刮掉細(xì)胞單層，并轉(zhuǎn)移至冷凍的微量離心管中。使用超聲波液體處理器對全細(xì)胞裂解物進(jìn)行超聲處理。然后將細(xì)胞裂解物在室溫下以8000rpm離心10分鐘，其后使用bradford方法(bradford，1976)測定每個(gè)裂解物的蛋白質(zhì)含量。制備蛋白質(zhì)樣品并儲(chǔ)存在-80℃直至需要。通過從每個(gè)腫瘤切下一小塊并將其放入具有1mlripa和5μlpmsf的試管中來從腫瘤中提取蛋白質(zhì)。然后將樣品均化并放在冰上沉降泡沫，然后以8000rpm消旋10分鐘，其后將上清液置于干凈的微量離心管中。提取后，用bradford方法(bradford，1976)測定蛋白質(zhì)含量，并儲(chǔ)存于-80℃直至分析。

將準(zhǔn)備的樣品解凍，然后在95℃下煮沸5分鐘，然后離心幾秒鐘。將20μg蛋白質(zhì)加載到4-15％tris-甘氨酸預(yù)制凝膠(bio-rad，4561085)的孔中，并通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)在250v，400ma下分離25分鐘。將blueye預(yù)染蛋白階梯(genedirex，pm007-0500)裝載到每個(gè)凝膠的第一個(gè)孔中以確定特定條帶的分子量并使凝膠定向。在15v，2.5a下使用turbotm轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(bio-rad)用12分鐘將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到pvdf(聚偏二氟乙烯)膜(turbo^tmminipvdftransferpacks，bio-rad，170-4156)上。然后將pdvf膜在室溫下在溶解于100mltris緩沖鹽水-吐溫溶液(tbs-t)(5g/100mltbs-t)中的5％無脂奶粉中封閉1小時(shí)。封閉后，用tbs-t將膜洗滌3次，并在tbs-t中用相應(yīng)的一級(jí)抗體(cellsignalingtechnology)在4℃培養(yǎng)過夜。使用的一級(jí)抗體是p53、磷酸-p53ser15、裂解的半胱天冬酶-3、裂解的parp和parp(1:1000稀釋)。在一級(jí)抗體培養(yǎng)后，用tbs-t將膜洗滌3次，并用與hrp連接的抗兔二抗(cellsignalingtechnology，#7074)在室溫下(1：4000稀釋)培養(yǎng)1小時(shí)。用tbs-t將膜洗滌3次，用pierceecl蛋白質(zhì)印跡基底(thermoscientific,#32106)覆蓋。使用帶有imagelab^tm軟件的chemidoc^tmxrs+系統(tǒng)(bio-rad)檢測條帶。產(chǎn)生的條帶以體積表示，以對照樣品(未處理)的百分比表示。β-肌動(dòng)蛋白用作荷載。

數(shù)據(jù)分析

每個(gè)樣品三種不同的提取物使用lc/ms分析并繪圖。多變量統(tǒng)計(jì)用來分析lc/ms分析后獲得的所有代謝組學(xué)結(jié)果。應(yīng)用pca來識(shí)別對不同組的分離有重要影響的特征成分。因此，該方法不僅在樣本中有效地區(qū)分，而且特征成分的鑒定提供了新的有效的化學(xué)標(biāo)記，這些標(biāo)記已經(jīng)被提出用于車桑子樣品的鑒別和質(zhì)量控制。分級(jí)聚類分析(hca)也被應(yīng)用，以將復(fù)雜數(shù)據(jù)集減少到一系列優(yōu)化的和可理解的視圖。hca提供了一個(gè)有洞察力的方法來查看大型數(shù)據(jù)集以方便理解。這些觀點(diǎn)強(qiáng)調(diào)數(shù)據(jù)中的自然分組，并顯示哪些變量最強(qiáng)烈地影響這些模式，從而允許識(shí)別用于此效應(yīng)的配方的可能的主成分。因此，hca本質(zhì)上用于通過測量樣品之間的相似性將樣品分組。樣本之間的相似性和差異性以樹形圖表示以方便理解。

對于測試細(xì)胞活性的mtt測定，進(jìn)行三次重復(fù)以測試可重復(fù)性。用于的version5(graphpadsoftware，sandiego，ca)用于數(shù)據(jù)的可視化表示和統(tǒng)計(jì)分析。進(jìn)行單因素方差分析后進(jìn)行bonferroni事后校正檢驗(yàn)。所有值都以對照組的百分比表示，且數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。p值<0.05被認(rèn)為是統(tǒng)計(jì)顯著的。

結(jié)果與討論

不同種群的代謝物分析

w：a：f和甲醇提取物得到相似的代謝物曲線(圖4)。為了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，因?yàn)榧状荚诟稍锖蛢?chǔ)存期間可能導(dǎo)致化學(xué)酯化，所以使用w：a：f。因?yàn)樗崛〉玫降幕瘜W(xué)物質(zhì)與其他溶劑相比較少，沒有測試水提取物的進(jìn)一步藥理作用。此外，醇制酊劑在植物藥劑行業(yè)中很受歡迎。來自德霍普的樣品(圖2a)使用hca根據(jù)高度進(jìn)行區(qū)分。來自斯泰倫博斯和賽德堡的樣品的聚類表明化學(xué)相似性，而來自德霍普的樣品形成了獨(dú)特的一組。德霍普樣品的種群內(nèi)差異明顯，表明競爭和高度(例如溫度和風(fēng)的差異)可能會(huì)影響次級(jí)代謝。有幾項(xiàng)研究說明熱帶植物中沿著高度相關(guān)的生態(tài)梯度的基于化學(xué)的適應(yīng)性(goldstein等，1985；ziska等，1992；rada等，1998；cabrera等，1998)。alonso-amelot等(2004)指出，與高度相關(guān)的新型熱帶蕨菜(蕨類植物)中的低分子量酚類物質(zhì)的合成可能是對生物和適應(yīng)性壓力的綜合響應(yīng)。植物天然產(chǎn)物特別是與生物環(huán)境相互作用時(shí)具有關(guān)鍵作用。他們吸引傳粉者或種子分散器，保護(hù)植物對抗天敵或作為針對競爭對手的化感物質(zhì)(kroymann，2011)。

pca模型由5個(gè)部分組成。圖中解釋了種群內(nèi)分析中86％的差異(r²(pc1)＝0.4589；r²(pc2)＝0.2688(圖2c))和種群間分析中的65％的差異(r²(pc1)＝0.4476；r²(pc2)＝0.1334(圖2e))。來自德霍普的樣品形成了三個(gè)簇。來自德霍普的s3和s4分子量分別為308.1518和200.20(圖2d和3)，在保留時(shí)間7.37和8.12時(shí)分別具有鑒別峰。在種群間研究中，ds3r2和ds1分子量分別為345.09和517.17(圖2f和4)，在保留時(shí)間6.59和7.71時(shí)表現(xiàn)出差異。

位于namakaroo的賽德堡在中部地區(qū)呈現(xiàn)典型的地中海氣候(溫和，潮濕的冬天和溫暖的夏天)，而西部和東部地區(qū)更干。沿海的年降水量從100毫米不等上升到西部山脈的400毫米，再到中部的最高山脈的700毫米以上(low等，2004：8)。由于地形變化，氣候條件范圍很廣。在冬季，最低溫度范圍為-3至3℃，有時(shí)會(huì)在高山上發(fā)生嚴(yán)重的霜凍，而夏天的溫度可能會(huì)升高到39-44℃。斯泰倫博斯有地中海氣候，最近年降水量為993.9毫米(lacolline天文臺(tái)，斯泰倫博斯氣象臺(tái)，2014)。冬季寒冷潮濕，七月份氣溫可能會(huì)下降到3.02℃，周圍的山上會(huì)有降雪。夏天是溫暖和干燥的，溫度幾天上升到大約40℃(meijers，j.p.，2014)。斯泰倫博斯也容易受到人為的干擾。德霍普自然保護(hù)區(qū)離海岸不遠(yuǎn)。它具有溫和的地中海氣候，具有溫暖的夏季和溫和的冬季，7月份最低氣溫約為6攝氏度，1-2月最高氣溫為27℃。年降雨量約為564毫米，降雨量通常在四月/八月最高(歐盟，2010a)。這些環(huán)境條件的差異很重要。

自然的次級(jí)代謝具有非常高的遺傳可塑性和多樣性，使植物能夠靈活適應(yīng)動(dòng)態(tài)環(huán)境的困難。在每個(gè)植物種群中發(fā)現(xiàn)了獨(dú)特的一系列對植物生態(tài)位的特定菌株適應(yīng)良好的次級(jí)化合物(hartmann，2007)。與德霍普相比，賽德堡和斯泰倫博斯的冬季更為寒冷和潮濕，且這兩個(gè)地方位于內(nèi)陸地區(qū)。這些生態(tài)差異可以解釋導(dǎo)致德霍普簇在主成分1(pc1)負(fù)向量上分離的化學(xué)特征的差異(圖2e)。分析鑒定峰上的感興趣的化合物，并將其與報(bào)道的ms數(shù)據(jù)(yagudaev等，1968；shakirov和avazmukhamedov，1969年；sultanov等，1969)和massbank數(shù)據(jù)庫(horai等，2010)(表1)進(jìn)行比較。

mtt細(xì)胞活性測定-體內(nèi)和體外細(xì)胞毒性研究

不同劑量處理后，使用mtt測試研究了來自斯泰倫博斯的車桑子的酒精提取物對mda-mb-231細(xì)胞活性的影響(圖5a)。處理24小時(shí)后，與dox(47.88±0.83％，44.33±0.73％，50.10±0.39％，62.30±1.94％，70.04±0.87，p<0.001)和對照組(100％)相比，除41.6mg/ml以外的所有濃度均有效降低mda-mb-231細(xì)胞系的活性。出乎意料的是，在41.6mg/ml的最高劑量時(shí)，提取物誘導(dǎo)細(xì)胞增殖(112.7±4.74％，p<0.01)。與對照組相比，商業(yè)上使用的dox也降低了細(xì)胞活性(89.77±1.23％，p<0.01)，但不如濃度為2.1至25mg/ml的車桑子提取物有效。結(jié)果顯示(圖5b)，當(dāng)施用2.1至8.3mg/ml時(shí)，提取物對mcf-12a細(xì)胞的生長具有相似的作用(p<0.01)。與對照組和所有劑量的提取物相比，用dox處理導(dǎo)致細(xì)胞活性極大的降低(75.58±1.26％，p<0.001)。與dox相比，車桑子對乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性明顯更高，但對正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性卻較低，因此表明濃度為2.1到4.2mg/ml的車桑子提取物對乳腺癌細(xì)胞的效力最好，同時(shí)對非癌細(xì)胞幾乎沒有傷害。

表1：使用ms/ms方法暫時(shí)確定的感興趣化合物的保留時(shí)間和離子碎片

mtt細(xì)胞活性測試–種群化學(xué)型的代謝組學(xué)研究

對于mcf-12a細(xì)胞系(圖5c)，沒有一個(gè)樣品在經(jīng)24小時(shí)處理后顯著降低了細(xì)胞活性(114±4.67％，110±3.01％，101±6.33％和92.7±2.02％，p>0.05)。來自德霍普的樣品1和樣品4對于mcf-12a和mcf-7細(xì)胞系(bonferroni的多重比較試驗(yàn))的還原能力有顯著差異。這些差異證實(shí)了來自德霍普的樣品4和樣品1的分組為單獨(dú)的簇?；瘜W(xué)成分的差異與體外藥理活性相關(guān)。在所有測試的樣品中，斯泰倫博斯提取物在mcf-7細(xì)胞系的生長中產(chǎn)生最顯著的降低頻率(圖5d)(84.9±2.35％，p<0.05)。幾項(xiàng)研究表明了研究用于抗癌細(xì)胞毒性作用的草藥療法的重要性。據(jù)報(bào)道，苦瓜提取物對mda-mb-231有效(ray等，2010)。南非醉茄的葉提取物也顯示出對癌細(xì)胞的選擇性細(xì)胞毒性(widodo等，2007)。濃度較低時(shí)，車桑子提取物在mda-md-231細(xì)胞系中很有效，且對正常mcf-12乳腺上皮細(xì)胞系毒性很低(圖5a和5b)。車桑子已經(jīng)顯示出對癌癥有效(cao等，2009)，但這是首次對乳腺癌細(xì)胞系顯示出這種活性。由于疾病的性質(zhì)和/或在植物提取物中表現(xiàn)出癌癥抑制的化學(xué)物質(zhì)，對不同癌癥的作用可能是物種依賴性的。眾所周知，在包括車桑子的許多植物中發(fā)現(xiàn)的多酚化合物因?yàn)樗鼈兊淖杂苫宄钚远哂锌寡趸再|(zhì)(fiorentino等人，2007；pietta，1999；wang等人，2004)。如在許多其他植物(saleem等，2002)中，類黃酮，一種多酚類化合物，是車桑子中最豐富的化合物之一(cao等，2009；venkatesh，2008)。然而，這些類黃酮也在hl-60早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中表現(xiàn)出促氧化誘導(dǎo)的毒性和細(xì)胞凋亡(sergediene等，1999；saleem等，2002)。

類黃酮在水性介質(zhì)中自動(dòng)氧化并可形成高反應(yīng)性的基團(tuán)。hirano等人的一項(xiàng)研究(1995)發(fā)現(xiàn)柑橘類黃酮誘導(dǎo)hl-60細(xì)胞凋亡，wei等(1994)證實(shí)，在幾種細(xì)胞系中，類黃酮引起細(xì)胞凋亡相關(guān)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。類黃酮誘導(dǎo)的對幾種癌細(xì)胞系的抗增殖作用或細(xì)胞凋亡與磷脂酰肌醇3-激酶(pi3k)抑制、細(xì)胞周期阻滯和p53積累有關(guān)(sergediene等，1999)。細(xì)胞凋亡受pi3k和akt信號(hào)的負(fù)調(diào)節(jié)。這些途徑容易結(jié)合幾種生存因子(kasibhatla，2003)，因此pi3k/akt的抑制將誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。氧化損傷在衰老和幾種如心臟病和癌癥的退行性疾病中起重要作用(pietta，1999；fiorentino等，2007)。

體內(nèi)模型

在7天的治療期間用車桑子的酒精提取物(0.065mg/g平均體重)和dox(5mg/g平均體重)治療減少了腫瘤體積，而對照組小鼠的腫瘤繼續(xù)生長(圖6a)。對照組、dox和提取物組在研究結(jié)束時(shí)的平均腫瘤體積分別為370，106.51和130.94mm²。widodo等(2007)的研究報(bào)道了其體內(nèi)模型中的相似發(fā)現(xiàn)；盡管使用了惡性的人纖維肉瘤細(xì)胞，但是南非醉茄的提取物導(dǎo)致腫瘤抑制。雖然dox和車桑子治療能夠或多或少地減少腫瘤體積到相同程度，但值得注意的是，在治療過程中，用提取物處理的小鼠持續(xù)增重，這強(qiáng)調(diào)了車桑子的低毒性(圖6b)。車桑子具有許多可以協(xié)同地作用以促進(jìn)生物活性和體重增加和/或維持的化學(xué)物質(zhì)。作為一個(gè)整體提取物，各種氨基酸、碳水化合物和一些親脂性生物化學(xué)品可發(fā)揮有益健康的作用。這對于使用草藥療法作為有利于腫瘤減少的免疫調(diào)節(jié)劑(jagtap等，2011)也是重要的。

c57bl6小鼠mda-mb-231細(xì)胞和腫瘤的蛋白質(zhì)印跡分析

基于其在mda-mb-231細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的能力，選擇2.1mg/ml劑量作為所需濃度(圖6)。為了評估該濃度對細(xì)胞死亡的影響，研究了細(xì)胞凋亡。車桑子(2.1mg/ml)在mda-mb-231細(xì)胞中顯著誘導(dǎo)了parp裂解(圖6b)。從小鼠獲得的腫瘤中parp裂解也增加到與dox誘導(dǎo)的相同程度，盡管由于n值小而不顯著。有趣的是，在mda-mb-231細(xì)胞中的裂解的半胱天冬酶和從小鼠獲得的腫瘤中沒有檢測到顯著的差異(圖7a)。這可能歸因于組織采集的時(shí)間，因?yàn)榘腚滋於?3裂解先于parp裂解；可能是在收集細(xì)胞和組織時(shí)，這個(gè)事件已經(jīng)完成并通過泛素降解去除(suzuki，2001)。

另一方面，chan等(2011)報(bào)道了用r.rohituka處理后，在乳腺癌中通過半胱天冬酶活性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。類似地，ray等人(2010)在用苦瓜提取物處理后檢測到mda-mb-231細(xì)胞和mcf-7細(xì)胞中活化的半胱天冬酶-3。這些數(shù)據(jù)表明，治療24小時(shí)后；半胱天冬酶-3被裂解并活化，從而促進(jìn)mda-mb-231細(xì)胞的凋亡。來自體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，車桑子觸發(fā)細(xì)胞凋亡途徑，導(dǎo)致parp裂解。parp在細(xì)胞凋亡早期被半胱天冬酶-3裂解，以防止atp消耗(boulares等，1999)。

在用植物提取物處理后，用2.1mg/ml植物提取物處理的所有細(xì)胞中ser15上p53的磷酸化顯著增加(2.85±0.22，p<0.01)(圖7d)。p53的表達(dá)受到與促進(jìn)p53快速降解的e3泛素連接酶mdm-2相關(guān)性的負(fù)調(diào)控(kasibhatla，2003)。已經(jīng)開發(fā)了許多能夠結(jié)合mdm-2，置換和激活p53的藥劑。由于p53的半衰期短，總p53的水平可能較低，而磷酸化的p53(絲氨酸15)更顯著地表達(dá)。研究表明，磷酸-ser15-p53轉(zhuǎn)位到線粒體中，其與bcl-2生理上相互作用并抑制bcl-2，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡(park，2005)。在這個(gè)階段，車桑子提取物的提取機(jī)理需要深入研究。然而，這些數(shù)據(jù)一起暗示了通過絲氨酸15的p53的磷酸化起作用，并且負(fù)調(diào)節(jié)與激活p53的mdm-2活性相關(guān)。

hui等(2006)已經(jīng)顯示mda-mb-231細(xì)胞不含有野生型p53，但含有表達(dá)突變體p53。處理后細(xì)胞中p53表達(dá)的低水平可能是由于mda-mb-231細(xì)胞表達(dá)與野生型p53相互作用并滅活野生型p53的突變型p53的事實(shí)。如mtt測定中低細(xì)胞活性所見(lowe，2000)，支持這一點(diǎn)的事實(shí)是，雖然突變體p53失去其凋亡功能，但仍然能夠啟動(dòng)細(xì)胞周期停滯。shin(2011)還觀察到用irisnertschinskia的乙醇提取物處理mcf-7細(xì)胞后絲氨酸15的p53磷酸化。p53誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞死亡，并引起半胱天冬酶裂解和bax的過度表達(dá)。在c57bl6小鼠中用車桑子處理后，很清楚的是，提取物能夠誘導(dǎo)凋亡，parp裂解顯示出與dox誘導(dǎo)相同的程度(圖7b)。用提取物處理的小鼠腫瘤也顯示出顯著更高水平的磷酸化p53(7.093±2.964，p<0.05)。與對照組相比，dox處理組的p53水平也顯著升高(5.3±1.016，p<0.05)，然而dox與提取組無差異。

結(jié)論

已經(jīng)證明車桑子對乳腺癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，但顯示對正常乳腺上皮細(xì)胞的有限的毒性。提取物在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中是有效的，這通過蛋白質(zhì)印跡分析檢測的凋亡標(biāo)記物是顯而易見的，但是與dox治療組相比，它在體內(nèi)保持無毒性并且導(dǎo)致對腫瘤生長相似的抑制，并且在治療過程中防止小鼠的體重減輕。斯泰倫博斯種群具有最好的抗癌活性，并且與賽德堡種群的化學(xué)特征相似。這種提取物可以證明是新型植物療法，作為輔助治療方法可單獨(dú)使用或與其他商業(yè)藥物一起使用，以協(xié)助減少腫瘤增殖。

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權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)

1.一種用于乳腺癌治療的來自車桑子的植物提取物，其來自車桑子植物的葉子。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物提取物，其是車桑子植物的葉子的全部提取物。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物提取物，其在一個(gè)或多個(gè)用來去除來自車桑子的葉子的對乳腺腫瘤細(xì)胞無活性的化合物的分離步驟之后獲得。

4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的植物提取物，其用于與其他的抗癌劑一起施用。

5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的植物提取物，其由車桑子亞種l.jacq得到。

6.一種用于乳腺癌治療的組合物，所述組合物包含如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的來自車桑子的植物提取物和一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或佐劑。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其用于與另外的抗癌劑一起施用。

8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的組合物，其為口服劑型。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的組合物，其中所述口服劑型選自膠囊、片劑、粉末和液體。

10.一種制備用于乳腺癌治療的具有抗乳腺腫瘤細(xì)胞活性的植物提取物的方法，所述方法包括以下步驟：

i.干燥車桑子的葉子材料；

ii.粉碎干燥的材料；

iii.將粉碎的材料與溶劑混合，以使來自干燥材料的化合物溶解到溶劑中；和

iv.將粉碎的材料從溶劑中去除，使得植物提取物保留在溶劑中。

11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述溶劑選自二氯甲烷、己烷、石油醚、氯仿、己烷、丙酮、甲醇、乙醇、異丙醇、乙酸乙酯、二甲基亞砜、丁醇、甲苯、甲酸、乙腈和水或其混合物。

12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述溶劑是水、乙腈和甲酸的混合物。

13.根據(jù)權(quán)利要求10至12中任一項(xiàng)所述的方法，還包括將所述提取物配制成口服劑型的步驟。

14.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項(xiàng)所述的植物提取物在制造治療乳腺癌的藥物的方法中的用途。

15.一種治療乳腺癌的方法，所述方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的植物提取物或組合物。

16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述植物提取物或組合物與其他抗癌劑一起施用于患者。