本發(fā)明涉及利用了植物發(fā)酵物的老化抑制劑，詳細而言，涉及兼具伴隨著動物的老齡的老化癥狀的體現(xiàn)抑制作用與存活的延長作用、且安全性優(yōu)異的老化抑制劑。

背景技術：

老化對動物而言是不可避免的現(xiàn)象。隨著生命科學的進步，對于老化的研究推進，已經闡明了個體、器官、組織、細胞、基因水平、進而與其連帶的神經·血管、免疫調節(jié)、激素類、調節(jié)因子的各種物質組的協(xié)調作用，但是詳細的機制仍未闡明。然而，發(fā)現(xiàn)了其線索，線蟲、果蠅、大鼠、小鼠、猴子等動物中，廣泛已知的是，飲食熱量限制顯示出壽命延長效果(非專利文獻1～4)。作為其背景，推定線粒體中的能量代謝參與。另外為了老化抑制·壽命延長，也探索了熱量限制模擬物(非專利文獻5)。另外胰島素·生長因子(igf-1)信號與壽命的相關以線蟲、果蠅、哺乳類(小鼠)的共通信號傳導通路形式體現(xiàn)(非專利文獻6)。進而，還發(fā)現(xiàn)了作為紅葡萄的低分子成分的白藜蘆醇期待老化抑制作用、壽命延長效果的結果(非專利文獻7)，進行了類似物質的探索研究(非專利文獻8)。最近，去乙?；妇哂薪M蛋白的脫乙酰化酶活性，發(fā)現(xiàn)了參與壽命延長，期待將各種線索的相關。另外還發(fā)現(xiàn)了去乙?；傅牡头肿诱{節(jié)物質(非專利文獻9)。

可能難以阻止伴隨著老化而引起的各種老化癥狀，但可以期待延遲老化癥狀的體現(xiàn)、進而延長壽命。然而，預測這些老化癥狀的原因與多個基因、過程相關(非專利文獻10)。因此，老化癥狀的發(fā)生延遲、壽命的延長的評價必需基于動物個體的試驗。另外，為了壽命的試驗研究，需要世代時間短的模型動物。作為這樣的模型動物，有線蟲、果蠅、小鼠，其中，小鼠為哺乳動物，正常型小鼠也為2～3年左右的壽命，因此，在較短期間內，可以推定對老化·壽命的效果。京都大學的動物實驗設施中，akr系的小鼠中發(fā)現(xiàn)的老化促進模型小鼠即sam-p系小鼠的壽命為1.5年左右，且顯示出各種老化特有的癥狀，因此，與同系的正常型的sam-r1小鼠相比，大多用于老化研究。這些小鼠也已經由sam研究會進行了傳代繁殖·市售，老化癥狀的評價方法也由sam研究會進行了標準化。標準化的老化指標利用行動異常、緩慢化、眼癥狀(眼睛周圍的損害、角膜的白濁、白內障等)、脫發(fā)、毛長等皮膚的老化癥狀、背骨的彎曲。另一方面，作為老化抑制的一個指標的存活率的延長未包含于sam研究會的標準的評價指標。

由輻射線照射所導致的障礙中，觀察到與老化類似的癥狀(非專利文獻11)。6～14戈瑞(gray)的x射線照射過的小鼠的小腸的粘膜干細胞受到障礙，但伊藤等人報道了，以混合飼料給予了味噌的小鼠中，小腸隱窩的干細胞的損傷少(非專利文獻12)。然而，沒有關于老化癥狀、存活率的報道。雖然報道了使用同樣的評價系，作為植物發(fā)酵食品的萬田酶對x射線照射過的小鼠的小腸的粘膜干細胞障礙抑制是有效的(非專利文獻13)，但是沒有報道老化癥狀的抑制、存活率的延長。

進而，報道了使用sam-p1系的老化促進模型小鼠的輔酶q10和還原型的老化癥狀的抑制效果(非專利文獻14)。報道了，與coq10無添加組相比，在眼癥狀、皮膚癥狀、背骨彎曲和綜合癥狀分數(shù)上顯示出顯著的老化抑制效果，但是，未見壽命的延長。另外將大豆蛋白spi與酪蛋白比較，老化度未見差異，但是spi確認到存活率延長效果(非專利文獻15)。

關于參與老化的去乙?；福瑘蟮懒耍芍兴幍纫鹑ヒ阴；傅脑鰪?、抑制，但沒有進行壽命延長的試驗。另一方面，報道了，紅葡萄中所含的白藜蘆醇延長果蠅、小鼠的壽命。

此外，關于老化抑制或者壽命延長，進行了各種報道，例如公開了，通過應用妨礙編碼g蛋白質γ亞基11的基因的表達或其作用的物質，可以抑制細胞老化(專利文獻1)。另外報道了，具有特定結構的烷基間苯二酚類具有去乙酰化酶活性化作用和老化抑制作用，顯示出延長個體壽命的效果(專利文獻2)。進而公開了，蜂王漿、特定結構的雜環(huán)化合物、白藜蘆醇、葡萄葉提取物、活性炭、紫荊提取物、姜黃素類、葛根提取物等顯示出防止老化、壽命延長等作用(專利文獻3～10)。

然后，實際情況是，對于哺乳動物，基本沒有均發(fā)揮老化癥狀的體現(xiàn)延遲效果和位于老化的延長線上的壽命的延長效果的食品、藥品等的報道。

現(xiàn)有技術文獻

專利文獻

專利文獻1：國際公開2007/102572

專利文獻2：日本特開2013-249260號公報

專利文獻3：日本特開2012-207004號公報

專利文獻4：日本特開2008-94795號公報

專利文獻5：日本特開2007-145809號公報

專利文獻6：日本特開2010-208969號公報

專利文獻7：日本特表2006-515590號公報

專利文獻8：日本特開2008-120726號公報

專利文獻9：日本特開2010-270012號公報

專利文獻10：日本特開2012-246242號公報

非專利文獻

非專利文獻1：a.dillinetal,“rateofbehaviorandagingspecifiedbymitochondrialfunctionduringdevelopment”,science298,2398-2401(2002)

非專利文獻2：grandisonrc1,pipermd,partridgel.“amino-acidinbalanceexplainsextensionoflifespanbydietaryrestrictionindrosophila”,nature462,1061-1064(2009)

非專利文獻3：“認識老化研究”羊土社2002、井出利憲編、p25,37

非專利文獻4：colemanr.j.etal,“carolicrestrictiondelaysdiseaseonsetandmortalityinrhesusmonkeys”,science325,201-204(2009)

非專利文獻5：“熱量限制模擬物”千葉卓哉、下川功、實驗醫(yī)學增刊31-no.20,182-189(2013)

非專利文獻6：“胰島素·igf-1信號與老化·壽命控制”植木浩二郎、實驗醫(yī)學增刊31-no.20,22-27(2013)

非專利文獻7：“resveratorolimproveshealthandsurvcivalofmiceonahigh-caloriediet”baueretal:nature,477：337-342(2006)

非專利文獻8：“源自紅葡萄酒的多酚protpcathchuicacid對果蠅壽命的效果”八木勇三等、foodfunction、11、9-13(2013)

非專利文獻9：“去乙?；傅牡头肿诱{節(jié)物質”d.a.sinclair、b.p.hubbard,實驗醫(yī)學增刊31-no.20,209-217(2013)

非專利文獻10：“老化·壽命的科學”實驗醫(yī)學增刊31卷-no.20(2013)今井真一郎、吉野純編集、羊土社

非專利文獻11：hoeijmakers,j.h.j.:“genomemaintenancemechanismsforpreventingcancer”:nature,411:366-374,2001

非專利文獻12：伊藤明弘“味噌去除放射性物質的效用預防發(fā)癌的味噌的生理作用”“味噌科學最前線”1999味噌健康推廣委員會發(fā)行

非專利文獻13：“植物發(fā)酵物對x線照射的防御效果-對小腸的隱窩再生的影響-”蘆田等、日本未病系統(tǒng)學會雜志、12(1)129-130(2006)

非專利文獻14：“reducedcoenzymeq10supplementationdeceleratesenescenceinsam-p1mice”j.yanet.al.:experimentalgerontology41(2006)130-140

非專利文獻15：“針對基于大豆蛋白的促進老化抑制效果-基于老化促進模型小鼠的實驗的研究”河野篤子等、nutr.sci.soyprotein、jpn:7,25-29(1986)

非專利文獻16：“老化解析”簗瀨澄乃、石井直明、“線蟲實驗室手冊”三谷昌平編、p.201-206(2003)springer-verlagtokyo,inc.

技術實現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的問題

本發(fā)明鑒于上述實際情況，其課題在于，提供：使老化相關的多個癥狀的體現(xiàn)延遲、且?guī)韷勖难娱L、安全性高的老化抑制劑。

用于解決問題的方案

本發(fā)明人為了解決上述課題，進行了深入鋭意研究，結果發(fā)現(xiàn)：使有多種食用經驗的植物用乳酸菌、酵母、曲霉等發(fā)酵而成的發(fā)酵物抑制伴隨著老齡的各種老化癥狀，且顯示出存活率的延長效果，至此完成了本發(fā)明。

即，本發(fā)明為一種老化抑制劑，其特征在于，含有植物發(fā)酵物作為有效成分，所述植物發(fā)酵物為如下(a)～(g)的混合物，

(a)選自由大麥、黑豆、紅米、黑米、小豆、薏仁、稗子、小米和黃米組成的組中的1種或2種以上的豆/谷物類的曲霉發(fā)酵物；

(b)選自由蜜柑、葡萄、蘋果、山葡萄、桃子、柿子、木瓜、梨、西瓜、梅子、無花果、榅桲、南瓜、金橘、柚子、枇杷、杏、棗、栗子、葛棗和李子組成的組中的1種或2種以上的水果類的酵母和/或乳酸菌發(fā)酵物；

(c)選自由紫薯、洋姜、胡蘿卜、洋蔥、甘薯、芋頭、薯蕷、蘿卜、紅蕪菁、牛蒡、蓮藕、雪蓮果、百合根、慈菇、姜、大蒜和姜黃組成的組中的1種或2種以上的塊根類/薯類的酵母和/或乳酸菌發(fā)酵物；

(d)選自由卷心菜、紫蘇、桑葉、魚腥草、苦艾、山白竹和蒲公英組成的組中的1種或2種以上的花/葉菜類的酵母和/或乳酸菌發(fā)酵物；

(e)選自由海帶、裙帶菜和海蘊組成的組中的1種或2種以上的海藻類的酵母和/或乳酸菌發(fā)酵物；

(f)選自由黑芝麻、胡桃和銀杏組成的組中的1種或2種以上的種子類的酵母和/或乳酸菌發(fā)酵物；

(g)選自由灰樹花和香菇組成的組中的1種或2種的蘑菇類的酵母和/或乳酸菌發(fā)酵物。

另外本發(fā)明為一種飲食品，其含有上述老化抑制劑。

另外本發(fā)明為一種壽命延長劑，其含有上述(a)～(g)的植物發(fā)酵物作為有效成分。

發(fā)明的效果

本發(fā)明的老化抑制劑可以抑制伴隨著動物的老齡的寬范圍的老化癥狀的體現(xiàn)，并且?guī)泶婊盥恃娱L。另外，作為有效成分即植物發(fā)酵物的原料的植物和微生物的食用經驗均豐富，因此，安全性極高。

附圖說明

圖1為制造例2的植物發(fā)酵物中所含的多酚類的基于hplc的分析結果。

圖2為制造例2的植物發(fā)酵物中所含的白藜蘆醇的基于hplc的分析結果。

圖3為示出試驗例1中的氧敏感性線蟲變異株(mev-1)在氧氣100％氣氛下的存活曲線的圖?？v軸表示每3.5cm有蓋培養(yǎng)皿的線蟲的平均存活只數(shù)，橫軸表示培養(yǎng)天數(shù)。

圖4為示出試驗例2中的sam小鼠的存活曲線的圖?？v軸表示sam小鼠的存活率(％)，橫軸表示sam小鼠的周齡。

圖5為示出試驗例2中、對于植物發(fā)酵物2％和0.2％給予試驗的存活率、基于kaplan-meier解析的顯著性檢驗的結果的圖?？v軸表示累積存活率，橫軸表示周齡。實線為植物發(fā)酵物2％組的存活曲線，虛線為植物發(fā)酵物0.2％組的存活曲線。

圖6為示出試驗例2中、使用sam研究會的標準法的老化度的綜合評價分數(shù)的推移的圖?？v軸表示老化指標綜合分/只，橫軸為周齡。實線為植物發(fā)酵物2％組，虛線為植物發(fā)酵物0.2％組。為了進行顯著性檢驗，選擇能夠確保存活數(shù)為6/8只以上的54周齡和60周齡的2點，用箭頭表示。

圖7為試驗例2中、針對54周齡(a)和60周齡(b)、分別比較植物發(fā)酵物2％組與0.2％組的老化度綜合評價分數(shù)的圖。

圖8為試驗例2中、針對54周齡(a)和60周齡(b)、比較植物發(fā)酵物2％組與0.2％組的植物發(fā)酵物的老化指標之一即“背骨彎曲分數(shù)”的圖。

圖9為示出試驗例2中、針對正常型(sam-r1)和老化促進型(sam-p1)小鼠、主要在鼠頸部產生的腫瘤的體積的推移的圖。

具體實施方式

本發(fā)明的老化抑制劑含有下述植物發(fā)酵物作為有效成分。該植物發(fā)酵物為以下(a)～(g)的植物發(fā)酵物的混合物。

(a)通過使曲霉作用于選自由大麥、黑豆、紅米、黑米、小豆、薏仁、稗子、小米和黃米組成的組中的1種或2種以上的豆/谷物類而得到的發(fā)酵物。

(b)通過使酵母和/或乳酸菌作用于選自由蜜柑、葡萄、蘋果、山葡萄、桃子、柿子、木瓜、梨、西瓜、梅子、無花果、榅桲、南瓜、金橘、柚子、枇杷、杏、棗、栗子、葛棗和李子組成的組中的1種或2種以上的水果類而得到的發(fā)酵物。

(c)通過使酵母和/或乳酸菌作用于選自由紫薯、洋姜、胡蘿卜、洋蔥、甘薯、芋頭、薯蕷、蘿卜、紅蕪菁、牛蒡、蓮藕、雪蓮果、百合根、慈菇、姜、大蒜和姜黃組成的組中的1種或2種以上的塊根類/薯類而得到的發(fā)酵物。

(d)通過使酵母和/或乳酸菌作用于選自由卷心菜、紫蘇、桑葉、魚腥草、苦艾、山白竹和蒲公英組成的組中的1種或2種以上的花/葉菜類而得到的發(fā)酵物。

(e)通過使酵母和/或乳酸菌作用于選自由海帶、裙帶菜和海蘊組成的組中的1種或2種以上的海藻類而得到的發(fā)酵物。

(f)通過使酵母和/或乳酸菌作用于選自由黑芝麻、胡桃和銀杏組成的組中的1種或2種以上的種子類而得到的發(fā)酵物。

(g)通過使酵母和/或乳酸菌作用于選自由灰樹花和香菇組成的組中的1種或2種的蘑菇類而得到的發(fā)酵物。

本發(fā)明的老化抑制劑可以直接將混合有上述(a)～(g)的發(fā)酵物的植物發(fā)酵物作為有效成分，通過使其進一步多階段發(fā)酵，從而可以提高呈味性、制劑性。

作為酵母，可以舉出：屬于酵母屬、接合酵母屬等的酵母，其中，優(yōu)選使用釀酒酵母(s.cervisiae)、魯氏酵母(z.rouxii)、啤酒酵母(s.exiguus)等。作為乳酸菌，例如可以舉出：屬于片球菌(pediococcus)屬、明串珠菌(leuconostoc)屬、乳酸菌(lactobacillus)屬、乳球菌(lactococcus)屬等的乳酸菌，其中，優(yōu)選使用乳酸片球菌(p.acidilacti)、短乳桿菌(l.brevis)、腸系膜明串珠菌(l.mesenteroides)、植物乳桿菌(l.plantarum)、乳酸乳球菌(l.lactis)、清酒乳桿菌(l.sakei)、戊糖片球菌(p.pentosaceus)、干酪乳桿菌(l.casei)、羅伊氏乳桿菌(l.reuteri)和彎曲乳桿菌(l.curvatus)等，可以使用它們中的1種或2種以上。作為曲霉，可以舉出：米曲霉(aspergillusoryzae)、黑曲霉(aspergillusniger)、白曲霉(aspergilluskawachii)等，可以使用它們中的1種或2種以上。它們也可以使用市售品。

供至發(fā)酵的豆/谷物類、水果等植物可以直接使用，或者也可以根據需要進行粉碎、干燥等前處理。另外也可以根據需要添加水進行稀釋。

上述(a)～(g)的發(fā)酵物通過向作為原料的植物中接種乳酸菌、酵母或曲霉并使其培養(yǎng)而得到。培養(yǎng)只要通過常規(guī)方法進行即可，例如，可以對于1種或2種以上的植物的混合物，添加0.001～1質量％左右的乳酸菌、酵母或曲霉，在20～50℃下進行70～140小時左右的發(fā)酵處理。

也可以將如此得到的(a)～(g)的發(fā)酵物混合而直接作為有效成分，優(yōu)選的是，根據需要進而在20～40℃下進行200～300小時左右的培養(yǎng)。進一步優(yōu)選使該混合物后發(fā)酵(熟化)。后發(fā)酵可以根據需要使醋酸菌作用，例如，可以向使上述酵母作用于上述(a)～(g)所含的植物中的1種或2種以上而得到的物質中，添加使醋酸桿菌(a.aceti)等醋酸菌作用的醋酸發(fā)酵物。后發(fā)酵可以在25～35℃下進行70小時～約1年左右。通過進行基于后發(fā)酵的熟化過程，可以改善呈味性、制劑性，另外也可以實現(xiàn)抗氧化活性的增大。

作為用于制造上述植物發(fā)酵物的適合的方法的例子，可以舉出：多階段復合發(fā)酵方式。該方法如下進行：將以水果類、蔬菜類、海藻類為主原料的復合乳酸菌發(fā)酵物與以蔬菜類、塊根類、種子類、蘑菇類、水果類為主要原料的酵母發(fā)酵物混合，向其中加入以谷物類、豆類為主原料的曲霉發(fā)酵物，進而加入醋酸發(fā)酵物并混合，然后進行過濾濃縮，進而進行約1年左右的后發(fā)酵。可以認為，通過這樣的多階段復合發(fā)酵，進而利用其他類型的菌類使各發(fā)酵產物其同化·轉化，可以提高風味且提高抗氧化活性等效果。

本發(fā)明的老化抑制劑和壽命延長劑可以如下得到：依據公知的制劑學制法，向如此得到的植物發(fā)酵物中加入藥理學上能夠允許的載體、賦形劑、水分活性調節(jié)劑等并制劑化而得到。植物發(fā)酵物可以根據需要濃縮而調整濃度，或者通過噴霧或冷凍干燥等進行粉末化。作為制劑化中使用的載體、賦形劑，例如可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉、糖類混合物等。作為最終形態(tài)，可以使用溶液、糊劑、軟膠囊、咀嚼片、膠囊。作為用量·用法，例如，以有效成分的植物發(fā)酵物計，大人每1天可以口服攝取0.1～10g、優(yōu)選口服攝取0.6～6g(換算為固體成分)左右。

另外，本發(fā)明的老化抑制·壽命延長劑除藥品、準藥品等之外，也可以與公知的食品原材料一起配合而形成飲食品的形態(tài)。上述植物發(fā)酵物也可以直接攝取，為了提高保存性，也可以在殺菌后進行過濾、濃縮，或者根據需要添加賦形劑進行噴霧或冷凍干燥而形成粉末狀。進而，為了提高流通過程中的保存期限，理想的是，進行濃縮而降低水分活性。作為上述飲食品的形態(tài)，可以舉出：糊劑、軟膠囊、片劑、保健飲料等。大人每1天，以植物發(fā)酵物計，攝取0.1～10g、優(yōu)選0.6～6g(換算為固體成分)左右，從而可以得到優(yōu)異的老化抑制效果等。作為使這樣的上述植物發(fā)酵物制劑化、食品的形態(tài)的市售品，可以舉出：天生酶金印、天生酶膠囊(nihonsizenhakkoh制)等。

本發(fā)明中使用的有效成分的植物發(fā)酵物具有下述(1)至(4)的性質。

(1)呈味性

具有源自水果、蔬菜等原料的甜味、在有機酸基礎上的源自谷芽的甜味。雖然包含源自原料的多酚類，但是苦味少。

(2)對水的溶解性

容易溶解于水。

(3)穩(wěn)定性

對熱、酸穩(wěn)定，糊劑在室溫下保存1年，也不會腐敗、呈味性也沒有變化。

(4)安全性

原料中使用的蔬菜、水果、藥草等是日常食用的，另外發(fā)酵中使用的酵母、乳酸菌、曲霉均使用源自食品的釀造、發(fā)酵等的菌種，因此，食用經驗豐富。

另外，本發(fā)明中使用的植物發(fā)酵物具有下述(i)至(vi)的性質。

(i)一般成分(每100g)

(ii)氨基酸組成(每100g)

(iii)有機酸組成(每100g)

(iv)礦物組成(每100g)

(v)多酚(μg/g)

(vi)白藜蘆醇

白藜蘆醇的反式體與順式體的含量的總計為0.1mg/g以下。

以該植物發(fā)酵物為有效成分的老化抑制劑顯示出如下效果：用量依賴性地提高氧敏感性的線蟲和老化促進小鼠的存活率，并且使小鼠的伴隨著老齡的行動、皮膚、眼、背骨中的老化癥狀的體現(xiàn)延遲。

實施例

接著，列舉實施例等，對本發(fā)明進行更詳細地說明，但本發(fā)明不受這些實施例等的任何限制。

制造例1

植物發(fā)酵物的制造(1)：

使用以下的植物作為原料。

(a)豆/谷物類(大麥、黑豆、紅米、黑米、小豆、薏仁、稗子、小米、黃米)

(b)水果類(蜜柑、葡萄、蘋果、山葡萄、桃子、柿子、木瓜、梨、西瓜、梅子、無花果、榅桲、南瓜、金橘、柚子、枇杷、杏、棗、栗子、葛棗、李子)

(c)塊根類(紫薯、洋姜、胡蘿卜、洋蔥、甘薯、芋頭、薯蕷、蘿卜、紅蕪菁、牛蒡、蓮藕、雪蓮果、百合根、慈菇、姜、大蒜、姜黃)

(d)花/葉菜類(卷心菜、紫蘇、桑葉、魚腥草、苦艾、山白竹、蒲公英)

(e)海草類(海帶、裙帶菜、海蘊)

(f)種子類(黑芝麻、胡桃、銀杏)

(g)蘑菇類(灰樹花、香菇)

將以乳酸菌類(乳酸片球菌(p.acidilacti)、短乳桿菌(l.brevis)、腸系膜明串珠菌(l.mesenteroides)、植物乳桿菌(l.plantarum)、乳酸乳球菌(l.lactis)、清酒乳桿菌(l.sakei)、干酪乳桿菌(l.casei))成為約1.0×10⁵cfu/g的菌濃度的方式調制的培養(yǎng)液0.2質量％接種至上述(c)、(d)和(g)的原料(730g)，在30℃下進行50小時培養(yǎng)。另外將以酵母類(釀酒酵母(s.cervisiae)5種、魯氏酵母(z.rouxii)2種)成為約1.0×10⁵cfu/g的菌濃度的方式調制的培養(yǎng)液0.4質量％接種至上述(b)、(e)和(f)的原料(900kg)，在30℃下進行50小時培養(yǎng)。將曲霉類(黃曲霉、黑曲霉、白曲霉)0.1質量％接種至(a)豆類和谷物類系原料(1000kg)，在35℃下進行70小時培養(yǎng)。接著，將各培養(yǎng)物混合后，在30℃下進行200小時培養(yǎng)。對結束了發(fā)酵的醪液進行固液分離操作，將所得濾液濃縮而形成糊狀的物質分別注入至容器，1年后進一步使其發(fā)酵(熟化)，得到植物發(fā)酵物。

制造例1中得到的植物發(fā)酵物具有以下的性質。

(i)一般分析值(每100g)

(ii)氨基酸組成(每100g)

通過氨基酸自動分析計對用6n鹽酸水解試樣而得到的物質進行分析。對于胱氨酸，過甲酸氧化處理后，使用鹽酸水解。色氨酸使用高效液相色譜法。

(iii)有機酸組成(每100g)

(iv)礦物組成(每100g)

制造例2

植物發(fā)酵物的制造(2)：

使用以下的植物作為原料。

(a)豆/谷物類(大麥、黑豆、紅米、黑米、小豆、薏仁、稗子、小米、黃米)

(b)水果類(蜜柑、葡萄、蘋果、山葡萄、桃子、柿子、木瓜、梨、西瓜、梅子、無花果、榅桲、南瓜、金橘、柚子、枇杷、杏、棗、栗子、葛棗、李子)

(c)塊根類(紫薯、洋姜、胡蘿卜、洋蔥、甘薯、芋頭、薯蕷、蘿卜、紅蕪菁、牛蒡、蓮藕、雪蓮果、百合根、慈菇、姜、大蒜、姜黃)

(d)花/葉菜類(卷心菜、紫蘇、桑葉、魚腥草、苦艾、山白竹、蒲公英)

(e)海草類(海帶、裙帶菜、海蘊)

(f)種子類(黑芝麻、胡桃、銀杏)

(g)蘑菇類(灰樹花、香菇)

將以乳酸菌類(乳酸片球菌(p.acidilacti)、短乳桿菌(l.brevis)、腸系膜明串珠菌(l.mesenteroides)、植物乳桿菌(l.plantarum)、乳酸乳球菌(l.lactis)、清酒乳桿菌(l.sakei)、干酪乳桿菌(l.casei))成為約1.0×10⁵cfu/g的菌濃度的方式調制的培養(yǎng)液0.2質量％接種至上述(c)、(d)和(g)的原料(730g)，在30℃下進行50小時培養(yǎng)。另外將以酵母類(釀酒酵母(s.cervisiae)5種、魯氏酵母(z.rouxii)2種)成為約1.0×10⁵cfu/g的菌濃度的方式調制的培養(yǎng)液0.4質量％接種至上述(b)、(e)和(f)的原料(900kg)，在30℃下進行50小時培養(yǎng)。將曲霉類(黃曲霉、黑曲霉、白曲霉)0.1質量％接種至(a)豆類和谷物類系原料(500kg)，在35℃下進行70小時培養(yǎng)。接著，將各培養(yǎng)物混合后，在30℃下進行200小時培養(yǎng)。對于結束了發(fā)酵的醪液進行固液分離操作，將所得濾液濃縮而形成糊狀的物質分別注入至容器，1年后進一步使其發(fā)酵(熟化)，得到植物發(fā)酵物。

制造例2中得到的植物發(fā)酵物具有以下的性質。

(i)一般分析值(每100g)

(ii)氨基酸組成(每100g)

通過氨基酸自動分析計對用6n鹽酸水解試樣而得到的物質進行分析。對于胱氨酸，過甲酸氧化處理后，使用鹽酸水解。色氨酸使用高效液相色譜法。

(iii)有機酸組成(每100g)

(iv)多酚(參照圖1；μg/g)

(hplc條件)

柱：mcm(4.6x250mm；5μm)

柱溫：35℃

流動相：流動相a:100mm磷酸鈉、5％甲醇

流動相b：100mm磷酸鈉、60％乙腈、10％甲醇

梯度條件：流動相b的直線梯度0-45分鐘、0～6％、

流動相b的直線梯度6％～14％、45～60分鐘、

流動相b的直線梯度14％～30％、60～90分鐘

流動相b的直線梯度30％～40％、90～120分鐘、

流動相b的直線梯度40％～77％、120～140分鐘、

流動相b的等度洗脫至85％，100分鐘

流量：1.0ml/分鐘

檢測器：coularray,model5600a

(測定方法)

精確地量取檢體約80mg，添加內標液(17-α-雌二醇100μg/ml)100μl，加入90％甲醇溶液5ml，振蕩10分鐘后，在35℃下進行30分鐘超聲波提取。提取后，利用離心器(3000rpm,10分鐘)進行離心分離后，分取上清，在氮氣氣流下進行濃縮，然后用0.1m醋酸鈉緩沖液定容至2ml。向該溶液1ml中添加β-糖苷酶系酶10mg，在43℃下進行2小時酶處理。向酶處理后的溶液中添加甲醇500μl，用0.45μm過濾器過濾，將所得液體作為試驗溶液。

(v)白藜蘆醇(參照圖2)

含有反式體與順式體的總計為0.022mg/g的白藜蘆醇(反式體0.002mg/g、順式體0.02mg/g)。

檢測器：uv(310nm)

柱：野村化學ods-mg-33×100mm

柱溫：40℃

流動相：稀釋了的磷酸(1→500)/乙腈混液(4：1)

流量：0.4ml/分鐘

(測定方法)

·nsk白藜蘆醇(標準溶液)

將1個膠囊(330mg相當于白藜蘆醇3.3mg)用70％甲醇溶解，制成100ml。

該液體用0.45μm的膜濾器過濾，將濾液作為標準溶液。

·試樣

將試樣約1g用水30ml溶解，加入乙酸乙酯20ml，混合，分取上清液，進行減壓濃縮。向殘留物中加入70％甲醇5ml。將該液體用0.45μm的膜濾器過濾，將濾液作為試樣溶液。

紅葡萄酒所含的白藜蘆醇已知有抗炎癥作用、老化抑制作用、或者延長果蠅的壽命。植物發(fā)酵物也顯示出sam小鼠中的老化抑制作用和壽命延長作用，因此，為了確認白藜蘆醇影響的有無，用hplc標準品分析其含量。結果，反式體為0.002mg/g、順式體為0.02mg/g(反式體與順式體的總量為0.022mg/g)。在該濃度下，無法期待老化抑制效果、壽命延長效果，可以認為，本植物發(fā)酵物的老化抑制作用與存活率的延長作用源自其他物質。

試驗例1對線蟲的延命效果：

將制造例1中得到的植物發(fā)酵物用離子交換水稀釋，制成2％(w/w)溶液，利用高壓釜，以121度進行20分鐘滅菌。作為線蟲(caenorhabditiselegans)，使用氧敏感性變異株(mev-1)。mev-1株在培養(yǎng)中的氧濃度增加時容易死亡，引起依賴于氧濃度的存活曲線的偏移。證明了，該變異株是源自線粒體的呼吸鏈中的復合體ii的細胞色素b560變異的琥珀酸-輔酶q脫氫酶的變異，長期間培養(yǎng)而老化了的線蟲在體內觀察到空洞，進而證明了，伴隨著老化的脂褐質蓄積。如此，mev-1變異株是適于老化研究的模型實驗動物。存活曲線依據石井等的方法(非專利文獻16)來進行。即，將大腸桿菌k562株的用胰蛋白胨肉湯振蕩培養(yǎng)的培養(yǎng)液用巴斯德吸管添加1滴至3.5cmfalconplates中加入的胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(tn培養(yǎng)基)，在30℃下培養(yǎng)1晩時，形成直徑5mm左右的大腸桿菌的簇。另行以直徑9cm的有蓋培養(yǎng)皿的tn瓊脂培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌為餌，使mev-1生長后，促進生長階段l4，將總計10只的線蟲移植至3.5cm板上的大腸桿菌簇。將移植有線蟲的4張3.5cm板放入密封袋后，用氧氣進行100％置換。從第二天起每天用實體顯微鏡記錄存活的線蟲的數(shù)量。觀察后，再次用氧氣同樣地進行置換。如圖3所示那樣，所得存活曲線在簗瀨·石井報道的最大80％氧氣飽和的條件下進一步向短壽命側偏移，表示實驗正常進行。氧氣100％氣氛下的該氧敏感性變異株的壽命與文獻(非專利文獻16)中報道的簗瀨·石井的圖相比時，示出50％存活率的培養(yǎng)天數(shù)(日齡)比石井等的80％氧氣氣氛下(約10天)進一步縮短，為約3天。與對照的水組相比，2％植物發(fā)酵物組在存活率約50％附近可見延命效果。進行t-檢驗，結果p＝0.025、有顯著性差異?？芍?，mev-1變異株在線粒體的呼吸鏈中有缺陷，因此強烈地暗示了，活性氧與毒性相關。

試驗例2

對于植物發(fā)酵物使用老化促進模型小鼠(sam小鼠)的伴隨著老齡的老化抑制效果和存活率的延長效果、和腫瘤的發(fā)生抑制效果，如下實施試驗。sam小鼠(sam-p1/skuslc、10周齡、雄)購入作為sam研究會指定的飼養(yǎng)員的japanslc,inc.生產的小鼠。餌使用自sankyolaboservicecorporation,inc.購入的γ射線滅菌過的固體飼料500n。對于sam小鼠，在spf專用動物室中，使用23±2℃、濕度50±10％的恒溫·恒濕設備，在鋪有滅菌墊料的cleajapan,inc.制的中型聚碳酸酯制使用籠中分別進行飼養(yǎng)。照明在20：00～08：00之間關閉。另外為了比較腫瘤形成，對于正常型的sam-r1/skuslc也同樣地進行飼養(yǎng)。

將制造例1的植物發(fā)酵物用離子交換水稀釋，制成2％和0.2％水溶液，以飲料水的形式使小鼠自由攝取。飼料使用自sankyolaboservicecorporation,inc.購入的γ射線滅菌飼料n500。各組使用8只，飼養(yǎng)當初設為4只/籠，依次移至個別飼養(yǎng)。正常型sam-r1使用4只，不給予植物發(fā)酵物，使其僅自由攝取離子交換水。移至個別飼養(yǎng)后，每周實施1次的評價·觀察和籠交換。一般的觀測項目設為體重、飲水量(＝樣品攝取量)、攝食量、外觀。老化指標的觀察使用sam研究會指定的評價說明書中記載的標準的評價方式，記載用紙使用sam研究會指定的片。進而，雖然sam研究會的評價方式中未包含，但是還實施了存活率的推移、能夠自體表觀察到的腫瘤的大小測量。

sam研究會指定的老化指標為以下的方法。

行為(behavious)(2項目)

1.反應(reactivity)(級別0-4)

小鼠出至籠外時可見的探索行動

0：低齡小鼠顯示出的動作

1：躡足而行(倉皇逃竄)或者興奮狀態(tài)

2：緩慢行走(慢吞吞地走)

3：不動，但觸摸臀部時移動

4：完全不動

2.被動性(passivity)(級別0-4)

從正上偷偷地按壓小鼠的脖子時的逃避行動

0：低齡小鼠顯示出的動作。強力地猛烈地逃避。

1：逃避慢

2：無逃避

3：無逃避。抓住脖子而向上仰時，翻身

4：即使抓住前肢、后肢也沒有掙扎。

光澤外觀(grossappearances)(9項目)

皮膚和毛發(fā)(4項目)

3.光澤度(glossiness)(級別0-4)

毛的光澤

0：為純白而閃亮(低齡小鼠顯示的毛光澤)

1：0與1之間

2：光澤清晰地消失，沒有被污染。

3：2與4之間

4：被嚴重污染的狀態(tài)

4.粗糙程度(coarseness)(級別0-4)

用面積判斷用指尖摩擦毛皮時感到的堅硬的觸感。

有時有小的潰瘍、皮膚炎

0：無毛疙瘩。平滑、光滑

1：位于頭、臉附近

2：擴展至肩附近。

3：擴展至背附近。

4：超過背直至尾巴附近。

5.毛發(fā)的流失(lossofhair)(級別0-4)

毛皮變薄的狀態(tài)或者光禿的狀態(tài)。腹部的毛薄因此在背部觀察。妊娠小鼠的毛變薄，因此可以觀察清楚的光禿。

0：完全沒有毛的損失

1：a；光禿為頭部程度的大小。

b；毛薄的部分直至背部整體的約一半。

2：a；光禿為背部整體的1/4以下

b；毛薄的部分為背部整體的1/2以上

3：光禿為背部整體的大體1/4以上且1/2以下

4：光禿為背部整體的1/2以上

6.皮膚潰瘍(skinulcers)(級別0-4)

也包含白的瘢痕。查找身體整體。

0：完全沒有

1：伴隨著瘢痕(皮膚白且肥厚)、痂皮的潰瘍。無論大小如何。

2：滲出地紅色潰爛的潰瘍。大體頭部的面積左右以下。

3：滲出地紅色潰爛的潰瘍。大體頭部的面積左右以上且背部的面積的1/2程度以下。

4：滲出地紅色潰爛的潰瘍。大體背部的面積的1/2左右以上。

眼睛(4項目)

左右分別進行評價?？偡种兄苯舆M行加和。也可以根據需要帶有1/2的系數(shù)，或僅采用容易評價的項目。角膜病變、白內障的觀察直接使用筆燈。

7.眼周病變(periophthalmiclesions)(級別0-3)

0：無變化。眼張開。

1：眼瞼腫脹而眼合上?；蛘邇H眼的周圍有損害。

2：眼周圍的損害擴展至鼻尖。

眼沒有問題，僅有鼻尖的潰瘍，因此應注意。

3：損害擴展至臉整體的狀態(tài)

8.角膜渾濁(corenealopacity)(級別0-3)

角膜的混濁。角膜白而渾濁，但表面平滑。

放入冰箱，變白的“饅頭碎屑”那樣的狀態(tài)。

0：無病變

1：可見虹彩

2：未見虹彩，但可見來自視網膜的反射(黃金色-橙色)

3：無反射光。

9.角膜潰瘍(ulcersofcornea)(級別0-3)

角膜白濁，表面粗糙。

0：無病變

1：眼裂部一致處有線狀的白濁。

2：1與3之間。有來自周圍的反射光。

3：基本擴展至角膜整體，未見視網膜的反射光。

10.白內障(cataract)(級別0-2)

白內障。白濁通過透明的角膜在底部投影出白色。從側方觀察時，可知角膜為透明。

0：無白濁。視網膜反射光正常

1：反射光稍減弱。

2：完全沒有反射。(未觀察到黃金-橙色)

脊椎(spine)(1項目)

11.脊椎彎曲(lordokyphosis)(級別0-3)

撫摸時，卡在頭部。

設置小鼠的姿勢使其頭部伸展。

0：無卡住。

1：輕輕地撫摸時卡住，但強力地撫摸時不會卡住。

2：即使強力地撫摸也卡住。拉伸尾巴伸展脊梁時，不會卡住。

3：無論怎么樣都卡住。

總分(totalscore)

全部單純地加和，作為小鼠個體的老化度評分。眼瞼閉合時，將生理鹽水取至注射器，清洗眼時使得能夠睜開眼，侵襲稍變強。角膜病變強而無法觀察到白內障時，嚴格地講，該小鼠不得不被省略。

依據sam研究會的上述老化度評價法，每周評價各小鼠1次，記入研究會指定的記錄用紙。同時進行體重測定、飲水量(樣品攝取量)的記錄、攝食量的記錄。sam研究會的指定評價法中不包含，但記錄存活的記錄與存活曲線，另外60周齡及其以后，根據鼠頸部中頻發(fā)的淋巴癌樣的腫瘤的長徑、短徑、高度的測量記錄腫瘤體積(mm³)。

圖4中示出存活曲線，圖5中示出存活率的kaplan-meyer解析，表1中示出植物發(fā)酵物與coq10和coq10還原型三者的存活率的平均天數(shù)的比較表，表2中示出存活期間的平均值、中央值、最長成長期間，圖6中示出老化綜合評分的推移，圖7中示出54周以及60周齡的老化綜合評分的顯著性差異解析，圖8中示出54周齡以及60周齡的背骨彎曲的比較。另外圖9中示出超過60周齡而飼養(yǎng)時頻發(fā)的腫瘤的體積的推移比較。

由圖4表明，植物發(fā)酵物2％組與植物發(fā)酵物0.2％組相比，存活率高，有濃度依賴性。另外，由圖5表明，根據兩者間的顯著性檢驗的結果，算出cox-mantel-henzel的顯著性檢驗的p值＝0.00461，植物發(fā)酵物2％組顯著具有延命效果。

對于kaplan-meyer解析(圖5)中算出的平均周齡(和平均天數(shù))，與使用同一小鼠種(sam-p1♂)的基于coq10和coq10還原型的試驗結果(非專利文獻14)進行比較(表1)。植物發(fā)酵物2％的平均天數(shù)(624.475天)與coq10(517.89天)和coq10還原型(519.64天)相比，超過誤差范圍，為較長。需要說明的是，報道了coq10與coq10還原型之間沒有顯著性差異。

[表1]

[表2]

如圖6所示那樣，植物發(fā)酵物2％組與0.2％組相比，老化度的體現(xiàn)延遲，另外老化綜合分數(shù)與0.2％組相比，也始終為低值。

如圖6所示那樣，全部周齡中，對于植物發(fā)酵物2％組，老化指標綜合分中，低于0.2％組，對于進行了顯著性檢驗的54周齡、60周齡，2％組與0.2％組相比，在t-檢驗的p<0.05下老化分數(shù)均顯著低(圖7)。

對于54周齡、60周齡，2％組與0.2％組相比，背骨老化指標分數(shù)均顯著顯示出低值，表明植物發(fā)酵物濃度依賴性地抑制伴隨著老齡的背骨彎曲異常(圖8)。

已知的是，小鼠一般超過60周齡時腫瘤自然發(fā)生，大多為淋巴癌。試驗例2中，70周齡以上時，正常型(sam-r1)和老化促進型(sam-p1)均主要在鼠頸部發(fā)生腫瘤，因此，將尺寸以短徑x長徑x高度計，而近似地測量體積的推移(圖9)。需要說明的是，沒有實施關于癌種類的細胞診斷，因此假定設為“腫瘤”。老化促進型的植物發(fā)酵物2％組與正常型的腫瘤尺寸的推移等同，但老化促進型的植物發(fā)酵物0.2％組中，腫瘤尺寸以高于這些組的值推移。

產業(yè)上的可利用性

本發(fā)明的老化抑制劑具有抑制伴隨著動物的老齡的老化癥狀的發(fā)生和存活率延長作用。該老化抑制劑為在抑制老化癥狀的同時、除了哺乳動物之外對具有動物的基本條件的氧敏感性的線蟲也用量依賴性地顯示出顯著的存活率的延長的首個例子，可以利用為不僅抑制寬范圍的老化癥狀而且也帶來存活率延長的新型藥物或食品。