本發(fā)明涉及感染性疾病的預(yù)防和治療。更具體而言，本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防A群鏈球菌屬鏈球菌相關(guān)的疾病和病況的疫苗。

發(fā)明背景

由于由釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)(蘭斯菲爾德A群鏈球菌；GAS)引起的衰弱性疾病，特別是風(fēng)濕熱和風(fēng)濕性心臟病，長(zhǎng)期以來(lái)一直尋求針對(duì)所述細(xì)菌的疫苗?，F(xiàn)今，在大多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家中，風(fēng)濕熱是一種罕見(jiàn)疾病，但是在發(fā)展中國(guó)家，其仍是兒童、青少年和青壯年中后天性心臟病的主要原因。此外，侵入性GAS疾病是兒童和成人中的膿毒病的常見(jiàn)原因且病死率高。進(jìn)一步增加GAS疾病的負(fù)擔(dān)的是鏈球菌感染后腎小球腎炎，其可能導(dǎo)致許多GAS流行地區(qū)的高晚期腎衰竭率。GAS咽炎和膿皰病是每年最大絕對(duì)數(shù)量的GAS感染。每年，GAS咽炎影響大約8％–15％的學(xué)齡兒童，以及GAS膿皰病是兒童中十分常見(jiàn)的感染，患病率為10-50％。嚴(yán)重的GAS相關(guān)疾病不僅是發(fā)展中國(guó)家的問(wèn)題，而且甚至是發(fā)達(dá)國(guó)家的問(wèn)題，具體地，已出現(xiàn)了有毒的GAS菌株，其對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的抗生素療法具有抗性且引起衰弱性疾病，如嚴(yán)重的壞死性筋膜炎。

GAS的重要毒力因子是M蛋白，其強(qiáng)烈地抗吞噬且與血清H因子結(jié)合，破壞C3-轉(zhuǎn)化酶并通過(guò)C3b阻止調(diào)理作用。已開(kāi)發(fā)出了含有來(lái)自M蛋白的保守C重復(fù)部分的免疫原性肽，如來(lái)自C重復(fù)區(qū)域的T細(xì)胞和B細(xì)胞表位的疫苗，或者含有來(lái)自該C重復(fù)區(qū)域的單一最小的B細(xì)胞表位的J8和J14肽疫苗。

發(fā)明概述

意外地，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，J8-肽誘導(dǎo)的對(duì)A群鏈球菌的免疫的重要因素是嗜中性粒細(xì)胞的活性。雖然體外的調(diào)理作用分析使用全血作為嗜中性粒細(xì)胞和補(bǔ)體的來(lái)源，但是體內(nèi)保護(hù)需要嗜中性粒細(xì)胞是未知的。而且，調(diào)理作用分析顯示了CFU的相對(duì)適度減少(通常少于10倍)，而J8在體內(nèi)誘導(dǎo)的保護(hù)可以導(dǎo)致細(xì)菌生物負(fù)載的數(shù)個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的減少。更具體而言，目前，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，嗜中性粒細(xì)胞抑制劑(如使嗜中性粒細(xì)胞趨化性物質(zhì)白介素8失活的SpyCEP)在誘導(dǎo)對(duì)A群鏈球菌的免疫方面針對(duì)J8起作用。

以廣泛的形式來(lái)說(shuō)，本發(fā)明因而涉及恢復(fù)或增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞的活性，從而幫助M蛋白誘導(dǎo)的對(duì)A群鏈球菌的免疫。

本發(fā)明的一個(gè)方面提供在哺乳動(dòng)物中引發(fā)對(duì)A群鏈球菌細(xì)菌的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括向哺乳動(dòng)物施用M蛋白的片段、其變體或衍生物；以及促進(jìn)恢復(fù)或增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞活性的物質(zhì)；從而在哺乳動(dòng)物中引發(fā)對(duì)A群鏈球菌細(xì)菌的免疫應(yīng)答的步驟。

本發(fā)明的另一方面提供使哺乳動(dòng)物對(duì)A群鏈球菌細(xì)菌免疫的方法，所述方法包括向哺乳動(dòng)物施用M蛋白，其片段、變體或衍生物；以及促進(jìn)恢復(fù)或增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞活性的物質(zhì)，從而使哺乳動(dòng)物對(duì)A群鏈球菌細(xì)菌免疫的步驟。

而本發(fā)明的另一方面提供治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的A群鏈球菌細(xì)菌感染的方法，所述方法包括向哺乳動(dòng)物施用M蛋白的片段，其變體或衍生物，或者它們的抗體或抗體片段；以及促進(jìn)恢復(fù)或增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞活性的物質(zhì)；從而治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中的A群鏈球菌細(xì)菌感染的步驟。

本發(fā)明的又一方面提供適合于向哺乳動(dòng)物施用的組合物，所述組合物包含：M蛋白的片段、其變體或衍生物，或者它們的抗體或抗體片段；以及促進(jìn)恢復(fù)或增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞活性的物質(zhì)。

本發(fā)明的相關(guān)方面提供編碼M蛋白的片段、其變體或衍生物以及促進(jìn)恢復(fù)或增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞活性的物質(zhì)的一種或多種分離的核酸的施用，或者包含所述一種或多種分離的核酸的組合物的施用。

在具體實(shí)施方案中，M蛋白的片段是M蛋白的保守區(qū)域或者包含M蛋白的保守區(qū)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述片段是包含p145肽的免疫原性片段，或者包含于p145肽內(nèi)的免疫原性片段。在具體實(shí)施方案中，免疫原性片段在J8肽或其變體內(nèi)，或者包含J8肽或其變體。在某些實(shí)施方案中，所述變體包含選自以下的氨基酸序列或者其片段或變體，基本上由選自以下的氨基酸序列或者其片段或變體組成，由選自以下的氨基酸序列或者其片段或變體組成：SREAKKQSREAKKQVEKALKQVEKALC(SEQ ID NO:59)；SREAKKQSREAKKQVEKALKQSREAKC(SEQ ID NO:60)；SREAKKQVEKALKQSREAKKQVEKALC(SEQ ID NO:61)；以及SREAKKQVEKALDASREAKKQVEKALC(SEQ ID NO:62)。

在一個(gè)寬泛的實(shí)施方案中，促進(jìn)恢復(fù)或增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞活性的物質(zhì)是通常直接或間接地抑制或阻抑嗜中性粒細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞活性的蛋白或其片段。適當(dāng)?shù)?，所述蛋白或其片段的施用引發(fā)對(duì)所述蛋白和/或?qū)群鏈球菌的免疫應(yīng)答。

在另一寬泛的實(shí)施方案中，促進(jìn)恢復(fù)或增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞活性的物質(zhì)是與通常直接或間接地抑制或阻抑嗜中性粒細(xì)胞或嗜中性粒細(xì)胞活性的蛋白或其片段結(jié)合的抗體或抗體片段。

在具體實(shí)施方案中，所述蛋白是SpyCEP或其片段。

在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述片段包含氨基酸序列NSDNIKENQFEDFDEDWENF(SEQ ID NO:18)。

本發(fā)明的另一其它方面提供分離的肽，其包含選自以下的氨基酸序列或者其片段或變體，基本上由選自以下的氨基酸序列或者其片段或變體組成，由選自以下的氨基酸序列或者其片段或變體組成：NSDNIKENQFEDFDEDWENF(SEQ ID NO:18)；SREAKKQSREAKKQVEKALKQVEKALC(SEQ ID NO:59)；SREAKKQSREAKKQVEKALKQSREAKC(SEQ ID NO:60)；SREAKKQVEKALKQSREAKKQVEKALC(SEQ ID NO:61)；以及SREAKKQVEKALDASREAKKQVEKALC(SEQ ID NO:62)。

相關(guān)方面提供編碼上述方面的分離的肽的分離的核酸，包含所述分離的核酸的遺傳構(gòu)建體和/或包含所述遺傳構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。

又一相關(guān)方面提供抗體或抗體片段，其與上述方面的分離的肽結(jié)合，或者由上述方面的分離的肽誘發(fā)。

本發(fā)明的又一方面提供包含前面方面的分離的肽、分離的核酸、遺傳構(gòu)建體、宿主細(xì)胞和/或抗體或抗體片段的組合物。

本文使用的不定冠詞‘一個(gè)/一種(a)’和‘一個(gè)/一種(an)’在此用來(lái)指或者涵蓋單數(shù)或復(fù)數(shù)的元素或特征，并且不應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為意指或限定“一個(gè)/一種(one)”或“單個(gè)/單種(single)”元素或特征。

除非上下文另有要求，術(shù)語(yǔ)“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”或者類(lèi)似的術(shù)語(yǔ)旨在意指非排他性的包含，以使元素或特征的所述列表不僅僅包括那些規(guī)定或列出的元素，而且可以包括未列出或規(guī)定的其它元素或特征。

在氨基酸序列的背景中，通過(guò)“基本上由…組成”，意指所敘述的氨基酸序列以及位于N-端或C-端的另外一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)氨基酸。

附圖簡(jiǎn)述

圖1：J8-DT/Alum疫苗接種的保護(hù)功效。

圖2：J8-DT介導(dǎo)的免疫中的嗜中性粒細(xì)胞。E：表皮；D：真皮；SC：皮下層(sub-cut layer)

圖3：嗜中性粒細(xì)胞的耗竭和J8-DT疫苗接種的功效。

圖4：CovR/S突變體GAS的M1T1分離物中升高的基因表達(dá)的概覽。

圖5：J8-DT保護(hù)免受5448AP的功效。

圖6：不同GAS菌株對(duì)IL-8的降解。

圖7：不同GAS菌株對(duì)MIP-2的降解。

圖8：不同GAS菌株對(duì)KC的降解。

圖9：不同GAS分離物對(duì)趨化因子的趨化能力的影響。

圖10：通過(guò)用J8-DT-rSpyCEP/Alum進(jìn)行免疫，保護(hù)免受GAS5448AP菌株。

圖11：如通過(guò)抗原特異性IgG的產(chǎn)生所測(cè)量的J8-DT-SpyCEP的免疫原性。

圖12：rSpyCEP抗血清對(duì)SpyCEP的IL-8降解活性的抑制。

圖13：橫跨SpyCEP的殘基35-587的重疊的20聚體肽(10個(gè)氨基酸重疊)(降序排列的SEQ ID NO:1-55)的表位作圖。加粗的肽是通過(guò)表位作圖選擇的肽。

圖14：抗重組SpyCEP的抗血清與各肽表位的反應(yīng)性。使用肽陣列進(jìn)行SpyCEP的B-細(xì)胞表位作圖(553個(gè)氨基酸)。用rSpyCEP抗血清探測(cè)如圖13中所示的有10個(gè)氨基酸重疊的20聚體肽。

圖15：與抗重組SpyCEP的抗血清顯示強(qiáng)反應(yīng)性的六(6)個(gè)表位的鑒定。S1＝SEQ ID NO:15；S2＝SEQ ID NO:18；S3＝SEQ ID NO:19；S4＝SEQ ID NO:24；S5＝SEQ ID NO:30；以及S6＝SEQ ID NO:54。

圖16：免疫原性以及SpyCEP表位的抗血清對(duì)親本肽的識(shí)別。

圖17：SpyCEP表位的抗血清對(duì)IL-8降解的抑制。

圖18：針對(duì)自體肽的鼠α-p145-DT和α-J8-DT的滴度以及交叉識(shí)別ELISA。

圖19：針對(duì)自體肽的鼠α-J8i變體-DT的滴度。

圖20：交叉識(shí)別ELISA。

圖21：recSpyCEP中的免疫優(yōu)勢(shì)表位的鑒定。為了鑒定recSpyCEP中的免疫優(yōu)勢(shì)表位，進(jìn)行肽抑制ELISA。在第0天，第21天和第28天，用SpyCEP表位-DT綴合物或SpyCEP對(duì)BALB/c小鼠(4-6周)組進(jìn)行皮下免疫。最后刺激之后一周，經(jīng)下頜出血使小鼠流血，并且收集抗血清。將表位抗血清與5μg/ml或0.5μg/ml濃度的自體肽孵育，并評(píng)估自體肽識(shí)別的抑制(A)。還將肽抗血清與5μg/ml或0.5μg/ml濃度的SpyCEP孵育。然后將血清用于針對(duì)固定化肽的ELISA(B)。最后，將SpyCEP抗血清與5μg/ml或0.5μg/ml濃度的各肽(S1-S6)或者與recSpyCEP孵育，并且評(píng)估其與各對(duì)應(yīng)的肽或SpyCEP的結(jié)合(C)。各柱的數(shù)據(jù)是平均值±SEM。使用雙因素方差分析，用Bonferroni的多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以確定組間的顯著性。*p<0.05和**p<0.01，***p<0.001。ns是p<0.05。

圖22：SpyCEP和SpyCEP表位的抗血清與不同GAS菌株的結(jié)合功效。為了測(cè)定recSpyCEP或SpyCEP表位抗血清對(duì)不同GAS菌株的特異性，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。分析通過(guò)FITC綴合的IgG測(cè)量了與SpyCEP抗血清相比表位抗血清(S1-S6)的結(jié)合。顯示了5448和其動(dòng)物傳代的衍生物(A)，BSA10和其動(dòng)物傳代的衍生物(B)以及咽喉分離物(pM1)和皮膚分離物(88/30)的結(jié)合(C)。各柱的數(shù)據(jù)是平均值±SEM。使用雙尾t-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析以確定與PBS對(duì)照相比的顯著性。*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。

圖23：J8-DT+S2-DT保護(hù)免受GAS的保護(hù)功效。在第0天、第21天和第28天，用J8-DT、J8-DT+SpyCEP、J8-DT+S2-DT、SpyCEP或PBS制劑對(duì)BALB/c小鼠(4-6周)組進(jìn)行皮下免疫。在最后的刺激之后兩周，用GAS 5448AP經(jīng)皮膚感染途徑感染小鼠(A和B)。在感染后第6天，處死5只小鼠/組，并且收集樣本以測(cè)定皮膚(A)和血液(B)中的GAS生物負(fù)載。數(shù)據(jù)代表兩次或更多次的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，并且結(jié)果顯示為各組中4-5只小鼠的平均值±SD。使用雙因素方差分析來(lái)確定疫苗接種組和對(duì)照組之間的顯著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。ns是p<0.05。

圖24：J8-DT+S2-DT保護(hù)免受GAS的保護(hù)功效。在第0天、第21天和第28天，用J8-DT、J8-DT+SpyCEP、J8-DT+S2-DT、SpyCEP或PBS制劑對(duì)BALB/c小鼠(4-6周)組進(jìn)行皮下免疫。在最后的刺激之后兩周，用GAS NS22.8經(jīng)皮膚感染途徑感染小鼠(A、B和C)。在感染后第3天和第6天，處死5只小鼠/組，并且收集樣本以測(cè)定皮膚(A)、血液(B)和脾臟(C)中的GAS生物負(fù)載。結(jié)果顯示為各組中4-5只小鼠的平均值±SD。使用雙因素方差分析來(lái)確定免疫接種組和對(duì)照組之間的顯著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。ns是p<0.05。

發(fā)明詳述

本發(fā)明至少部分基于這樣的發(fā)現(xiàn)：嗜中性粒細(xì)胞的活性對(duì)于用J8肽進(jìn)行針對(duì)A群鏈球菌的成功免疫是重要的。更具體而言，已經(jīng)意識(shí)到，A群鏈球菌的某些蛋白酶(如SpyCEP)通過(guò)使嗜中性粒細(xì)胞趨化性物質(zhì)白介素8蛋白水解失活來(lái)發(fā)揮對(duì)嗜中性粒細(xì)胞的有害或抑制作用。因此提出，通過(guò)用J8肽或其它M蛋白的片段，以及SpyCEP進(jìn)行免疫，將引起對(duì)SpyCEP的免疫應(yīng)答，其至少部分減弱SpyCEP使白介素8失活從而抑制嗜中性粒細(xì)胞的應(yīng)答的能力。因此，這將協(xié)同地增強(qiáng)J8免疫的免疫效果。在相關(guān)實(shí)施方案中，可以治療性地施用抗SpyCEP抗體，從而引發(fā)對(duì)J8肽的增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。而且，已鑒定出SpyCEP的免疫優(yōu)勢(shì)表位。在具體的形式中，本發(fā)明可以適合于治療或預(yù)防由A群鏈球菌的特別毒的菌株或分離物導(dǎo)致的感染，所述A群鏈球菌的特別毒的菌株或分離物對(duì)用于A群鏈球菌感染的典型的抗生素治療具有抗性。這些菌株或分離物通常引起皮膚的嚴(yán)重感染(例如壞死性筋膜炎)，并且在某些情況下可能含有CovR/SCovR/S突變。

因此，本發(fā)明的某些方面涉及向哺乳動(dòng)物施用M蛋白的片段、其變體或衍生物以及促進(jìn)恢復(fù)或增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞活性的物質(zhì)，從而在哺乳動(dòng)物中引發(fā)免疫應(yīng)答。

出于本發(fā)明的目的，“分離的”意指已從其天然狀態(tài)移出或以其它方式進(jìn)行人工操作的材料。分離的材料可以大體上或基本上不含其天然狀態(tài)中通常伴有的組分，或者可以進(jìn)行操作以使其與其天然狀態(tài)中通常伴有的組分一同處于人工狀態(tài)下。分離的材料可以是天然的、化學(xué)合成的或重組的形式。

如在本領(lǐng)域眾所周知的，“蛋白”意指氨基酸聚合物。氨基酸可以是天然或非天然的氨基酸、D-氨基酸或L-氨基酸。

術(shù)語(yǔ)“蛋白”包括且涵蓋“肽”和“多肽”，所述“肽”通常用于描述具有不超過(guò)五十(50)個(gè)氨基酸的蛋白，所述“多肽”通常用于描述具有超過(guò)五十(50)個(gè)氨基酸的蛋白。

“片段”是蛋白(如M蛋白、p145、J14或J8或SpyCEP或者SpyCEP的肽或表位)的區(qū)段、結(jié)構(gòu)域、部分或區(qū)域，其由少于所述蛋白的100％的氨基酸序列組成。將理解，所述片段可以是單個(gè)片段或者可以單獨(dú)重復(fù)或與其它片段一起重復(fù)。

通常，片段可以包含全長(zhǎng)蛋白的多至5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、100、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550或1600個(gè)氨基酸，基本上由全長(zhǎng)蛋白的多至5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、100、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550或1600個(gè)氨基酸組成或者由全長(zhǎng)蛋白的多至5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、100、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550或1600個(gè)氨基酸組成。

適當(dāng)?shù)?，所述片段是免疫原性片段。在本發(fā)明的背景中，當(dāng)向哺乳動(dòng)物施用免疫原性片段時(shí)，本文使用的術(shù)語(yǔ)“免疫原性”表示產(chǎn)生或引發(fā)如對(duì)A群鏈球菌或其分子組分(如M蛋白)的免疫應(yīng)答的能力或潛能。優(yōu)選地，由免疫原性片段引發(fā)的免疫應(yīng)答是保護(hù)性的。

“引發(fā)免疫應(yīng)答”意指導(dǎo)致或刺激免疫系統(tǒng)(包括細(xì)胞免疫系統(tǒng)、抗體和/或天然免疫系統(tǒng))的一個(gè)或多個(gè)元件的產(chǎn)生或活性。適當(dāng)?shù)?，免疫系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)元件包括B淋巴細(xì)胞、抗體和嗜中性粒細(xì)胞。

本文通常使用的術(shù)語(yǔ)“使…免疫”、“接種疫苗”和“疫苗”指引發(fā)針對(duì)A群鏈球菌的保護(hù)性免疫應(yīng)答，由此至少部分預(yù)防A群鏈球菌的后續(xù)感染或使之最小化的方法和/或組合物。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“A群鏈球菌(group A streptococcus)”、“A群鏈球菌(Group A Streptococci)”、“A群鏈球菌(Group A Streptococcal)”、“A群鏈球菌(Group A Strep)”以及縮寫(xiě)“GAS”指蘭斯菲爾德血清型A的鏈球菌細(xì)菌，其為物種釀膿鏈球菌的革蘭氏陽(yáng)性β溶血細(xì)菌。GAS的重要毒力因子是M蛋白，其強(qiáng)烈地抗吞噬并與血清因子H結(jié)合，破壞C3-轉(zhuǎn)化酶并阻止C3b的調(diào)理作用。這些還包含有毒的“突變體”，例如Graham等人，2002,PNAS USA 99 13855中所描述的，如CovR/S或CovRS突變體，盡管不限于這些。

由A群鏈球菌引起的疾病和病況包括蜂窩組織炎、丹毒、膿皰病、猩紅熱、咽喉感染如急性咽炎(“鏈球菌性喉炎”)、菌血癥、中毒性休克綜合征、壞死性筋膜炎、急性風(fēng)濕熱和急性腎小球腎炎，盡管不限于這些。

本文使用的“嗜中性粒細(xì)胞(neutrophil)”或嗜中性粒細(xì)胞(Neutrophil granulocyte)是與嗜堿性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞一起形成多形核細(xì)胞家族(PMN)的一部分的細(xì)胞。嗜中性粒細(xì)胞是由骨髓干細(xì)胞形成的相對(duì)短壽的吞噬細(xì)胞，并且通常構(gòu)成哺乳動(dòng)物中40％至75％的白細(xì)胞。以及作為吞噬細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞釋放可溶的抗微生物劑(例如顆粒蛋白)并產(chǎn)生嗜中性粒細(xì)胞胞外殺菌網(wǎng)絡(luò)(neutrophil extracellular trap)。嗜中性粒細(xì)胞響應(yīng)諸如白介素-8(IL-8)、C5a、fMLP和白三烯B4的分子，所述分子促進(jìn)損傷部位和/或急性炎癥部位的嗜中性粒細(xì)胞的趨化性。

本文使用的“促進(jìn)恢復(fù)或增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞活性的物質(zhì)”是直接或間接至少部分增加、增強(qiáng)或恢復(fù)嗜中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生、遷移和/或趨化性和/或嗜中性粒細(xì)胞的一種或多種免疫性活性的分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述物質(zhì)引發(fā)對(duì)嗜中性粒細(xì)胞抑制劑的免疫應(yīng)答。在另一實(shí)施方案中，所述物質(zhì)結(jié)合嗜中性粒細(xì)胞抑制劑并使之至少部分失活。嗜中性粒細(xì)胞抑制劑可以是源自或源于A群鏈球菌細(xì)菌的分子。在一種具體形式中，嗜中性粒細(xì)胞抑制劑是蛋白水解性地切割白介素8的絲氨酸蛋白酶或其片段。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，嗜中性粒細(xì)胞抑制劑是SpyCEP或其片段。SpyCEP是在人類(lèi)病原體釀膿鏈球菌表面表達(dá)的170-kDa的多結(jié)構(gòu)域絲氨酸蛋白酶，其通過(guò)催化嗜中性粒細(xì)胞趨化物白介素-8的切割和失活而在感染中發(fā)揮重要作用。SpyCEP氨基酸序列的非限制性實(shí)例可以在登錄號(hào)YP597949.1(釀膿鏈球菌MGAS10270)和YP596076.1(釀膿鏈球菌MGAS9429)下找到。因此，在一個(gè)具體實(shí)施方案中，促進(jìn)恢復(fù)或增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞活性的物質(zhì)是SpyCEP或其免疫原性片段。在另一實(shí)施方案中，促進(jìn)恢復(fù)或增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞活性的物質(zhì)是與SpyCEP結(jié)合的抗體或抗體片段。SpyCEP片段的具體實(shí)施方案在圖13中示出(SEQ ID NO:1-55)。優(yōu)選的SpyCEP片段是SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列(NSDNIKENQFEDFDEDWENF)，或者包含SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列(NSDNIKENQFEDFDEDWENF)。如將在以下更詳細(xì)描述的，抗SEQ ID NO:18肽的抗血清可以和抗rSpyCEP抗體同樣有效地阻斷IL8的降解。因此，提出，SEQ ID NO:18是可以誘導(dǎo)功能性抗體的SpyCEP上的優(yōu)勢(shì)表位，或者包含可以誘導(dǎo)功能性抗體的SpyCEP上的優(yōu)勢(shì)表位。

本文使用的“M蛋白的片段”是GAS M蛋白的任意片段，其是免疫原性的和/或能夠與抗體或抗體片段結(jié)合。通常，所述片段是GAS M蛋白的C-重復(fù)區(qū)域或其片段的氨基酸序列，包含GAS M蛋白的C-重復(fù)區(qū)或其片段的氨基酸序列，或者包含于GAS M蛋白的C-重復(fù)區(qū)或其片段的氨基酸序列內(nèi)。非限制性實(shí)例包括p145，其是具有氨基酸序列LRRDLDASREAKKQVEKALE(SEQ ID NO:56)的20聚體。就這點(diǎn)而言，p145氨基酸序列的片段可以存在于J14或J8肽中。

本文使用的“J14肽”可以包含氨基酸序列KQAEDKVKASREAKKQVEKALEQLEDRVK(SEQ ID NO:57)或其片段或變體，一種具有p145內(nèi)的最小B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位的肽，其被鑒定為GAS M蛋白C-區(qū)域的肽，其不含可能有害的T細(xì)胞自身表位，但是含有調(diào)理性的B細(xì)胞表位。J14是嵌合肽，其含有來(lái)自M蛋白C-區(qū)域的14個(gè)氨基酸(加粗顯示)且側(cè)面是酵母來(lái)源的GCN4序列，所述酵母來(lái)源的GCN4序列是維持所述肽的正確螺旋折疊和構(gòu)象結(jié)構(gòu)所必需的。

本文使用的“J8肽”是包含至少部分源自或者對(duì)應(yīng)于GAS M蛋白C-區(qū)域肽的氨基酸序列的肽。J8肽適當(dāng)?shù)匕珺-細(xì)胞構(gòu)象表位且缺少可能有害的T-細(xì)胞自身表位。優(yōu)選的J8肽氨基酸序列是QAEDKVKQKQLEDKVQ(SEQ ID NO:58)或其片段或變體，其中加粗的殘基對(duì)應(yīng)于GAS M蛋白的殘基344至355。在該實(shí)施方案中，J8是還包含側(cè)面的GCN4DNA-結(jié)合蛋白序列的嵌合肽，所述序列協(xié)助維持J8肽的正確螺旋折疊和構(gòu)象結(jié)構(gòu)。

本文使用的蛋白“變體”與參照氨基酸序列共有可確定的核苷酸或氨基酸序列關(guān)系。參照氨基酸序列可以是如以上所描述的M蛋白、SpyCEP或它們的片段的氨基酸序列?！白凅w”蛋白可以是參照氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失或被不同的氨基酸置換。本領(lǐng)域眾所周知的是，一些氨基酸可以被置換或缺失，而不改變免疫原性片段和/或蛋白的活性(保守置換)。優(yōu)選地，蛋白變體與參照氨基酸序列共有至少70％或75％，優(yōu)選地至少80％或85％，或者更優(yōu)選地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。

在一個(gè)具體實(shí)施方案中，變體蛋白或肽在其N(xiāo)端和/或C端可以包含一個(gè)或多個(gè)賴氨酸殘基。所述多個(gè)賴氨酸殘基(例如聚賴氨酸)可以是賴氨酸殘基的直鏈序列，或者可以是賴氨酸殘基的支鏈序列。這些另外的賴氨酸殘基可以促進(jìn)增加的肽的溶解度。

J8肽變體的非限制性實(shí)例包括：

S R E A K K Q S R E A K K Q V E K A L K Q V E K A L C(SEQ ID NO：59)

S R E A K K Q S R E A K K Q V E K A L K Q S R E A K C(SEQ ID NO：60)

S R E A K K Q V E K A L K Q S R E A K K Q V E K A L C(SEQ ID NO：61)

S R E A K K Q V E K A L D A S R E A K K Q V E K A L C(SEQ ID NO：62)

其它變體可以基于如Cooper等，1997所描述的七殘基(heptads)。

舉例來(lái)說(shuō)，如果已知表位位于a-螺旋蛋白的結(jié)構(gòu)構(gòu)象內(nèi)，則可以合成模型肽以折疊成該構(gòu)象。基于GCN4亮氨酸拉鏈的結(jié)構(gòu)(O’Shea等，1991)，我們?cè)O(shè)計(jì)了模型的α-螺旋卷曲的卷曲肽。第一七殘基含有序列MKQLEDK(SEQ ID NO:63)，其包含見(jiàn)于穩(wěn)定卷曲的卷曲七殘基重復(fù)基元(a-b-c-d-e-f-g)n中的數(shù)種特征(Cohen&Parry，1990)。這些特征包括位于a位和d位的大的非極性殘基，位于e位和g位的酸/堿對(duì)(Glu/Lys)(通常有利于鏈間的離子相互作用)，以及位于b、c、f位的極性基團(tuán)(與Lupas等(1991)的預(yù)測(cè)一致)。GCN4肽在a位還含有共有的纈氨酸。還注意到，當(dāng)a位和d位被V和L占據(jù)時(shí)，有助于卷曲的卷曲二聚體(Harbury等，1994)。模型七殘基重復(fù)來(lái)源于具有形成α-螺旋卷曲的卷曲的潛能的GCN4亮氨酸拉鏈肽(VKQLEDK；SEQ ID NO:64)的這些共有特征。該肽成為框架肽。將在研究中的構(gòu)象表位的重疊片段嵌入模型的卷曲的卷曲肽內(nèi)，以產(chǎn)生嵌合肽。每當(dāng)在螺旋模型肽和表位序列二者中發(fā)現(xiàn)相同的殘基時(shí)，就將設(shè)計(jì)以確保正確螺旋卷曲的卷曲構(gòu)象的氨基酸置換(Cohen&Parry,1990)并入嵌合肽中。通常使用下述置換：a位，V置換為I；b位，K置換為R；c位，Q置換為N；d位，L置換為A；e位，E置換為Q；f位：D置換為E；g位，K置換為R。在卷曲的卷曲蛋白中，所有這些替換的殘基均常見(jiàn)于其各自位點(diǎn)上(Lupas等，1991)。

本文通常用于描述各蛋白和核酸之間的序列關(guān)系的術(shù)語(yǔ)包括“比較窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”以及“基本相同(substantial identity)”。由于各核酸/蛋白可以各自(1)僅包含所述核酸/蛋白共有的完整的核酸/蛋白序列的一個(gè)部分或多個(gè)部分，以及(2)包含核酸/蛋白之間不同的一個(gè)或多個(gè)部分，因此通常通過(guò)在“比較窗口”比較序列來(lái)進(jìn)行序列比較，以鑒定和比較局部區(qū)域的序列相似性?！氨容^窗口”指與參照序列進(jìn)行比較的通常為6、9或12個(gè)連續(xù)殘基的概念上的區(qū)段。為了各序列的最佳比對(duì)，比較窗口可以包含相比于參照序列約20％或更少的添加或缺失(即，空位)?？梢酝ㄟ^(guò)算法(Intelligenetics的Geneworks程序；威斯康星遺傳學(xué)軟件包7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Drive Madison,WI,USA，通過(guò)引用并入本文)的計(jì)算機(jī)化實(shí)施或者通過(guò)檢驗(yàn)以及由選擇的各種方法中任一種所產(chǎn)生的最佳比對(duì)(即，在比較窗口上產(chǎn)生最高的同源性百分比)進(jìn)行用于對(duì)齊比較窗口的最佳序列比對(duì)。還可以參考如例如Altschul等，1997,Nucl.Acids Res.25 3389所公開(kāi)的BLAST程序家族，將其通過(guò)引用并入本文。序列分析的詳細(xì)討論可見(jiàn)于Ausubel等人編著的《最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法匯編》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(John Wiley&Sons Inc NY,1995-1999)的第19.3單元。

術(shù)語(yǔ)“序列同一性”在本文以其最廣泛的含義使用，以包括精確的核苷酸或氨基酸匹配數(shù)，其涉及使用標(biāo)準(zhǔn)算法的適當(dāng)對(duì)齊、涉及比較窗口中序列的同一性程度。因此，通過(guò)以下計(jì)算“序列同一性百分比”：在比較窗口比較兩條最佳對(duì)齊的序列，確定兩條序列上均存在的相同的核酸堿基(如，A、T、C、G、I)的位置數(shù)目以得到匹配的位置數(shù)，將匹配的位置數(shù)除以比較窗口中的總位置數(shù)(即，窗口大小)，以及將結(jié)果乘以100以得到序列同一性百分比。例如，“序列同一性”可以理解為意指通過(guò)DNASIS計(jì)算機(jī)程序(對(duì)于windows，版本2.5；可獲自Hitachi Software engineering Co.,Ltd.,South San Francisco,California,USA)計(jì)算的“匹配百分比”。

如本領(lǐng)域所理解的，本文使用的“衍生物”是諸如例如通過(guò)以下而被改變的蛋白、其片段或變體的分子：與其它化學(xué)部分結(jié)合或絡(luò)合，翻譯后修飾(例如磷酸化、乙?；?，糖基化修飾(例如添加、移除或改變糖基化)和脂化修飾和/或包含另外的氨基酸序列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，另外的氨基酸序列在其N(xiāo)端和/或C端可以包含一個(gè)或多個(gè)賴氨酸殘基。所述多個(gè)賴氨酸殘基(例如聚賴氨酸)可以是賴氨酸殘基的直鏈序列，或者可以是賴氨酸殘基的支鏈序列。這些另外的賴氨酸殘基可以促進(jìn)增加的肽的溶解度。

Olive等，2002，Infect&Immun.70 2734中所描述的一種具體的J8肽衍生物是“脂質(zhì)核心肽”。在一個(gè)實(shí)施方案中，脂質(zhì)核心肽可以包含多個(gè)J8肽(例如四個(gè)J8肽)，所述J8肽被直接地合成在與親脂性錨耦合的支鏈聚賴氨酸核心的各賴氨酸的兩個(gè)氨基上。

另外的氨基酸序列可以包含融合伴侶(fusion partner)的氨基酸序列，其生成融合蛋白。舉例來(lái)說(shuō)，融合伴侶的氨基酸序列可以幫助檢測(cè)和/或純化分離的融合蛋白。非限制性實(shí)例包括金屬結(jié)合融合伴侶(例如聚組氨酸)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、蛋白A、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、熒光蛋白序列(例如GFP)、表位標(biāo)簽(如myc、FLAG和血凝素標(biāo)簽)。

本發(fā)明考慮的其它衍生物包括但不限于：對(duì)側(cè)鏈的修飾，在肽或蛋白合成期間并入非天然氨基酸和/或它們的衍生物，以及使用交聯(lián)劑和對(duì)本發(fā)明的免疫原性蛋白、片段和變體強(qiáng)加構(gòu)象限制的其它方法。

就這點(diǎn)而言，對(duì)于涉及蛋白質(zhì)化學(xué)修飾的更廣泛方法學(xué)，技術(shù)人員參考Coligan等人編著的《最新蛋白質(zhì)科學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE)(John Wiley&Sons NY1995-2008)的第15章。

可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法產(chǎn)生本發(fā)明的分離的免疫原性蛋白、片段和/或衍生物，所述方法包括但不限于：化學(xué)合成、重組DNA技術(shù)以及蛋白水解切割以產(chǎn)生肽片段。

化學(xué)合成包括固相合成和液相合成。此類(lèi)方法在本領(lǐng)域眾所周知，盡管參考如Nicholson編著的《合成疫苗》(SYNTHETIC VACCINES)(Blackwell Scientific Publications)的第9章和Coligan等人編著的《最新蛋白質(zhì)科學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE)(John Wiley&Sons,Inc.NY USA 1995-2008)的第15章中提供的化學(xué)合成技術(shù)的實(shí)例。就這點(diǎn)而言，還參考國(guó)際公開(kāi)WO 99/02550和國(guó)際公開(kāi)WO 97/45444。

利用如例如下述中所述的標(biāo)準(zhǔn)方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地制備重組蛋白：Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(Cold Spring Harbor Press，1989)，特別是第16部分和第17部分；Ausubel等人編著的《最新分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法匯編》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(John Wiley&Sons,Inc.NY USA1995-2008)，特別是第10章和第16章；以及Coligan等人編著的《最新蛋白質(zhì)科學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE)(John Wiley&Sons,Inc.NY USA 1995-2008)，特別是第1章、第5章和第6章。通常，重組蛋白的制備包括編碼所述蛋白的核酸在合適的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。

某些方面和實(shí)施方案涉及施用編碼M蛋白的片段、其變體或衍生物以及促進(jìn)恢復(fù)或增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞活性的物質(zhì)的一種或多種核酸，或者包含所述一種或多種核酸的組合物，從而引發(fā)對(duì)GAS的免疫應(yīng)答和/或針對(duì)GAS感染產(chǎn)生免疫。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“核酸”指單鏈或雙鏈DNA和RNA。DNA包括基因組DNA以及cDNA。RNA包括mRNA、RNA、RNAi、siRNA、cRNA和自催化的RNA。核酸還可以是DNA-RNA雜交體。核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列通常包含包括A、G、C、T或U堿基的核苷酸。然而，核苷酸序列可以包含其它堿基，如修飾的嘌呤(例如肌苷、甲肌苷和甲基腺苷)和修飾的嘧啶(例如硫代尿苷和甲基胞嘧啶)。

在優(yōu)選形式中，編碼M蛋白的片段、其變體或衍生物以及促進(jìn)恢復(fù)或增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞活性的物質(zhì)的一種或多種分離的核酸為適于向哺乳動(dòng)物(如人)施用的遺傳構(gòu)建體的形式。在優(yōu)選形式中，遺傳構(gòu)建體適合于哺乳動(dòng)物(如人)的DNA疫苗接種。

適當(dāng)?shù)兀绫绢I(lǐng)域眾所周知的，遺傳構(gòu)建體為質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、酵母或細(xì)菌人工染色體的形式，或者包含質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、酵母或細(xì)菌人工染色體的遺傳組件。遺傳構(gòu)建體還可適合于在細(xì)菌或其它宿主細(xì)胞中維持和增殖分離的核酸，適合于通過(guò)重組DNA技術(shù)進(jìn)行操作。

出于蛋白表達(dá)的目的，遺傳構(gòu)建體是表達(dá)構(gòu)建體。適當(dāng)?shù)?，表達(dá)構(gòu)建體包含與表達(dá)載體中的一種或多種另外的序列可操作地連接的一種或多種核酸?！氨磉_(dá)載體”可以是自我復(fù)制的染色體外載體(如質(zhì)粒)，或者是整合進(jìn)宿主基因組的載體。

“可操作地連接”意指所述另外的核苷酸序列的定位相對(duì)于本發(fā)明的核酸，以優(yōu)選地起始、調(diào)控或以其它方式控制轉(zhuǎn)錄。

調(diào)控性核苷酸序列通常適用于需要表達(dá)的宿主細(xì)胞或組織。對(duì)于各種宿主細(xì)胞而言，眾多類(lèi)型的適合的表達(dá)載體以及合適的調(diào)控序列在本領(lǐng)域是已知的。

通常，所述一種或多種調(diào)控性核苷酸序列可以包括但不限于：?jiǎn)?dòng)子序列、前導(dǎo)序列或信號(hào)序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列以及增強(qiáng)子或激活子序列。本發(fā)明考慮本領(lǐng)域已知的組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。如以上所描述的，表達(dá)構(gòu)建體還可以包含編碼融合伴侶的另外的核苷酸序列(通常由表達(dá)載體提供)，以使本發(fā)明的重組蛋白表達(dá)為融合蛋白。

將理解，編碼M蛋白，其片段、變體或衍生物以及促進(jìn)恢復(fù)或增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞活性的物質(zhì)(例如SpyCEP或其免疫原性片段)的分離的核酸可以以單獨(dú)的表達(dá)構(gòu)建體的方式施用或者可以存在于同一表達(dá)構(gòu)建體中(例如多順?lè)醋颖磉_(dá)構(gòu)建體)。

適當(dāng)?shù)?，DNA疫苗接種是以一種或多種質(zhì)粒DNA表達(dá)構(gòu)建體的方式。質(zhì)粒通常包含病毒啟動(dòng)子(如SV40、RSV或CMV啟動(dòng)子)?？梢园瑑?nèi)含子A以提高mRNA的穩(wěn)定性，從而增加蛋白的表達(dá)。質(zhì)粒還可以包含多克隆位點(diǎn)、強(qiáng)的聚腺苷酸化信號(hào)/轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)(如牛生長(zhǎng)激素或兔β-球蛋白聚腺苷酸化序列)。質(zhì)粒還可以包含梅森-菲舍猴病毒順式作用轉(zhuǎn)錄元件(MPV-CTE)，其具有或不具有HIV rev增加的包膜表達(dá)。可以增強(qiáng)表達(dá)的另外修飾包括增強(qiáng)子序列、合成的內(nèi)含子序列、腺病毒三聯(lián)前導(dǎo)(TPL)序列的插入和/或?qū)巯佘账峄?或轉(zhuǎn)錄終止序列的修飾。DNA疫苗質(zhì)粒的非限制性實(shí)例是pVAC，其可商購(gòu)自Invivogen。

描述DNA疫苗學(xué)的有用參考是《DNA疫苗：方法和實(shí)驗(yàn)指南》，第二版(DNA Vaccines,Methods and Protocols,Second Edition)(《分子藥學(xué)方法系列》第127卷(Volume 127of Methods in Molecular Medicine series)，Humana Press,2006)。

如以上所述，本發(fā)明提供預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物中的A群鏈球菌相關(guān)的疾病、病癥或病況的組合物和/或方法。

本文使用的“治療(treating)”、“治療(treat)”或“治療(treatment)”指在A群鏈球菌相關(guān)的疾病、病癥或病況已開(kāi)始發(fā)展之后，至少部分改善、消除或減輕其癥狀或病理學(xué)征象的治療性干預(yù)。治療不需要對(duì)對(duì)象絕對(duì)有益?？梢岳帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何方法或標(biāo)準(zhǔn)確定有益效果。

本文使用的“預(yù)防(preventing)”、“預(yù)防(prevent)”或“預(yù)防(prevention)”指在感染或暴露于A群鏈球菌之前和/或在A群鏈球菌相關(guān)的疾病、病癥或病況的癥狀或病理學(xué)征象發(fā)作之前起始的作用過(guò)程，以預(yù)防感染和/或減輕癥狀或病理學(xué)征象。應(yīng)當(dāng)理解，此類(lèi)預(yù)防不需要對(duì)對(duì)象絕對(duì)有益?！邦A(yù)防性(prophylactic)”治療指出于降低發(fā)展A群鏈球菌相關(guān)的疾病、病癥或病況的癥狀或病理學(xué)征象的風(fēng)險(xiǎn)的目的，向未顯現(xiàn)A群鏈球菌相關(guān)的疾病、病癥或病況的征象的對(duì)象，或僅顯現(xiàn)早期征象的對(duì)象施用的治療。

在本發(fā)明的背景中，“A群鏈球菌相關(guān)的疾病、病癥或病況”意指由A群鏈球菌的感染導(dǎo)致的任何臨床病理，并且包括蜂窩組織炎、丹毒、膿皰病、猩紅熱、咽喉感染如急性咽炎(“鏈球菌性喉炎”)、菌血癥、中毒性休克綜合征、壞死性筋膜炎、急性風(fēng)濕熱和急性腎小球腎炎，盡管不限于這些。

如以上所述，本文公開(kāi)的治療和/或免疫方法包括向哺乳動(dòng)物單獨(dú)或者組合施用M蛋白的片段、變體或衍生物以及促進(jìn)恢復(fù)或增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞活性的物質(zhì)，從而引發(fā)哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答?？蛇x地，如以上所述，治療和/或免疫方法包括單獨(dú)或者組合施用編碼M蛋白的片段、其變體或衍生物以及促進(jìn)恢復(fù)或增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞活性的物質(zhì)的一種或多種分離的核酸，從而引發(fā)哺乳動(dòng)物的免疫應(yīng)答。

如本文所公開(kāi)的，本發(fā)明的其它具體方面和實(shí)施方案涉及使用抗體或抗體片段，以如通過(guò)靶向感染部位(例如皮膚)的SpyCEP而治療性地治療GAS感染。這可以與M蛋白的片段的免疫和/或抗M蛋白的片段的抗體或抗體片段的施用組合進(jìn)行。

抗體和抗體片段可以是多克隆的或單克隆的、天然的或重組的?？贵w片段包含F(xiàn)c、Fab或F(ab)₂片段和/或可以包含單鏈Fv抗體(scFv)?？梢岳绺鶕?jù)美國(guó)專(zhuān)利第5,091,513號(hào)、歐洲專(zhuān)利第239,400號(hào)或Winter&Milstein,1991,Nature 349:293的文章中分別描述的方法制備此類(lèi)scFv?？贵w還可以包含含有多個(gè)scFv的多價(jià)重組抗體片段以及二聚作用活化的demibody(如WO/2007/062466)，所述多價(jià)重組抗體片段如雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)和/或四鏈抗體(tetrabody)。舉例來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)Holliger等，1993Proc Natl Acad Sci USA 90 6444；或者Kipriyanov,2009Methods Mol Biol 562 177中所描述的方法制備此類(lèi)抗體。適用于抗體的產(chǎn)生、純化和使用的眾所周知的方案可見(jiàn)于，例如Coligan等人的《最新免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY)(John Wiley&Sons NY，1991-1994)的第二章和Harlow,E.&Lane,D.Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,Cold Spring Harbor Laboratory,1988。

產(chǎn)生多克隆抗體的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言眾所周知。可以使用的示例性方案描述于例如以上Coligan等人的《最新免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY)和以上Harlow&Lane,1988。在具體實(shí)施方案中，抗SpyCEP多克隆抗體可以獲自或純化自來(lái)自暴露于或者感染A群鏈球菌的個(gè)體的人血清?？蛇x地，多克隆抗體可以在產(chǎn)生物種如馬中由純化的或重組的SpyCEP或者其免疫原性片段誘發(fā)，以及隨后在施用之前純化。

可以使用如例如 &Milstein,1975,Nature 256,495的文章中最初描述的標(biāo)準(zhǔn)方法，或者通過(guò)如例如以上Coligan等人的《最新免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY)中描述的對(duì)標(biāo)準(zhǔn)方法的最近的改進(jìn)，通過(guò)使源自產(chǎn)生物種的脾細(xì)胞或其它抗體產(chǎn)生細(xì)胞永生化來(lái)產(chǎn)生單克隆抗體，所述產(chǎn)生物種已接種本發(fā)明的分離的蛋白、片段、變體或衍生物中的一種或多種。因此，對(duì)于本發(fā)明的用途，可以由M蛋白的片段、變體或衍生物和/或促進(jìn)恢復(fù)或增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞活性的物質(zhì)(例如SpyCEP)誘發(fā)單克隆抗體。在某些實(shí)施方案中，單克隆抗體或其片段可以是重組形式。如果單克隆抗體最初由非人的哺乳動(dòng)物的脾細(xì)胞產(chǎn)生，則重組形式對(duì)于使所述單克隆抗體或片段“人源化”可能特別有利。

對(duì)于涉及治療性抗體的實(shí)施方案，優(yōu)選的M蛋白的片段可以是p145肽。

SpyCEP的優(yōu)選片段可以包含氨基酸序列NSDNIKENQFEDFDEDWENF(SEQ ID NO:18)或者由氨基酸序列NSDNIKENQFEDFDEDWENF(SEQ ID NO:18)組成。

在某些方面和實(shí)施方案中，可以以組合物的形式向哺乳動(dòng)物單獨(dú)或者組合施用M蛋白的片段、變體或衍生物以及促進(jìn)恢復(fù)或增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞活性的物質(zhì)，包括如本文所公開(kāi)的抗體或抗體片段。

在優(yōu)選形式中，組合物包含可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。

“可接受的載體、稀釋劑或賦形劑”意指可以安全地用于全身施用的固體或液體填充劑、稀釋劑或包封物質(zhì)。根據(jù)具體的施用途徑，可以使用本領(lǐng)域眾所周知的多種載體、稀釋劑和賦形劑。這些可以選自包括以下的組：糖、淀粉、纖維素及其衍生物、麥芽、明膠、滑石粉、硫酸鈣、植物油、合成油、多元醇、海藻酸、磷酸鹽緩沖溶液、乳化劑、等滲鹽水以及諸如無(wú)機(jī)酸鹽(包括鹽酸鹽、溴酸鹽和硫酸鹽)和有機(jī)酸鹽(如乙酸鹽、丙酸鹽和丙二酸鹽)的鹽、水以及無(wú)熱原水。

描述可接受的載體、稀釋劑和賦形劑的可用參考是《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(Mack Publishing Co.N.J.USA,1991)，將其通過(guò)引用并入本文。

優(yōu)選地，出于引發(fā)免疫應(yīng)答的目的，可以將某些免疫學(xué)物質(zhì)與J8肽、片段、變體或衍生物以及促進(jìn)恢復(fù)或增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞活性的物質(zhì)組合使用，或者與編碼這些的一種或多種遺傳構(gòu)建體組合使用。

如本領(lǐng)域眾所周知的，術(shù)語(yǔ)“免疫學(xué)物質(zhì)”在其范圍內(nèi)包括載體、遞送物質(zhì)、免疫刺激劑和/或佐劑。如本領(lǐng)域所理解的，免疫刺激劑和佐劑指或者包括增強(qiáng)組合物的免疫原性和/或功效的一種或多種物質(zhì)。合適的免疫刺激劑和佐劑的非限制性實(shí)例包括角鯊?fù)楹徒酋徬?或者植物或動(dòng)物來(lái)源的其它油類(lèi))；嵌段共聚物；洗滌劑(如-80)； A、礦物油(如Drakeol或Marcol)、植物油(如花生油)；棒狀桿菌來(lái)源的佐劑(如短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum))；丙酸桿菌來(lái)源的佐劑(如痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acne))；牛型結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium bovis)(卡介苗或BCG)；百日咳桿菌(Bordetella pertussis)抗原；破傷風(fēng)類(lèi)毒素；白喉類(lèi)毒素；表面活性物質(zhì)，如十六胺、十八胺、十八烷基氨基酸酯、溶血卵磷脂、二甲基雙十八烷基溴化銨、N,N-dicoctadecyl-N′,N′雙(2-羥乙基-丙二胺)、甲氧基十六烷基甘油和復(fù)合多元醇；聚胺如吡喃、硫酸葡聚糖、聚IC羧乙烯聚合物(poly IC carbopol)；肽，如胞壁酰二肽和衍生物、二甲基甘氨酸、促吞噬肽(tuftsin)；油性乳狀液；以及礦物凝膠，如磷酸鋁、氫氧化鋁或明礬；白介素，如白介素2和白介素12；單核因子，如白介素1；腫瘤壞死因子；干擾素，如γ干擾素；免疫刺激性DNA(如CpG DNA)、免疫刺激性組合(如皂角苷-氫氧化鋁或Quil-A氫氧化鋁)；脂質(zhì)體；和佐劑；分枝桿菌細(xì)胞壁提取物；合成的糖肽，如胞壁酰二肽或其它衍生物；Avridine；脂質(zhì)A衍生物；硫酸葡聚糖；單獨(dú)的DEAE-葡聚糖或含有磷酸鋁的DEAE-葡聚糖；羧基聚亞甲基，如Carbopol’EMA；丙烯酸共聚物乳狀液，如Neocryl A640(例如美國(guó)專(zhuān)利第5,047,238號(hào))；油包水乳化劑，如Montanide ISA 720；脊髓灰質(zhì)炎病毒蛋白、牛痘蛋白或動(dòng)物痘病毒蛋白；或者它們的混合物。

免疫學(xué)物質(zhì)可以包括載體，如甲狀腺球蛋白；白蛋白，如人血清白蛋白；毒素、類(lèi)毒素或者來(lái)自破傷風(fēng)、白喉、百日咳、假單胞菌(Pseudomonas)、大腸桿菌(E.coli)、葡萄球菌(Staphylococcus)和鏈球菌的毒素的任何突變交叉反應(yīng)材料(CRM)；聚氨基酸，如聚(賴氨酸：谷氨酸)；流感病毒；輪狀病毒VP6，細(xì)小病毒VP1和VP2；乙型肝炎病毒核心蛋白；乙型肝炎病毒重組疫苗等?？蛇x地，可以使用載體蛋白或其它免疫原性蛋白的片段或表位。例如，可以使用細(xì)菌毒素、類(lèi)毒素或CRM的T細(xì)胞表位。就這點(diǎn)而言，可以參考美國(guó)專(zhuān)利第5,785,973號(hào)，將其通過(guò)引用并入本文。

考慮用于產(chǎn)生疫苗組合物的任何合適程序。示例性程序包括例如New Generation Vaccines(1997,Levine等，Marcel Dekker,Inc.New York,Basel,Hong Kong)中所描述的那些，將其通過(guò)引用并入本文。

在一些實(shí)施方案中，組合物和疫苗可以以減毒或滅活細(xì)菌的形式施用至哺乳動(dòng)物，可以對(duì)所述減毒或滅活的細(xì)菌進(jìn)行遺傳修飾以表達(dá)J8肽、片段、變體或衍生物和/或促進(jìn)恢復(fù)或增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞活性的物質(zhì)。減毒細(xì)菌的非限制性實(shí)例包括沙門(mén)氏菌(Salmonella)屬物種，例如鼠傷寒腸沙門(mén)氏菌變種(Salmonella enterica var.Typhimurium)或傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhi)?？蛇x地，可以以減毒的形式使用其它腸病原體如志賀氏菌(Shigella)屬物種或大腸桿菌。通過(guò)以下構(gòu)建減毒的沙門(mén)氏菌屬菌株：使芳香族氨基酸生物合成途徑中的基因失活(Alderton等，Avian Diseases 35 435)，將突變引入芳香族氨基酸生物合成途徑中的兩個(gè)基因(如描述于美國(guó)專(zhuān)利5,770,214)或者引入其它基因如htrA(如描述于美國(guó)專(zhuān)利5,980,907)或者引入編碼外膜蛋白的基因如ompR(如描述于美國(guó)專(zhuān)利5,851,519)。

可以采用任何安全的施用途徑，包括口服施用、直腸施用、腸胃外施用、舌下施用、口腔施用、靜脈內(nèi)施用、關(guān)節(jié)內(nèi)施用、肌肉內(nèi)施用、皮內(nèi)施用、皮下施用、吸入施用、眼內(nèi)施用、腹膜內(nèi)施用、腦室內(nèi)施用、局部施用、黏膜以及經(jīng)皮施用，盡管不限于這些。

劑型包括片劑、分散劑、懸液、注射劑、溶液、糖漿劑、錠劑、膠囊、鼻用噴霧、栓劑、氣霧劑、透皮貼劑等。這些劑型還可以包括為該目的特別設(shè)計(jì)的注入式或植入式控釋裝置，或者被改進(jìn)以以該方式另外作用的其它植入物形式。控釋可能受疏水聚合物包被的影響，所述疏水聚合物包括丙烯酸樹(shù)脂、蠟類(lèi)、高級(jí)脂肪醇、聚乳酸和聚乙醇酸以及某些纖維素衍生物(如羥丙基甲基纖維素)。此外，控釋可能會(huì)受使用其它聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和/或微球體的影響。

組合物可以以以下形式存在：離散單元如膠囊、小袋(sachet)、功能性食物/飼料或片劑，其各自含有預(yù)先確定量的本發(fā)明的一種或多種治療劑；粉末或顆粒；或者溶液或在水性液體、非水性液體中的懸浮液，水包油乳狀液或水包油液體乳狀液?？梢酝ㄟ^(guò)任何藥學(xué)方法制備此類(lèi)組合物，但是所有方法均包括下述步驟：將如上所述的一種或多種物質(zhì)與構(gòu)成一種或多種必需成分的載體聯(lián)合。通常，通過(guò)下述來(lái)制備組合物：將本發(fā)明的物質(zhì)與液體載體或細(xì)分的固體載體或者這兩者均勻或緊密混合，然后，如果需要，則將產(chǎn)品塑形成期望的外觀。

以上組合物可以以與劑型兼容的方式以及以有效的量施用。在本發(fā)明的背景中，向患者施用的劑量應(yīng)當(dāng)足以經(jīng)合適的時(shí)間段在患者中產(chǎn)生有益應(yīng)答。待施用的物質(zhì)的量可以取決于待治療的對(duì)象，包括年齡、性別、體重及其整體健康狀況(為取決于專(zhuān)業(yè)人員的判斷的因素)。

本文通常使用的術(shù)語(yǔ)“患者”、“個(gè)體”和“對(duì)象”用于本文公開(kāi)的治療或組合物的任何哺乳類(lèi)接受者的背景下。因此，本文公開(kāi)的方法和組合物可以具有醫(yī)學(xué)和/或獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用。在優(yōu)選形式中，哺乳動(dòng)物是人。

為了可以完全地理解本發(fā)明并將其投入實(shí)際應(yīng)用，參考下述非限制性實(shí)施例。

實(shí)施例

材料和方法

動(dòng)物：BALB/c小鼠(雌性，4-6周齡)獲自動(dòng)物資源中心(ARC,Perth,Western Australia)。根據(jù)澳大利亞國(guó)立健康與醫(yī)學(xué)研究理事會(huì)(NHMRC)指南，所有方案均被格里菲斯大學(xué)的動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

細(xì)菌菌株和培養(yǎng)基：在本研究中采用獲自不同來(lái)源的大量GAS分離物。釀膿鏈球菌M1(emm1)、88/30(emm 97)、BSA10(emm 124)和NS27(emm 91)、NS1(emm 100)和90/31(emm 57)獲自澳大利亞達(dá)爾文市曼茲斯衛(wèi)生研究院(Menzies School of Health Research,Darwin,Australia)。菌株5448AP(emm1)獲自Mark Walker教授(昆士蘭大學(xué),Brisbane,Australia)的實(shí)驗(yàn)室。將所有菌株在小鼠中傳代，并且通過(guò)將它們連續(xù)置于增加濃度的鏈霉素中使之對(duì)鏈霉素(200μg/ml)有抗性。為了制備激發(fā)接種物，使GAS菌株在37℃，在補(bǔ)充有1％新胨蛋白胨(neopeptone,Difco)，含有Todd-Hewitt肉湯(THB；Oxoid,Australia)的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。為了在感染之后測(cè)定細(xì)菌生物負(fù)載，將樣本接種在由以上所述的液體培養(yǎng)基與2％瓊脂、200μg/ml鏈霉素和2％馬血組成的血瓊脂平板上。

肽的合成和疫苗制劑：如別處所描述的(Batzloff等，2003)，合成肽J8并將其與Auspep Pty Ltd(Australia)的DT綴合。重組SpyCEP由GenScript USA Inc表達(dá)和純化。將所有的肽凍干儲(chǔ)存或者以溶液的形式于-80℃儲(chǔ)存。用30μg/小鼠劑量的J8-DT或重組SpyCEP接種小鼠。對(duì)于用組合的蛋白-肽綴合疫苗進(jìn)行的接種，將每只小鼠30μg肽綴合物J8-DT和30μg重組SpyCEP混合，并且以1:1(v/v)的比例吸附在氫氧化鋁(Alhydrogel,alum)上。

淺表皮膚感染模型的建立：為了開(kāi)發(fā)用于GAS的淺表皮膚感染模型，使用近交系的雌性BALB/c以及遠(yuǎn)交系的Swiss小鼠(4-6周齡)。腹膜內(nèi)(IP)注射(100μl/10g小鼠)比例為1:1:10的氯胺酮(100mg/ml儲(chǔ)液)/Xylazil-20(20mg/ml儲(chǔ)液)/水使小鼠麻醉。使用修剪工具和剃須刀移除小鼠后臀部(back haunch)的皮毛。用乙醇拭子將皮膚擦凈，然后借助于金屬銼刀機(jī)械劃痕。皮膚擦傷后，使小鼠感染GAS。將含有已知CFU計(jì)數(shù)的GAS的接種物(20μl)局部應(yīng)用在劃痕皮膚上。一旦接種物被皮膚完全吸收，將受傷部位進(jìn)行暫時(shí)覆蓋，并且將小鼠在單獨(dú)的籠中飼養(yǎng)。除淺表感染的組之外，將肺泡感染的小鼠組用作陽(yáng)性對(duì)照。按照Raeder和Boyle(1993)的方法使這些小鼠感染。根據(jù)批準(zhǔn)的評(píng)分表，每日監(jiān)測(cè)小鼠的感染損傷以及疾病征象。密切監(jiān)測(cè)受傷部位以評(píng)價(jià)感染的狀態(tài)。

組織學(xué)切片：在感染后第3天，處死有GAS皮膚感染或無(wú)GAS皮膚感染的劃痕小鼠(每組n＝3)。收集來(lái)自感染部位的組織皮膚樣本，用福爾馬林緩沖液固定，并包埋在石蠟中以用于蘇木精&伊紅(H&E)染色。然后切成5μm厚的組織切片，并用H&E以及姬姆薩和革蘭氏染色劑染色，以顯現(xiàn)革蘭氏陽(yáng)性生物體。掃描切片，并使用ImageScope軟件在高的放大倍數(shù)下讀取。對(duì)于免疫組織化學(xué)，將樣本在OCT中冷凍。同時(shí)在嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞耗竭之后的不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行組織學(xué)檢查。使用ImageJ(國(guó)立衛(wèi)生研究院,Bethesda,MD,USA)，在掃描的玻片的五個(gè)區(qū)域中對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并表示為每10,000μm²陽(yáng)性細(xì)胞的平均數(shù)。

小鼠免疫和激發(fā)方案：在第0天，用30μg J8-DT，30μg rSpyCEP或者60μg制劑(其包含30μg J8-DT和30μg rSpyCEP)在尾根處對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行皮下免疫。將所有在PBS中的抗原制備物配制在作為佐劑的鋁膠中。在第21天和第28天刺激小鼠。對(duì)照小鼠僅接受佐劑。在最后的免疫之后兩周，利用皮膚感染途徑用GAS激發(fā)小鼠。感染后，密切監(jiān)測(cè)小鼠，并且處死顯示疾病征象的任何小鼠(基于評(píng)分表，由GU動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn))。

樣本的收集和CFU測(cè)定：在感染后的限定時(shí)間點(diǎn)(第3天、第6天和第9天)，從各組挑選5只小鼠。經(jīng)心臟穿刺收集血液樣本，并且從位于被感染小鼠的后臀部的感染損傷處切離皮膚組織。將皮膚樣本稱重并在鹽水中均質(zhì)化。然后將適當(dāng)?shù)南♂屢航臃N在鏈霉素血瓊脂平板上，一式兩份，以測(cè)定感染損傷處的細(xì)菌負(fù)載。在PBS中稀釋血液樣本，并且將適當(dāng)?shù)南♂屢褐貜?fù)接種在鏈霉素血瓊脂平板上以測(cè)定血液中的細(xì)菌負(fù)載。

細(xì)胞耗竭研究：如之前所述的(Goldmann等，2004)，經(jīng)由卡拉膠(CGN)的IP施用耗竭巨噬細(xì)胞。為了耗竭皮膚巨噬細(xì)胞，每72小時(shí)，皮下注射CGN，這導(dǎo)致皮膚駐留巨噬細(xì)胞>95％的耗竭。在用FITC-綴合的抗小鼠Mac-1和APC綴合的F4/80(BD Biosciences,New Jersey,USA)標(biāo)記之后，利用脾細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析來(lái)優(yōu)化CGN注射的劑量和時(shí)間進(jìn)程。為了耗竭嗜中性粒細(xì)胞，如之前所述(Eyles等，2008)，使用抗Ly6G mAb(克隆1A8)。使用CD11b-perCp-cy5.5和Gr-1-APC mAb，通過(guò)血液、骨髓和脾細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析來(lái)確認(rèn)嗜中性粒細(xì)胞的耗竭。

體外趨化因子降解的分析：如之前所述(Hidalgo-Grass等，2004)，進(jìn)行IL-8、MIP-2和KC降解，并使用Quantikine試劑盒(R&D systems,Minneapolis,MN,USA)通過(guò)ELISA對(duì)其進(jìn)行定量。使用該方法測(cè)量與GAS培養(yǎng)上清液(S/N)孵育后未降解的趨化因子(IL-8、MIP-2和KC)的量。簡(jiǎn)言之，為了收集培養(yǎng)物S/N，使各種GAS菌株生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期(OD₆₀₀ 0.5)，將其再次接種進(jìn)新鮮的THB并且于37℃過(guò)夜生長(zhǎng)。然后將來(lái)自各菌株的無(wú)細(xì)胞GAS培養(yǎng)物S/N與已知濃度的重組趨化因子(IL-8、MIP-2和KC)于37℃孵育。在2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)或24小時(shí)收集樣本，并且如上所述，通過(guò)ELISA(R&D Systems)測(cè)定未降解的趨化因子的量。

嗜中性粒細(xì)胞的分離和transwell遷移分析：使用嗜中性粒細(xì)胞分離試劑盒(Miltenyi Biotech,Germany)，從小鼠骨髓分離嗜中性粒細(xì)胞。將嗜中性粒細(xì)胞(100μl培養(yǎng)基中2.5×10⁵個(gè))添加至transwell系統(tǒng)(Costar 24孔transwell,Corning NY)的上室，然后將其放置在含有單獨(dú)的培養(yǎng)基或者完整的或降解的趨化因子的下室。作為陽(yáng)性對(duì)照，還使用含有已知濃度的各重組趨化因子的孔。于37℃孵育2小時(shí)之后，從上室和下室收集細(xì)胞，并使用臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)定轉(zhuǎn)移的活的嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)目。通過(guò)將遷移的嗜中性粒細(xì)胞的數(shù)目除以存在的嗜中性粒細(xì)胞的總數(shù)來(lái)計(jì)算遷移的嗜中性粒細(xì)胞的百分比。

SpyCEP中和分析：為了評(píng)估rSpyCEP抗血清的SpyCEP中和能力，在BALB/C小鼠中產(chǎn)生針對(duì)rSpyCEP的超免疫血清。使包括90/31、BSA10和5448AP的一組GAS菌株生長(zhǎng)至穩(wěn)定期。將無(wú)細(xì)胞的GAS培養(yǎng)上清液與重組趨化因子和50％的正常血清或者抗SpyCEP血清于37℃共孵育16小時(shí)。使用Quantikine ELISA試劑盒(R&D System)測(cè)量未切割的IL-8。

SpyCEP表位作圖：在GenScript(Genscript USA Inc)合成肽陣列，所述肽陣列包含來(lái)自SpyCEP的N-端區(qū)域的553個(gè)氨基酸。在總的55種肽(SEQ ID NO：1-55)中，將重疊10個(gè)的各20聚體印跡至膜上。按照ELISA方案，用來(lái)自被30μg/劑量rSpyCEP/Alum制備物免疫3次的小鼠的抗血清探測(cè)膜。取被SpyCEP抗血清最強(qiáng)識(shí)別的6種肽用于進(jìn)一步的研究(SEQ ID NO:15、18、19、24、30和54)。

肽的合成和疫苗制劑：在GenScript，將通過(guò)表位作圖(如上所討論的)鑒定的六種肽(各為20聚體)合成為游離的肽或在C-端具有另外的半胱氨酸殘基。然后將具有C-端的肽與DT綴合并在小鼠中用于體內(nèi)免疫原性研究。將所有的肽凍干儲(chǔ)存或以溶液的形式于-20℃儲(chǔ)存。以30μg/小鼠的劑量，用rSpyCEP或SpyCEP肽(S1-S6)-DT綴合物將小鼠疫苗接種3次。

各肽免疫原性的測(cè)定：在各次刺激之前和之后收集血清樣本以測(cè)定針對(duì)免疫肽以及針對(duì)親本蛋白(rSpyCEP)的抗體滴度。為了測(cè)定肽特異性的IgG的滴度，用5μg/ml的六種肽(S1-S6)中的每一種包被板。使用由各肽誘發(fā)的抗血清的2倍連續(xù)稀釋液進(jìn)行ELISA。為了通過(guò)rSpyCEP確定SpyCEP肽的識(shí)別，使用rSpyCEP抗血清的2倍連續(xù)稀釋液。最后為了測(cè)定肽抗血清的親本肽的識(shí)別，用rSpyCEP包被板，并且使用肽的抗血清評(píng)估其與rSpyCEP的結(jié)合/識(shí)別。

體外IL-8保護(hù)分析：為了評(píng)估肽抗血清抑制IL-8降解的能力，進(jìn)行體外IL-8保護(hù)分析。將GAS培養(yǎng)上清液(S/N)與已知濃度的重組IL-8和肽抗血清(S1-S6)的1:2稀釋液孵育。如前所述(Hidalgo-Grass等，2004)，使用Quantikine試劑盒(R&D systems，Minneapolis，MN，USA)，通過(guò)ELISA來(lái)定量反應(yīng)混合物中未降解的IL-8的量。簡(jiǎn)言之，為了收集培養(yǎng)物S/N，使各種GAS菌株生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中期(OD₆₀₀ 0.5)，再次接種至新鮮的THB，并于37℃過(guò)夜生長(zhǎng)。然后在來(lái)自各肽的抗血清存在或不存在的情況下，將來(lái)自各菌株的無(wú)細(xì)胞GAS培養(yǎng)物S/N與已知濃度的重組趨化因子(IL-8)于37℃孵育。孵育16小時(shí)之后收集樣本，并且如上所述通過(guò)ELISA(R&D Systems)測(cè)定未降解的趨化因子的量。

肽抑制ELISA：對(duì)于肽抑制ELISA分析，將微量滴定板用100μl終濃度為5μg/ml的肽S1至S6或recSpyCEP(在75mM碳酸鈉緩沖液(pH 9.6)中)于4℃包被過(guò)夜。將板用緩沖液(含0.05％吐溫20的PBS，pH 7.2)洗滌，并且用補(bǔ)充有5％脫脂奶的緩沖液(封閉緩沖液)于37℃封閉90分鐘。將抗肽或recSpyCEP血清與5μg/ml或2.5μg/ml的各自體肽或recSpyCEP于37℃預(yù)孵育30分鐘。其后將測(cè)試抗血清添加至封閉板并且于37℃孵育90分鐘。將板洗滌四次，并且添加HRP-綴合山羊抗小鼠-IgG(Biorad,Australia)，并于37℃孵育另外90分鐘。另外的洗滌之后，如上所述鋪板并測(cè)量OD450。

流式細(xì)胞術(shù)分析：通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析recSpyCEP或SpyCEP表位抗體與GAS細(xì)胞表面的結(jié)合。使細(xì)菌在含有1％新胨蛋白胨的THB中過(guò)夜生長(zhǎng)，并且在PBS中洗滌。其后，將細(xì)菌(1×10⁷個(gè)菌落形成單位；cfu)與100μl Fc封阻劑于室溫預(yù)孵育15分鐘，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。之后添加1:20稀釋度的肽抗血清。室溫孵育1小時(shí)之后，將細(xì)菌在PBS中洗滌兩次，隨后與FITC-綴合的抗小鼠IgG(在含2％BSA的PBS中以1/50稀釋)孵育。最后，洗滌細(xì)菌，并且將其在1％甲醛(在PBS中)中于室溫孵育15分鐘。在CyAn ADP分析儀(Beckman Coulter,Inc.)上分析樣本。單獨(dú)添加FITC-綴合的抗小鼠IgG作為所分析的各菌株的陰性對(duì)照，并且此外，將非特異性小鼠IgG作為對(duì)照。

評(píng)估疫苗功效的激發(fā)模型：腹膜內(nèi)(IP)注射(100μl/10g小鼠)比例為1:1:10的氯胺酮(100mg/ml儲(chǔ)液)/Xylazil-20(20mg/ml儲(chǔ)液)/水，使近交系的雌性BALB/c小鼠(4-6周齡)麻醉。使用修剪工具和剃須刀移除小鼠頸部的毛發(fā)。對(duì)皮膚進(jìn)行淺表劃痕后，局部施加含1×10⁶個(gè)CFU計(jì)數(shù)的GAS接種物(20μl)。一旦接種物被皮膚完全吸收，將受傷部位進(jìn)行暫時(shí)覆蓋，并且將小鼠放置在單獨(dú)的籠中飼養(yǎng)。在感染之前24小時(shí)向小鼠飼喂鏈霉素(200μg/ml)水溶液，并且在整個(gè)研究進(jìn)程中保持飼喂鏈霉素(200μg/ml)水溶液。根據(jù)格里菲斯大學(xué)IBC批準(zhǔn)的評(píng)分表，每日監(jiān)測(cè)小鼠的感染損傷以及疾病征象。密切監(jiān)測(cè)受傷部位以評(píng)價(jià)感染狀態(tài)。

器官的收集和CFU測(cè)定：在感染后不同時(shí)間點(diǎn)(第3天、第6天和第9天)，處死來(lái)自各組的限定數(shù)量的小鼠。經(jīng)心臟穿刺收集血液樣本，移出脾，并獲得來(lái)自位于頸部感染損傷處的皮膚活檢樣本。將皮膚和脾樣本均質(zhì)化，然后將適當(dāng)?shù)南♂屢航臃N在鏈霉素血瓊脂平板上，一式兩份。感染后，密切監(jiān)測(cè)小鼠，并處死顯示疾病征象的任何小鼠(基于評(píng)分表)。

結(jié)果

在圖1中，通過(guò)比較不同GAS菌株M1(咽喉分離物)以及皮膚分離物88/30和BSA10來(lái)顯示J8-DT/Alum疫苗接種的保護(hù)功效。與M1相比，對(duì)于兩種皮膚分離物，J8-DT/Alum疫苗接種不太有效。如圖2所示，與J8免疫的效力相關(guān)的是GAS感染小鼠的皮膚中嗜中性粒細(xì)胞(PMN)的存在。

因此，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以測(cè)量嗜中性粒細(xì)胞耗竭對(duì)針對(duì)J8-DT/Alum的應(yīng)答的影響，其結(jié)果顯示于圖3中。嗜中性粒細(xì)胞耗竭對(duì)J8-DT/Alum疫苗接種的功效具有有害影響。

圖1-3中的數(shù)據(jù)顯示，嗜中性粒細(xì)胞可能在測(cè)定針對(duì)GAS感染的J8免疫的功效中發(fā)揮作用。圖4提供了在具有CovR/S突變的GAS分離物(如5448AP(M1T1分離物))中表達(dá)上調(diào)的細(xì)菌基因的概覽。如圖5中所示，J8-DT/Alum針對(duì)GAS分離物5448AP的保護(hù)功效相對(duì)弱?？紤]到嗜中性粒細(xì)胞似乎促進(jìn)對(duì)J8肽的免疫應(yīng)答，在GAS分離物5448AP中高表達(dá)的候選細(xì)菌基因是SpyCEP(70kD絲氨酸蛋白酶)，其切割并使嗜中性粒細(xì)胞趨化性物質(zhì)白介素8失活(參見(jiàn)圖4)。圖6顯示了實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中5448AP呈現(xiàn)特別強(qiáng)的IL-8降解。5448AP分離物對(duì)IL-8的鼠功能同源物：CXCL1/MIP-2(圖7)和CXCL1/KC(圖8)也呈現(xiàn)強(qiáng)烈的降解活性。功能上，該降解與如圖9中所示的嗜中性粒細(xì)胞趨化性的抑制相關(guān)。

圖1-9中的數(shù)據(jù)顯示，絲氨酸蛋白酶SpyCEP在CovR/SCovR/S突變體GAS細(xì)菌中高表達(dá)，其通過(guò)蛋白水解降解負(fù)調(diào)控IL-8，從而抑制或阻抑嗜中性粒細(xì)胞的趨化性。因此，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定靶向SpyCEP是否將改善、恢復(fù)或增加對(duì)J8肽的免疫應(yīng)答。圖10中顯示的結(jié)果表示，用J8-DT-重組SpyCEP/Alum進(jìn)行的免疫遠(yuǎn)比用單獨(dú)地J8-DT肽-綴合物或重組SpyCEP進(jìn)行的免疫有效，J8肽和重組SpyCEP的組合協(xié)同作用以保護(hù)免受5448AP GAS細(xì)菌的感染。進(jìn)一步地，圖11顯示用J8-DT-rSpyCEP進(jìn)行的免疫導(dǎo)致比用單獨(dú)的J8-DT或SpyCEP更強(qiáng)的IgG抗體應(yīng)答。這些數(shù)據(jù)產(chǎn)生了這樣的可能性：針對(duì)SpyCEP的抗體可能是有益的治療劑，其可以被直接施用至GAS感染部位(皮膚)從而治療感染。如圖12中所示，抗SpyCEP抗體(以來(lái)自用重組SpyCEP免疫的小鼠的抗血清的形式)抑制SpyCEP的IL-8降解活性。

我們從SpyCEP的殘基35-587制備了一系列重疊的20聚體肽(硝酸纖維素膜上的肽陣列)(圖13中的SEQ ID NO:1-55)，以確定哪一些被recSpyCEP抗血清識(shí)別。從圖14中的數(shù)據(jù)，我們鑒定了具有圖15中所示的氨基酸序列的6個(gè)推定的肽表位(S1-6；SEQ ID NO:15、18、19、24、30和54)。然后我們制備了那些單獨(dú)的合成肽并且將每一種與DT綴合。對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，并且我們顯示了抗血清可以識(shí)別recSpyCEP，盡管某些抗血清比其它抗血清更強(qiáng)(圖16)。然后我們進(jìn)行了IL-8保護(hù)分析，并且表明抗肽抗體可以不同程度地阻斷SpyCEP對(duì)IL-8的降解，而且一種肽(S2；SEQ ID NO:18)的抗血清可以與抗recSpyCEP同樣有效地阻斷IL8的降解(圖17)。因此，我們鑒定了SpyCEP上能夠誘導(dǎo)功能性抗體的優(yōu)勢(shì)表位(SEQ ID NO:18)。

圖18-20中顯示了測(cè)試如下指定的p145、J8和J8肽變體的免疫原性的數(shù)據(jù)：

●p145 LRRDLDASREAKKQVEKALE(SEQ ID NO:56)

●J8 QAEDKVKQSREAKKQVEKALKQLEDKVQ(SEQ ID NO:58)

●J8i V1 SREAKKQSREAKKQVEKALKQVEKALC(SEQ ID NO:59)

●J8i V2 SREAKKQSREAKKQVEKALKQSREAKC(SEQ ID NO:60)

●J8i V3 SREAKKQVEKALKQSREAKKQVEKALC(SEQ ID NO:61)

●J8i V4 SREAKKQVEKALDASREAKKQVEKALC(SEQ ID NO:62)。

根據(jù)28天的免疫方案，在4-6周齡的雌性Balb/c小鼠中產(chǎn)生超免疫血清。用30mg于PBS和Alum中的DT綴合肽(J8、p145、J8iV1、J8iV2、J8iV3或J8iV4)對(duì)小鼠進(jìn)行皮下免疫。在第0天、第21天、第28天發(fā)生免疫。在第35天、第42天和第49天，使下頜出血以收集血液/血清。

之前我們已觀察到，在小鼠和人中，通過(guò)用J8-DT疫苗接種所誘導(dǎo)的抗體僅很弱地識(shí)別天然序列p145。因此，基于12聚體的J8插入序列，我們?cè)O(shè)計(jì)了4種變體肽，并且設(shè)計(jì)這樣的變體肽以保持疏水和親水氨基酸的七殘基周期，從而維持肽的α-螺旋結(jié)構(gòu)。這些是以上列出的J8iV1、J8iV2、J8iV3和J8iV4肽。

圖18(右圖)顯示，通過(guò)J8-DT疫苗接種所誘導(dǎo)的p145-特異性抗體的滴度非常低(平均值為約2000，其中在某些小鼠中低于200)。相比之下，J8-DT疫苗接種后J8-特異性抗體的滴度為約600,000。針對(duì)J8的高滴度必定意味著，大多數(shù)抗體識(shí)別位于J8的氨基端和羧基端區(qū)段的非鏈球菌的側(cè)翼序列，盡管這還未被正式證明。

圖19顯示，J8iV1、J8iV2、J8iV3和J8iV4均誘導(dǎo)針對(duì)自身的高滴度的抗體(大約100,000)。重要的是，全部均誘導(dǎo)針對(duì)p145的高滴度(>10,000)，其中J8iV3-DT誘導(dǎo)大約30,000的滴度(圖20，右圖)?？赡艿氖牵码尼槍?duì)自身的滴度高于針對(duì)p145的滴度，因?yàn)閜145含有新肽中不存在的其它氨基酸，并且這些中的一些可能掩蓋了被針對(duì)新變體的抗血清所識(shí)別的表位。然而，變體J8肽針對(duì)自身的高滴度(大約100,000)是顯著的，因?yàn)樗鼈儗?zhuān)有地來(lái)源于鏈球菌序列。因此，新變體誘導(dǎo)100,000的滴度，其中所有抗體均識(shí)別鏈球菌序列，然而，J8誘導(dǎo)大約2,000的鏈球菌滴度。

使用肽抑制分析進(jìn)一步評(píng)估S2的免疫優(yōu)勢(shì)。將針對(duì)recSpyCEP和各表位的抗血清與各免疫抗原預(yù)孵育，在此之后，分析它們與抗原的結(jié)合。與自體肽預(yù)孵育之后，表位抗血清與固定化的自體肽的結(jié)合被大大減弱(40-80％的抑制)(圖21A)。表位抗血清與recSpyCEP的預(yù)孵育還導(dǎo)致固定化自體肽的識(shí)別的抑制，其中當(dāng)將針對(duì)S2-DT的抗血清與recSpyCEP孵育時(shí)，觀察到最高抑制(圖21B)，這指示被S2-DT免疫所識(shí)別的表位呈現(xiàn)在recSpyCEP的表面。而且，當(dāng)將針對(duì)SpyCEP的抗血清與6種肽中的每一種孵育時(shí)，我們觀察到肽S2(SEQ ID NO:18)最大程度地抑制結(jié)合，并且可以與由recSpyCEP引起的抑制相當(dāng)(圖21C)。這些數(shù)據(jù)表示，以ELISA的方式，對(duì)SpyCEP的免疫應(yīng)答主要由S2(SEQ ID NO:18)的抗體識(shí)別來(lái)限定，并且S2(SEQ ID NO:18)可以引發(fā)與針對(duì)整個(gè)recSpyCEP的免疫應(yīng)答相似的免疫應(yīng)答。因此，S2(SEQ ID NO:18)是SpyCEP的免疫優(yōu)勢(shì)表位。

然后，我們測(cè)試了SpyCEP和表位抗血清與各種GAS菌株的結(jié)合功效。SpyCEP在GAS的表面表達(dá)并且脫落(shed)。為了估計(jì)對(duì)天然抗原的識(shí)別，使用FACS分析來(lái)比較不同的表位特異性抗體與各種GAS菌株的結(jié)合。將GAS菌株5448與其動(dòng)物傳代的衍生物5448AP(已知高水平表達(dá)SpyCEP的CovR/S突變體)一起使用。類(lèi)似地，將野生型BSA10與其動(dòng)物傳代的衍生物pBSA10(也是CovR/S突變體)并行使用。還包括參照菌株2031(emm1)和澳大利亞北部地區(qū)的皮膚分離物88/30。我們的數(shù)據(jù)表明，在所有的情況下，由recSpyCEP疫苗接種誘導(dǎo)的抗體與GAS分離物的結(jié)合可與由S2-DT免疫誘導(dǎo)的抗體與GAS分離物的結(jié)合相比較。針對(duì)其它表位的抗體顯示可變水平的與GAS的結(jié)合(圖22A、B和C)。此外，如通過(guò)平均熒光強(qiáng)度(MFI)數(shù)據(jù)所測(cè)量的，發(fā)現(xiàn)在所有測(cè)試菌株中，SpyCEP以及S2的表面表達(dá)最高(數(shù)據(jù)未顯示)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了天然SpyCEP上的S2表位的免疫優(yōu)勢(shì)。然而，數(shù)據(jù)未表明，針對(duì)S2表位的抗體將功能性地?fù)p害SpyCEP的CXC趨化因子蛋白酶。

然后，我們?cè)儐?wèn)S2-DT是否可以增強(qiáng)J8-DT疫苗的功效。我們之前已經(jīng)證明，recSpyCEP與J8-DT的組合導(dǎo)致比單獨(dú)的J8-DT或單獨(dú)的recSpyCEP顯著更好地針對(duì)GAS的CovR/S突變株的侵入性感染的保護(hù)(提交的手稿)。將J8-DT和recSpyCEP或S2-DT以1:1的重量比混合，并且在我們最新開(kāi)發(fā)的皮膚激發(fā)模型中進(jìn)行測(cè)試(提交的手稿)。用各抗原或PBS疫苗接種對(duì)照小鼠。疫苗接種后，用5448AP GAS激發(fā)小鼠。用J8-DT+S2-DT進(jìn)行的疫苗接種導(dǎo)致5448AP感染的小鼠的皮膚以及血液中的細(xì)菌生物負(fù)載顯著減少(圖23A和B)。還發(fā)現(xiàn)由J8-DT+S2-DT疫苗接種所提供的保護(hù)水平與J8-DT+SpyCEP疫苗接種所提供的保護(hù)水平相當(dāng)。為了確認(rèn)這些發(fā)現(xiàn)，用另一CovR/S突變株NS88.2重復(fù)激發(fā)實(shí)驗(yàn)(圖24A和B)。再一次，我們發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)的J8-DT相比，用J8-DT+SpyCEP或J8-DT+S2-DT進(jìn)行的疫苗接種導(dǎo)致顯著增強(qiáng)的保護(hù)功效。與PBS對(duì)照相比，單獨(dú)用J8-DT或SpyCEP疫苗接種不能提供任何保護(hù)。

結(jié)論

嗜中性粒細(xì)胞的活性似乎是用J8肽進(jìn)行的疫苗接種的功效的關(guān)鍵因素。SpyCEP是由有毒的GAS細(xì)菌(如具有CovR/S突變的那些細(xì)菌)高表達(dá)的IL-8降解蛋白酶。與單獨(dú)的J8肽或SpyCEP相比，用J8肽和rSpyCEP的組合進(jìn)行的免疫對(duì)由CovR/S GAS突變體5448AP導(dǎo)致的GAS感染具有協(xié)同作用。同樣明顯的是，抗SpyCEP抗體可以有效地中和SpyCEP的IL-8降解活性，從而為既有的GAS感染提供治療干預(yù)。而且，我們已鑒定了SpyCEP上可以誘導(dǎo)功能性抗體的優(yōu)勢(shì)表位(SEQ ID NO:18)。我們當(dāng)前正在計(jì)劃用GAS激發(fā)進(jìn)行主動(dòng)和被動(dòng)疫苗研究。該表位的優(yōu)勢(shì)是，其能夠使我們?cè)谝呙缰斜苊馐褂猛暾亟MSpyCEP蛋白，從而改善了安全性特征。我們相信，最佳的疫苗是J8和該表位的混合物。在該預(yù)測(cè)的確認(rèn)中，相比于單獨(dú)的J8-DT，用J8-DT+SpyCEP或J8-DT+S2-DT進(jìn)行的疫苗接種導(dǎo)致顯著增強(qiáng)的保護(hù)功效。而且，已開(kāi)發(fā)了針對(duì)它們自身和鏈球菌的肽p145，誘導(dǎo)高的滴度的變體J8肽，大概是因?yàn)樗鼈儗?zhuān)有地來(lái)源于鏈球菌p145的氨基酸序列。

在整個(gè)說(shuō)明書(shū)中，目標(biāo)是描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，而不將本發(fā)明限于任一實(shí)施方案或者特征的具體集合中。在不脫離本發(fā)明的廣泛精神和范圍的情況下，可以對(duì)本文所描述和示例的實(shí)施方案作出各種改變和修改。

將本文提及的所有計(jì)算機(jī)程序、算法、專(zhuān)利和科學(xué)文獻(xiàn)通過(guò)引用整體并入本文。