專利名稱：一種應(yīng)用環(huán)介導等溫擴增技術(shù)快速檢測羅非魚無乳鏈球菌的試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水產(chǎn)生物病原快速檢測技術(shù)，具體是利用環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術(shù)快速檢測羅非魚無乳鏈球菌かagalactiae, GBS)病原的檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
無乳鏈球菌(義agalactiae)也稱B群鏈球菌(GBS)，是ー類廣泛存在于自然界的革蘭氏陽性菌，宿主范圍廣，對哺乳類、爬行類、兩棲類及魚類均可造成危害。自1958年日本在虹鱒{Oncorhychus mikiss)中首次獲得鏈球菌病原后，魚類鏈球菌病相繼在多個國家流行。近年來在我國多發(fā)于養(yǎng)殖的羅非魚，其感染性強，死亡率高，而且治療困難，導致我國南方各地養(yǎng)殖羅非魚爆發(fā)性死亡，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。目前已經(jīng)建立的有關(guān)細菌病原檢測的技術(shù)較多，如常規(guī)的生化檢測方法，主要建立在生物化學中的快速專有酶反應(yīng)和細菌代謝產(chǎn)物的檢測技術(shù)；以免疫學為基礎(chǔ)的檢測方法如免疫學中的放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、熒光免疫分析(FIA)、時間分辨熒光免疫分析(TrFIA)、化學發(fā)光免疫分析(CIA)、生物發(fā)光免疫分析(BIA)等，足以檢出臨床標本中痕量的微生物抗原；以及以分子生物學為基礎(chǔ)的核酸探針和聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)分析。但這些方法或耗時長，或敏感性差、或特異性不強。GBS的PCR檢測法，雖然在實驗室條件下能對GBS進行相對快速、準確的檢測，但由于常規(guī)PCR檢測需要昂貴的PCR儀，凝膠電泳和成像系統(tǒng)等，這大大限制了 PCR檢測方法在生產(chǎn)實際中的推廣應(yīng)用。因此開發(fā)簡便快速、準確靈敏的檢測GBS的新技術(shù)，加強苗種和不同規(guī)格魚種的檢疫以及養(yǎng)殖水體的檢測，對預報預測，預防疫情感染，切斷病原傳播，保障我國羅非魚產(chǎn)業(yè)鏈的健康持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是，提供ー種羅非魚無乳鏈球菌環(huán)介導等溫擴增檢測技術(shù)，以實現(xiàn)對羅非魚無乳鏈球菌病的快速、靈敏、特異、簡便的快速檢測。環(huán)介導等溫擴增法(LAMP)是ー種新型的核酸擴增方法，該方法對病原保守基因上的八個區(qū)域設(shè)計六條特異性引物，利用Bst DNA聚合酶在60-65°C進行恒溫擴增30_60min，通過觀察反應(yīng)物濁度或結(jié)合染料顏色變化判定結(jié)果，該方法靈敏、快速、準確、簡便，不需要昂貴儀器，成本低，可用于樣品野外實地快速檢測。本發(fā)明具體包括三個部分1.將法醫(yī)分子鑒定用的chelex-100樹脂結(jié)合水煮法用于快速提取羅非魚無乳鏈球菌基因組DNA，大大簡化并縮短操作時間的同時，保證了所提取DNA的質(zhì)量；2.提供兩對用于無乳鏈球菌LAMP快速檢測的引物序列，依次命名為GBS-F3 ;GBS-B3 ;GBS-FIP ;GBS-BIP，長度分別為 21bp，18 bp，51bp，50 bp ；3.提供ー種羅非魚無乳鏈球菌的LAMP快速檢測方法，首先是快速簡便的制備反應(yīng)模版，并配置LAMP反應(yīng)體系，然后通過LAMP反應(yīng)程序?qū)Ψ磻?yīng)模版進行擴增，最后根據(jù)反應(yīng)混合物顯示的顔色對檢測結(jié)果進行判讀，如反應(yīng)物顯示綠色則表示該樣品的GBS檢測結(jié)果為陽性，若顯示橙黃色、則表示該樣品的GBS檢測為陰性。上述兩對LAMP引物序列(GBS-F3 ;GBS_B3 ；GBS-FIP ；GBS-BIP)分別與羅非魚無乳鏈球菌促溶血因子基因上相應(yīng)位置的核苷酸序列相同或互補，其序列如下
GBS-F3: 5， -AGTAATAGCCTCATTAACCGG-3，;
GBS-B3: 5’ -CTAGTGGCTGGTGCATTG-3’ ;
GBS-FIP:
5’ -GCTCAAAAGCTTGATCAAGATAGCTTTTCTGTTCCCTGAACATTATCTTTG-3’ ;
GBS-BIP:
5’ - TTACTTGATTTACCACTTGTGGAGTTTTTTTCACCAGCTGTATTAGAAGT-3’ ;
本發(fā)明的無乳鏈球菌LAMP快速檢測試劑盒由提取無乳鏈球菌基因組試劑和LAMP反應(yīng)試劑組成
所述提取無乳鏈球菌基因組試劑組成chelex-100, Tris, EDTA, Tritonx-100 ； 所述LAMP反應(yīng)液由反應(yīng)液A和反應(yīng)液B組成反應(yīng)液A含有10XLAMP Buffer (200mMTris-Hcl, pH8. 8 ； 100 mM 氯化鉀；100 mM 硫酸銨；20mM 硫酸鎂和 l%TritonX_100)、BstDNA 聚合酶、dNTP、內(nèi)外引物(GBS-FIP; GBS-BIP; GBS-F3; GBS-B3)、甜菜堿、超純水。GBS-F3: AGTAATAGCCTCATTAACCGG;
GBS-B3: CTAGTGGCTGGTGCATTG;
GBS-FIP: GCTCAAAAGCTTGATCAAGATAGCTTTTCTGTTCCCTGAACATTATCTTTG;
GBS-BIP: TTACTTGATTTACCACTTGTGGAGTTTTTTTCACCAGCTGTATTAGAAGT;
反應(yīng)液B為熒光染料。上述提取無乳鏈球菌基因組試劑5%chelex_100 CpH=IO. 4)包括5%chelex_100，10mmol/L Tris (ΡΗ=8· O), I mmol/L EDTA,1% Tritonx-IOO0上述LAMP反應(yīng)試劑中Bst DNA聚合酶濃度為8U/ μ L、dNTP濃度為2. 5 mM、內(nèi)引物(GBS-FIP; GBS-BIP )濃度均為20 μ M、外引物(GBS-F3; GBS-B3 )濃度均為20 μ Μ、甜菜堿濃度為5Μ。所述熒光染料為1000X SYBR Green I。本發(fā)明的試劑盒檢測無乳鏈球菌的方法包括如下步驟
(1)取Iml無乳鏈球菌菌液，IOOOOrpm離心5min后棄上清，再用無菌水稀釋至50μ L ;
(2)加入5%chelex-100復合液至總體積200ul，56°C孵育15_30min，劇烈震蕩IOs ；
(3)轉(zhuǎn)入100°C沸水中孵育8-10min，再劇烈震蕩IOs；
(4)冰浴2η η,4· 條件下，12000rpm離心3min,吸取上清液作為模板備用；
(5)往兩個裝有23μ L的LAMP反應(yīng)試劑的反應(yīng)管中分別加入2 μ L上述模板和陽性對照核酸；
(6)將上述反應(yīng)管置于65°C保溫60min，然后置于80°C保溫IOmin進行LAMP反應(yīng)；
(7)結(jié)束后，在每個反應(yīng)管中加入ZyLlOOOXSYBRGreen I，然后肉眼觀察被測樣品的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物，如反應(yīng)物顯示綠色則表示該樣品的GBS檢測結(jié)果為陽性，若顯示橙黃色則表示該樣品的GBS檢測為陰性。本發(fā)明所提供的檢測方法具有如下優(yōu)點
(I)檢測時間短1. 5-2h即可獲得檢測結(jié)果，比現(xiàn)有最快的PCR檢測方法節(jié)省4_6h ；
(2)操作簡單、結(jié)果明顯整個檢測過程不涉及復雜昂貴的儀器或設(shè)備，只需ー個水浴鍋即可完成檢測，檢測結(jié)果可直接用肉眼觀察；
(3)靈敏度高對羅非魚無乳鏈球菌的檢測極限可低至9個細菌，比普通PCR靈敏度高10倍以上。(4) 特異性強所用的特異性引物是根據(jù)羅非魚無乳鏈球菌的促溶血因子基因中6個不同區(qū)域設(shè)計，特異性超過常規(guī)PCR。(5) 安全檢測過程不涉及有毒試劑，不會對人和環(huán)境造成危害。總之，該方法解決了現(xiàn)有技術(shù)中檢測無乳鏈球菌的方法所需周期長、靈敏度較低、操作復雜、現(xiàn)場應(yīng)用困難等缺陷，可廣泛用于獸醫(yī)、水產(chǎn)、出入境檢疫等領(lǐng)域。具體實施方法
實施案例
按下列配方制作無乳鏈球菌的環(huán)介導等溫擴增檢測試劑盒
I.配置無乳鏈球菌基因組提取試劑
(1)TEX (10mmol/L Tris [pH=8. O],lmmol/L EDTA,l%TritonX-100)
(2)利用TEX 配制 5% 的 chelex-100 (pH=10. 4)。提取無乳鏈球菌基因組
(1)取Iml無乳鏈球菌菌液，IOOOOrpm離心5min后棄上清，再用無菌水稀釋至50μ L ;
(2)加入5%chelex-100復合液至總體積200μ L，56°C孵育15_30min，劇烈震蕩IOs ；
(3)轉(zhuǎn)入100°C沸水中孵育8-10min，再劇烈震蕩IOs；
(4)冰浴2η η,4· 條件下，12000rpm離心3min,吸取上清液作為模板備用；
3.配置LAMP反應(yīng)試劑
(1)反應(yīng)液A: 2. 5μ L 10 X LAMP BufferU. 5μ L Bst DNA聚合酶(8U/μ L)、4 μ L dNTP(2.5 mM)、0. lyL*$_GBS-F3 (20μΜ)，0· lyL*$_GBS_B3 (20μΜ),0. 8μ L 內(nèi)引物GBS-FIP (20μΜ)，0· 8μ L 內(nèi)引物 GBS-BIP (20 μ Μ)、2· 5 μ L 甜菜堿(5Μ)、10· 7 μ L 超純水。本發(fā)明兩對LAMP引物序列(GBS-F3;GBS-B3;GBS-FIP;GBS-BIP)分別與羅非魚無乳鏈球菌促溶血因子基因上相應(yīng)位置的核苷酸序列相同或互補，其序列如下
GBS-F3:5， -AGTAATAGCCTCATTAACCGG-3， (2Ibp)
GBS-B3:5 ’ -CTAGTGGCTGGTGCATTG-3’( 18bp)
GBS-FIP:
5’ -GCTCAAAAGCTTGATCAAGATAGCTTTTCTGTTCCCTGAACATTATCTTTG-3’ ，
(51bp)
GBS-BIP:
5，-TTACTTGATTTACCACTTGTGGAGTTTTTTTCACCAGCTGTATTAGAAGT-3，
(50bp)
(2)反應(yīng)液B:1000XSYBR Green I。無乳鏈球菌的環(huán)介導等溫擴增及顯色反應(yīng)
(I)往兩個裝有23 μ L的LAMP反應(yīng)試劑的反應(yīng)管中分別加入2 μ L上述模板和陽性對照核酸；、(2)將上述反應(yīng)管置于65°C保溫60min，然后置于80°C保溫IOmin進行LAMP反應(yīng)；
(3)結(jié)束后，在每個反應(yīng)管中加入2μL 1000 X SYBR Green I，然后肉眼觀察被測樣品的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物，如反應(yīng)物顯示綠色則表示該樣品的GBS檢測結(jié)果為陽性，即含有無乳鏈球菌，若顯示橙黃色則表示該樣品的GBS檢測為陰性，即不含無乳鏈球菌。實施例I :本發(fā)明試劑盒在檢測無乳鏈球菌中的應(yīng)用效果之敏感性
(I) 樣品羅非魚無乳鏈球菌(原始濃度為9. IXlO8 cfu/mL )。(2)樣品處理提取羅非魚無乳鏈球菌DNA (原始濃度為27. O μ g/mL)，并將其做KT1-KT8的倍比稀釋。(3)無乳鏈球菌LAMP檢測試劑盒反應(yīng)液A配制如下2· 5 μ L IOXLAMP Buffer、
I.5μ L Bst DNA 聚合酶(8υ/μ υ、4μ L dNTP (2.5 mM)、0. I μ L 外引物 GBS-F3 (20 μ Μ)，
O.lyL*$_GBS-B3 (20μΜ),0. 8μ L 內(nèi)引物 GBS-FIP (20μΜ),0. 8μ L 內(nèi)引物 GBS-BIP(20μΜ)、2· 5μ L甜菜堿(5Μ)、10· 7μ L超純水
(4)無乳鏈球菌的環(huán)介導擴增反應(yīng)
往兩個裝有23 μ L的LAMP反應(yīng)試劑的反應(yīng)管中分別加入2 μ L上述模板和陽性對照核 酸，將上述反應(yīng)管置于65°C保溫60min，然后置于80°C保溫IOmin進行LAMP反應(yīng)；
(5)擴增產(chǎn)物的顯色反應(yīng)
結(jié)束后，在每個反應(yīng)管中加入2μ L 1000XSYBR Green I，然后肉眼觀察被測樣品的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物，如反應(yīng)物顯示綠色則表示該樣品的GBS檢測結(jié)果為陽性，若顯示橙黃色則表示該樣品的GBS檢測為陰性。敏感性結(jié)果
試驗結(jié)果表明采用本發(fā)明試劑盒最低能檢測9個細菌/管，表明本檢測方法具有很高的敏感性。實施例2:臨床檢測
(I)樣品羅非魚發(fā)病現(xiàn)場采集的羅非魚無乳鏈球菌陽性樣品5株和陰性樣品12株(包括患病羅非魚體分離的其他病原菌如海豚鏈球菌、嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌、淺綠氣球菌、金黃色葡萄球菌、普通變形桿菌、乳酸桿菌、點狀氣單胞菌等)。利用5% chelex-100水煮法提取各樣品的DNA
①取Iml無乳鏈球菌菌液，IOOOOrpm離心5min后棄上清，再用無菌水稀釋至50μ L ;
②加入5%chelex-100復合液至總體積200μ L，56°C孵育15_30min，劇烈震蕩IOs ；
③轉(zhuǎn)入100°C沸水中孵育8-10min，再劇烈震蕩IOs；
④冰浴2min,4°C條件下，12000 rpm離心3min,吸取上清液作為模板備用；
(3)對各樣品進行LAMP反應(yīng)及顯色檢測具體步驟如下
①往裝有23μ L的LAMP反應(yīng)A試劑的反應(yīng)管中分別加入2 μ L上述各樣品模板和陽性對照核酸；
②將上述反應(yīng)管置于65°C保溫60min，然后置于80°C保溫IOmin進行LAMP反應(yīng)；
③結(jié)束后，在每個反應(yīng)管中加入2μ L反應(yīng)液B即1000X SYBR Green I，然后肉眼觀察被測樣品的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物，如反應(yīng)物顯示綠色則表示該樣品的GBS檢測結(jié)果為陽性，即含有無乳鏈球菌，若顯示橙黃色則表示該樣品的GBS檢測為陰性，即不含無乳鏈球菌。實驗結(jié)果表明以上經(jīng)過LAMP檢測顯示為陽性，均可通過其他生理生化及分子生物學方法檢測無乳鏈球菌的存在；經(jīng)過LAMP檢測為陰性的，通過生理生化及分子生物學方法檢測確認均不含無乳鏈球菌。以上結(jié)果表明本檢測方法特異性強，檢測結(jié)果準確可靠。權(quán)利要求
1.一種用于無乳鏈球菌LAMP快速檢測的兩對引物，兩對特異性引物為GBS-F3 ;GBS-B3 ；GBS-FIP和GBS-BIP，上述兩對LAMP引物分別與羅非魚無乳鏈球菌促溶血因子基因上相應(yīng)位置的核苷酸序列相同或互補。
2.—種利用環(huán)介導等溫擴增技術(shù)快速檢測羅非魚無乳鏈球菌的試劑盒，其特征是試劑包括 (1)提取無乳鏈球菌基因組試劑 ①5% chelex-ΙΟΟ 復合液； ②無菌蒸餾水； (2)LAMP反應(yīng)試劑由反應(yīng)液A和反應(yīng)液B組成 反應(yīng)液A 包括有 10XLAMP Buffer ( 200mM Tris-Hcl, pH8. 8 ；100 mM 氯化鉀；100 mM 硫酸銨；20mM 硫酸鎂；l%TritonX-100)、Bst DNA 聚合酶、dNTP、內(nèi)引物 GBS-F3 及 GBS-B3，外引物GBS-FIP及GBS-BIP、甜菜堿、超純水， 反應(yīng)液B為熒光染料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ー種利用環(huán)介導等溫擴增技術(shù)快速檢測羅非魚無乳鏈球菌的試劑盒，其特征在于作為核酸抽提液5%chelex-100復合液體由以下組分按比例組成 5% chelex-ΙΟΟ,由 TEX 配制而成(10mmol/L Tris (pH=8. O),lmmol/LEDTA,l%TritonX-100)配制而成，最終pH調(diào)節(jié)至10.4。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ー種利用環(huán)介導等溫擴增技術(shù)快速檢測羅非魚無乳鏈球菌的試劑盒，其特征在于LAMP反應(yīng)液由以下成分組成 Bst DNA聚合酶濃度為8U/μ L、dNTP濃度為2. 5 mM、內(nèi)外引物GBS-FIP ;GBS_BIP及GBS-F3 ；GBS-B3的濃度均為20 μ Μ、甜菜堿濃度為5Μ。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ー種利用環(huán)介導等溫擴增技術(shù)快速檢測羅非魚無乳鏈球菌的試劑盒，其特征在于所述熒光染料為1000XSYBR Green I。
6.ー種利用環(huán)介導等溫擴增技術(shù)快速檢測羅非魚無乳鏈球菌的試劑盒檢測羅非魚無乳鏈球菌病原的方法，其特征在于該方法包括以下步驟 (1)取Iml無乳鏈球菌菌液，IOOOOrpm離心5min后棄上清，再加無菌水稀釋至50μ L ; (2)加入5%chelex-100復合液至總體積200ul，56°C孵育15_30min，劇烈震蕩IOs ； (3)轉(zhuǎn)入100°C沸水中孵育8-10min，再劇烈震蕩IOs； (4)冰浴2η η,4· 條件下，12000rpm離心3min,吸取上清液作為模板備用； (5)往兩個裝有23μ L的LAMP反應(yīng)試劑的反應(yīng)管中分別加入2 μ L上述模板和陽性對照核酸； (6)將上述反應(yīng)管置于65°C保溫65min，然后置于80°C保溫IOmin進行LAMP反應(yīng)； (7)結(jié)束后，在每個反應(yīng)管中加入2μL 1000 X SYBR Green I，然后肉眼觀察被測樣品的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物，如反應(yīng)物顯示綠色則表示該樣品的GBS檢測結(jié)果為陽性，若顯示橙黃色則表示該樣品的GBS檢測為陰性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用環(huán)介導等溫擴增技術(shù)快速檢測羅非魚無乳鏈球菌的試劑盒及檢測方法，可用于魚類養(yǎng)殖場的病原檢測。它公開了用于無乳鏈球菌LAMP檢測的兩對特異性引物，以及所述用途檢測的試劑盒，所述試劑包括無乳鏈球菌基因組提取試劑，LAMP反應(yīng)液，該反應(yīng)液包括10×LAMPBuffer(200mMTris-Hcl，pH8.8;100mM氯化鉀；100mM硫酸銨；20mM硫酸鎂和1%TritonX-100)、BstDNA聚合酶、dNTP、內(nèi)引物GBS-F3及GBS-B3，外引物GBS-FIP及GBS-BIP、甜菜堿、超純水，熒光染料。本發(fā)明具有檢測時間短、操作簡單、結(jié)果明顯、靈敏度高、特異性強、對人和環(huán)境安全等特點。
文檔編號C12Q1/14GK102747165SQ20121026020
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月26日
發(fā)明者劉志剛, 盧邁新, 可小麗, 朱華平, 霍歡歡, 高風英 申請人:中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所