本申請要求于2014年6月16日提交的美國臨時申請?zhí)?2/012865和于2015年2月19日提交的美國臨時申請?zhí)?2/118396的優(yōu)先權(quán)。每個在先申請的內(nèi)容均通過引用整體并入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

本文提供了用于治療麩質(zhì)不耐受和相關(guān)病況如乳糜瀉或麩質(zhì)敏感的組合物和方法。本文進一步提供了用于減弱或預防由腸中存在食物蛋白質(zhì)抗原所誘導的上皮內(nèi)淋巴細胞(IEL)浸潤的組合物和方法。此類食物蛋白質(zhì)抗原包括難以消化的富含脯氨酸的食物，如在含有麩質(zhì)的小麥、大麥、裸麥等中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)。具體而言，麩質(zhì)在胃腸道中部分水解，并且可導致IEL浸潤和產(chǎn)生包括肌內(nèi)膜IgA和抗組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶在內(nèi)的抗體。本發(fā)明的組合物和方法在腸中提供了降低量的此類食物蛋白質(zhì)抗原，這進而降低了腸的IEL浸潤量。

發(fā)明背景

幾種疾病由易感個體中對抗原性食物蛋白質(zhì)的反應(yīng)介導。例如，攝入含有抗原性食物蛋白質(zhì)(例如，麩質(zhì))的小麥、大麥和裸麥可在麩質(zhì)不耐受個體中引起異常的自身免疫反應(yīng)，如乳糜瀉、小麥變態(tài)反應(yīng)和皰疹樣皮炎。麩質(zhì)是富含谷氨酰胺和脯氨酸的麥谷蛋白和谷醇溶蛋白蛋白質(zhì)分子的混合物。

乳糜瀉是影響小腸的自身免疫病癥。大多數(shù)具有特征為乳糜瀉的異常自身免疫反應(yīng)的個體表達人白細胞抗原(HLA)DQ2或DQ8分子。所述疾病的癥狀由與麩質(zhì)蛋白質(zhì)的反應(yīng)引起，并且還可包括所食用的谷物產(chǎn)品中的其它儲存蛋白質(zhì)(例如絲氨酸蛋白酶抑制蛋白、purinin)。臨床上，所述疾病可部分通過對麩質(zhì)和組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG)特異的抗體的定量來檢測。自身免疫反應(yīng)導致具有隱窩增生的小腸粘膜絨毛萎縮和粘膜炎癥的發(fā)生。乳糜瀉的癥狀可因個體差異而不同，并且可包括以下中的一種或多種：疲勞、慢性腹瀉、便秘、營養(yǎng)素吸收不良、重量減輕、腹脹、貧血，以及大大提高的發(fā)生骨質(zhì)疏松癥和腸惡性腫瘤(淋巴瘤和癌瘤)的風險。

I型糖尿病是乳糜瀉的風險因素。孤獨癥也與乳糜瀉相關(guān)，并且不含麩質(zhì)的膳食可幫助減輕孤獨癥的一些癥狀。類似地，當從有注意缺陷多動障礙的人的膳食中去除麩質(zhì)時，認為他們中的一些展現(xiàn)更少的癥狀。可從消除膳食性麩質(zhì)中受益的其它病況包括類風濕性關(guān)節(jié)炎和纖維肌痛。

對于麩質(zhì)不耐受、尤其是乳糜瀉的治療通常涉及終生嚴格的不含麩質(zhì)的膳食。然而，不含麩質(zhì)的膳食是不便的，受限制的，并且麩質(zhì)難以避免。因此，需要對麩質(zhì)不耐受和乳糜瀉的有效的替代治療。

發(fā)明概要

本發(fā)明涉及以下發(fā)現(xiàn)：本文所述的包含一種或多種豬籠草(Nepenthes)酶的藥物組合物與潛在抗原性食物蛋白質(zhì)的聯(lián)合施用導致對攝入后的抗原食物蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)降低，包括腸中上皮內(nèi)淋巴細胞的浸潤和/或產(chǎn)生的減少。上皮內(nèi)淋巴細胞是散布在大腸和小腸的上皮細胞之間的T細胞。增加的T細胞計數(shù)是炎癥的早期指標，并且與麩質(zhì)不耐受(包括乳糜瀉)潛在相關(guān)。

認為麩質(zhì)蛋白質(zhì)(例如，麥醇溶蛋白和麥谷蛋白)的毒性性質(zhì)主要歸因于在所述蛋白質(zhì)被人消化酶(包括胃蛋白酶)不完全降解期間產(chǎn)生的富含脯氨酸和谷氨酰胺的肽。胃內(nèi)切蛋白酶和胰內(nèi)切蛋白酶不能裂解這些不完全降解的毒性或免疫原性肽副產(chǎn)物，這至少部分歸因于此類酶缺乏對脯氨酸和/或谷氨酰胺的特異性的事實。認為所述肽在敏感個體中引起眾多腸癥狀，包括上皮內(nèi)淋巴細胞增多、絨毛萎縮和/或炎癥。存在于小麥中的其它蛋白質(zhì)也可能與免疫反應(yīng)有關(guān)，包括絲氨酸蛋白酶抑制蛋白、purinin、α-淀粉酶/蛋白酶抑制劑、球蛋白和farinin。

T細胞是敏感個體中對抗原攻擊(即，毒性食物肽的存在)的第一反應(yīng)物。T細胞與抗原攻擊快速反應(yīng)并引起炎癥，并且在一些情況下，引起腸的降解。因此，腸中T細胞的減少指示降低的免疫反應(yīng)，并且是敏感個體中與免疫原性食物(例如，麩質(zhì))食用相關(guān)的癥狀降低或消除的潛在指標。

不受理論的約束，認為使麩質(zhì)(或其它抗原性蛋白質(zhì))與如本文所述的藥物組合物接觸將所述蛋白質(zhì)分解成降低或消除免疫反應(yīng)的小的多肽片段(即，無毒或毒性較小)。

預期如本文所述的藥物組合物可用于降解未被消化道酶有效降解的膳食蛋白質(zhì)，特別是富含脯氨酸和/或谷氨酰胺的蛋白質(zhì)。進一步預期這樣的降解將增加蛋白質(zhì)的吸收和/或降低免疫原性。這樣的結(jié)果可能對腸疾病和病癥(例如，乳糜瀉、麩質(zhì)不耐受、腸易激綜合征、結(jié)腸炎、克羅恩氏病(Crohn's disease)、食物變態(tài)反應(yīng)等)的癥狀具有有益作用。在一個實施方案中，施用所述藥物組合物改進了營養(yǎng)素吸收。

豬籠草(Nepenthes)是一種肉食性瓶狀體植物，在熱帶地區(qū)通常被稱為瓶子草，其瓶狀體分泌物包含多種蛋白酶。濃縮的豬籠草瓶狀體流體對富含脯氨酸和谷氨酰胺的麩質(zhì)肽具有高特異性。美國專利申請公開號2014/0186330和2014/0140980(它們通過引用整體并入本文)描述了濃縮的豬籠草瓶狀體流體和重組豬籠草酶的活性和特異性。瓶狀體流體是酸性的，并且其中的酶通常在酸性pH下活性最高。

豬籠草蛋白酶(EC 3.4.23.12)是可從豬籠草瓶狀體分泌物以及各種其它植物來源分離或濃縮的天冬氨酸蛋白酶。等，Digestive Enzymes Secreted by the Carnivorous Plant Nepenthes macferlanei L.,Planta(Berl.)119,39-46(1974)。已發(fā)現(xiàn)豬籠草蛋白酶的活性高于胃蛋白酶(EC 3.4.23.1)的活性，胃蛋白酶是存在于人胃中的酶，其部分地負責將食物蛋白質(zhì)降解成肽。豬籠草蛋白酶具有兩種已知的同種型：豬籠草蛋白酶I(已知具有兩種變體：豬籠草蛋白酶Ia和豬籠草蛋白酶Ib)和豬籠草蛋白酶II。

在一個方面，本發(fā)明涉及新穎的脯氨酰基內(nèi)肽酶奈普洛森(neprosin)的發(fā)現(xiàn)，該酶具有裂解富含脯氨酸的蛋白質(zhì)和寡肽(如麩質(zhì)蛋白質(zhì))的高蛋白水解活性。奈普洛森可從豬籠草的瓶狀體分泌物中分離或濃縮，在寬的pH范圍下具有活性，并且在低pH(例如，約3至5)下尤其具有活性。奈普洛森蛋白質(zhì)序列與基因組數(shù)據(jù)庫中任何其它已知的蛋白質(zhì)均不同源。奈普洛森可在脯氨酸的羧基(C)-末端側(cè)上有效地裂解肽。此種裂解似乎是高特異性的。

單獨或組合的奈普洛森、豬籠草蛋白酶I和豬籠草蛋白酶II能夠?qū)⒍拘允澄镫牧呀獬筛〉姆嵌拘噪?。由于所述酶在寬的酸性pH范圍下具有活性，因此可在胃的酸性環(huán)境中引發(fā)通過所述酶進行的消化。

本發(fā)明進一步基于以下發(fā)現(xiàn)；當與食物聯(lián)合使用時，此類酶組合物能夠?qū)⑹澄锏鞍踪|(zhì)抗原降解至減弱或消除如通過IEL浸潤測量的腸中的免疫反應(yīng)的水平。由于存在肽類食物抗原所致的IEL浸潤是對食物抗原(例如，麩質(zhì))的敏感性的早期生物指標。因此，在一個方面，本發(fā)明涉及用于減弱或預防哺乳動物的腸中對食物蛋白質(zhì)抗原的免疫反應(yīng)的方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用有效量的包含至少一種豬籠草酶的藥物組合物。在一個實施方案中，至少一種豬籠草酶是豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II、奈普洛森、其變體或其混合物。在一個實施方案中，所述藥物組合物的量為可有效減弱或預防由于存在肽類食物抗原所致的腸的IEL浸潤的量。在一個實施方案中，IEL浸潤歸因于內(nèi)源性胃酶和/或腸酶對潛在抗原性食物蛋白質(zhì)的不完全消化。在一個實施方案中，在攝入潛在抗原性食物或蛋白質(zhì)之前，向哺乳動物施用所述組合物。在一個實施方案中，與攝入潛在抗原性食物或蛋白質(zhì)同時，向哺乳動物施用所述組合物。在一個實施方案中，在攝入潛在抗原性食物或蛋白質(zhì)之后，向哺乳動物施用所述組合物。在一個實施方案中，向哺乳動物施用所述組合物，不論是否食用潛在抗原性食物或蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，潛在抗原性蛋白質(zhì)是麩質(zhì)。在一個實施方案中，潛在抗原性蛋白質(zhì)是一種或多種小麥蛋白質(zhì)。

在一個實施方案中，腸道炎癥的特征在于腸中IEL的浸潤和/或增殖。因此，在一個方面，本發(fā)明涉及用于減弱或預防哺乳動物的腸中由于存在肽類食物抗原所致的腸道炎癥方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用有效量的包含至少一種豬籠草酶的藥物組合物。在一個實施方案中，所述至少一種豬籠草酶是豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II、奈普洛森、其變體或其混合物。在一個實施方案中，所述藥物組合物的量為可有效減弱或預防由于存在肽類食物抗原所致的腸道炎癥的量。在一個實施方案中，腸道炎癥歸因于內(nèi)源性胃酶和/或腸酶對潛在抗原性食物蛋白質(zhì)的不完全消化。在一個實施方案中，在攝入潛在抗原性食物或蛋白質(zhì)之前，向哺乳動物施用所述組合物。在一個實施方案中，與攝入潛在抗原性食物或蛋白質(zhì)同時，向哺乳動物施用所述組合物。在一個實施方案中，在攝入潛在抗原性食物或蛋白質(zhì)之后，向哺乳動物施用所述組合物。在一個實施方案中，向哺乳動物施用所述組合物，不論是否食用潛在抗原性食物或蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，潛在抗原性蛋白質(zhì)是麩質(zhì)。在一個實施方案中，潛在抗原性蛋白質(zhì)是一種或多種小麥蛋白質(zhì)。

在一個方面，本發(fā)明涉及用于減弱或預防哺乳動物的腸中由于存在肽類食物抗原所致的上皮內(nèi)淋巴細胞增多的方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用有效量的包含至少一種豬籠草酶的藥物組合物。在一個實施方案中，所述至少一種豬籠草酶是豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II、奈普洛森、其變體或其混合物。在一個實施方案中，所述藥物組合物的量為可有效抑制腸中的上皮內(nèi)淋巴細胞增多的量。在一個實施方案中，在攝入潛在抗原性食物或蛋白質(zhì)之前，向哺乳動物施用所述組合物。在一個實施方案中，與攝入潛在抗原性食物或蛋白質(zhì)同時，向哺乳動物施用所述組合物。在一個實施方案中，在攝入潛在抗原性食物之后，向哺乳動物施用所述組合物。在一個實施方案中，向哺乳動物施用所述組合物，不論是否食用潛在抗原性食物或蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，潛在抗原性蛋白質(zhì)是麩質(zhì)。在一個實施方案中，潛在抗原性蛋白質(zhì)是一種或多種小麥蛋白質(zhì)。

在一個實施方案中，所述藥物組合物的有效量為約1mg至約1g。在一個實施方案中，所述藥物組合物的有效量取決于所食用的潛在抗原性蛋白質(zhì)的量。

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及治療和/或改善至少一種與患者的腸中對存在麩質(zhì)或其它抗原蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)相關(guān)的癥狀。癥狀包括但不限于“思維混沌”、抑郁癥、焦慮癥、ADHD樣行為、腹痛、腹脹、腹瀉、便秘、頭痛、偏頭痛、骨或關(guān)節(jié)疼痛、慢性疲勞、小腸損傷、產(chǎn)生組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG)抗體、嚴重痤瘡、嘔吐、重量減輕、應(yīng)激性、缺鐵性貧血、關(guān)節(jié)炎、四肢刺麻、不育癥和口腔潰瘍。

在一個方面，本發(fā)明涉及用于減弱或預防哺乳動物的腸中由于存在肽類食物抗原所致的絨毛萎縮的方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用有效量的包含至少一種豬籠草酶的藥物組合物。在一個實施方案中，所述至少一種豬籠草酶是豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II、奈普洛森、其變體或其混合物。在一個實施方案中，通過所述藥物組合物降解潛在抗原性蛋白質(zhì)以抑制腸中的絨毛萎縮。在一個實施方案中，潛在抗原性蛋白質(zhì)是麩質(zhì)。在一個實施方案中，潛在抗原性蛋白質(zhì)是一種或多種小麥蛋白質(zhì)。

在一個方面，本發(fā)明涉及用于降低對肽類食物抗原的T細胞反應(yīng)的方法，所述方法包括使肽類食物抗原與有效量的包含至少一種豬籠草酶的藥物組合物接觸。在一個實施方案中，在將所述抗原降解以降低對所述抗原的T細胞反應(yīng)的條件下，所述至少一種豬籠草酶是豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II、奈普洛森、其變體或其混合物。在一個實施方案中，哺乳動物的腸中的T細胞反應(yīng)降低。在一個實施方案中，所述抗原與所述藥物組合物在哺乳動物的胃中接觸。在一個實施方案中，所述抗原與所述藥物組合物離體接觸。在一個實施方案中，所述抗原是麩質(zhì)。在一個實施方案中，所述抗原是免疫毒性麩質(zhì)蛋白質(zhì)。

在一個方面，本發(fā)明涉及用于減弱或預防患有乳糜瀉患者的腸中由存在部分水解小麥蛋白質(zhì)所引起的乳糜瀉的表現(xiàn)的方法，其包括向所述患者施用有效量的包含至少一種豬籠草酶的藥物組合物。在一個實施方案中，所述至少一種豬籠草酶是豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II、奈普洛森、其變體或其混合物，以減弱或預防乳糜瀉的表現(xiàn)。

在一個方面，本發(fā)明涉及用于改善患有腸病癥的哺乳動物對來自食物的蛋白質(zhì)的消化性的方法，所述方法包括向所述哺乳動物施用有效量的包含至少一種豬籠草酶的藥物組合物。在一個實施方案中，在通過所述藥物組合物降解食物中的蛋白質(zhì)的條件下，所述至少一種豬籠草酶是豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II、奈普洛森、其變體或其混合物。在一個實施方案中，蛋白質(zhì)的降解改善了蛋白質(zhì)在腸中的吸收。在一個實施方案中，所述病癥的至少一種癥狀被減弱或預防。在一個實施方案中，所述腸病癥是克羅恩氏病、腸易激綜合征或結(jié)腸炎。在一個實施方案中，來自食物的蛋白質(zhì)吸收增加。

在一個方面，本發(fā)明涉及用于治療有需要的患者的胰酶不足的方法，其包括向所述患者施用有效量的包含至少一種豬籠草酶的藥物組合物。在一個實施方案中，所述至少一種豬籠草酶是豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II、奈普洛森、其變體和其混合物。在一個實施方案中，施用一種或多種胰酶。一種或多種胰酶可與藥物組合物同時施用，或在不同的時間施用。在一個實施方案中，胰酶是脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶或其混合物。在一個實施方案中，胰酶不足歸因于胰腺炎、囊性纖維化、Shwachman-Bodian-Diamond綜合征、膽結(jié)石、狼瘡、乳糜瀉、胰腺癌或胰腺手術(shù)。在一個實施方案中，胰腺炎是慢性胰腺炎。

在一個實施方案中，從豬籠草植物的瓶狀體流體中濃縮、分離或提取豬籠草酶。在一個實施方案中，豬籠草酶包括重組豬籠草蛋白酶I、重組豬籠草蛋白酶II、重組奈普洛森、其變體或其混合物。

在一個實施方案中，其變體包括氨基酸序列與選自由SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:7、SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:9、SEQ ID NO.:20和SEQ ID NO.:21組成的組的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，其變體包括氨基酸序列與由選自由SEQ ID NO.:2、SEQ ID NO.:4和SEQ ID NO.:14組成的組的cDNA編碼的氨基酸具有至少85％序列同源性的蛋白質(zhì)。

在一個實施方案中，食物是液體。在一個方面，食物是固體。在優(yōu)選的實施方案中，口服施用藥物組合物。

即使在患者堅持嚴格的不含麩質(zhì)的膳食時，也難以避免麩質(zhì)。眾多食物、特別是加工食物被少量麩質(zhì)污染。甚至食用微量麩質(zhì)也可導致乳糜瀉患者的癥狀復發(fā)。其它潛在免疫原性食物也是如此。

在一個實施方案中，施用所述藥物組合物，不論患者是否已攝入(例如，明知地攝入)含有潛在免疫原性蛋白質(zhì)的食物。在一個實施方案中，根據(jù)需要，例如在可能被潛在免疫原性蛋白質(zhì)污染或其中潛在免疫原性蛋白質(zhì)含量未知的用餐之前、期間和/或之后施用所述藥物組合物。在一個實施方案中，定期施用所述藥物組合物。在一個實施方案中，每天施用所述藥物組合物至少一次。在一個實施方案中，每天施用所述藥物組合物兩次、三次、四次或更多次。在一個實施方案中，將所述藥物組合物與每次用餐和/或零食聯(lián)合(例如，在其之前、期間或之后)施用。在一個實施方案中，所述藥物組合物作為持續(xù)釋放制劑的一部分被包括在所述制劑中，所述持續(xù)釋放制劑中存在酶的連續(xù)釋放以允許間歇性吃零食等，而不考慮食物的抗原蛋白質(zhì)含量。

在一個實施方案中，將所述藥物組合物維持在約pH 2的水性體系中，其中所述酶的游離氨基帶電荷。在一個實施方案中，在與胃中的酸接觸之前，將所述組合物維持在中性pH。在一個實施方案中，所述藥物組合物包含藥學上可接受的緩沖劑，使得在與胃中的酸接觸之后，所述組合物的pH保持在pH 5或6。

在一個實施方案中，藥物組合物的有效量為約1mg至約1g。在一個實施方案中，藥物組合物的有效量為每1g底物(例如，麩質(zhì)或其它潛在免疫原性蛋白質(zhì))約1mg至約1g。在一個實施方案中，所述藥物組合物包含豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II、奈普洛森或其變體中的多于一種。

在一個實施方案中，哺乳動物是人。在一個方面，人罹患麩質(zhì)敏感或乳糜瀉。在一個方面，預期腸抗原蛋白質(zhì)敏感與注意缺陷多動障礙、孤獨癥、類風濕性關(guān)節(jié)炎、纖維肌痛和/或皰疹樣皮炎直接或間接相關(guān)。進一步預期使用本發(fā)明的組合物從腸中去除此類抗原性腸蛋白質(zhì)對注意缺陷多動障礙、孤獨癥、類風濕性關(guān)節(jié)炎、纖維肌痛、和/或皰疹樣皮炎具有積極作用。在優(yōu)選的實施方案中，人罹患乳糜瀉。

在一個方面，本發(fā)明涉及包含豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II、奈普洛森、其變體或其混合物的藥物組合物。在優(yōu)選的實施方案中，所述藥物組合物包含奈普洛森或其變體和/或鹽。在又一優(yōu)選的實施方案中，所述藥物組合物還包含至少一種另外的豬籠草酶。在一個實施方案中，所述另外的豬籠草酶包括豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II、其變體和/或其鹽。

不受理論的約束，認為豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II和奈普洛森在中性至堿性pH下活性較低或基本上無活性。在存在由所述酶進行不期望的消化的可能性的情況下，這可能是重要的。例如，在口服施用所述藥物組合物的情況下，將所述組合物緩沖至pH 6.5或更大可產(chǎn)生所述酶的活性較低的形式，使得口腔粘膜、食管粘膜和可與所述組合物接觸的其它細胞將不被其中的酶消化。同樣，當將所述組合物添加至食物中時，在所述食物被食用之前，緩沖酶將不能(或較不能)消化所述食物。在此類情況下，將所述組合物引入胃的酸性環(huán)境中將導致酶的pH和活化的降低。

在一個實施方案中，將所述藥物組合物緩沖至約pH 6.5或更高。在優(yōu)選的實施方案中，將所述組合物緩沖至約pH 6.5至約pH 8.5。在一個實施方案中，所述組合物呈液體形式。在一個實施方案中，所述組合物呈固體形式。在一個實施方案中，將所述組合物的pH以液體形式調(diào)整，并將組合物干燥以形成固體。

在一個實施方案中，所述藥物組合物包含一種或多種另外的蛋白酶。在一個實施方案中，一種或多種另外的蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶。在一個實施方案中，所述藥物組合物包含一種或多種另外的外蛋白酶，如亮氨酸氨肽酶和羧肽酶。在一個實施方案中，一種或多種另外的蛋白酶是胰蛋白酶。在優(yōu)選的實施方案中，一種或多種另外的蛋白酶在酸性pH(例如，pH 2-6)下具有活性。

在一個方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的藥物組合物的制劑，其中所述酶存在于延遲釋放型媒劑中，使得當所述制劑存在于胃中時所述酶連續(xù)釋放。在一個實施方案中，在與胃中的酸接觸之前，所述制劑具有大于約5的pH。在一個實施方案中，所述制劑包含生物學上可接受的緩沖劑，使得在與胃中的酸接觸之后，所述組合物的pH在約pH 5或6下保持至少一段時間。

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及所述藥物組合物的單位劑量制劑。例如且不限于，單位劑量可以片劑、膠囊等存在。單位劑量可呈固體、液體、粉末或任何其它形式。不受理論的約束，預想所述藥物組合物的單位劑量制劑將允許適當?shù)慕o藥(例如，基于免疫原性蛋白質(zhì)的攝入量)，同時避免施用過量的所述組合物的潛在負面副作用。

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及酶原形式的豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II、奈普洛森和/或其變體。在一個實施方案中，前肽存在于所述酶上。在優(yōu)選的實施方案中，通過酸性pH去除所述前肽，由此活化所述酶。在一個實施方案中，所述前肽包含所述酶的天然存在的前肽氨基酸序列。在一個實施方案中，所述前肽是人工前肽或異源(meterologous)前肽(即，來自不同的蛋白質(zhì)和/或物種的酸不穩(wěn)定性前肽)。

附圖簡述

圖1顯示來自奇異豬籠草(Nepenthes mirabilis)(SEQ ID NO.:5)、翼狀豬籠草(Nepenthes alata)(SEQ ID NO.:6)、小豬籠草(Nepenthes gracilis)(SEQ ID NO.:7)、玉米(Zea mays)(SEQ ID NO.:10)和水稻(Oryza sativa)(SEQ ID NO.:11)的豬籠草蛋白酶I以及來自奇異豬籠草(SEQ ID NO.:8)、小豬籠草(SEQ ID NO.:9)、水稻(SEQ ID NO.:12)和玉米(SEQ ID NO.:13)的豬籠草蛋白酶II的蛋白質(zhì)序列的比對。

圖2顯示重組豬籠草蛋白酶蛋白質(zhì)的大小。A：豬籠草蛋白酶I的考馬斯藍染色凝膠。B：酸活化的豬籠草蛋白酶I的MALDI-TOF MS分析。C：豬籠草蛋白酶II的考馬斯藍染色凝膠。D：酸活化的豬籠草蛋白酶II的MALDI-TOF MS分析。

圖3顯示通過MALDI-TOF MS獲得的天然豬籠草蛋白酶I和豬籠草蛋白酶II(從2-3個物種匯集)的大小。

圖4是顯示在用重組豬籠草蛋白酶II、豬籠草提取物或胃蛋白酶消化后麩質(zhì)片段的分子量的考馬斯藍染色凝膠SDS-PAGE凝膠的照片。

圖5A是裝有用胃蛋白酶(40μg)或所示量的重組豬籠草蛋白酶I或重組豬籠草蛋白酶II消化的麩質(zhì)蛋白質(zhì)漿液的小瓶的照片。圖5B是裝有用胃蛋白酶(40μg)或所示量的豬籠草提取物消化的麩質(zhì)蛋白質(zhì)漿液的小瓶的照片。用豬籠草蛋白酶或豬籠草提取物孵育的小瓶不如胃蛋白酶小瓶渾濁，這表明對麩質(zhì)的消化更強烈。

圖6顯示在37℃1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘、130分鐘、360分鐘或810分鐘后，使用LC-MS/MS從用富集的豬籠草流體對來自小麥的麥醇溶蛋白的消化鑒別的所有肽的平均長度。使用對評分的95％置信度截留值(p<0.05)來減少假陽性鑒別。肽長度的相對標準偏差示于插圖中。

圖7展示在37℃消化1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘、130分鐘、360分鐘或810分鐘后通過LC-MS/MS鑒別的按長度分組的肽的數(shù)目。數(shù)據(jù)如圖6中所示。

圖8展示與圖6中相同的數(shù)據(jù)，作為在37℃消化10分鐘、60分鐘、120分鐘、360分鐘或810分鐘后獲得一定長度的累積概率。

圖9顯示所示酶在(A)裂解位點的P1或N-末端側(cè)和(B)裂解位點的P1'或C-末端側(cè)的裂解偏好。每個殘基的左側(cè)條形指示用豬籠草提取物消化，中間條形指示用純化的豬籠草提取物消化，并且右側(cè)條形指示用重組豬籠草蛋白酶I消化。裂解％表示相對于存在的肽的總數(shù)在給定殘基處觀察到的裂解的數(shù)目。從麥醇溶蛋白的消化物獲得數(shù)據(jù)。

圖10顯示豬籠草流體的離子交換純化分布圖。對應(yīng)于奈普洛森和豬籠草蛋白酶的峰以箭頭指示。帶框區(qū)域指示收集的級分。

圖11顯示小鼠在處理過程期間的體重。陰性對照(●)動物未用麥醇溶蛋白激發(fā)。陽性對照(■)動物用通過胃蛋白酶消化的麥醇溶蛋白激發(fā)。處理1(▲)動物用經(jīng)豬籠草提取物消化的麥醇溶蛋白激發(fā)。處理2(▼)動物用經(jīng)重組豬籠草蛋白酶II消化的麥醇溶蛋白激發(fā)。

圖12是被處理小鼠的腸中的CD3-陽性IEL的免疫組織化學的照片。

圖13顯示每個處理組的腸中每100個腸細胞的CD3-陽性上皮內(nèi)淋巴細胞(IEL)的平均數(shù)目。*p<0.05；***p<0.001

圖14顯示每個處理組的絨毛與隱窩的平均比率。

圖15A顯示被奈普洛森消化的麥醇溶蛋白的各部分的取樣，如通過數(shù)據(jù)依賴性LC-MS/MS所檢測。

圖15B顯示在用奈普洛森消化后的麥醇溶蛋白的消化分布圖。句點指示裂解位點。

圖16顯示來自豬籠草屬的不同物種的奈普洛森的氨基酸序列中的多態(tài)性的定位。

具體實施方式

應(yīng)當理解，本發(fā)明不限于所描述的特定實施方案，因為這些當然可以變化。還應(yīng)當理解，本文所用的術(shù)語僅用于描述特定實施方案的目的，而無意進行限定，因為本發(fā)明的范圍將僅受所附權(quán)利要求限制。

本發(fā)明的具體實施方式僅為了讀者的方便而被分成各個部分，并且見于任何部分中的公開均可與另一部分中的公開組合。

I.定義

除非另有定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學術(shù)語均與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的含義相同。雖然類似或等同于本文所述的方法和材料的任何方法和材料均可用于實踐或測試本發(fā)明，但本文中現(xiàn)在描述了優(yōu)選的方法、裝置和材料。本文所引用的所有技術(shù)和專利公開均通過引用整體并入本文。不得將本文中任何內(nèi)容解釋為承認本發(fā)明無權(quán)早于在先發(fā)明的公開內(nèi)容。

除非上下文另有明確規(guī)定，說明書和權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式冠詞“a、an和the”包括復數(shù)個指示物。

如本文所用的術(shù)語“包含”意在指所述組合物和方法包括所記載的要素，但不排除其它。當用于定義組合物和方法時，“基本上由……組成”應(yīng)當意指排除對該組合具有任何重要意義的其它元素。例如，基本上由如本文所定義的要素組成的組合物將不排除不實質(zhì)影響要求保護的本發(fā)明的基本和新穎特征的其它元素?！坝伞M成”應(yīng)當意指排除超過痕量的其它成分和所述的實質(zhì)性方法步驟。由這些過渡術(shù)語中的每一個所限定的實施方案均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

如本文所用的“潛在抗原性食物或蛋白質(zhì)”是可在敏感個體的腸中引起免疫反應(yīng)和/或炎性反應(yīng)的任何食物或蛋白質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，個體是人，并且食物是意在用于人食用的食物。潛在抗原性食物包括但不限于小麥、裸麥、大麥、花生、堅果和種子。在一個實施方案中，來自這些食物的潛在抗原性蛋白質(zhì)包括谷醇溶蛋白蛋白質(zhì)、2S白蛋白、非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)、雙功能α-淀粉酶/蛋白酶抑制劑、大豆疏水蛋白質(zhì)、二氫吲哚、麩質(zhì)、絲氨酸蛋白酶抑制蛋白、purinin、α-淀粉酶/蛋白酶抑制劑、球蛋白和farinin。在優(yōu)選的實施方案中，潛在抗原性蛋白質(zhì)(或肽)富含脯氨酸和/或谷氨酰胺殘基。在尤其優(yōu)選的實施方案中，潛在抗原性蛋白質(zhì)是麩質(zhì)。在另一優(yōu)選的實施方案中，潛在抗原性蛋白質(zhì)是小麥蛋白質(zhì)。

如本文所用的術(shù)語“麩質(zhì)”通常是指存在于小麥或相關(guān)谷物種(包括大麥和裸麥)中的蛋白質(zhì)，其對某些個體具有潛在有害的影響。麩質(zhì)蛋白質(zhì)包括麥醇溶蛋白，如α-麥醇溶蛋白、β-麥醇溶蛋白、γ-麥醇溶蛋白、ω-麥醇溶蛋白(其為單體蛋白質(zhì))；和麥谷蛋白，其為通過二硫鍵保持在一起的高分子量和低分子量亞單位的聚集體的高度非均質(zhì)混合物。許多小麥麩質(zhì)蛋白質(zhì)已被表征。參見例如Woychik等，Amino Acid Composition of Proteins in Wheat Gluten,J.Agric.Food Chem 9(4),307-310(1961)。如本文所用的術(shù)語麩質(zhì)還包括可衍生自來自含有麩質(zhì)的食物的麩質(zhì)蛋白質(zhì)的正常人消化并引起異常的免疫反應(yīng)的寡肽。這些寡肽中的一些對正常消化酶有抗性。認為包括上述蛋白質(zhì)和寡肽的麩質(zhì)在患有麩質(zhì)不耐受(例如，乳糜瀉)的患者中充當T細胞(例如，IEL)的抗原。術(shù)語麩質(zhì)還指變性麩質(zhì)，如將在烘焙產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)的。

如本文所用的術(shù)語“麩質(zhì)敏感和相關(guān)病況”是指源于對麩質(zhì)蛋白質(zhì)或肽的不耐受或敏感的任何病況。這些包括但不限于乳糜瀉(乳糜瀉)、小麥變態(tài)反應(yīng)、麩質(zhì)敏感、麩質(zhì)敏感性腸病、特發(fā)性麩質(zhì)敏感和皰疹樣皮炎。相關(guān)病況還包括但不限于孤獨癥、注意缺陷多動障礙(ADHD)、類風濕性關(guān)節(jié)炎、纖維肌痛、克羅恩氏病、營養(yǎng)素吸收不良和腸易激綜合征(IBS)。

術(shù)語“奈普洛森”是指具有大約29千道爾頓(kDa)的分子量的脯氨酰基內(nèi)切蛋白酶?？蓮呢i籠草屬種的瓶狀體分泌物中分離奈普洛森。奈普洛森以高特異性在脯氨酸的羧基末端裂解蛋白質(zhì)。所述酶在約pH 2至約pH 6下具有活性。在一個實施方案中，奈普洛森具有SEQ ID NO.:1的氨基酸序列。奈普洛森氨基酸序列與任何其它已知的蛋白質(zhì)均不同源。在一個實施方案中，奈普洛森由SEQ ID NO.:2的cDNA序列編碼。在一個實施方案中，奈普洛森包含信號序列。在一個實施方案中，信號序列包含SEQ ID NO.:3的氨基酸序列。在一個實施方案中，奈普洛森不包含信號序列。

奈普洛森包括奈普洛森的所有亞型、同種型和變體、重組奈普洛森和其鹽。鹽是指通過奈普洛森與一種或多種堿、或一種或多種酸形成的那些鹽，其保持了游離奈普洛森的生物學有效性和性質(zhì)，并且不是生物學或其它方面不期望的。衍生自無機堿的鹽包括但不限于鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、錳鹽、鋁鹽等。衍生自有機堿的鹽包括但不限于伯胺鹽、仲胺鹽和叔胺鹽；取代胺，包括天然存在的取代胺；環(huán)狀胺和堿性離子交換樹脂，如異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、2-二乙氨基乙醇、二環(huán)己胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡因、普魯卡因(procaine)、哈胺(hydrabamine)、膽堿、甜菜堿、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可堿、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺樹脂等。可形成鹽的酸包括但不限于無機酸，如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；和有機酸，如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、馬來酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、苦杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸等。

蛋白酶的實例包括但不限于天冬氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。可用于本發(fā)明中的蛋白酶包括但不限于BACE、組織蛋白酶D、組織蛋白酶E、凝乳酶(或“凝乳酵素”)、napsin、胃蛋白酶、瘧原蟲天冬氨酸蛋白酶、早老素、腎素、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(chemotrypsin)、彈性蛋白酶和半胱氨酸內(nèi)切蛋白酶(EP)B2(也被稱為EPB2)。蛋白酶包括描述于例如美國專利號7,320,788、7,303,871、7,320,788、7,628,985、7,910,541和7,943,312；PCT專利公開號2005/107786、2008/115428、2008/115411、2010/021752、2010/042203、2011/097266中的那些，這些專利中的每一個通過引用明確并入本文。在優(yōu)選的實施方案中，至少一種另外的蛋白酶在酸性pH如在胃中發(fā)現(xiàn)的pH(例如，pH 1.5至3.5)下具有活性。

術(shù)語“豬籠草蛋白酶”是指具有酶學委員會編號EC 3.4.23.12的天冬氨酸蛋白酶，并且包括豬籠草蛋白酶的所有亞型、同種型和變體，如豬籠草蛋白酶I和豬籠草蛋白酶II、豬籠草蛋白酶亞型，以及重組豬籠草蛋白酶和其鹽。豬籠草蛋白酶(EC 3.4.23.12)是起源于植物的天冬氨酸蛋白酶，該天冬氨酸蛋白酶可從各種植物來源分離或濃縮，所述植物來源如豬籠草的瓶狀體分泌物，豬籠草是一種食肉瓶狀體植物，在熱帶地區(qū)通常被稱為瓶子草。豬籠草蛋白酶詳細描述于2013年3月15日提交的美國專利申請序列號13/843,369中，該美國專利申請通過引用整體并入本文。已知豬籠草蛋白酶蛋白質(zhì)序列(和推定的豬籠草蛋白酶蛋白質(zhì)序列)的序列比對示于圖1中。

在一個實施方案中，“有效量”是指使受試者的癥狀得到抑制或改善或產(chǎn)生期望的生物學結(jié)局(例如，改進的臨床體征、疾病的延遲發(fā)作等)的組合物的量。有效量可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定。所選劑量水平可取決于所治療病況的嚴重性以及所治療哺乳動物的病況和先前醫(yī)療史。然而，在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)，以低于實現(xiàn)期望的治療作用所需的水平開始組合物的劑量，并逐漸增加劑量直至達到期望的作用。

術(shù)語“乳糜瀉的表現(xiàn)”是指乳糜瀉的任何癥狀或臨床呈現(xiàn)，此類表現(xiàn)包括但不限于腸道炎癥、“思維混沌”、抑郁癥、焦慮癥、ADHD樣行為、腹痛、腹脹、腹瀉、便秘、頭痛、偏頭痛、骨或關(guān)節(jié)疼痛、慢性疲勞、小腸損傷、組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG)抗體的產(chǎn)生、嚴重痤瘡、嘔吐、重量減輕、應(yīng)激性、缺鐵性貧血、關(guān)節(jié)炎、四肢刺麻、不育癥和口腔潰瘍。表現(xiàn)進一步包括具有隱窩增生的小腸粘膜絨毛萎縮、腸粘膜炎癥、營養(yǎng)素吸收不良、腹脹，以及大大提高的發(fā)生骨質(zhì)疏松癥和腸惡性腫瘤(淋巴瘤和癌瘤)的風險。

如本文所用的“同時施用”或“共治療”包括將試劑一起或在彼此之前或之后施用。

術(shù)語“調(diào)節(jié)”、“減弱”或“改善”意指對受試者如哺乳動物的疾病或病癥的任何治療，其包括：

·預防或防御疾病或病癥，即，使異常的生物反應(yīng)或癥狀不發(fā)展；

·抑制疾病或病癥，即，阻止或阻抑異常的生物反應(yīng)和/或臨床癥狀的發(fā)展；和/或

·緩解疾病或病癥，即，使異常的生物反應(yīng)和/或癥狀消退。

如本文所用的術(shù)語“預防”或“抑制”是指對有需要的受試者的預防性治療。所述預防性治療可通過向處于罹患疾病的風險中的受試者提供適當劑量的治療劑來實現(xiàn)，由此基本上防止所述疾病的發(fā)作。

如本文所用的術(shù)語“病況”是指對其使用本文所提供的化合物、組合物和方法的疾病狀態(tài)。

如本文所用的術(shù)語“患者”或“受試者”是指哺乳動物，并且包括人和非人哺乳動物。在本文的特定實施方案中，患者或受試者是人。

在數(shù)值之前使用的術(shù)語“約”指示該值可在合理的范圍內(nèi)變化：±5％、±1％或±0.2％。

與另一序列具有一定百分比(例如，80％、85％、90％或95％)的“序列同一性”的多核苷酸或多核苷酸區(qū)域(或多肽或多肽區(qū)域)意指在比對時，該百分比的堿基(或氨基酸)在這兩個序列的比較中是相同的。比對和百分比同源性或序列同一性可使用本領(lǐng)域內(nèi)已知的軟件程序來確定，所述程序例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等編輯，1987)增刊30，第7.7.18部分，表7.7.1中所述的那些。優(yōu)選地，將默認參數(shù)用于比對。一個比對程序是BLAST，其使用默認參數(shù)。所述程序的實例包括BLASTN和BLASTP，其使用以下默認參數(shù)：遺傳密碼＝標準；過濾器＝無；鏈＝兩者；截留值＝60；期望值＝10；矩陣＝BLOSUM62；描述＝50個序列；排序方式＝高評分；數(shù)據(jù)庫＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻譯+Swiss蛋白質(zhì)+SPupdate+PIR。這些程序的細節(jié)可見于以下網(wǎng)絡(luò)地址：ncbi.nlm.mh.gov/cgi-bin/BLAST。

“同源性”或“同一性”或“相似性”是指兩個肽之間或兩個核酸分子之間的序列相似性。同源性可通過比較每個序列中可出于比較目的進行比對的位置來確定。當被比較序列中的位置被相同堿基或氨基酸占據(jù)時，所述分子在該位置是同源的。序列之間的同源性程度隨所述序列所共有的匹配或同源位置的數(shù)目而變化。“無關(guān)”或“非同源”序列與本公開的序列之一共有小于40％的同一性，或者小于25％的同一性。

II.方法

在一個方面，本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)患者的由麩質(zhì)不耐受介導的病況的方法，其包括向所述患者施用有效量的包含豬籠草酶的藥物組合物。在優(yōu)選的實施方案中，所述病況是乳糜瀉或小麥變態(tài)反應(yīng)。

在另一方面，本發(fā)明涉及用于減弱或預防由于哺乳動物的腸中存在肽類食物抗原而在腸中產(chǎn)生和/或募集IEL的方法。在一個實施方案中，所述方法包括向哺乳動物施用有效量的包含豬籠草酶的藥物組合物。在一個實施方案中，通過所述藥物組合物降解麩質(zhì)蛋白質(zhì)以減弱或預防腸中產(chǎn)生和/或募集IEL。

在一個方面，本發(fā)明涉及用于減弱或預防由于哺乳動物的腸中存在肽類食物抗原所致的腸道炎癥的方法。在一個實施方案中，所述方法包括向哺乳動物施用有效量的包含豬籠草酶的藥物組合物。在一個實施方案中，通過所述酶降解肽類食物抗原以減弱或預防腸道炎癥。

在一個方面，本發(fā)明涉及用于減弱或預防由于哺乳動物的腸中存在肽類食物抗原所致的上皮內(nèi)淋巴細胞增多的方法。在一個實施方案中，所述方法包括向哺乳動物施用有效量的包含豬籠草酶的藥物組合物。在一個實施方案中，通過所述藥物組合物降解肽類食物抗原以減弱或預防腸中的上皮內(nèi)淋巴細胞增多。

在一方面，本發(fā)明涉及用于減弱或預防由于哺乳動物的腸中存在肽類食物抗原所致的絨毛萎縮的方法。在一個實施方案中，所述方法包括向哺乳動物施用有效量的包含豬籠草酶的藥物組合物。在一個實施方案中，通過所述藥物組合物降解肽類食物抗原以減弱或預防腸中的絨毛萎縮。在一個實施方案中，絨毛萎縮是由于腸的炎癥所致。

在一個實施方案中，豬籠草酶是豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II、奈普洛森、其變體或其混合物。在優(yōu)選的實施方案中，藥物制劑是持續(xù)釋放型制劑。

在一個實施方案中，所述變體是具有與SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:7、SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:9、SEQ ID N0.:20或SEQ ID NO.:21的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，所述變體是具有與SEQ ID NO.:1的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，所述變體是具有與SEQ ID NO.:5的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，所述變體是具有與SEQ ID NO.:6的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，所述變體是具有與SEQ ID NO.:7的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，所述變體是具有與SEQ ID NO.:8的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，所述變體是具有與SEQ ID NO.:9的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，所述變體是具有與SEQ ID NO.:20的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，所述變體是具有與SEQ ID NO.:21的氨基酸序列具有至少85％序列同源性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。

在一個實施方案中，所述藥物組合物包含豬籠草瓶狀體流體的提取物。在一個實施方案中，所述藥物組合物包含從豬籠草瓶狀體流體的提取物純化的豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II和/或奈普洛森。在一個實施方案中，豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II、奈普洛森或其變體中的至少一種是重組蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，在施用之前，所述藥物組合物為約pH 5至約pH 8。用于本文所述的方法的藥物組合物更詳細地論述于下文。

在優(yōu)選的實施方案中，哺乳動物是人。在一個實施方案中，人罹患選自由麩質(zhì)不耐受、乳糜瀉、注意缺陷多動障礙、孤獨癥、類風濕性關(guān)節(jié)炎、纖維肌痛和皰疹樣皮炎組成的組的疾病。在一個實施方案中，人罹患食物變態(tài)反應(yīng)。

在一個實施方案中，在食用含麩質(zhì)食物之前、期間或之后立即口服施用所述藥物組合物。

在一些實施方案中，在受試者攝入包含麩質(zhì)或疑似包含麩質(zhì)的食物之前，向所述受試者施用所述藥物組合物。在一些實施方案中，在所述酶在降解受試者將攝入的食物中的麩質(zhì)方面至少部分有效(例如，至少約10％、20％、50％、70％、90％的原始活性)的時段內(nèi)施用所述藥物組合物。在一些實施方案中，在受試者攝入食物之前不超過約4小時、3小時、2小時、1小時或30分鐘，施用所述藥物組合物。

在一些實施方案中，與受試者攝入潛在免疫原性食物同時，向所述受試者施用所述藥物組合物。在一些實施方案中，將酶組合物與食物一起施用。在一些實施方案中，將所述藥物組合物與食物分開施用。

在一些實施方案中，在受試者攝入潛在免疫原性食物之后不久，向所述受試者施用所述藥物組合物。在一些實施方案中，在食物中至少一部分(例如，至少約10％、20％、50％、70％、90％)抗原仍在受試者的胃中的時段內(nèi)施用所述藥物組合物。在一些實施方案中，在受試者攝入食物之后不超過4小時、3小時、2小時、1小時或30分鐘，施用所述藥物組合物。

通常，以安全且足以產(chǎn)生將肽類食物抗原解毒的期望作用的量施用所述藥物組合物。所述藥物組合物的劑量可取決于許多因素而變化，如所施用的特定酶、受試者對食物的敏感性、所攝入的含抗原食物的量和類型、酶的藥物效應(yīng)動力學性質(zhì)、施用方式、接受者的年齡、健康和體重、癥狀的性質(zhì)和程度、治療的頻率和同時治療的類型(如果有的話)以及酶的清除率。本領(lǐng)域技術(shù)人員可基于上述因素確定適當?shù)膭┝俊Ｋ鼋M合物可以最初以可根據(jù)需要調(diào)整的適合劑量施用，這取決于臨床反應(yīng)。體外測定可任選地用于幫助鑒別最佳的劑量范圍。待用于制劑中的精確劑量還將取決于施用途徑和/或疾病或病癥的嚴重性，并且應(yīng)當根據(jù)醫(yī)師的判斷和每個受試者的情況來決定。

成年受試者的劑量或給藥方案可針對兒童和嬰兒按比例調(diào)整，并且還針對其它施用或其它形式，與例如分子量或免疫反應(yīng)按比例調(diào)整?？稍卺t(yī)生的決定下以適當?shù)拈g隔重復施用或治療。

通常，當需要時，如當受試者將要或正在食用或已經(jīng)食用包含抗原性蛋白質(zhì)或疑似包含抗原性蛋白質(zhì)的食物時，施用所述藥物組合物。在任何情況下，對于普通人，其可以每天每千克體重約0.001mg至約1000mg酶、或每劑量約1mg至約100g的劑量施用。在一些實施方案中，所述酶可以每天0.001、0.01、0.1、1、5、10、50、100、500或1000mg/kg體重、以及這些值中的任何兩個之間的范圍(包括端點)施用。在一些實施方案中，所述酶可以每劑量1mg、10mg、100mg、200mg、500mg、700mg、1g、10g、20g、50g、70g、100g、以及這些值中的任何兩個之間的范圍(包括端點)施用。在一些實施方案中，取決于受試者攝入包含抗原性蛋白質(zhì)的食物的次數(shù)和/或食用此類食物的量，其可以一天施用一次、兩次、三次等。本文所述的酶的量可涉及所述組合物中的全部酶或每種酶。

在一些實施方案中，所施用的藥物組合物的量(或近似量)取決于食用/待食用的底物(例如，麩質(zhì)和/或其它蛋白質(zhì)或潛在抗原性蛋白質(zhì))的量。在一個實施方案中，每1g底物施用約1mg至約1g的酶。在一個實施方案中，每1g底物施用約5mg至約1g的酶。在一個實施方案中，每1g底物施用約10mg至約1g的酶。在一個實施方案中，每1g底物施用約100mg至約1g的酶。在一個實施方案中，每1g底物施用約1mg至約500mg的酶。在一個實施方案中，每1g底物施用約1mg至約250mg的酶。在一個實施方案中，每1g底物施用約1mg至約100mg的酶。在一個實施方案中，每1g底物施用約1mg至約10mg的酶。這包括這些范圍內(nèi)的任何值(包括端點)，以及這些值中的任兩個之間的子范圍。

在一個實施方案中，底物與施用的酶的比率為約1:1至約10000:1。在優(yōu)選的實施方案中，底物與酶的比率為約10:1至約1000:1。在一個實施方案中，底物與酶的比率為約10:1至約100:1。

本發(fā)明的藥物組合物可作為唯一的活性劑施用，或它們可與其它試劑聯(lián)合(同時、依序或分開，或通過共配制)施用，所述試劑包括表現(xiàn)出相同或類似的治療活性并且被確定為對于此類聯(lián)合施用安全且有效的其它化合物。

在一些實施方案中，將所述藥物組合物與另外的酶如胃部蛋白酶(gastric protease)、天冬氨酸蛋白酶(如胃蛋白酶、胃蛋白酶原或由Chen等，Aspartic proteases gene family in rice:Gene structure and expression,predicted protein features and phylogenetic relation,Gene 442:108-118(2009)描述的那些)以及酶如另一脯氨?；鶅?nèi)肽酶(PEP)、二肽基肽酶IV(DPP IV)和二肽基羧肽酶(DCP)或半胱氨酸蛋白酶B(描述于美國專利號7,910,541中)一起施用。在一個實施方案中，另一酶以產(chǎn)生和/或分泌另外的酶的細菌的形式被施用。在一個實施方案中，所述細菌被工程化以產(chǎn)生和/或分泌豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II、奈普洛森和/或其變體。

在一些實施方案中，向受試者施用所述藥物組合物與另一試劑?？膳c所述藥物組合物一同施用的試劑的非限制性實例包括組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶抑制劑、抗炎劑如淀粉酶、葡糖淀粉酶、內(nèi)肽酶、HMG-CoA還原酶抑制劑(例如，康帕丁(compactin)、洛伐他汀(lovastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、普伐他汀(pravastatin)和阿托伐他汀(atorvastatin))、白三烯受體拮抗劑(例如，孟魯司特(montelukast)和扎魯司特(zafirlukast))、COX-2抑制劑(例如，塞來昔布(celecoxib)和羅非昔布(rofecoxib))、p38MAP激酶抑制劑(例如，BIRB-796)；肥大細胞-穩(wěn)定劑如色甘酸鈉(chromolyn)、吡嘧司特(pemirolast)、普昔羅米(proxicromil)、瑞吡司特(repirinast)、硫蒽唑(doxantrazole)、氨來呫諾(amlexanox)、奈多羅米(nedocromil)和普克羅米(probicromil)、抗?jié)儎?、抗變態(tài)反應(yīng)劑如抗組胺劑(例如，阿伐斯汀(acrivastine)、西替利嗪(cetirizine)、地氯雷他定(desloratadine)、依巴斯汀(ebastine)、非索非那定(fexofenadine)、左西替利嗪(levocetirizine)、氯雷他定(loratadine)和咪唑斯汀(mizolastine))、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2(TG2)抑制劑、抗-TNFα劑和抗生素。在一個實施方案中，另外的試劑是益生菌。益生菌包括但不限于乳桿菌屬(lactobacillus)、酵母菌、芽孢桿菌屬(bacillus)或雙歧桿菌屬(bifidobacterium)的種和菌株。在一個實施方案中，另一試劑是彈性蛋白酶抑制劑。在一個實施方案中，另一試劑以產(chǎn)生和/或分泌另外的試劑的細菌的形式被施用。

在一些實施方案中，另一試劑包括在腸中具有活性的酶(例如，蛋白酶)。不受限于理論，認為此類酶可與所述藥物組合物的酶協(xié)同作用以進一步降解免疫原性蛋白質(zhì)。

本文還提供了包含豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II、奈普洛森、其變體和/或其鹽的酶組合物在制造用于治療或預防上述病況和疾病中的一種的藥物中的應(yīng)用。

III.藥物組合物

所述藥物組合物可單獨或與適當?shù)乃帉W上可接受的載劑、賦形劑或稀釋劑以各種組合物的形式施用。

因此，在另一方面，本文提供了包含豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II、奈普洛森、其變體和/或其鹽的組合物。在一些實施方案中，所述組合物是藥物組合物。所述組合物可被配制成固體、半固體或液體形式，如片劑、膠囊、粉末、顆粒、軟膏、溶液、注射劑、凝膠和微球。所述組合物的施用可以各種方式實現(xiàn)，例如通過口服施用。

在一些實施方案中，所述藥物組合物包含治療有效量的豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II、奈普洛森、其變體或其混合物和藥學上可接受的載劑。在特定的實施方案中，術(shù)語“藥學上可接受的”意指獲得聯(lián)邦、州政府的管理機構(gòu)批準或列示于美國藥典或另一公認藥典中用于動物且更特別地用于人。術(shù)語“載劑”是指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑。此類藥物載劑可以是無菌的液體，如水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的以那些，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。還可采用鹽水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液作為液體載劑。

適合的藥物賦形劑包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、二氧化硅凝膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果期望的話，所述組合物還可含有少量潤濕劑或乳化劑或pH緩沖劑。這些組合物可呈溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、粉末、持續(xù)釋放型制劑等的形式。適合的藥物載劑的實例描述于E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中，該文獻通過引用整體并入本文。此類組合物將含有治療有效量的優(yōu)選呈純化形式的酶，以及適合量的載劑，以向受試者提供適當施用的形式。制劑應(yīng)適合施用方式。

對于口服施用來說，所述藥物組合物可單獨或與適當?shù)奶砑觿┙M合用于制備片劑、粉末、顆粒、膠囊、糖漿、液體、懸浮液等。例如，可利用常規(guī)的添加劑、崩解劑、潤滑劑、稀釋劑、緩沖劑、濕潤劑、防腐劑和調(diào)味劑來制備所述組合物的固體口服形式。賦形劑的非限制性實例包括乳糖、甘露醇、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、微晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯膠、玉米淀粉、羧甲基纖維素鈉、滑石、硬脂酸鎂、調(diào)味劑和著色劑。在一些實施方案中，所述制劑在受試者的胃中釋放酶，使得肽類食物抗原可被所述酶降解。

可任選地在適當?shù)木彌_劑(例如磷酸鹽、檸檬酸鹽、組氨酸、咪唑緩沖液)和賦形劑(例如冷凍保護劑如蔗糖、乳糖、海藻糖)存在下，從水溶液中凍干所述組合物。凍干餅可任選地與賦形劑共混并制成不同的形式。

在另一方面，本文提供用于治療有需要的患者的麩質(zhì)不耐受或相關(guān)病況(如乳糜瀉、小麥變態(tài)反應(yīng)、麩質(zhì)敏感和皰疹樣皮炎)的方法，其包括在被患者食用之前，用有效量的所述組合物處理包含麩質(zhì)或疑似包含麩質(zhì)的食物。在一些實施方案中，在食物制備期間，將其與有效量的所述組合物組合。在一個實施方案中，在食物制備中的任何加熱步驟之后添加所述組合物。在一個實施方案中，在食物制備中的一個或多個加熱步驟之前添加所述組合物。

豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II和奈普洛森在活化前作為酶原存在于豬籠草中。即，所述蛋白質(zhì)包括被裂解以活化瓶狀體流體中的酶的前肽。在一個實施方案中，所述組合物包含豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II、奈普洛森、其變體和/或其鹽，包含前肽。在一個實施方案中，所述前肽與所述酶的N末端相鄰。在一個實施方案中，所述前肽是所述酶的天然存在的前肽。在一個實施方案中，所述前肽是異源前肽(例如，來自不同的蛋白質(zhì)或物種，或合成的)。在一個實施方案中，所述前肽被酸性條件裂解。在一個實施方案中，所述前肽被酶裂解。在一個實施方案中，所述前肽的存在導致所述酶在胃中的活性延遲(例如，歸因于去除所述前肽和產(chǎn)生成熟酶所需的時間)。在一個實施方案中，所述前肽被工程化以更緩慢地被去除以延遲所述酶在胃中的活性。在一個實施方案中，所述前肽被工程化以更快速地地被去除以加速所述酶在胃中的活性。

在優(yōu)選的實施方案中，所述制劑是受控釋放型制劑。術(shù)語“受控釋放型制劑”包括持續(xù)釋放型制劑和延時釋放型制劑。受控釋放型制劑是本領(lǐng)域所熟知的。這些包括允許藥物的持續(xù)釋放、周期性釋放、脈沖釋放或延遲釋放的賦形劑。受控釋放型制劑包括但不限于將藥物包埋至基質(zhì)中；腸溶包衣；微囊包封；凝膠和水凝膠；和允許藥物的受控釋放的任何其它制劑。

在一些實施方案中，所述組合物作為食物添加劑與包含或疑似包含潛在抗原性食物蛋白質(zhì)的食物一起施用。在一個實施方案中，所述食物包含或疑似包含麩質(zhì)，例如由小麥、裸麥和大麥等制成的面包、意大利面、谷物等。在一些實施方案中，所述組合物作為此類食物中的成分被添加。在一些實施方案中，在食用食物之前，任選地在所述組合物無活性的pH(如約5或高于5的pH)下，將所述組合物分散至食物中。在一些實施方案中，所述組合物可被制成或并入粉末、涂抹料、噴霧劑、調(diào)味醬、蘸醬、攪打奶油等中，當食物正在被患者食用時，其可被施加至食物。在一些實施方案中，所述組合物可被制成引起人食欲的形式，如糖果、口香糖、膳食補充劑咀嚼物、糖漿等，以易于施用。在一些實施方案中，所述組合物可與常見的食品混合，如糖、鹽、色拉調(diào)味汁、香料、奶酪、黃油、人造黃油、涂抹料、黃油、油煎起酥油、蛋黃醬、乳制品、堅果黃油、種子醬、果仁醬、花生醬等。優(yōu)選地，包含所述組合物的食品或添加劑無需在被患者攝入之前加熱，使得可將由于升高溫度所致酶的活性的可能損失最小化。

在一個實施方案中，所述組合物中的酶在與酸(即，在胃中)接觸后被活化。

在另一方面，本文提供包含奈普洛森、豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II、其變體或其組合的食物產(chǎn)品。在一些實施方案中，食物產(chǎn)品包含麩質(zhì)或疑似包含麩質(zhì)，如由小麥、裸麥和大麥制成的焙烤產(chǎn)品(例如，蛋糕、松餅、炸面圈、酥皮糕點、卷狀物和面包)、意大利面食、薄脆餅干、脆玉米片、谷物等。在一些實施方案中，所述食物產(chǎn)品可與包含麩質(zhì)或疑似包含麩質(zhì)的另一食物產(chǎn)品一起食用。此類食物的非限制性實例包括粉末、涂抹料、噴霧劑、調(diào)味醬、蘸醬、攪打奶油、糖果、口香糖、糖漿、糖、鹽、色拉調(diào)味汁、香料、奶酪、黃油、人造黃油、涂抹料、黃油、油煎起酥油、蛋黃醬、乳制品、堅果黃油、種子醬、果仁醬、花生醬等。

在一些實施方案中，將包含奈普洛森、豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II、其變體或其組合的組合物與食物混合，或用于預處理含有麩質(zhì)的食品。存在于食物中的組合物可具有酶活性以降低在攝入之前或期間食物中麩質(zhì)的水平。

在本發(fā)明的一個方面，在食用食物之前，將包含奈普洛森、豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II、其變體或其組合的組合物添加至食物中。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含內(nèi)部賦形劑和有效量的藥物組合物的分配器，其用以消化麩質(zhì)。在一個實施方案中，在食用食物之前，將所述藥物組合物和/或內(nèi)部賦形劑添加至食物中。在一個實施方案中，所述食物包含麩質(zhì)或疑似包含麩質(zhì)。在一個實施方案中，所述內(nèi)部賦形劑包含氯化鈉或碘化鈉或其混合物。在一個實施方案中，所述藥物組合物和/或內(nèi)部賦形劑呈大小適于從所述分配器中有效地分配的顆粒形式。

在一些實施方案中，所述組合物(如藥物組合物或可食用組合物)或食物產(chǎn)品包含約0.1％至約99％、約0.5％至約95％、約1％至約95％、約5％至約95％、約10％至約90％、約20％至約80％、約25％至約75％的所述酶。在一些實施方案中，所述組合物(如藥物組合物或可食用組合物)或食物產(chǎn)品中的酶的量是總組合物或食物產(chǎn)品的約0.01％、約0.1％、約0.5％、約1％、約5％、約10％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％或約95％、或所述值中的任何兩個之間的范圍(包括端點)。

在一些實施方案中，所述組合物包含奈普洛森和豬籠草蛋白酶或其變體。在一些實施方案中，豬籠草蛋白酶是豬籠草蛋白酶I和/或豬籠草蛋白酶II或其變體。在一些實施方案中，豬籠草蛋白酶是重組豬籠草蛋白酶I和/或重組豬籠草蛋白酶II或其變體。在一些實施方案中，豬籠草蛋白酶是重組豬籠草蛋白酶I和重組豬籠草蛋白酶II或其各自的變體。在一些實施方案中，奈普洛森是重組奈普洛森或其變體。在優(yōu)選的實施方案中，所述組合物包含豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II和/或奈普洛森，其包含來自豬籠草屬種的豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II和/或奈普洛森或其變體的氨基酸序列。

已從若干豬籠草屬種(例如，奇異豬籠草(GenBank登記號JX494401)、小豬籠草(GenBank登記號AB114914)和翼狀豬籠草(GenBank登記號AB266803))中描述豬籠草蛋白酶I mRNA/cDNA序列。已從若干豬籠草屬種(例如，奇異豬籠草(GenBank登記號JX494402)和小豬籠草(GenBank登記號AB114915))中描述豬籠草蛋白酶II mRNA/cDNA序列。

已從若干豬籠草屬種(例如，奇異豬籠草(GenBank登記號AFV26024；SEQ ID NO.:5)、小豬籠草(GenBank登記號BAD07474；SEQ ID NO.:7)和翼狀豬籠草(GenBank登記號BAF98915；SEQ ID NO.:6))中描述豬籠草蛋白酶I蛋白質(zhì)序列。已從若干豬籠草屬種(例如，奇異豬籠草(GenBank登記號AFV26025；SEQ ID NO.:8)和小豬籠草(GenBank登記號BAD07475；SEQ ID NO.:9))中描述豬籠草蛋白酶II蛋白質(zhì)序列。所述序列還見于美國專利申請公開號2014/0186330，該美國專利申請通過引入整體并入本文。

由本文所提供的GenBank登記號表示的每個序列均通過引用整體并入本文。

在一些實施方案中，豬籠草蛋白酶是與豬籠草蛋白酶I的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:7或SEQ ID NO.:21)具有至少約85％序列同源性的豬籠草蛋白酶變體。在一些實施方案中，所述變體與豬籠草蛋白酶I的氨基酸序列具有至少約90％序列同源性。在一些實施方案中，所述變體與豬籠草蛋白酶I的氨基酸序列具有至少約95％序列同源性。在一些實施方案中，所述變體與豬籠草蛋白酶I的氨基酸序列具有至少約96％序列同源性。在一些實施方案中，所述變體與豬籠草蛋白酶I的氨基酸序列具有至少約97％序列同源性。在一些實施方案中，所述變體與豬籠草蛋白酶I的氨基酸序列具有至少約98％序列同源性。在一些實施方案中，所述變體與豬籠草蛋白酶I的氨基酸序列具有至少約99％序列同源性。在一個實施方案中，豬籠草蛋白酶包含SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:7或SEQ ID NO.:21的氨基酸序列。

在一些實施方案中，豬籠草蛋白酶是與豬籠草蛋白酶II的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:9或SEQ ID NO.:22)具有至少約85％序列同源性的豬籠草蛋白酶變體。在一些實施方案中，所述變體與豬籠草蛋白酶II的氨基酸序列具有至少約90％序列同源性。在一些實施方案中，所述變體與豬籠草蛋白酶II的氨基酸序列具有至少約95％序列同源性。在一些實施方案中，所述變體與豬籠草蛋白酶II的氨基酸序列具有至少約96％序列同源性。在一些實施方案中，所述變體與豬籠草蛋白酶II的氨基酸序列具有至少約97％序列同源性。在一些實施方案中，所述變體與豬籠草蛋白酶II的氨基酸序列具有至少約98％序列同源性。在一些實施方案中，所述變體與豬籠草蛋白酶II的氨基酸序列具有至少約99％序列同源性。在一個實施方案中，豬籠草蛋白酶包含SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:9或SEQ ID NO.:22的氨基酸序列。

在本發(fā)明的一個方面，所述組合物中的奈普洛森與豬籠草蛋白酶I和/或II的比率使得肽類食物抗原被裂解成足夠小和/或無害的片段，以預防受試者的腸中的麩質(zhì)不耐受、乳糜瀉、小麥變態(tài)反應(yīng)、或皰疹樣皮炎、炎癥、IEL增殖或募集、上皮內(nèi)淋巴細胞增多、和/或絨毛萎縮、或其任何癥狀。在一些實施方案中，奈普洛森：豬籠草蛋白酶的比率為約1:100至約100:1。

在一些實施方案中，所述組合物包含至少約100:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶(豬籠草蛋白酶I和/或II)。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約90:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約70:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約60:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約50:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約40:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約30:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約20:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約10:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約5:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約4:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約3:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約2:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:2的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:3的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:4的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:5的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:10的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:20的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:30的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:40的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:50的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:60的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:70的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:80的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:90的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:100的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。

在本發(fā)明的一個方面，所述組合物中的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II的比率使得肽類食物抗原被裂解成足夠小和/或無害的片段，以預防受試者的腸中的炎癥、IEL增殖或募集、上皮內(nèi)淋巴細胞增多和/或絨毛萎縮。在一些實施方案中，豬籠草蛋白酶I：豬籠草蛋白酶II的比率為約1:100至約100:1。

在一些實施方案中，所述組合物包含至少約100:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約90:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約70:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約60:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約50:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約40:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約30:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約20:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約10:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約5:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約4:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約3:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約2:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:2的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:3的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:4的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:5的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:10的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:20的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:30的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:40的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:50的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:60的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:70的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:80的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:90的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述組合物包含至少約1:100的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。

IV.制備方法

預期豬籠草蛋白酶和/或奈普洛森可通過本領(lǐng)域已知的方法濃縮(或提取)或純化，所述方法例如(但不限于)過濾或基于來自天然來源的固定化胃蛋白酶抑制劑的親和純化，所述天然來源包括諸如豬籠草的植物的瓶狀體分泌物。經(jīng)典的蛋白質(zhì)色譜，如尺寸排阻色譜(也被稱為凝膠滲透色譜)和/或色譜聚焦色譜也可用于濃縮(或提取)或純化豬籠草蛋白酶和/或奈普洛森?？稍诔叽缗抛柚盎蛑笫褂蒙V聚焦。豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II和奈普洛森以相對少量存在于天然植物分泌物中。例如可使用產(chǎn)生表達和/或分泌增加量的期望的酶或其變體的轉(zhuǎn)基因植物的生物工程技術(shù)來增加豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II和/或奈普洛森的產(chǎn)量。

除了從植物來源分離之外，豬籠草酶或其變體還可通過化學合成制備?；瘜W合成可根據(jù)期望的酶或變體的序列通過氨基酸的偶合來實現(xiàn)。各種肽偶合方法和商業(yè)肽合成設(shè)備可用于合成肽或蛋白質(zhì)，例如，Applied Biosystems公司(Foster City,Calif.)、Beckman和其它制造商的自動化合成器。

在另一方面，本文提供了使用重組產(chǎn)生系統(tǒng)通過以下方式來制備豬籠草酶或其變體的方法：用所述酶的DNA(例如，cDNA)和/或信使RNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細胞而使得所述細胞能夠產(chǎn)生所述酶。例如，可通過在生物體如大腸桿菌(Escherichia coli)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、乳桿菌、芽孢桿菌、曲霉(Aspergilli)和植物細胞培養(yǎng)物如煙草細胞等中建立宿主-載體系統(tǒng)來產(chǎn)生豬籠草蛋白酶。

本文還提供了包含多核苷酸的載體和宿主細胞如大腸桿菌以及含有如本文所述的任何多核苷酸或多肽的組合物。

在另一方面，本文提供了用于產(chǎn)生重組豬籠草酶(豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II和/或奈普洛森或其變體)的方法，其包括在所選宿主生物體中表達編碼所述酶的核酸序列，和將所述核酸序列插入適當設(shè)計的載體中。在一個方面，所述重組酶是豬籠草蛋白酶I或其變體。在一個方面，所述重組酶是豬籠草蛋白酶II或其變體。在一個方面，所述重組酶是奈普洛森或其變體。在一個方面，所述重組酶是豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II和/或奈普洛森或其變體的混合物。

在另一方面，本文提供了包含重組豬籠草蛋白酶如豬籠草蛋白酶I和/或豬籠草蛋白酶II或其變體的組合物。在一個方面，所述重組豬籠草蛋白酶是豬籠草蛋白酶I或其變體。在一個方面，所述重組豬籠草蛋白酶是豬籠草蛋白酶II或其變體。在一個方面，所述重組豬籠草蛋白酶是豬籠草蛋白酶I和豬籠草蛋白酶II或其變體的混合物。

在一個方面，本發(fā)明涉及如本文所述的cDNA。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含如本文所述的cDNA的載體。在優(yōu)選的實施方案中，所述載體是表達載體。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及表達重組豬籠草蛋白酶I、重組豬籠草蛋白酶II、重組奈普洛、其變體或混合物的細胞。

在一些實施方案中，豬籠草酶的生物合成可通過用包含編碼豬籠草蛋白酶I的cDNA(例如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.:6、GenBank登記號JX494401、GenBank登記號AB114914或GenBank登記號AB266803的核苷酸序列)的載體轉(zhuǎn)化細胞來實現(xiàn)。在一些實施方案中，豬籠草蛋白酶的生物合成可通過用包含與編碼豬籠草蛋白酶I的cDNA同源的序列的載體轉(zhuǎn)化細胞來實現(xiàn)，該序列編碼具有蛋白酶活性的蛋白質(zhì)。所述序列可與編碼豬籠草蛋白酶I的cDNA具有至少約60％同源性。所述序列可與編碼豬籠草蛋白酶I的cDNA具有至少約70％同源性。所述序列可與編碼豬籠草蛋白酶I的cDNA具有至少約80％同源性。所述序列可與編碼豬籠草蛋白酶I的cDNA具有至少約85％同源性。所述序列可與編碼豬籠草蛋白酶I的cDNA具有至少約90％同源性。所述序列可與編碼豬籠草蛋白酶I的cDNA具有至少約95％同源性。所述序列可與編碼豬籠草蛋白酶I的cDNA具有至少約96％同源性。所述序列可與編碼豬籠草蛋白酶I的cDNA具有至少約97％同源性。所述序列可與編碼豬籠草蛋白酶I的cDNA具有至少約98％同源性。所述序列可與編碼豬籠草蛋白酶I的cDNA具有至少約99％同源性。在優(yōu)選的實施方案中，所述序列編碼保持麩質(zhì)酶活性的豬籠草蛋白酶I變體。在特別優(yōu)選的實施方案中，所述序列編碼降解至少一種毒性麩質(zhì)肽的豬籠草蛋白酶I變體。

在一些實施方案中，豬籠草酶的生物合成可通過用包含編碼豬籠草蛋白酶II的cDNA(例如SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:9、GenBank登記號JX494402或GenBank登記號AB114915的核苷酸序列)的載體轉(zhuǎn)化細胞來實現(xiàn)。在一些實施方案中，豬籠草蛋白酶的生物合成可通過用包含與編碼豬籠草蛋白酶II的cDNA同源的序列的載體轉(zhuǎn)化細胞來實現(xiàn)，該序列編碼具有蛋白酶活性的蛋白質(zhì)。所述序列可與編碼豬籠草蛋白酶II的cDNA具有至少約60％同源性。所述序列可與編碼豬籠草蛋白酶II的cDNA具有至少約70％同源性。所述序列可與編碼豬籠草蛋白酶II的cDNA具有至少約80％同源性。所述序列可與編碼豬籠草蛋白酶II的cDNA具有至少約85％同源性。所述序列可與編碼豬籠草蛋白酶II的cDNA具有至少約90％同源性。所述序列可與編碼豬籠草蛋白酶II的cDNA具有至少約95％同源性。所述序列可與編碼豬籠草蛋白酶II的cDNA具有至少約96％同源性。所述序列可與編碼豬籠草蛋白酶II的cDNA具有至少約97％同源性。所述序列可與編碼豬籠草蛋白酶II的cDNA具有至少約98％同源性。所述序列可與編碼豬籠草蛋白酶II的cDNA具有至少約99％同源性。在優(yōu)選的實施方案中，所述序列編碼保持麩質(zhì)酶活性的豬籠草蛋白酶II變體。在特別優(yōu)選的實施方案中，所述序列編碼降解至少一種毒性麩質(zhì)肽的豬籠草蛋白酶II變體。

在一些實施方案中，豬籠草酶的生物合成可通過用包含編碼奈普洛森的cDNA(例如SEQ ID NO.:2的核苷酸序列)的載體轉(zhuǎn)化細胞來實現(xiàn)。在一些實施方案中，奈普洛森的生物合成可通過用包含與編碼奈普洛森的cDNA同源的序列的載體轉(zhuǎn)化細胞來實現(xiàn)，該序列編碼具有蛋白酶活性的蛋白質(zhì)。所述序列可與編碼奈普洛森的cDNA具有至少約60％同源性。所述序列可與編碼奈普洛森的cDNA具有至少約70％同源性。所述序列可與編碼奈普洛森的cDNA具有至少約80％同源性。所述序列可與編碼奈普洛森的cDNA具有至少約85％同源性。所述序列可與編碼奈普洛森的cDNA具有至少約90％同源性。所述序列可與編碼奈普洛森的cDNA具有至少約95％同源性。所述序列可與編碼奈普洛森的cDNA具有至少約96％同源性。所述序列可與編碼奈普洛森的cDNA具有至少約97％同源性。所述序列可與編碼奈普洛森的cDNA具有至少約98％同源性。所述序列可與編碼奈普洛森的cDNA具有至少約99％同源性。在優(yōu)選的實施方案中，所述序列編碼保持脯氨?；鶅?nèi)切蛋白酶活性的奈普洛森變體。在尤其優(yōu)選的實施方案中，所述序列編碼保持麩質(zhì)酶活性的奈普洛森變體。在特別優(yōu)選的實施方案中，所述序列編碼降解至少一種毒性麩質(zhì)肽的奈普洛森變體。

不受理論的約束，認為受影響的個體的腸中對麩質(zhì)的炎性反應(yīng)歸因于麩質(zhì)蛋白質(zhì)的不完全水解，導致形成毒性(免疫毒性)麩質(zhì)肽。已知若干免疫毒性和/或潛在免疫毒性麩質(zhì)肽。這些包括但不限于33聚體(SEQ ID NO.:15，LQLQPF(PQPQLPY)₃PQPQPF)和p31-49(SEQ ID NO.:16，LGQQQPFPPQQPYPQPQPF)，其來自α-麥醇溶蛋白；Gly-156(SEQ ID NO.:17，QQQQPPFSQQQQSPFSQQQQ)，其來自低分子量麥谷蛋白；以及九肽重復(SEQ ID NO.:18，GYYPTSPQQ)和六肽重復(SEQ ID NO.:19,PGQGQQ)，其來自高分子量麥谷蛋白。

在一些實施方案中，通過用一種或多種包含每種期望酶的cDNA序列的載體轉(zhuǎn)染、感染或轉(zhuǎn)化細胞來合成豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II、奈普洛森和/或其變體。即，單個細胞、細胞系或生物體可被工程化以產(chǎn)生兩種或更多種酶。在一些實施方案中，通過單獨的細胞合成期望酶并將其組合于所述藥物組合物中。在優(yōu)選的實施方案中，重組豬籠草蛋白酶I、重組豬籠草蛋白酶II、重組奈普洛森和/或其變體未被糖基化。在一個實施方案中，重組豬籠草蛋白酶I、重組豬籠草蛋白酶II、重組奈普洛森和/或其變體具有不同于天然酶(即，從豬籠草屬植物中分離的豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II或奈普洛森)的糖基化模式。

合成(例如，重組)豬籠草酶可根據(jù)已知方法濃縮或純化，所述方法如用于從植物瓶狀體液體中分離豬籠草酶的那些。

在一些實施方案中，從天然來源或合成(例如，重組)來源分離的蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含至少20重量％的至少一種豬籠草酶或其變體。在一些實施方案中，所分離的蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含至少約50重量％、約75重量％、約90重量％、約95重量％的豬籠草酶或其變體。在一些實施方案中，所分離的蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含至少約99重量％的豬籠草酶或其變體。

在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶或其變體基本上僅包含重組豬籠草蛋白酶或其變體。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶或其變體基本上僅包含重組豬籠草蛋白酶I或其變體。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶或其變體基本上僅包含豬籠草蛋白酶II或其變體。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶或其變體包含豬籠草蛋白酶I和豬籠草蛋白酶II或其變體。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶或其變體包含至少約100:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II(或其各自的變體)。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約90:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約70:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約60:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約50:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約40:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約30:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約20:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約10:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約5:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約4:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約3:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約2:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約1:1的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約1:2的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約1:3的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約1:4的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約1:5的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約1:10的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約1:20的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約1:30的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約1:40的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約1:50的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約1:60的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約1:70的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約1:80的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約1:90的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。在一些實施方案中，所述重組豬籠草蛋白酶包含至少約1:100的比率的豬籠草蛋白酶I與豬籠草蛋白酶II。

在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶或其變體基本上僅包含重組奈普洛森或其變體。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶或其變體包含奈普洛森和豬籠草蛋白酶或其變體。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶或其變體包含奈普洛森和豬籠草蛋白酶I或其變體。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶或其變體包含奈普洛森和豬籠草蛋白酶II或其變體。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶或其變體包含奈普洛森、豬籠草蛋白酶I和豬籠草蛋白酶II或其變體。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶或其變體包含至少約100:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶(或其各自的變體)。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶包含至少約90:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶包含至少約70:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶包含至少約60:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶包含至少約50:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶包含至少約40:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶包含至少約30:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶包含至少約20:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶包含至少約10:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶包含至少約5:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶包含至少約4:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶包含至少約3:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶包含至少約2:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶包含至少約1:1的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶包含至少約1:2的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶包含至少約1:3的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶包含至少約1:4的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶包含至少約1:5的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶包含至少約1:10的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶包含至少約1:20的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶包含至少約1:30的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶包含至少約1:40的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶包含至少約1:50的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶包含至少約1:60的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶包含至少約1:70的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶包含至少約1:80的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，重組豬籠草酶包含至少約1:90的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。在一些實施方案中，所述重組豬籠草酶包含至少約1:100的比率的奈普洛森與豬籠草蛋白酶。

在一些實施方案中，從天然來源或合成來源分離的蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含與豬籠草屬豬籠草蛋白酶I的氨基酸序列(例如，SEQ ID NO.:5；SEQ ID NO.:6；SEQ ID NO.:7；SEQ ID NO.:21)至少約70％同源的氨基酸。在一個實施方案中，蛋白質(zhì)產(chǎn)物保持蛋白酶活性。所述蛋白質(zhì)可與豬籠草屬豬籠草蛋白酶I至少約80％同源。所述蛋白質(zhì)可與豬籠草屬豬籠草蛋白酶I至少約85％同源。所述蛋白質(zhì)可與豬籠草屬豬籠草蛋白酶I至少約90％同源。所述蛋白質(zhì)可與豬籠草屬豬籠草蛋白酶I至少約95％同源。所述蛋白質(zhì)可與豬籠草屬豬籠草蛋白酶I至少約96％同源。所述蛋白質(zhì)可與豬籠草屬豬籠草蛋白酶I至少約97％同源。所述蛋白質(zhì)可與豬籠草屬豬籠草蛋白酶I至少約98％同源。所述蛋白質(zhì)可與豬籠草屬豬籠草蛋白酶I至少約99％同源。

在一些實施方案中，從天然來源或合成來源分離的蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含與豬籠草屬豬籠草蛋白酶II(例如，SEQ ID NO.:8；SEQ ID NO.:9；SEQ ID NO.:20)至少約70％同源的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，蛋白質(zhì)產(chǎn)物保持蛋白酶活性。所述蛋白質(zhì)可與豬籠草屬豬籠草蛋白酶II至少約80％同源。所述蛋白質(zhì)可與豬籠草屬豬籠草蛋白酶II至少約85％同源。所述蛋白質(zhì)可與豬籠草屬豬籠草蛋白酶II至少約90％同源。所述蛋白質(zhì)可與豬籠草屬豬籠草蛋白酶II至少約95％同源。所述蛋白質(zhì)可與豬籠草屬豬籠草蛋白酶II至少約96％同源。所述蛋白質(zhì)可與豬籠草屬豬籠草蛋白酶II至少約97％同源。所述蛋白質(zhì)可與豬籠草屬豬籠草蛋白酶II至少約98％同源。所述蛋白質(zhì)可與豬籠草屬豬籠草蛋白酶II至少約99％同源。

在一些實施方案中，從天然來源或合成來源分離的蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含與豬籠草屬奈普洛森(例如，SEQ ID NO.:1)至少約70％同源的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，蛋白質(zhì)產(chǎn)物保持蛋白酶活性。所述蛋白質(zhì)可與豬籠草屬奈普洛森至少約80％同源。所述蛋白質(zhì)可與豬籠草屬奈普洛森至少約85％同源。所述蛋白質(zhì)可與豬籠草屬奈普洛森至少約90％同源。所述蛋白質(zhì)可與豬籠草屬奈普洛森至少約95％同源。所述蛋白質(zhì)可與豬籠草屬奈普洛森至少約96％同源。所述蛋白質(zhì)可與豬籠草屬奈普洛森至少約97％同源。所述蛋白質(zhì)可與豬籠草屬奈普洛森至少約98％同源。所述蛋白質(zhì)可與豬籠草屬奈普洛森至少約99％同源。

在一些實施方案中，從天然來源或合成來源分離的蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有豬籠草屬豬籠草蛋白酶I的至少約10％的原始蛋白酶活性的豬籠草蛋白酶或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有豬籠草蛋白酶I的至少約20％的原始蛋白酶活性的豬籠草蛋白酶或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有豬籠草蛋白酶I的至少約30％的原始蛋白酶活性的豬籠草蛋白酶或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有豬籠草蛋白酶I的至少約40％的原始蛋白酶活性的豬籠草蛋白酶或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有豬籠草蛋白酶I的至少約50％的原始蛋白酶活性的豬籠草蛋白酶或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有豬籠草蛋白酶I的至少約60％的原始蛋白酶活性的豬籠草蛋白酶或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有豬籠草蛋白酶I的至少約70％的原始蛋白酶活性的豬籠草蛋白酶或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有豬籠草蛋白酶I的至少約80％的原始蛋白酶活性的豬籠草蛋白酶或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有豬籠草蛋白酶I的至少約90％的原始蛋白酶活性的豬籠草蛋白酶或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有豬籠草蛋白酶I的大于約100％的原始蛋白酶活性的豬籠草蛋白酶或其變體。

在一些實施方案中，從天然來源或合成來源分離的蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有豬籠草屬豬籠草蛋白酶II的至少約10％的原始蛋白酶活性的豬籠草蛋白酶或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有豬籠草蛋白酶II的至少約20％的原始蛋白酶活性的豬籠草蛋白酶或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有豬籠草蛋白酶II的至少約30％的原始蛋白酶活性的豬籠草蛋白酶或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有豬籠草蛋白酶II的至少約40％的原始蛋白酶活性的豬籠草蛋白酶或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有豬籠草蛋白酶II的至少約50％的原始蛋白酶活性的豬籠草蛋白酶或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有豬籠草蛋白酶II的至少約60％的原始蛋白酶活性的豬籠草蛋白酶或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有豬籠草蛋白酶II的至少約70％的原始蛋白酶活性的豬籠草蛋白酶或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有豬籠草蛋白酶II的至少約80％的原始蛋白酶活性的豬籠草蛋白酶或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有豬籠草蛋白酶II的至少約90％的原始蛋白酶活性的豬籠草蛋白酶或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有豬籠草蛋白酶II的大于約100％的原始蛋白酶活性的豬籠草蛋白酶或其變體。

在一些實施方案中，從天然來源或合成來源分離的蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有豬籠草屬奈普洛森的至少約10％的原始蛋白酶活性的奈普洛森或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有奈普洛森的至少約20％的原始蛋白酶活性的奈普洛森或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有奈普洛森的至少約30％的原始蛋白酶活性的奈普洛森或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有奈普洛森的至少約40％的原始蛋白酶活性的奈普洛森或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有奈普洛森的至少約50％的原始蛋白酶活性的奈普洛森或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有奈普洛森的至少約60％的原始蛋白酶活性的奈普洛森或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有奈普洛森的至少約70％的原始蛋白酶活性的奈普洛森或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有奈普洛森的至少約80％的原始蛋白酶活性的奈普洛森或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有奈普洛森的至少約90％的原始蛋白酶活性的奈普洛森或其變體。在一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)產(chǎn)物包含具有奈普洛森的大于約100％的原始蛋白酶活性的奈普洛森或其變體。

除非另有說明，說明書通篇中所用的縮寫具有以下含義：

g＝克

kDa＝千道爾頓

kg＝千克

L＝升

LC＝液相色譜

mg＝毫克

min＝分鐘

mL＝毫升

mM＝毫摩爾

MS＝質(zhì)譜

nM＝納摩爾

pM＝皮摩爾

s.d.＝標準偏差

μCi＝微居里

μg＝微克

μL＝微升

μM＝微摩爾

μm＝微米

℃＝攝氏度

當表示氨基酸時，這些單字母符號具有以下含義：

A＝丙氨酸

R＝精氨酸

N＝天冬酰胺

D＝天冬氨酸

C＝半胱氨酸

E＝谷氨酸

Q＝谷氨酰胺

G＝甘氨酸

H＝組氨酸

I＝異亮氨酸

L＝亮氨酸

K＝賴氨酸

M＝甲硫氨酸

F＝苯丙氨酸

P＝脯氨酸

S＝絲氨酸

T＝蘇氨酸

W＝色氨酸

Y＝酪氨酸

V＝纈氨酸

實施例

實施例1.豬籠草蛋白酶提取物制備

化學品

水和乙腈(HPLC級，來自Burdick and Jackson)購自VWR。甲酸、Tris和甘氨酸購自Sigma Aldrich。

植物培養(yǎng)

萊佛士豬籠草(Nepenthes rafflesiana)、蘋果豬籠草(Nepenthes ampularia)、奇異豬籠草和海盜豬籠草(Nepenthes globosa)的移植株購自Keehns Carnivores(www.keehnscarnivores.ca)。將這些用木皮、珍珠巖、泥炭蘚和腐殖土(分別為40％、35％、10％、5％)盆栽。生長條件涉及每天14小時光照，80％濕度和23℃至28℃范圍的溫度，以及每周澆水2至3次。在瓶狀體成熟后，向植物每個瓶狀體供給一個或兩個果蠅并且在一周后收獲瓶狀體流體。留下瓶狀體和它們的分泌物進行一周的恢復，隨后進行第二輪供給和提取。

提取物制備

從所有4種植物收集瓶狀體流體并將其合并。首先通過0.22μm過濾器將粗制瓶狀體流體澄清，然后使用Amicon Ultra離心10kDa分子量截留過濾器(均來自Millipore)將該流體濃縮80倍至100倍。在用于消化之前，用100mM甘氨酸HCl(pH 2.5)將濃縮物酸活化3小時，然后在過濾裝置中用100mM甘氨酸-HCl(pH 2.5)洗滌3次，每次洗滌使用10X流體體積。然后基于瓶狀體流體的原始取樣將最終分離物再稀釋至11X濃度。

瓶狀體流體提取物的表征

將瓶狀體植物的流體分泌物濃縮并且通過減小pH(pH 2.5)將消化酶活化。使用蛋白質(zhì)組學方法確定富集過程和活化對流體蛋白質(zhì)組的影響。首先，為了確認豬籠草蛋白酶的存在，通過SDS-PAGE分離無活性濃縮物。用胰蛋白酶消化7個具有非常弱的考馬斯藍染色的鄰接凝膠區(qū)域并通過nanoLC-MS/MS使用標準方法對其進行分析。這預計不是活化的流體蛋白質(zhì)組的完整目錄，但該分析確認了存在天冬氨酸蛋白酶豬籠草蛋白酶I/II以及植物來源的葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶、羧肽酶和過氧化物酶加上中等水平的果蠅和細菌污染。流體蛋白質(zhì)組的低復雜性與最近的分析是一致的(Hatano N，Hamada T(2012)Proteomic analysis of secreted protein induced by a component of prey in pitcher fluid of the carnivorous plant Nepenthes alata.Journal of Proteomics 3；75(15):4844-52(2012年6月15日電子出版))，但在該分析中發(fā)現(xiàn)豬籠草蛋白酶-I分布于寬得多的質(zhì)量范圍(40-70kDa)內(nèi)。

然后以類似方式處理并分析酸活化的流體?；罨^程降低了總體蛋白質(zhì)產(chǎn)率，并且也似乎簡化了組合物。除了豬籠草蛋白酶-I以外，僅來自角蛋白和肌動蛋白的微小污染是顯而易見的。這些分析指向富集流體的低復雜性，其中豬籠草蛋白酶是主要組分。通過BCA測定將活化和80X富集的流體的總蛋白質(zhì)濃度測量為22ng/μL。該值與描述流體的富集的早期研究一致。Tokes ZA等，Digestive Enzymes Secreted by Carnivorous Plant Nepenthes-Macferlanei-L.Planta119(l):39-46(1974)。

實施例2：豬籠草蛋白酶提取物純化

提取物的純化

將在50×2cm ID柱中的Sepharose固定的胃蛋白酶抑制劑在20mM甘氨酸-HCl(pH2.5-3)中平衡。將過濾的瓶狀體流體(如實施例1中所述制備)通過柱循環(huán)兩次，并用100mL平衡緩沖液(20mM甘氨酸HCl，pH 2.5)洗滌柱。用100mM碳酸氫銨(pH 8.7)洗脫所述柱并收集級分。為了保持最大的酶活性，在收集級分之后立即用2M甘氨酸HCl(pH 2.5)將pH降低至4。使用消化測定驗證活性，并且將最大活性級分合并且基于原始流體體積濃縮至大約80x。

豬籠草流體和/或提取物中在可檢測水平下發(fā)現(xiàn)的唯一內(nèi)切蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶和脯氨?；鶅?nèi)切蛋白酶。

實施例3：重組豬籠草蛋白酶I

從豬籠草蛋白酶I cDNA制備豬籠草蛋白酶I的基因(SEQ ID NO:4；編碼氨基酸殘基20-413，來自小豬籠草，無植物信號序列)，并將其置于Ndel與HindIII限制位點之間。使用T4DNA連接酶(1U)(New England Bio,NEB)、T4DNA連接酶緩沖液(NEB)、ATP(0.5mM)(NEB)、0.5μg pET21a載體和2μg豬籠草蛋白酶I cDNA將該序列克隆至pET21a中。將其在18℃孵育4小時。將連接混合物(5μL)添加至200μL的NovaBlue感受態(tài)細胞中并在冰上孵育15分鐘。通過熱激(在42℃45秒，然后立即置于冰上，使用1ml LB培養(yǎng)基)轉(zhuǎn)化細胞，并在37℃孵育1小時，并且用抗生素(四環(huán)素和氨芐西林)涂鋪。在確認基因存在于若干白色菌落中后，選擇代表性菌落用于maxiprep。通過如上文所述的熱激將所得重組質(zhì)粒pET21a/R.NepI轉(zhuǎn)化至大腸桿菌C41中，用于在通過IPTG的誘導下表達。這里，在37℃使細胞生長至0.6的OD₆₆₀并用0.1mM IPTG誘導4小時。被表達的蛋白質(zhì)前往包涵體。

將包涵體如下分離。將細胞離心，添加蔗糖溶解緩沖液(25％蔗糖、50mM TrisCl pH 7.4、1mM EDTA、1mM NaN₃和蛋白酶抑制劑)，并且使細胞經(jīng)受4輪冷凍/解凍和超聲波處理。之后添加DNA酶和RNA酶，用于在室溫下孵育30min。將制劑離心(在5000x g下約15min.)以使包涵體和膜片段形成小粒。將該小粒再懸浮于Triton緩沖液(50mM TrisCl pH 7.4、10mM NaCl、1mMβ-巰基乙醇、1mM NaN₃、0.5％Triton X100+蛋白酶抑制劑)中并在冰上進行超聲波處理。將其再次離心，以使包涵體形成小粒，并且將小粒在不含Triton的緩沖液(50mM TrisCl pH 7.4、10mM NaCl、1mMβ-巰基乙醇、1mM NaN₃、蛋白酶抑制劑)中在冰上洗滌兩次(利用混合和超聲波處理)。

然后使蛋白質(zhì)小粒經(jīng)受再折疊。將1g包涵體懸浮至1L 50mM CAPS pH 10.5、8M脲、1mM EDTA、1mM甘氨酸、500mM NaCl、300mMβ-巰基乙醇中并且振蕩1小時。將懸浮液針對50mM Tris(pH 11)透析兩次，每次1小時，之后針對50mM Tris(pH 7.5)透析一天，并且最后針對具有300mM NaCl的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)透析。

將溶液高速離心(10000x g持續(xù)15min.)以去除任何未再折疊的蛋白質(zhì)，并且將上清液通過.22μm膜過濾。在4℃將豬籠草蛋白酶I在pH 2.5(甘氨酸-HCl)下活化過夜。從1L細胞培養(yǎng)物開始，產(chǎn)率為10至100mg的折疊的活化蛋白質(zhì)。

實施例4：重組豬籠草蛋白酶II

來自小豬籠草的豬籠草蛋白酶II的cDNA(參見SEQ ID NO.:14)(無植物信號序列)用于制備豬籠草蛋白酶II cDNA。使用T4DNA連接酶(1U)(New England Bio,NEB)、T4DNA連接酶緩沖液(NEB)、ATP(0.5mM)(NEB)、0.5μg pET21a載體和2μg豬籠草蛋白酶II cDNA將該序列克隆至pET2la中的Ndel與HindIII限制位點之間。將其在18℃孵育4小時。將連接混合物(5μL)添加至200μL的NovaBlue感受態(tài)細胞中并在冰上孵育15分鐘。通過熱激(在42℃45秒，然后立即置于冰上，使用1ml LB培養(yǎng)基)轉(zhuǎn)化細胞，并在37℃孵育1小時，并且用抗生素(四環(huán)素和氨芐西林)涂鋪。在確認基因存在于若干白色菌落中后，選擇代表性菌落用于maxiprep。通過如上文所述的熱激將所得重組質(zhì)粒pET21a/R.NepI轉(zhuǎn)化至大腸桿菌C41中，用于在通過IPTG的誘導下表達。這里，在37℃使細胞生長至0.6的OD₆₆₀并用0.1mM IPTG誘導4小時。被表達的蛋白質(zhì)前往包涵體。

將包涵體如下分離。將細胞離心，添加蔗糖溶解緩沖液(25％蔗糖、50mM TrisCl pH 7.4、1mM EDTA、1mM NaN₃和蛋白酶抑制劑)，并且使細胞經(jīng)受4輪冷凍/解凍和超聲波處理。之后添加DNA酶和RNA酶，用于在室溫下孵育30min。將制劑離心(在5000x g下約15min.)以使包涵體和膜片段形成小粒。將該小粒再懸浮于Triton緩沖液(50mM TrisCl pH 7.4、10mM NaCl、1mMβ-巰基乙醇、1mM NaN₃、0.5％Triton X100+蛋白酶抑制劑)中并在冰上進行超聲波處理。將其再次離心，以使包涵體形成小粒，并且將小粒在不含Triton的緩沖液(50mM TrisCl pH 7.4、10mM NaCl、1mMβ-巰基乙醇、1mM NaN₃、蛋白酶抑制劑)中在冰上洗滌兩次(利用混合和超聲波處理)。

然后使蛋白質(zhì)小粒經(jīng)受再折疊。將1g包涵體懸浮至1L 50mM CAPS pH 10.5、8M脲、1mM EDTA、1mM甘氨酸、500mM NaCl、300mMβ-巰基乙醇中并且振蕩1小時。將懸浮液針對50mM Tris(pH 11)透析兩次，每次1小時，之后針對50mM Tris(pH 7.5)透析一天，并且最后針對具有300mM NaCl的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)透析。

將溶液高速離心(10000x g持續(xù)15min.)以去除任何未再折疊的蛋白質(zhì)，并且將上清液通過.22μm膜過濾。在4℃將豬籠草蛋白酶II在pH 2.5(甘氨酸-HCl)下活化過夜。從1L細胞培養(yǎng)物開始，產(chǎn)率為10至100mg的折疊的活化蛋白質(zhì)。

實施例5.豬籠草酶的糖基化

通過純化的大腸桿菌包涵體的再折疊重組生成豬籠草蛋白酶I(A)和II(C)示于圖2中。監(jiān)測再折疊程序的每一步驟并將其顯示為：來自純化的大腸桿菌包涵體的總?cè)芙獾鞍踪|(zhì)(泳道1)、最后透析后的再折疊的豬籠草蛋白酶(泳道2)、24小時酸活化(100mM甘氨酸-HCl,pH 2.5)的再折疊產(chǎn)物(泳道3)。對24小時酸活化的豬籠草蛋白酶I(B)和II(D)酶進行MALDI-TOF MS分析。酸活化的條帶(A和C，泳道3)的膠內(nèi)消化物的LC-MS/MS分析確認分別存在純豬籠草蛋白酶I和II。

對天然豬籠草蛋白酶(匯集自2-3個種)進行MALDI-TOF分析。結(jié)果示于圖3中。認為37,200的質(zhì)量是豬籠草蛋白酶II并且38,951的質(zhì)量是豬籠草蛋白酶I。不管怎樣，它們都不同于重組酶的質(zhì)量，如表1中所示。

表1：重組豬籠草蛋白酶與天然豬籠草蛋白酶的質(zhì)量

*由于MALDI所增加的質(zhì)子而減去1道爾頓。

不受理論的約束，我們認為這確認了豬籠草蛋白酶I在天然狀態(tài)下是糖基化的。重組豬籠草蛋白酶II的活性成熟酶大于天然存在的。仍然可能的是，天然豬籠草蛋白酶II在蛋白質(zhì)序列上甚至更小，但有些微小的糖基化。本文所報告的天然酶的質(zhì)量不同于Athauda等，可能是因為質(zhì)譜對于確定分子的質(zhì)量是比SDS PAGE更精確的技術(shù)。

實施例6.豬籠草酶與胃蛋白酶的比較

對通過所示酶消化的麥醇溶蛋白進行SDS-PAGE。SDS-PAGE根據(jù)分子量大致剖析蛋白質(zhì)。以大約100:1的底物與酶的比率用胃蛋白酶、純化的豬籠草提取物或重組豬籠草蛋白酶II進行麥醇溶蛋白消化。將麥醇溶蛋白(5mg)與所示制劑在37℃孵育2小時。圖4顯示通過重組豬籠草蛋白酶II、豬籠草提取物或胃蛋白酶進行的麥醇溶蛋白消化的SDS-PAGE凝膠。該凝膠顯示相比于胃蛋白酶，通過重組豬籠草蛋白酶II對麥醇溶蛋白的消化導致不同的消化模式并消化成更小的肽。這在帶框的凝膠區(qū)域特別顯著。豬籠草提取物在降解麥醇溶蛋白方面如此有效，以致于在該區(qū)域中沒有觀察到殘余的麥醇溶蛋白蛋白質(zhì)。

表2顯示用于通過胃蛋白酶、重組豬籠草蛋白酶I和II以及豬籠草提取物進行C-末端裂解的優(yōu)選的、低概率的和禁用的殘基?；谝淮笕旱鞍踪|(zhì)底物概述了C-末端裂解特異性，該裂解特異性是將酶分類的經(jīng)典方式。豬籠草蛋白酶在裂解特異性方面相當不同于胃蛋白酶，這表明豬籠草蛋白酶和胃蛋白酶是非常不同的酶。從文獻(例如“Determining the Specificity of Pepsin for Proteolytic Digestion”，Melissa Palashoff的一篇論文，其可于以下網(wǎng)址獲得：books.google.ca/books？id＝7O1nU4-6T-wC&printsec＝frontcover#v＝onepage&q&f＝false)概述了提供于表2中胃蛋白酶數(shù)據(jù)。從消化物研究如描述于美國專利申請公開號2014/0186330中的研究概述了豬籠草酶數(shù)據(jù)，該美國專利申請通過引入整體并入本文。

表2：C-末端裂解

進行LC-MS測定以確定每種酶裂解33聚體毒性麩質(zhì)肽的能力。將33聚體與所示酶以100:1比率(底物:酶)孵育0.5h，并且依照慣例相對于標準物確定未消化的33聚體的量。將數(shù)據(jù)提供為對照(未添加酶的33聚體)的百分比。

表3提供了來自麩質(zhì)蛋白質(zhì)的抗胃蛋白酶的片段的消化，該片段被稱為“33聚體”(LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF)SEQ ID.15。該序列與乳糜瀉密切相關(guān)并且經(jīng)常被稱為毒性麩質(zhì)肽。與全麩質(zhì)蛋白質(zhì)自身一樣，33聚體富含Q、P和L氨基酸。僅使用胃蛋白酶的延長消化時間對該肽沒有太多的影響-該肽對胃蛋白酶消化具有極大抵抗性。相比之下，豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II和高分子量級分(>大約10kDa)的豬籠草提取物(流體)展現(xiàn)消化該肽的能力。將數(shù)據(jù)提供為對照(沒有酶的33聚體)的％。

表3：33聚體消化

將麥醇溶蛋白蛋白質(zhì)漿液(5mg麩質(zhì))與40μg或200μg重組豬籠草蛋白酶I或重組豬籠草蛋白酶II、或40μg胃蛋白酶孵育，并檢查消化度(如通過相對溶液的渾濁度所確定)。增加胃蛋白酶的量對漿液的渾濁度(數(shù)據(jù)未顯示)沒有影響。圖5A是容納麥醇溶蛋白漿液和所示量的重組豬籠草蛋白酶I、重組豬籠草蛋白酶II或胃蛋白酶的小瓶的圖像。圖5B是類似的，但使用了5μg、20μg或100μg的豬籠草提取物。用豬籠草蛋白酶或豬籠草提取物孵育的小瓶不如胃蛋白酶小瓶渾濁，顯示對麥醇溶蛋白的更強烈消化。

這些數(shù)據(jù)顯示在凝膠水平(其顯示“較大的”消化產(chǎn)物)、肽水平(33聚體的加工)和漿液水平(澄清溶液)下，麥醇溶蛋白蛋白質(zhì)消化物在豬籠草酶與胃蛋白酶之間是不同的。胃蛋白酶、奈普洛森和豬籠草蛋白酶是具有獨特的裂解特異性的非常不同的蛋白質(zhì)，特別是對于麩質(zhì)蛋白質(zhì)來說。簡單地說，胃蛋白酶不以避免麩質(zhì)毒性的方式充分消化麩質(zhì)，而豬籠草酶則會。

實施例7.通過豬籠草提取物對麥醇溶蛋白的消化

使用LEAP HTX-PAL自動取樣器和設(shè)計用于氫/氘交換(HDX)應(yīng)用的分配系統(tǒng)在溶液中進行通過豬籠草蛋白酶對麥醇溶蛋白的消化。使用AB Sciex Triple-TOF 5600QqTOF質(zhì)譜儀收集數(shù)據(jù)。使用Mascot(v2.3)從MS/MS數(shù)據(jù)鑒別肽。簡單地說，將12pmol粗制麥醇溶蛋白(購自Sigma Aldrich)與2μL如實施例1所述產(chǎn)生的100x濃縮提取物混合。在消化之后，將整個體積注入連接至質(zhì)譜儀的反相LC系統(tǒng)中。將肽捕集于7cm,150μm i.d.Magic C18柱上并在10或30分鐘內(nèi)用10％至40％的乙腈梯度洗脫。這些分析中所檢測到的肽被選擇用于MS/MS波譜的多個信息依賴性獲取中的CID斷裂。針對含有所有鑒別的小麥麥醇溶蛋白(α、β、γ、ω)蛋白質(zhì)加上低分子量和高分子量麥谷蛋白的序列的微型數(shù)據(jù)庫搜索波譜。

圖6顯示在37℃1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘、130分鐘、360分鐘或810分鐘后，使用LC-MS/MS從來自小麥的麥醇溶蛋白的豬籠草提取物消化所鑒別的所有肽的平均長度。使用對評分的95％置信度截留值(p<0.05)來減少假陽性鑒別。肽長度的相對標準偏差示于插圖中。

圖7展示在37℃消化1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘、130分鐘、360分鐘或810分鐘后通過LC-MS/MS鑒別的按長度分組的肽的數(shù)目。數(shù)據(jù)如在圖6中。

圖8展示與圖6中相同的數(shù)據(jù)，作為在37℃消化10分鐘、60分鐘、120分鐘、360分鐘或810分鐘后獲得一定長度的概率。

對于消化作圖，如上文所述進行麥醇溶蛋白消化，不同之處在于底物與酶的比率為大約1000:1。在37℃，用豬籠草蛋白酶提取物、純化的豬籠草蛋白酶提取物或重組豬籠草蛋白酶I將麥醇溶蛋白消化2小時。

重組豬籠草蛋白酶I的P1裂解偏好非常類似于濃縮的流體提取物以及所述提取物的純化級分(圖9A)。令人驚訝地，所述提取物顯示比純化的提取物或重組豬籠草蛋白酶I對谷氨酰胺更高的偏好。

重組豬籠草蛋白酶I的P1'裂解偏好非常類似于濃縮的流體提取物以及所述提取物的純化級分(圖9B)。令人驚訝地，所述提取物顯示比純化的提取物或重組豬籠草蛋白酶I對脯氨酸更高的偏好。

所述提取物含有豬籠草蛋白酶I、豬籠草蛋白酶II和奈普洛森，但所述純化策略相比于另外兩種酶回收了更多的豬籠草蛋白酶I。不希望受限于理論，認為所述提取物在P1谷氨酰胺位置和P1'脯氨酸位置處的增強裂解歸因于奈普洛森、豬籠草蛋白酶II、和/或所述酶中的兩種或更多種間的協(xié)同作用。

實施例8.奈普洛森提取物的制備

從豬籠草屬種消化流體中提取奈普洛森。在用冷凍果蠅供給之后5天，從植物瓶狀體中收集流體。將收集的液體過濾以去除死昆蟲，并通過多個濃縮/過濾循環(huán)經(jīng)過10kDa分子量截留膜用20mM乙酸銨鹽(pH 5.0)反復洗滌。

在單P 5/50GL柱上從豬籠草蛋白酶中部分地純化出奈普洛森。將5mL 1.5X濃縮流體注入在低離子強度(20mM乙酸銨鹽pH 6)下平衡的單P柱上。用40min NaCl梯度(0至1M)以0.5ml/min洗脫所述蛋白質(zhì)。每0.5ml收集級分。在各個級分中通過消化固有無序的富含脯氨酸的蛋白質(zhì)APLF來測試奈普洛森活性。將所產(chǎn)生的肽在C8柱上分離，并通過LC-MS/MS在tripleToF 5600(AB Sciex)上分析。級分19-22富集奈普洛森(圖10)并被稱為粗制奈普洛森提取物；奈普洛森不同于豬籠草蛋白酶，所述豬籠草蛋白酶富集于隨后的級分中。

實施例9.豬籠草酶在抑制麩質(zhì)不耐受小鼠的腸中的炎癥方面的功效

目的：測試使用豬籠草提取物或重組豬籠草蛋白酶II對麥醇溶蛋白的體外消化在預防使用麥醇溶蛋白致敏的NOD-DQ8小鼠的體內(nèi)麥醇溶蛋白誘導的損傷方面的功效。

實驗設(shè)計：用霍亂毒素(CT)和麥醇溶蛋白使NOD DQ8小鼠致敏以破壞對麥醇溶蛋白的口服耐受性。用CT和麥醇溶蛋白處理陰性對照，但沒有隨后的口服麥醇溶蛋白激發(fā)。用含有各種毒性和免疫原性衍生肽的麥醇溶蛋白的豬蛋白酶(胃蛋白酶)消化物進行麥醇溶蛋白激發(fā)。用經(jīng)豬籠草提取物或重組豬籠草蛋白酶II預消化的麥醇溶蛋白激發(fā)處理組(在37攝氏度持續(xù)90分鐘)。假設(shè)豬籠草提取物-麥醇溶蛋白消化物或重組豬籠草蛋白酶II-麥醇溶蛋白消化物在體內(nèi)將比胃蛋白酶-麥醇溶蛋白消化物具有更低的免疫原性。

分組：

陽性對照(n-8)：致敏的和麥醇溶蛋白激發(fā)的。用霍亂毒素(CT)和胃蛋白酶麥醇溶蛋白(P-G)使小鼠致敏(每周一次，持續(xù)3周)。在實驗期間，用P-麥醇溶蛋白管飼小鼠(每周三次，持續(xù)3周)。

陰性對照(n＝8)：致敏的(然后沒有麥醇溶蛋白)。用霍亂毒素(CT)和胃蛋白酶麥醇溶蛋白(P-G)使小鼠致敏(每周一次，持續(xù)3周)。在實驗期間，用媒劑管飼小鼠(每周三次，持續(xù)3周)。

處理1(n＝8)：豬籠草提取物。用霍亂毒素(CT)和胃蛋白酶麥醇溶蛋白(P-G)使小鼠致敏(每周一次，持續(xù)3周)。在實驗期間，用豬籠草提取物消化的麥醇溶蛋白管飼小鼠(每周三次，持續(xù)3周)。

處理2(n＝8)用霍亂毒素(CT)和胃蛋白酶麥醇溶蛋白(P-G)使小鼠致敏(每周一次，持續(xù)3周)。在實驗期間，用豬籠草蛋白酶II消化的麥醇溶蛋白管飼小鼠(每周三次，持續(xù)3周)

結(jié)果：

用胃蛋白酶-麥醇溶蛋白消化物加上霍亂毒素使所有4組小鼠致敏。陰性對照在致敏后沒有麥醇溶蛋白激發(fā)。陽性對照和處理組在致敏后用麥醇溶蛋白口服激發(fā)。處理組的差異在于用豬籠草提取物或豬籠草蛋白酶II預消化醇溶蛋白激發(fā)。以這種方式，“陰性對照”不是完全未經(jīng)麥醇溶蛋白處理的(因為它們在致敏階段期間暴露于該蛋白)，且因此模擬了進入緩解同時堅持不含麩質(zhì)的膳食的乳糜瀉患者的臨床情況。

臨床/毒性作用：評價了小鼠的總體表現(xiàn)(移動、睜眼、理毛)。在任何處理組或?qū)φ战M中均未觀察到不良作用。在整個實驗中記錄體重，并且在任何組中均未觀察到重量減輕(圖11)。

針對麥醇溶蛋白激發(fā)的先天免疫變化：對來自每個處理組的小鼠的腸進行CD3+上皮內(nèi)淋巴細胞的免疫組織化學(圖12)。這是模型中腸道麥醇溶蛋白暴露的快速且早期的先天免疫標志物。麥醇溶蛋白暴露導致與陰性對照小鼠和暴露于用豬籠草提取物或豬籠草蛋白酶II預消化的麥醇溶蛋白的小鼠相比IEL計數(shù)增加(圖13)。在豬籠草提取物處理組與豬籠草蛋白酶II處理組之間沒有觀察到IEL計數(shù)的差異。

絨毛/隱窩比率：在陽性對照組中觀察到較低絨毛/隱窩(V/C)比率的非顯著趨勢(圖14)。與陽性對照和陰性對照相比，豬籠草提取物和豬籠草蛋白酶II處理組具有更高比率的趨勢。

解釋/討論：

用豬籠草提取物或豬籠草蛋白酶II預消化的麥醇溶蛋白的三周激發(fā)是安全的，并且不誘導小鼠的體重的短期降低或任何臨床不良事件。

口服麥醇溶蛋白激發(fā)導致先前致敏的小鼠的小腸IEL計數(shù)的顯著增加。在用已經(jīng)用豬籠草提取物或豬籠草蛋白酶II預消化的麥醇溶蛋白激發(fā)的小鼠中未觀察到IEL增加。這表明用豬籠草提取物或豬籠草蛋白酶II處理的麥醇溶蛋白的較低腔內(nèi)抗原性。

陽性對照組中V/C比率的降低非常微小。然而，在用利用豬籠草提取物或豬籠草蛋白酶II預消化的麥醇溶蛋白激發(fā)的小鼠中，存在更高的V/C比率的非顯著趨勢。該動物模型中V/C比率的降低是中度的，并且隨著麥醇溶蛋白激發(fā)的持續(xù)時間和劑量而變化。當陰性對照完全未經(jīng)麥醇溶蛋白/麩質(zhì)處理(非致敏的)時，陽性對照與陰性對照之間的差異更為顯著。認為在更慢性的情況下和/或與完全未經(jīng)麥醇溶蛋白處理的(非致敏的)小鼠相比，使用預消化的豬籠草提取物或豬籠草蛋白酶II的V/C比率的差異將更為顯著。

總體結(jié)論：結(jié)果顯示用豬籠草提取物或豬籠草蛋白酶II將麥醇溶蛋白預消化以降低麥醇溶蛋白肽在致敏的NOD/DQ8小鼠的小腸道中的抗原性的作用。

實施例10.通過奈普洛森進行的麥醇溶蛋白消化

將粗制奈普洛森提取物與麥醇溶蛋白在pH 2.5孵育并且通過MS分析所得肽片段。將結(jié)果示于圖15A和15B中(點[.]指示裂解位點)。所述提取物的蛋白質(zhì)序列覆蓋率為61％。通過粗制奈普洛森提取物加工了麥醇溶蛋白中的大約57％的潛在脯氨酸(P)裂解位點(C-末端)。不受理論的約束，認為至少一部分谷氨酰胺裂解位點歸因于豬籠草蛋白酶蛋白質(zhì)對提取物的少量污染。