1.技術(shù)領(lǐng)域

本文提供了細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組合物及其制備方法。本文還提供了本文所提供的ECM組合物的用途。

2.

背景技術(shù)：

細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)包含形成身體中的許多結(jié)構(gòu)(包括支持皮膚和內(nèi)部器官的肌腱、韌帶和鞘(sheets))的蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域中仍然需要新的和改進(jìn)的ECM組合物及制備這種ECM組合物的方法。

3.

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在一個方面中，本文提供了使用胎盤組織(例如，人胎盤組織)制備的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組合物。

在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物包含約30％-約60％的膠原蛋白和約10％-約35％的彈性蛋白。另外，這類ECM組合物包含(i)非常低量的纖連蛋白(例如，少于0.1％的纖連蛋白)，例如，如通過ELISA測量的；(ii)沒有或不可檢測量的層粘連蛋白，例如，如通過ELISA測量的；和/或沒有或不可檢測量的糖胺聚糖，例如，如通過ELISA測量的。

在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物包含約30％-約72％的膠原蛋白和約10％-約35％的彈性蛋白。另外，這類ECM組合物可包含(i)纖連蛋白(例如，少于0.1％的纖連蛋白)，例如，如通過ELISA測量的；(ii)層粘連蛋白(例如，少于0.1％的層粘連蛋白)，例如，如通過ELISA測量的；糖胺聚糖(例如，少于0.1％的糖胺聚糖)，例如，如通過ELISA測量的；(iii)沒有或不可檢測量的細(xì)胞因子；(iv)沒有或不可檢測量的生長因子；和/或(v)沒有或不可檢測量的脫氧膽酸。

本文提供的ECM組合物具有使得它們非常適合于治療/醫(yī)學(xué)用途的特征。具體地，本文描述的ECM組合物是無菌的、無細(xì)胞的(例如，≥99％無細(xì)胞的)和/或不含細(xì)胞碎片的(例如，≥99％無細(xì)胞碎片的)。在特定實施方式中，本文提供的ECM組合物不包含細(xì)胞因子或包含不可檢測量的細(xì)胞因子，如通過，例如，ELISA測量的。在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物進(jìn)一步缺乏試劑殘留，即，最終ECM組合物包含不可檢測量的用于制造該組合物的試劑。此外，在特定實施方式中，本文提供的ECM組合物包含最少量的核酸(例如，～41-171ng/mg干產(chǎn)物)和內(nèi)毒素(例如，<0.25EU)。

本文提供的ECM組合物的另一有利特征是其吸收水的能力。在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物吸收150％-225％的其重量的水。這種特征在本文提供的ECM組合物的例如傷口愈合應(yīng)用中是有利的。

在具體的實施方式中，本文提供了包含約35-55％的膠原蛋白和約10-30％的彈性蛋白的ECM組合物。在具體的實施方式中，所述組合物包含34-53％的膠原蛋白和13-29％的彈性蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤組織，例如，人胎盤組織獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤的絨毛膜，例如，人胎盤的絨毛膜獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白；不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白；且不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。

在具體的實施方式中，本文提供了包含約35-72％的膠原蛋白和約15-25％的彈性蛋白的ECM組合物。在另一具體實施方式中，本文提供了包含約40-70％的膠原蛋白和約15-25％的彈性蛋白的ECM組合物。在另一具體實施方式中，所述組合物包含40-70％的膠原蛋白和15-22％的彈性蛋白。在再另一具體實施方式中，所述組合物包含43-68％的膠原蛋白和18-21％的彈性蛋白。在某些實施方式中，所述ECM組合物包含纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.05％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白、少于0.001％的纖連蛋白、0.001-0.1％的纖連蛋白、0.001-0.05％的纖連蛋白、0.001-0.01％的纖連蛋白、0.01-0.1％的纖連蛋白或0.01-0.05％的纖連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含層粘連蛋白，例如，少于0.1％的層粘連蛋白、少于0.05％的層粘連蛋白、少于0.01％的層粘連蛋白、少于0.001％的層粘連蛋白、0.001-0.1％的層粘連蛋白、0.001-0.05％的層粘連蛋白、0.001-0.01％的層粘連蛋白、0.01-0.1％的層粘連蛋白或0.01-0.05％的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含糖胺聚糖，例如，少于0.1％的糖胺聚糖、少于0.05％的糖胺聚糖、少于0.01％的糖胺聚糖、少于0.001％的糖胺聚糖、0.001-0.1％的糖胺聚糖、0.001-0.05％的糖胺聚糖、0.001-0.01％的糖胺聚糖、0.01-0.1％的糖胺聚糖或0.01-0.05％的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的細(xì)胞因子、生長因子和/或脫氧膽酸。在某些實施方式中，所述ECM組合物包含纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.05％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白、少于0.001％的纖連蛋白、0.001-0.1％的纖連蛋白、0.001-0.05％的纖連蛋白、0.001-0.01％的纖連蛋白、0.01-0.1％的纖連蛋白或0.01-0.05％的纖連蛋白；層粘連蛋白，例如，少于0.1％的層粘連蛋白、少于0.05％的層粘連蛋白、少于0.01％的層粘連蛋白、少于0.001％的層粘連蛋白、0.001-0.1％的層粘連蛋白、0.001-0.05％的層粘連蛋白、0.001-0.01％的層粘連蛋白、0.01-0.1％的層粘連蛋白或0.01-0.05％的層粘連蛋白；糖胺聚糖，例如，少于0.1％的糖胺聚糖、少于0.05％的糖胺聚糖、少于0.01％的糖胺聚糖、少于0.001％的糖胺聚糖、0.001-0.1％的糖胺聚糖、0.001-0.05％的糖胺聚糖、0.001-0.01％的糖胺聚糖、0.01-0.1％的糖胺聚糖或0.01-0.05％的糖胺聚糖，和任選地不包含或包含不可檢測量的細(xì)胞因子、生長因子和/或脫氧膽酸。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤組織，例如，人胎盤組織獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤的絨毛膜(例如胎盤的絨毛膜板)獲得，例如，來自人胎盤的絨毛膜(例如，絨毛膜板)。

在另一具體實施方式中，本文提供了包含約50-60％的膠原蛋白和約10-20％的彈性蛋白的ECM組合物。在具體的實施方式中，所述ECM組合物從胎盤組織，例如，人胎盤組織獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤的絨毛膜，例如，來自人胎盤的絨毛膜獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白；不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白；和不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。

在另一具體實施方式中，本文提供了包含約45-55％的膠原蛋白和約15-25％的彈性蛋白的ECM組合物。在具體的實施方式中，所述ECM組合物從胎盤組織，例如，人胎盤組織獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤的絨毛膜，例如，來自人胎盤的絨毛膜獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白；不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白；和不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。

在另一具體實施方式中，本文提供了包含約40-50％的膠原蛋白和約20-30％的彈性蛋白的ECM組合物。在具體的實施方式中，所述ECM組合物從胎盤組織，例如，人胎盤組織獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤的絨毛膜，例如，來自人胎盤的絨毛膜獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白；不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白；和不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。

在另一具體實施方式中，本文提供了包含約30-40％的膠原蛋白和約25-35％的彈性蛋白的ECM組合物。在具體的實施方式中，所述ECM組合物從胎盤組織，例如，人胎盤組織獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤的絨毛膜，例如，來自人胎盤的絨毛膜獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白；不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白；和不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。

在另一具體實施方式中，本文提供了包含約34-43％的膠原蛋白和約16-24％的彈性蛋白的ECM組合物。在具體的實施方式中，所述ECM組合物從胎盤組織，例如，人胎盤組織獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤的絨毛膜，例如，來自人胎盤的絨毛膜獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白；不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白；和不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。

在另一具體實施方式中，本文提供了包含約37-42％的膠原蛋白和約16-24％的彈性蛋白的ECM組合物。在具體的實施方式中，所述ECM組合物從胎盤組織，例如，人胎盤組織獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤的絨毛膜，例如，來自人胎盤的絨毛膜獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白；不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白；和不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。

在另一具體實施方式中，本文提供了包含約30-70％、30-60％、30-50％、30-40％、30-35％、34-43％、35-72％、35-40％、37-42％、40-70％、40-60％、40-50％、40-45％、40-65％、43-68％、45-50％、50-55％或55-60％的膠原蛋白和約10-30％、10-20％、10-15％、15-25％、15-22％、15-20％、16-24％、17-24％、18-21％、18-20％、20-24％、20-30％、20-25％、25-30％或約30-35％的彈性蛋白的ECM組合物。在具體的實施方式中，所述ECM組合物從胎盤組織，例如，人胎盤組織獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤的絨毛膜(例如，絨毛膜板)獲得，例如，來自人胎盤的絨毛膜(例如，絨毛膜板)。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.05％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白。在某些實施方式中，所述ECM組合物包含0.001-0.1％的纖連蛋白、0.001-0.05％的纖連蛋白、0.001-0.01％的纖連蛋白、0.01-0.1％的纖連蛋白或0.01-0.05％的纖連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的層粘連蛋白，例如，少于0.1％的層粘連蛋白、少于0.05％的層粘連蛋白、少于0.01％的層粘連蛋白或少于0.001％的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含層粘連蛋白，例如，0.001-0.1％的層粘連蛋白、0.001-0.05％的層粘連蛋白、0.001-0.01％的層粘連蛋白、0.01-0.1％的層粘連蛋白或0.01-0.05％的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的糖胺聚糖，例如，少于0.1％的糖胺聚糖、少于0.05％的糖胺聚糖、少于0.01％的糖胺聚糖或少于0.001％的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含糖胺聚糖，例如，0.001-0.1％的糖胺聚糖、0.001-0.05％的糖胺聚糖、0.001-0.01％的糖胺聚糖、0.01-0.1％的糖胺聚糖或0.01-0.05％的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白；不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白；和不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在某些實施方式中，所述ECM組合物包含纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.05％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白、少于0.001％的纖連蛋白、0.001-0.1％的纖連蛋白、0.001-0.05％的纖連蛋白、0.001-0.01％的纖連蛋白、0.01-0.1％的纖連蛋白或0.01-0.05％的纖連蛋白；層粘連蛋白，例如，少于0.1％的層粘連蛋白、少于0.05％的層粘連蛋白、少于0.01％的層粘連蛋白、少于0.001％的層粘連蛋白、0.001-0.1％的層粘連蛋白、0.001-0.05％的層粘連蛋白、0.001-0.01％的層粘連蛋白、0.01-0.1％的層粘連蛋白或0.01-0.05％的層粘連蛋白；糖胺聚糖，例如，少于0.1％的糖胺聚糖、少于0.05％的糖胺聚糖、少于0.01％的糖胺聚糖、少于0.001％的糖胺聚糖、0.001-0.1％的糖胺聚糖、0.001-0.05％的糖胺聚糖、0.001-0.01％的糖胺聚糖、0.01-0.1％的糖胺聚糖或0.01-0.05％的糖胺聚糖；和另外地不包含或包含不可檢測量的細(xì)胞因子、生長因子和/或脫氧膽酸。

在另一具體實施方式中，本文提供了包含約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％或約72％的膠原蛋白和約10％、約15％、約18％、約20％、約25％、約30％或約35％的彈性蛋白的ECM組合物。在具體的實施方式中，所述ECM組合物從胎盤組織，例如，人胎盤組織獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤的絨毛膜(例如，絨毛膜板)獲得，例如，來自人胎盤的絨毛膜(例如，絨毛膜板)。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.05％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白。在某些實施方式中，所述ECM組合物包含0.001-0.1％的纖連蛋白、0.001-0.05％的纖連蛋白、0.001-0.01％的纖連蛋白、0.01-0.1％的纖連蛋白或0.01-0.05％的纖連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的層粘連蛋白，例如，少于0.1％的層粘連蛋白、少于0.05％的層粘連蛋白、少于0.01％的層粘連蛋白或少于0.001％的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含層粘連蛋白，例如，0.001-0.1％的層粘連蛋白、0.001-0.05％的層粘連蛋白、0.001-0.01％的層粘連蛋白、0.01-0.1％的層粘連蛋白或0.01-0.05％的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的糖胺聚糖，例如，少于0.1％的糖胺聚糖、少于0.05％的糖胺聚糖、少于0.01％的糖胺聚糖或少于0.001％的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含糖胺聚糖，例如，0.001-0.1％的糖胺聚糖、0.001-0.05％的糖胺聚糖、0.001-0.01％的糖胺聚糖、0.01-0.1％的糖胺聚糖或0.01-0.05％的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白；不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白；和不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在某些實施方式中，所述ECM組合物包含纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.05％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白、少于0.001％的纖連蛋白、0.001-0.1％的纖連蛋白、0.001-0.05％的纖連蛋白、0.001-0.01％的纖連蛋白、0.01-0.1％的纖連蛋白或0.01-0.05％的纖連蛋白；層粘連蛋白，例如，少于0.1％的層粘連蛋白、少于0.05％的層粘連蛋白、少于0.01％的層粘連蛋白、少于0.001％的層粘連蛋白、0.001-0.1％的層粘連蛋白、0.001-0.05％的層粘連蛋白、0.001-0.01％的層粘連蛋白、0.01-0.1％的層粘連蛋白或0.01-0.05％的層粘連蛋白；糖胺聚糖，例如，少于0.1％的糖胺聚糖、少于0.05％的糖胺聚糖、少于0.01％的糖胺聚糖、少于0.001％的糖胺聚糖、0.001-0.1％的糖胺聚糖、0.001-0.05％的糖胺聚糖、0.001-0.01％的糖胺聚糖、0.01-0.1％的糖胺聚糖或0.01-0.05％的糖胺聚糖；和另外地不包含或包含不可檢測量的細(xì)胞因子、生長因子和/或脫氧膽酸。

在另一具體實施方式中，本文提供了包含約31％、約32％、約33％、約34％、約35％、約36％、約37％、約38％、約39％、約40％、約41％、約42％、約43％、約44％、約45％、約46％、約47％、約48％、約49％、約50％、約51％、約52％、約53％、約54％、約55％、約56％、約57％、約58％、約59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％或約72％的膠原蛋白和約10％、約11％、約12％、約13％、約14％、約15％、約16％、約17％、約18％、約19％、約20％、約21％、約22％、約23％、約24％、約25％、約26％、約27％、約28％、約29％、約30％、約31％、約32％、約33％、約34％或35％的彈性蛋白的ECM組合物。在具體的實施方式中，所述ECM組合物從胎盤組織，例如，人胎盤組織獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤的絨毛膜(例如，絨毛膜板)獲得，例如，來自人胎盤的絨毛膜(例如，絨毛膜板)。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.05％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白。在某些實施方式中，所述ECM組合物包含0.001-0.1％的纖連蛋白、0.001-0.05％的纖連蛋白、0.001-0.01％的纖連蛋白、0.01-0.1％的纖連蛋白或0.01-0.05％的纖連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的層粘連蛋白，例如，少于0.1％的層粘連蛋白、少于0.05％的層粘連蛋白、少于0.01％的層粘連蛋白或少于0.001％的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含層粘連蛋白；例如，0.001-0.1％的層粘連蛋白、0.001-0.05％的層粘連蛋白、0.001-0.01％的層粘連蛋白、0.01-0.1％的層粘連蛋白或0.01-0.05％的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的糖胺聚糖，例如，少于0.1％的糖胺聚糖、少于0.05％的糖胺聚糖、少于0.01％的糖胺聚糖或少于0.001％的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含糖胺聚糖，例如，0.001-0.1％的糖胺聚糖、0.001-0.05％的糖胺聚糖、0.001-0.01％的糖胺聚糖、0.01-0.1％的糖胺聚糖或0.01-0.05％的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白；不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白；和不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在某些實施方式中，所述ECM組合物包含纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.05％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白、少于0.001％的纖連蛋白、0.001-0.1％的纖連蛋白、0.001-0.05％的纖連蛋白、0.001-0.01％的纖連蛋白、0.01-0.1％的纖連蛋白或0.01-0.05％的纖連蛋白；層粘連蛋白，例如，少于0.1％的層粘連蛋白、少于0.05％的層粘連蛋白、少于0.01％的層粘連蛋白、少于0.001％的層粘連蛋白、0.001-0.1％的層粘連蛋白、0.001-0.05％的層粘連蛋白、0.001-0.01％的層粘連蛋白、0.01-0.1％的層粘連蛋白或0.01-0.05％的層粘連蛋白；糖胺聚糖，例如，少于0.1％的糖胺聚糖、少于0.05％的糖胺聚糖、少于0.01％的糖胺聚糖、少于0.001％的糖胺聚糖、0.001-0.1％的糖胺聚糖、0.001-0.05％的糖胺聚糖、0.001-0.01％的糖胺聚糖、0.01-0.1％的糖胺聚糖或0.01-0.05％的糖胺聚糖；和另外地不包含或包含不可檢測量的細(xì)胞因子、生長因子和/或脫氧膽酸。

本文提供的ECM組合物可以以多種方式配制，且制劑的類型可以基于，例如，ECM組合物的預(yù)期用途來選擇。本文提供的ECM組合物的示例性制劑詳述于4.1.1節(jié)中。在具體的實施方式中，本文提供的ECM組合物配制為可流動基質(zhì)，例如，為可以使用注射器施用的形式。在另一具體實施方式中，本文提供的ECM組合物配制為顆粒物，例如，為粉末的形式。在另一具體實施方式中，本文提供的ECM組合物配制為薄片。在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物配制為包含作為非-ECM組分的一種或多種組分。參見4.1.1.1節(jié)。

在某些實施方式中，本文提供了包含至少一個本文提供的ECM薄片的疊層。在具體的實施方式中，本文提供了包含兩個ECM薄片的疊層。在另一具體實施方式中，本文提供了包含至少一個本文提供的ECM薄片和至少一個其它平面去細(xì)胞組織(例如，去細(xì)胞/脫水羊膜，其完全去細(xì)胞或被去細(xì)胞以便保留成纖維細(xì)胞層)，或者具有平面人造組織替代物的疊層。在某些實施方式中，疊層可以通過在粘合劑，例如，膠水(例如，天然膠，例如，纖連蛋白、纖維蛋白或合成膠)的存在下將ECM薄片彼此接觸或者一個或多個ECM薄片和另一平面去細(xì)胞組織彼此接觸來產(chǎn)生。在某些實施方式中，疊層可以通過將兩個或更多個ECM薄片或者一個或多個ECM薄片和一個或多個平面去細(xì)胞組織一起熱干燥來產(chǎn)生。

本文提供的ECM組合物可以用于接種一種或多種類型的細(xì)胞和/或包含一種或多種類型的細(xì)胞，即，細(xì)胞可以用本文描述的ECM組合物培養(yǎng)或在其上生長，或者細(xì)胞可以分散在本文描述的ECM組合物中(例如，添加到ECM可流動基質(zhì)組合物中)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本領(lǐng)域中已知的任何細(xì)胞類型可以用本文提供的ECM組合物接種和/或培養(yǎng)，包括干細(xì)胞和非干細(xì)胞兩者。可以在本文提供的ECM組合物上接種的細(xì)胞類型的非限制列表提供在4.1.2節(jié)中。

在另一方面中，本文提供了制備本文描述的ECM組合物的方法。參見4.2節(jié)。在某些實施方式中，本文提供的從胎盤(例如，人胎盤)制備ECM組合物的方法順序地包括以下步驟：(i)從胎盤(例如，從獲自剛生產(chǎn)后的母親的胎盤或從存儲的胎盤)除去羊膜、絨毛膜和臍帶；(ii)使胎盤組織經(jīng)受引起與胎盤組織相關(guān)的細(xì)胞滲透破壞的溶液；(iii)使胎盤與包含清潔劑的溶液接觸；和(iv)使胎盤與包含堿的溶液接觸。在某些實施方式中，從胎盤制備ECM組合物的方法使用胎盤(例如，人胎盤)的絨毛膜，其中所述方法順序地包括以下步驟：(i)從胎盤(例如，從獲自剛生產(chǎn)后的母親的胎盤或從存儲的胎盤)獲得絨毛膜；(ii)使絨毛膜經(jīng)受引起與絨毛膜相關(guān)的細(xì)胞滲透破壞的溶液；(iii)使絨毛膜與包含清潔劑的溶液接觸；和(iv)使絨毛膜與包含堿的溶液接觸。在某些實施方式中，從胎盤制備ECM組合物的方法使用胎盤(例如，人胎盤)的絨毛膜，其中所述方法順序地包括以下步驟：(i)從胎盤(例如，從獲自剛生產(chǎn)后的母親的胎盤或從存儲的胎盤)獲得絨毛膜；(ii)刮擦和清潔絨毛膜；(iii)使絨毛膜經(jīng)受引起與絨毛膜相關(guān)的細(xì)胞滲透破壞的溶液；(iv)使絨毛膜與包含清潔劑的溶液接觸；和(v)研磨和凍干。在某些其它實施方式中，從胎盤制備ECM組合物的方法使用胎盤(例如，人胎盤)的絨毛膜，其中所述方法順序地包括以下步驟：(i)從胎盤(例如，從獲自剛生產(chǎn)后的母親的胎盤或從存儲的胎盤)獲得絨毛膜；(ii)刮擦和清潔絨毛膜；(iii)使絨毛膜經(jīng)受引起與絨毛膜相關(guān)的細(xì)胞滲透破壞的溶液；(iv)使絨毛膜與包含的第一清潔劑溶液接觸，然后與第二清潔劑溶液接觸，所述溶液包含清潔劑和螯合劑，例如，EDTA；和(v)凍干。本文描述的制備ECM組合物的方法使用例如，堿、清潔劑、螯合劑的組分，其量導(dǎo)致產(chǎn)生具有本文描述的那些的特定特征的ECM組合物。

制備本文描述的ECM組合物的方法使用例如，堿、清潔劑的組分，其量導(dǎo)致產(chǎn)生具有本文描述的那些的特定特征的ECM組合物。

在具體的實施方式中，本文提供了制備ECM組合物的方法，所述方法包括(i)從胎盤(例如，從獲自剛生產(chǎn)后的母親的胎盤或從存儲的胎盤)除去羊膜、絨毛膜和臍帶；(ii)將剩余胎盤組織置于引起與胎盤組織相關(guān)的細(xì)胞滲透破壞的溶液(例如，氯化鈉(NaCl，例如，1M NaCl))中并使胎盤組織均質(zhì)化；(iii)使胎盤組織與包含清潔劑，例如，脫氧膽酸鈉(例如，2％的脫氧膽酸鈉)的溶液接觸；(iv)用例如水洗滌胎盤組織；(v)使胎盤組織與包含堿，例如，氫氧化鈉(NaOH，例如，1M NaOH)的溶液接觸；(vi)向包含胎盤組織的溶液添加酸溶液，例如，鹽酸(HCl)，以使其達(dá)到或接近中性pH(例如，pH 6.0-8.0)；和(vii)將胎盤組織與溶液的液體部分分離(例如，通過離心)并收集胎盤組織，由此制備ECM組合物。根據(jù)該方法產(chǎn)生的ECM組合物一般是糊的形式(ECM糊)，其可以在收集后冷凍和存儲用于隨后使用，或者其可以在收集后直接用于制備本文描述的ECM制劑，例如，ECM薄片的制劑、ECM顆粒物制劑或ECM可流動基質(zhì)。

在另一具體實施方式中，本文提供了制備ECM組合物的方法，所述方法包括(i)從胎盤(例如，從獲自剛生產(chǎn)后的母親的胎盤或從存儲的胎盤)獲得絨毛膜；(ii)將絨毛膜組織置于引起與絨毛膜組織相關(guān)的細(xì)胞滲透破壞的溶液(例如，氯化鈉(NaCl，例如，1M NaCl))中并使絨毛膜組織均質(zhì)化；(iii)使絨毛膜組織與包含清潔劑，例如，脫氧膽酸鈉(例如，2％的脫氧膽酸鈉)的溶液接觸；(iv)用例如水洗滌絨毛膜組織；(v)使絨毛膜組織與包含堿，例如，氫氧化鈉(NaOH，例如，1M NaOH)的溶液接觸；(vi)向包含絨毛膜組織的溶液添加酸溶液，例如，鹽酸(HCl)，以使其達(dá)到或接近中性pH(例如，pH 6.0-8.0)；和(vii)將絨毛膜組織與溶液的液體部分分離(例如，通過離心)并收集絨毛膜組織，由此制備ECM組合物。根據(jù)該方法產(chǎn)生的ECM組合物一般是糊的形式(ECM糊)，其可以在收集后冷凍和存儲用于隨后使用，或者其可以在收集后直接用于制備本文描述的ECM制劑，例如，ECM薄片的制劑、ECM顆粒物制劑或ECM可流動基質(zhì)。

在另一具體實施方式中，本文提供了制備ECM組合物的方法，所述方法包括(i)從胎盤(例如，從獲自剛生產(chǎn)后的母親的胎盤或從存儲的胎盤)獲得絨毛膜，例如，絨毛膜板；(ii)刮擦和清潔絨毛膜；(iii)將絨毛膜組織置于引起與絨毛膜組織相關(guān)的細(xì)胞滲透破壞的溶液(例如，氯化鈉(NaCl，例如，0.5M NaCl))中；(iv)使絨毛膜組織與包含清潔劑，例如，脫氧膽酸或脫氧膽酸鈉(例如，2％的脫氧膽酸或脫氧膽酸鈉)的溶液接觸并清洗，例如，通過水清洗；和(v)研磨和凍干。ECM組合物(一般為糊(ECM糊))可以配制，例如，碾磨和配制，成各種形狀和形式，例如，ECM薄片、ECM顆粒物制劑或ECM可流動基質(zhì)。

在再另一具體實施方式中，本文提供了制備ECM組合物的方法，所述方法包括(i)從胎盤(例如，從獲自剛生產(chǎn)后的母親的胎盤或從存儲的胎盤)獲得絨毛膜，例如，絨毛膜板；(ii)刮擦和清潔絨毛膜；(iii)將絨毛膜組織置于引起與絨毛膜組織相關(guān)的細(xì)胞滲透破壞的溶液(例如，氯化鈉(NaCl，例如，1.0M NaCl))中；(iv)使絨毛膜組織與包含清潔劑，例如，脫氧膽酸或脫氧膽酸鈉(例如，0.05％-0.2％或0.3％-0.6％的脫氧膽酸或脫氧膽酸鈉)，和EDTA(例如，1-5mM EDTA或5-10mM EDTA)的第一清潔劑溶液接觸；(v)使絨毛膜組織與包含清潔劑，例如，脫氧膽酸或脫氧膽酸鈉(例如，0.05％-0.2％或0.3％-0.6％的脫氧膽酸或脫氧膽酸鈉)，和EDTA(例如，1-5mM EDTA或5-10mM EDTA)的第二清潔劑溶液接觸，并例如，通過水清洗；(vi)凍干以產(chǎn)生去細(xì)胞的凍干的全絨毛膜，其可以配制，例如，碾磨和重懸浮在溶液(例如，水或磷酸鹽緩沖鹽水)中以形成去細(xì)胞的ECM糊，并配制成各種形狀和形式，例如，ECM薄片、ECM顆粒物制劑或ECM可流動基質(zhì)。

在具體的實施方式中，本文提供了產(chǎn)生ECM薄片的方法，所述方法包括(i)根據(jù)本文描述的方法制備ECM糊；(ii)懸浮ECM糊在，例如，水中，并添加懸浮的ECM溶液到合適的基質(zhì)用于形成薄片，例如，添加ECM到模具；(iii)冷凍ECM；(iv)凍干冷凍的ECM；(v)從基質(zhì)移除凍干的ECM并將其浸沒于水中；和(vi)干燥ECM，例如，使用真空干燥器。

在具體的實施方式中，本文提供了產(chǎn)生ECM顆粒物的方法，所述方法包括(i)根據(jù)本文描述的方法制備ECM糊；(ii)懸浮ECM糊在，例如，水中；(iii)冷凍ECM；(iv)凍干冷凍的ECM；和(v)碾磨凍干的ECM。

在具體的實施方式中，本文提供了產(chǎn)生ECM可流動基質(zhì)的方法，所述方法包括(i)根據(jù)本文描述的方法制備ECM糊；(ii)懸浮ECM糊在，例如，水中；(iii)冷凍ECM；(iv)凍干冷凍的ECM；和(v)使凍干的ECM微粉化。在微粉化的ECM懸浮在，例如，鹽水中時，產(chǎn)生ECM可流動基質(zhì)。

在另一方面中，本文提供了本文提供的ECM組合物的用途。參見4.3節(jié)。在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物用于治療/醫(yī)學(xué)目的。參見4.3.1節(jié)。在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物用于美容目的。參見4.3.2節(jié)。

在具體的實施方式中，本文提供的ECM組合物用于傷口治療和/或處理。參見4.3.1節(jié)。在具體的實施方式中，本文提供的ECM組合物用于填充傷口，即，作為傷口填充料。在另一具體實施方式中，本文提供的ECM組合物用于包扎(即，覆蓋)傷口，例如，由燒傷引起的傷口。

在另一具體實施方式中，本文提供的ECM組合物用于治療和/或處理牙科病癥，例如，修復(fù)牙體缺損。參見4.3.2節(jié)。

在另一具體實施方式中，本文提供的ECM組合物用于治療和/或處理口腔病變，參見4.3.3節(jié)。

在另一具體實施方式中，本文提供的ECM組合物用于密封、填充和/或以其它方式處理受試者身體內(nèi)的空隙。參見4.3.4節(jié)。

在另一具體實施方式中，本文提供的ECM組合物用于受試者中的組織增量(tissue bulking)。參見4.3.5節(jié)。

在另一具體實施方式中，本文提供的ECM組合物用于治療受試者的尿失禁。參見4.3.6節(jié)。

在另一具體實施方式中，本文提供的ECM組合物用于治療受試者的膀胱輸尿管反流。參見4.3.7節(jié)。

在另一具體實施方式中，本文提供的ECM組合物用于治療受試者的胃食管反流病。參見4.3.8節(jié)。

在另一具體實施方式中，本文提供的ECM組合物用于治療受試者中影響聲帶和/或喉之一或兩者的疾病、障礙或其它異常。參見4.3.9節(jié)。

在另一具體實施方式中，本文提供的ECM組合物用于處理或治療受試者中的聲門閉合不全(glottic incompetence)。參見4.3.10節(jié)。

在另一具體實施方式中，本文提供的ECM組合物用于組織或器官的生物工程。參見4.3.11節(jié)。

在另一具體實施方式中，本文提供的ECM組合物用于美容目的，例如，為美容目的增強(qiáng)(augment)受試者的皮膚(例如，使受試者看起來更年輕)。參見4.3.12節(jié)。

在另一方面中，本文提供了包含本文提供的ECM組合物的試劑盒。本文提供的試劑盒通常在便于分配給具有本領(lǐng)域技能的實施者的包裝中包含本文描述的ECM組合物。參見第5節(jié)。

3.1附圖說明

圖1A-1F：在植入白化新西蘭白兔后，根據(jù)本文描述的方法制備的ECM薄片的組織反應(yīng)性與豬膀胱基質(zhì)組織的反應(yīng)性相比較。在植入后第1周，鄰近膀胱基質(zhì)(UBM)薄片的組織顯示肉芽形成和炎癥反應(yīng)的明顯跡象(圖1A)，而ECM薄片顯示散布著粒細(xì)胞的輕度浸潤的肌肉組織(圖1B)。在第2和第4周，肉芽形成鄰近UBM薄片仍然是明顯的(圖1C和1E)，而鄰近ECM薄片的組織事實上沒有顯示肉芽形成且看起來是正常的(圖1D和1F)。

圖2A-2F：在植入白化新西蘭白兔后，根據(jù)本文描述的方法制備的ECM顆粒物的組織反應(yīng)性與MATRISTEM的組織反應(yīng)性相比較。在植入后第1周，ECM顆粒物顯示出表明炎癥的一些肉芽形成(圖2B)，但顯著少于UBM顆粒物(圖2A)，而在第2和第4周，ECM顆粒物與UBM顆粒物相比顯示肉芽形成的顯著減少(分別圖2D和2F)，UBM顆粒物在第2和第4周時仍然顯示出大量的炎癥(分別圖2C和2E)。

圖3A-3F：在植入白化新西蘭白兔后，根據(jù)本文描述的方法制備的ECM可流動基質(zhì)的組織反應(yīng)性與牛來源的傷口基質(zhì)產(chǎn)品(INTEGRA^TM Flowable)的組織反應(yīng)性相比較。牛來源的傷口基質(zhì)產(chǎn)品(INTEGRA^TM Flowable)在第1周時顯示肉芽形成(圖3A)，在第2和第4周時顯示瘢痕形成(圖3C和3E中的較亮區(qū)域)，而ECM可流動基質(zhì)僅在第1周中顯示實質(zhì)的炎性反應(yīng)(圖3B)，接著在第2和第4周時接近完全痊愈(分別圖3D和3F)。

4.具體實施方式

本文提供了細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組合物(參見4.1節(jié))及其制備方法(參見4.2節(jié))。本文還提供了本文提供的ECM組合物的用途(參見4.3節(jié))和包含本文提供的ECM組合物的試劑盒(參見第5節(jié))。

4.1細(xì)胞外基質(zhì)組合物

在一個方面中，本文提供了使用胎盤組織，例如，人胎盤組織制備的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組合物。本文描述的ECM組合物包含ECM組分，例如，膠原蛋白和彈性蛋白，其量與本領(lǐng)域中已知的ECM組合物中的量不同。

在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物包含約30％-約60％的膠原蛋白和約10％-約35％的彈性蛋白。如本文中使用的，術(shù)語“約”是指所指的數(shù)值加或減10％的量。另外，本文提供的這類ECM組合物包含(i)非常低量的纖連蛋白(例如，少于0.1％的纖連蛋白)，例如，如通過ELISA測量的；(ii)沒有或不可檢測量的層粘連蛋白，例如，如通過ELISA測量的；和/或沒有或不可檢測量的糖胺聚糖，例如，如通過ELISA測量的。

在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物包含約30％-約72％的膠原蛋白和約10％-約35％的彈性蛋白。另外，這類ECM組合物可以包含(i)纖連蛋白(例如，少于0.1％的纖連蛋白)，例如，如通過ELISA測量的；(ii)層粘連蛋白(例如，少于0.1％的層粘連蛋白)，例如，如通過ELISA測量的；糖胺聚糖(例如，少于0.1％的糖胺聚糖)，例如，如通過ELISA測量的；(iii)沒有或不可檢測量的細(xì)胞因子；(iv)沒有或不可檢測量的生長因子；和/或(v)沒有或不可檢測量的脫氧膽酸。

本文提供的ECM組合物具有使得它們非常適合于治療/醫(yī)學(xué)用途的特征。具體地，本文描述的ECM組合物是無菌的、無細(xì)胞的(例如，≥99％無細(xì)胞)和/或不含細(xì)胞碎片的(例如，≥99％不含細(xì)胞碎片)。在特定實施方式中，本文提供的ECM組合物不包含細(xì)胞因子或包含不可檢測量的細(xì)胞因子，如通過例如ELISA測量的。在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物還缺乏試劑殘留物，即，最終ECM組合物包含不可檢測量的用于制備組合物的試劑。此外，在特定實施方式中，本文提供的ECM組合物包含最少量的核酸(～41-171ng/mg干產(chǎn)物)和內(nèi)毒素(<0.25EU)。

本文提供的ECM組合物的另一有利特征是其吸水的能力。在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物吸收150％-225％的其重量的水。

在具體的實施方式中，本文提供了包含34-53％的膠原蛋白和13-29％的彈性蛋白的ECM組合物。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤組織，例如，人胎盤組織獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤的絨毛膜，例如，來自人胎盤的絨毛膜獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白；不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白；和不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。

在另一具體實施方式中，本文提供了包含約35-55％的膠原蛋白和約10-30％的彈性蛋白的ECM組合物。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤組織，例如，人胎盤組織獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤的絨毛膜，例如，來自人胎盤的絨毛膜獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白；不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白；和不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。

在具體的實施方式中，本文提供了包含約35-72％的膠原蛋白和約15-25％的彈性蛋白的ECM組合物。在另一具體實施方式中，本文提供了包含約40-70％的膠原蛋白和約15-25％的彈性蛋白的ECM組合物。在另一具體實施方式中，所述組合物包含40-70％的膠原蛋白和15-22％的彈性蛋白。在再另一具體實施方式中，所述組合物包含43-68％的膠原蛋白和18-21％的彈性蛋白。在某些實施方式中，所述ECM組合物包含纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.05％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白、少于0.001％的纖連蛋白、0.001-0.1％的纖連蛋白、0.001-0.05％的纖連蛋白、0.001-0.01％的纖連蛋白、0.01-0.1％的纖連蛋白或0.01-0.05％的纖連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含層粘連蛋白，例如，少于0.1％的層粘連蛋白、少于0.05％的層粘連蛋白、少于0.01％的層粘連蛋白、少于0.001％的層粘連蛋白、0.001-0.1％的層粘連蛋白、0.001-0.05％的層粘連蛋白、0.001-0.01％的層粘連蛋白、0.01-0.1％的層粘連蛋白或0.01-0.05％的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含糖胺聚糖，例如，少于0.1％的糖胺聚糖、少于0.05％的糖胺聚糖、少于0.01％的糖胺聚糖、少于0.001％的糖胺聚糖、0.001-0.1％的糖胺聚糖、0.001-0.05％的糖胺聚糖、0.001-0.01％的糖胺聚糖、0.01-0.1％的糖胺聚糖或0.01-0.05％的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的細(xì)胞因子、生長因子和/或脫氧膽酸。在某些實施方式中，所述ECM組合物包含纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.05％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白、少于0.001％的纖連蛋白、0.001-0.1％的纖連蛋白、0.001-0.05％的纖連蛋白、0.001-0.01％的纖連蛋白、0.01-0.1％的纖連蛋白或0.01-0.05％的纖連蛋白；層粘連蛋白，例如，少于0.1％的層粘連蛋白、少于0.05％的層粘連蛋白、少于0.01％的層粘連蛋白、少于0.001％的層粘連蛋白、0.001-0.1％的層粘連蛋白、0.001-0.05％的層粘連蛋白、0.001-0.01％的層粘連蛋白、0.01-0.1％的層粘連蛋白或0.01-0.05％的層粘連蛋白；糖胺聚糖，例如，少于0.1％的糖胺聚糖、少于0.05％的糖胺聚糖、少于0.01％的糖胺聚糖、少于0.001％的糖胺聚糖、0.001-0.1％的糖胺聚糖、0.001-0.05％的糖胺聚糖、0.001-0.01％的糖胺聚糖、0.01-0.1％的糖胺聚糖或0.01-0.05％的糖胺聚糖，且另外地不包含或包含不可檢測量的細(xì)胞因子、生長因子和/或脫氧膽酸。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤組織，例如，人胎盤組織獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤的絨毛膜(例如胎盤的絨毛膜板)獲得，例如，來自人胎盤的絨毛膜(例如絨毛膜板)。

在另一具體實施方式中，本文提供了包含約50-60％的膠原蛋白和約10-20％的彈性蛋白的ECM組合物。在具體的實施方式中，所述ECM組合物從胎盤組織，例如，人胎盤組織獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤的絨毛膜，例如，來自人胎盤的絨毛膜獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白；不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白；和不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。

在另一具體實施方式中，本文提供了包含約45-55％的膠原蛋白和約15-25％的彈性蛋白的ECM組合物。在具體的實施方式中，所述ECM組合物從胎盤組織，例如，人胎盤組織獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤的絨毛膜，例如，來自人胎盤的絨毛膜獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白；不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白；和不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。

在另一具體實施方式中，本文提供包含約40-50％的膠原蛋白和約20-30％的彈性蛋白的ECM組合物。在具體的實施方式中，所述ECM組合物從胎盤組織，例如，人胎盤組織獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤的絨毛膜，例如，來自人胎盤的絨毛膜獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白；不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白；和不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。

在另一具體實施方式中，本文提供了包含約30-40％的膠原蛋白和約25-35％的彈性蛋白的ECM組合物。在具體的實施方式中，所述ECM組合物從胎盤組織，例如，人胎盤組織獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤的絨毛膜，例如，來自人胎盤的絨毛膜獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白；不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白；和不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。

在另一具體實施方式中，本文提供了包含約34-43％的膠原蛋白和約16-24％的彈性蛋白的ECM組合物。在具體的實施方式中，所述ECM組合物從胎盤組織，例如，人胎盤組織獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤的絨毛膜，例如，來自人胎盤的絨毛膜獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白；不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白；和不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。

在另一具體實施方式中，本文提供了包含約37-42％的膠原蛋白和約16-24％的彈性蛋白的ECM組合物。在具體的實施方式中，所述ECM組合物從胎盤組織，例如，人胎盤組織獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤的絨毛膜，例如，來自人胎盤的絨毛膜獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白；不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白；和不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。

在另一具體實施方式中，本文提供了包含約30-70％、30-60％、30-50％、30-40％、30-35％、34-43％、35-72％、35-40％、37-42％、40-70％、40-60％、40-50％、40-45％、40-65％、43-68％、45-50％、50-55％或55-60％的膠原蛋白和約10-30％、10-20％、10-15％、15-25％、15-22％、15-20％、16-24％、17-24％、18-21％、18-20％、20-24％、20-30％、20-25％、25-30％或約30-35％的彈性蛋白的ECM組合物。在具體的實施方式中，所述ECM組合物從胎盤組織，例如，人胎盤組織獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤的絨毛膜(例如絨毛膜板)獲得，例如，來自人胎盤的絨毛膜(例如，絨毛膜板)。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.05％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白。在某些實施方式中，所述ECM組合物包含0.001-0.1％的纖連蛋白、0.001-0.05％的纖連蛋白、0.001-0.01％的纖連蛋白、0.01-0.1％的纖連蛋白或0.01-0.05％的纖連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的層粘連蛋白，例如，少于0.1％的層粘連蛋白、少于0.05％的層粘連蛋白、少于0.01％的層粘連蛋白或少于0.001％的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含層粘連蛋白，例如，0.001-0.1％的層粘連蛋白、0.001-0.05％的層粘連蛋白、0.001-0.01％的層粘連蛋白、0.01-0.1％的層粘連蛋白或0.01-0.05％的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的糖胺聚糖，例如，少于0.1％的糖胺聚糖、少于0.05％的糖胺聚糖、少于0.01％的糖胺聚糖或少于0.001％的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含糖胺聚糖，例如，0.001-0.1％的糖胺聚糖、0.001-0.05％的糖胺聚糖、0.001-0.01％的糖胺聚糖、0.01-0.1％的糖胺聚糖或0.01-0.05％的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白；不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白；和不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在某些實施方式中，所述ECM組合物包含纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.05％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白、少于0.001％的纖連蛋白、0.001-0.1％的纖連蛋白、0.001-0.05％的纖連蛋白、0.001-0.01％的纖連蛋白、0.01-0.1％的纖連蛋白或0.01-0.05％的纖連蛋白；層粘連蛋白，例如，少于0.1％的層粘連蛋白、少于0.05％的層粘連蛋白、少于0.01％的層粘連蛋白、少于0.001％的層粘連蛋白、0.001-0.1％的層粘連蛋白、0.001-0.05％的層粘連蛋白、0.001-0.01％的層粘連蛋白、0.01-0.1％的層粘連蛋白或0.01-0.05％的層粘連蛋白；糖胺聚糖，例如，少于0.1％的糖胺聚糖、少于0.05％的糖胺聚糖、少于0.01％的糖胺聚糖、少于0.001％的糖胺聚糖、0.001-0.1％的糖胺聚糖、0.001-0.05％的糖胺聚糖、0.001-0.01％的糖胺聚糖、0.01-0.1％的糖胺聚糖或0.01-0.05％的糖胺聚糖，且另外地不包含或包含不可檢測量的細(xì)胞因子、生長因子和/或脫氧膽酸。

在另一具體實施方式中，本文提供了包含約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％或約72％的膠原蛋白和約10％、約15％、約18％、約20％、約25％、約30％,或約35％的彈性蛋白的ECM組合物。在具體的實施方式中，所述ECM組合物從胎盤組織，例如，人胎盤組織獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤的絨毛膜(例如，絨毛膜板)獲得，例如，來自人胎盤的絨毛膜(例如，絨毛膜板)。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.05％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白。在某些實施方式中，所述ECM組合物包含0.001-0.1％的纖連蛋白、0.001-0.05％的纖連蛋白、0.001-0.01％的纖連蛋白、0.01-0.1％的纖連蛋白或0.01-0.05％的纖連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的層粘連蛋白，例如，少于0.1％的層粘連蛋白、少于0.05％的層粘連蛋白、少于0.01％的層粘連蛋白或少于0.001％的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含層粘連蛋白，例如，0.001-0.1％的層粘連蛋白、0.001-0.05％的層粘連蛋白、0.001-0.01％的層粘連蛋白、0.01-0.1％的層粘連蛋白或0.01-0.05％的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的糖胺聚糖，例如，少于0.1％的糖胺聚糖、少于0.05％的糖胺聚糖、少于0.01％的糖胺聚糖或少于0.001％的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含糖胺聚糖，例如，0.001-0.1％的糖胺聚糖、0.001-0.05％的糖胺聚糖、0.001-0.01％的糖胺聚糖、0.01-0.1％的糖胺聚糖或0.01-0.05％的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白；不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白；和不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在某些實施方式中，所述ECM組合物包含纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.05％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白、少于0.001％的纖連蛋白、0.001-0.1％的纖連蛋白、0.001-0.05％的纖連蛋白、0.001-0.01％的纖連蛋白、0.01-0.1％的纖連蛋白或0.01-0.05％的纖連蛋白；層粘連蛋白，例如，少于0.1％的層粘連蛋白、少于0.05％的層粘連蛋白、少于0.01％的層粘連蛋白、少于0.001％的層粘連蛋白、0.001-0.1％的層粘連蛋白、0.001-0.05％的層粘連蛋白、0.001-0.01％的層粘連蛋白、0.01-0.1％的層粘連蛋白或0.01-0.05％的層粘連蛋白；糖胺聚糖，例如，少于0.1％的糖胺聚糖、少于0.05％的糖胺聚糖、少于0.01％的糖胺聚糖、少于0.001％的糖胺聚糖、0.001-0.1％的糖胺聚糖、0.001-0.05％的糖胺聚糖、0.001-0.01％的糖胺聚糖、0.01-0.1％的糖胺聚糖或0.01-0.05％的糖胺聚糖，和另外地不包含或包含不可檢測量的細(xì)胞因子、生長因子和/或脫氧膽酸。

在另一具體實施方式中，本文提供了包含約31％、約32％、約33％、約34％、約35％、約36％、約37％、約38％、約39％、約40％、約41％、約42％、約43％、約44％、約45％、約46％、約47％、約48％、約49％、約50％、約51％、約52％、約53％、約54％、約55％、約56％、約57％、約58％、約59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％或約72％的膠原蛋白和約10％、約11％、約12％、約13％、約14％、約15％、約16％、約17％、約18％、約19％、約20％、約21％、約22％、約23％、約24％、約25％、約26％、約27％、約28％、約29％、約30％、約31％、約32％、約33％、約34％,或35％的彈性蛋白的ECM組合物。在具體的實施方式中，所述ECM組合物從胎盤組織，例如，人胎盤組織獲得。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物從胎盤的絨毛膜(例如，絨毛膜板)獲得，例如，來自人胎盤的絨毛膜(例如，絨毛膜板)。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.05％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白。在某些實施方式中，所述ECM組合物包含0.001-0.1％的纖連蛋白、0.001-0.05％的纖連蛋白、0.001-0.01％的纖連蛋白、0.01-0.1％的纖連蛋白或0.01-0.05％的纖連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的層粘連蛋白，例如，少于0.1％的層粘連蛋白、少于0.05％的層粘連蛋白、少于0.01％的層粘連蛋白或少于0.001％的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含層粘連蛋白，例如，0.001-0.1％的層粘連蛋白、0.001-0.05％的層粘連蛋白、0.001-0.01％的層粘連蛋白、0.01-0.1％的層粘連蛋白或0.01-0.05％的層粘連蛋白。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的糖胺聚糖，例如，少于0.1％的糖胺聚糖、少于0.05％的糖胺聚糖、少于0.01％的糖胺聚糖或少于0.001％的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含糖胺聚糖，例如，0.001-0.1％的糖胺聚糖、0.001-0.05％的糖胺聚糖、0.001-0.01％的糖胺聚糖、0.01-0.1％的糖胺聚糖或0.01-0.05％的糖胺聚糖。在另一具體實施方式中，所述ECM組合物包含非常低量的纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白或少于0.001％的纖連蛋白；不包含或包含不可檢測量的層粘連蛋白；和不包含或包含不可檢測量的糖胺聚糖。在某些實施方式中，所述ECM組合物包含纖連蛋白，例如，少于0.1％的纖連蛋白、少于0.05％的纖連蛋白、少于0.01％的纖連蛋白、少于0.001％的纖連蛋白、0.001-0.1％的纖連蛋白、0.001-0.05％的纖連蛋白、0.001-0.01％的纖連蛋白、0.01-0.1％的纖連蛋白或0.01-0.05％的纖連蛋白；層粘連蛋白，例如，少于0.1％的層粘連蛋白、少于0.05％的層粘連蛋白、少于0.01％的層粘連蛋白、少于0.001％的層粘連蛋白、0.001-0.1％的層粘連蛋白、0.001-0.05％的層粘連蛋白、0.001-0.01％的層粘連蛋白、0.01-0.1％的層粘連蛋白或0.01-0.05％的層粘連蛋白；糖胺聚糖，例如，少于0.1％的糖胺聚糖、少于0.05％的糖胺聚糖、少于0.01％的糖胺聚糖、少于0.001％的糖胺聚糖、0.001-0.1％的糖胺聚糖、0.001-0.05％的糖胺聚糖、0.001-0.01％的糖胺聚糖、0.01-0.1％的糖胺聚糖或0.01-0.05％的糖胺聚糖，和另外地不包含或包含不可檢測量的細(xì)胞因子、生長因子和/或脫氧膽酸。

在某些實施方式中，本文描述的ECM組合物中的膠原蛋白包含端肽膠原蛋白或由其組成。在某些實施方式中，本文描述的ECM組合物中的膠原蛋白包含非端肽膠原蛋白(atelopeptide collagen)或由其組成。在某些實施方式中，由端肽膠原蛋白和無端肽膠原蛋白組成。

本文提供的ECM組合物中膠原蛋白的主要類型是I型膠原蛋白。在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物中的膠原蛋白包含按干重計至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或大于80％的I型膠原蛋白。在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物中的膠原蛋白包含按干重計50％和70％之間的I型膠原蛋白、60％和80％之間的I型膠原蛋白或70％和90％之間的I型膠原蛋白。在具體的實施方式中，本文提供的ECM組合物中的膠原蛋白包含60％和80％之間的I型膠原蛋白。

在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物中的膠原蛋白包含膠原蛋白類型的混合物，例如，包含I型膠原蛋白以及III型膠原蛋白和/或IV型膠原蛋白。

在具體的實施方式中，本文提供的ECM組合物中的膠原蛋白包含大量的I型膠原蛋白(例如，60％-80％的I型膠原蛋白)，同時也包含III型膠原蛋白。例如，除I型膠原蛋白外，本文提供的ECM組合物中的膠原蛋白可以包含按干重計1％和5％之間的III型膠原蛋白、5％和10％之間的III型膠原蛋白或1％和10％之間的III型膠原蛋白；或者本文提供的ECM組合物中的膠原蛋白可以包含按干重計約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％或約10％的III型膠原蛋白。

在另一具體實施方式中，本文提供的ECM組合物中的膠原蛋白包含大量的I型膠原蛋白(例如，60％-80％的I型膠原蛋白)，同時也包含IV型膠原蛋白。例如，除I型膠原蛋白外，本文提供的ECM組合物中的膠原蛋白可以包含按干重計1％和5％之間的IV型膠原蛋白、5％和10％之間的IV型膠原蛋白或1％和10％之間的IV型膠原蛋白；或者本文提供的ECM組合物中的膠原蛋白可以包含按干重計約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％或約10％的IV型膠原蛋白。

在另一具體實施方式中，本文提供的ECM組合物中的膠原蛋白包含大量的I型膠原蛋白(例如，60％-80％的I型膠原蛋白)，同時也包含III型膠原蛋白和IV型膠原蛋白。例如，除I型膠原蛋白外，本文提供的ECM組合物中的膠原蛋白可以包含按干重計(i)1％和5％之間的III型膠原蛋白、5％和10％之間的III型膠原蛋白或1％和10％之間的III型膠原蛋白；或者本文提供的ECM組合物中的膠原蛋白可以包含按干重計約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％或約10％的III型膠原蛋白；和(ii)按干重計1％和5％之間的IV型膠原蛋白、5％和10％之間的IV型膠原蛋白或1％和10％之間的IV型膠原蛋白；或者本文提供的ECM組合物中的膠原蛋白可以包含按干重計約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％或約10％的IV型膠原蛋白。

在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物中的膠原蛋白是交聯(lián)的，例如，用交聯(lián)劑交聯(lián)。示例性的交聯(lián)劑包括戊二醛(參見，例如，U.S.專利No.4,852,640,5,428,022,5,660,692和5,008,116，其內(nèi)容通過引入整體并入本文)、1,4-丁二醇二縮水甘油醚和京尼平(參見，例如，U.S.專利申請公開No.2003/0049301，其內(nèi)容通過引入整體并入本文)。其它的示例性交聯(lián)劑和交聯(lián)膠原蛋白的方法描述于U.S.專利No.5,880,242和6,117,979中及Zeeman等,2000,J Biomed Mater Res.51(4):541-8,van Wachem等,2000,J Biomed Mater Res.53(1):18-27,van Wachem等,1999,J Biomed Mater Res.47(2):270-7,Zeeman等,1999,J Biomed Mater Res.46(3):424-33,Zeeman等,1999,Biomaterials 20(10):921-31中，其內(nèi)容通過引入整體并入本文。

4.1.1制劑

本文提供的ECM組合物可以以多種方式配制，且制劑類型可以基于，例如，ECM組合物的預(yù)想用途來選擇。

在具體的實施方式中，本文提供的ECM組合物配制為可流動基質(zhì)，例如，可以使用注射器施用的形式。因此，本文提供了包含本文描述的ECM組合物的注射器。在某些實施方式中，本文提供的可流動基質(zhì)ECM組合物可以在水或磷酸鹽緩沖鹽水中配制為，例如，溶液或懸浮液，例如，嗽口水。當(dāng)在溶液中時(即，作為可流動基質(zhì))，本文提供的ECM組合物可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的任何濃度存在。在某些實施方式中，本文提供的可流動基質(zhì)ECM組合物包含200-300mg/ml、100-200mg/ml、150-250mg/ml、0.1-100mg/ml、1-100mg/ml、1-75mg/ml、1-50mg/ml、1-40mg/ml、10-40mg/ml或20-40mg/ml的ECM。在某些實施方式中，本文提供的可流動基質(zhì)ECM組合物包含約5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml ECM、75mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml、225mg/ml、250mg/ml、275mg/ml或300mg/ml的ECM。在具體的實施方式中，本文提供了包含約200mg/ml的ECM的可流動基質(zhì)ECM組合物。在某些實施方式中，本文提供的可流動基質(zhì)ECM組合物通過本領(lǐng)域技術(shù)人員使用利用本文描述的方法制備的凍干的、微粉化的ECM制備，例如，所述凍干的、微粉化的ECM以試劑盒的形式提供，伴隨適宜的懸浮溶液，例如，鹽水，且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過將凍干的、微粉化的ECM懸浮在懸浮溶液中容易地產(chǎn)生可流動基質(zhì)ECM組合物。

在另一具體實施方式中，本文提供的ECM組合物配制為顆粒物，例如，為粉末形式。當(dāng)作為顆粒物存在時，本文提供的ECM組合物可以提供在適合儲存顆粒物的任何容器中，例如，小瓶(例如，玻璃小瓶)。當(dāng)作為顆粒物存在時，本文提供的ECM組合物可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的任何濃度提供在容器中。在某些實施方式中，本文提供的顆粒物ECM組合物包含200-300mg、100-200mg、150-250mg、50-100mg、25-50mg、10-25mg、5-10mg或1-5mg的ECM。在某些實施方式中，本文提供的可流動基質(zhì)ECM組合物包含約5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40m、45mg、50m ECM、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg或300mg的ECM。在具體的實施方式中，本文提供了包含約200mg ECM的顆粒物ECM組合物。在另一具體實施方式中，本文提供了包含約100mg ECM的顆粒物ECM組合物。

在另一具體實施方式中，本文提供的ECM組合物配制為薄片，即，平面的固體ECM層。當(dāng)作為薄片存在時，本文提供的ECM組合物可以成形為適合其預(yù)期用途的任何厚度和尺寸的薄片。在某些實施方式中，本文提供的ECM薄片以標(biāo)準(zhǔn)尺寸提供，例如，5x 5cm或8x 8cm尺寸，且可以在使用前由本領(lǐng)域技術(shù)人員操作(例如，切割)，例如，切割以使得它們具有適合其預(yù)期用途(例如，作為傷口敷料)的尺寸。在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物配制為具有約0.1-0.15mm、0.15-0.2mm、0.1-0.2mm、0.2-0.25mm、0.25-0.3mm或0.2-0.3mm的厚度的薄片。在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物配制為具有約0.1mm、0.15mm、0.2mm、0.25mm或0.3mm的厚度的薄片。在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物配制為2x 2cm薄片、3x 3cm薄片、4x 4cm薄片、5x 5cm薄片、6x 6cm薄片、7x 7cm薄片、8x 8cm薄片或9x 9cm薄片，其中所述薄片具有約0.1-0.15mm、0.15-0.2mm、0.1-0.2mm、0.2-0.25mm、0.25-0.3mm或0.2-0.3mm的厚度。

在某些實施方式中，本文提供了包含至少一個本文提供的ECM薄片的疊層。在具體的實施方式中，本文提供了包含兩個ECM薄片的疊層。在另一具體實施方式中，本文提供了包含至少一個本文提供的ECM薄片和至少一個另外的平面去細(xì)胞組織(例如，去細(xì)胞/脫水的羊膜，其完全去細(xì)胞或被去細(xì)胞以保留成纖維細(xì)胞層)，或者具有平面人造組織替代物的疊層。在某些實施方式中，疊層可以通過在粘合劑，例如，膠水(例如，天然膠，例如，纖連蛋白、纖維蛋白，或合成膠)的存在下將ECM薄片或者將一個或多個ECM薄片和另一平面去細(xì)胞組織彼此接觸來產(chǎn)生。在某些實施方式中，疊層可以通過將兩個或更多個ECM薄片或者一個或多個ECM薄片和一個或多個平面去細(xì)胞組織一起熱干燥來產(chǎn)生。

4.1.1.1非-ECM組分

在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物配制為包含正常情況下不與ECM相關(guān)的一種或多種組分。

在一個實施方式中，本文提供的ECM組合物與藥學(xué)上或美容上可接受的載體組合，以使得ECM組合物適合施用于受試者，例如，需要這種施用的人類受試者。施用的形式包括，但不限于注射劑、溶液、乳膏、凝膠、植入物、泵、油膏、乳液、懸浮液、微球、顆粒、微粒、納米顆粒、脂質(zhì)體、糊劑、貼片、片劑、透皮遞送裝置、噴霧劑、氣霧劑和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方式。這樣的藥學(xué)上或美容上可接受的載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的。術(shù)語“藥學(xué)上或美容上可接受的載體”或“藥學(xué)上或美容上可接受的媒介”在本文中用于指(但不限于)任何液體、固體或半固體，包括但不限于，水或鹽水、凝膠、乳膏、藥膏、溶劑、稀釋劑、流體軟膏基質(zhì)、油膏、糊料、植入物、脂質(zhì)體、膠束、巨膠束等等，其適合用于與活的動物或人體組織接觸而不引起不良的生理或美容反應(yīng)，且其不以有害的方式與組合物(例如，ECM)的其它組分相互作用。

在一個實施方式中，本文提供的ECM組合物構(gòu)造為使得其能夠釋放活性成分，例如，除ECM組合物之外的活性成分。例如，本文提供的ECM組合物可以在生產(chǎn)過程中或之后用生物分子浸漬。示例性的生物分子包括，但不限于抗生素(如克林霉素、米諾環(huán)素、強(qiáng)力霉素、慶大霉素)、激素、生長因子、抗腫瘤劑、抗真菌劑、抗病毒劑、止痛藥、抗組胺劑、抗炎劑、抗感染藥、元素銀、抗生素、殺菌酶(如溶酶體(lysozome))、傷口愈合劑(如細(xì)胞因子，包括但不限于，PDGF、TGF、胸腺素)、透明質(zhì)酸、傷口密封劑(如具有或不具有凝血酶的纖維蛋白)及細(xì)胞引誘劑和支架試劑。在具體的實例中，本文提供的ECM組合物用至少一種生長因子浸漬，例如，成纖維細(xì)胞生長因子或表皮生長因子。在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物可以用小有機(jī)分子浸漬，如特定生物化學(xué)過程的特異性抑制劑，例如，膜受體抑制劑、激酶抑制劑、生長抑制劑和抗癌藥物。

在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物與水凝膠組合?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何水凝膠，例如，Graham,1998,Med.Device Technol.9(1)：18-22；Peppas等,2000,Eur.J.Pharm.Biopharm.50(1)：27-46；Nguyen等,2002,Biomaterials,23(22)：4307-14；Henincl等,2002,Adv.Drug Deliv.Rev 54(1)：13-36；Skelhorne等,2002,Med.Device.Technol.13(9):19-23或Schmedlen等,2002,Biomaterials 23：4325-32中公開的任何水凝膠組合物。在具體的實施方式中，水凝膠施用到ECM組合物上，即，在ECM組合物的表面上放出。例如，水凝膠可以噴射到ECM組合物上、在ECM組合物的表面上飽和、用ECM組合物浸沒、用ECM組合物浸浴或涂布到ECM組合物的表面上。可用于本文提供的方法和組合物中的水凝膠可以從本領(lǐng)域中已知的任何水相互作用的或水溶性的聚合物制備，包括但不限于，聚乙烯醇(PVA)、聚羥乙基甲基丙烯酸酯、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、透明質(zhì)酸、葡聚糖及其衍生物和類似物。

4.1.2細(xì)胞

本文提供的ECM組合物可以包含一種或多種類型的細(xì)胞、接種有一種或多種類型的細(xì)胞或培養(yǎng)一種或多種類型的細(xì)胞。例如，細(xì)胞可以用本文描述的ECM組合物培養(yǎng)和在其上生長或者分散在本文描述的ECM組合物上或其內(nèi)(例如，添加到ECM可流動基質(zhì)組合物)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，本領(lǐng)域中已知的任何細(xì)胞類型可以用本文提供的ECM組合物接種和/或培養(yǎng)，包括干細(xì)胞和非-干細(xì)胞。

在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物接種有和/或包含干細(xì)胞。干細(xì)胞可以是適合于給定目的的任何干細(xì)胞，且可以是全能或多能干細(xì)胞，或者可以是祖細(xì)胞。在具體的實施方式中，本文提供的ECM組合物接種有和/或包含胎盤干細(xì)胞，如U.S.專利No.7,045,148；7,468,276；8,057,788和8,202,703中描述的那些，其公開內(nèi)容通過引用全文并入本文。在另一具體實施方式中，本文提供的ECM組合物接種有和/或包含胚胎干細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓源干細(xì)胞、造血祖細(xì)胞(例如，來自外周血、胎兒血、胎盤血、臍帶血、胎盤灌流液等的造血干細(xì)胞)、成體干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、肝臟干細(xì)胞、胰腺干細(xì)胞、內(nèi)皮干細(xì)胞、心肌干細(xì)胞、肌肉干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞等等。在具體的實施方式中，干細(xì)胞是人干細(xì)胞。

在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物接種有和/或包含一種或多種類型的非-干細(xì)胞。如本文中使用的，“非-干細(xì)胞”是指終末分化的細(xì)胞。例如，在一個實施方式中，本文提供的ECM組合物包含多個成纖維細(xì)胞?？梢耘c本文提供的ECM組合物組合的非-干細(xì)胞包括，但不限于成纖維細(xì)胞或成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞、真皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞和胰腺細(xì)胞。在某些其它實施方式中，本文提供的ECM組合物接種有和/或包含至少兩種類型的非-干細(xì)胞。

在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物培養(yǎng)細(xì)胞足以使多種所述細(xì)胞附著于ECM組合物的時間。根據(jù)這樣的實施方式，ECM組合物可以在ECM組合物與細(xì)胞接觸之前成形為可用的構(gòu)型，例如，成形為薄片、栓、管或其它構(gòu)型。

ECM組合物可以培養(yǎng)至少1X 10⁶、3X 10⁶、1X 10⁷、3X 10⁷、1X 10⁸、3X 10⁸、1X 10⁹、3X 10⁹、1X 10¹⁰、3X 10¹⁰、1X 10¹¹、3X 10¹¹或1X 10¹²個細(xì)胞；或可以不超過1X 10⁶、3X 10⁶、1X 10⁷、3X 10⁷、1X 10⁸、3X 10⁸、1X 10⁹、3X 10⁹、1X 10¹⁰、3X 10¹⁰、1X10¹¹、3X 10¹¹或1X 10¹²個細(xì)胞。

4.1.1表征

本領(lǐng)域中已知的基于生物化學(xué)的分析可以用于確認(rèn)使用本文描述的方法產(chǎn)生的ECM組合物的生物化學(xué)組成。蛋白質(zhì)含量可以使用，例如，吸光度分析測定，如Layne,E,Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins,Methods in Enzymology 3：447-455,(1957)；Stoscheck,C M,Quantitation of Protein,Methods in Enzymology 182：50-69,(1990)),Scopes,R K,Analytical Biochemistry 59：277,(1974)和Stoscheck,C M.Quantitation of Protein,Methods in Enzymology 182：50-69,(1990))中描述的那些?；蛘?，基于比色的分析可以用于測量特定蛋白質(zhì)的含量，包括改良的勞里測定法、縮二脲測定法、Bradford測定法和二喹啉甲酸(Smith)測定法(參見，例如，Stoscheck,C M,Quantitation of Protein,Methods in Enzymology 182：50-69(1990))。

本文提供的ECM組合物的總膠原蛋白含量可使用，例如，羥脯氨酸或定量的染料基測定試劑盒測定，例如，通過Biocolor Ltd,UK生產(chǎn)的SIRCOL^TM試劑盒。本文提供的ECM組合物中的膠原蛋白類型可以使用本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)方法測定，例如，ELISA測定法。

本文提供的ECM組合物的總彈性蛋白含量可使用，例如，定量的染料基測定法測定，例如，通過Biocolor Ltd,UK生產(chǎn)的基于染料的測定試劑盒(FASTIN)。

本文提供的ECM組合物的總糖胺聚糖(GAG)含量可使用，例如，由Biocolor Ltd,UK生產(chǎn)的定量的基于染料的測定試劑盒(BLYSCAN)測定。GAG含量也可以使用本領(lǐng)域中已知的方法通過ELISA測量。

本文提供的ECM組合物的總層粘連蛋白和纖連蛋白含量可使用，例如，ELISA測定法測定，例如，夾心ELISA分析，例如，作為來自Takara Bio Inc.,Shiga,日本的試劑盒提供的對于層粘連蛋白或纖連蛋白特異性的ELISA分析。

本文描述的ECM組合物是非-免疫原性的且與受試者(例如，人類受試者)的組織生物相容。如本文使用的“生物相容性”是指按照不產(chǎn)生毒性的、有害的或免疫的反應(yīng)或者在活體組織中不產(chǎn)生排斥而言是生物相容的性質(zhì)?？梢赃M(jìn)行生物相容性分析以確認(rèn)本文提供的ECM組合物的生物相容性。這樣的分析是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的且包括，但不限于細(xì)胞毒性分析(例如，ISO MEM Elution測試)、兔眼刺激測試、溶血檢驗和產(chǎn)熱原性分析(pyrogencity assay)。

本文提供的ECM組合物可以配制為無菌的，且因此不含微生物污染物。微生物的存在可以使用本領(lǐng)域已知的方法測定，例如，ECM組合物直接接種到細(xì)菌生長培養(yǎng)基中/之上，例如，大豆酪蛋白培養(yǎng)基或巰基醋酸鹽培養(yǎng)基。

本文提供的ECM組合物可以配制為幾乎不包含、不包含或包含不可檢測水平的內(nèi)毒素。本文提供的ECM組合物中內(nèi)毒素的存在可以使用，例如，Limulus Amebocyte Lysate(LAL)測試(細(xì)菌內(nèi)毒素測試)，一種本領(lǐng)域中公知的體外測試，來測定。在具體的實施方式中，本文提供的ECM組合物包含每制劑少于20的內(nèi)毒素單位(EU)(例如，本文提供的ECM的薄片包含少于20EU)。

4.2制備細(xì)胞外基質(zhì)組合物的方法

在一個方面中，本文提供了產(chǎn)生胎盤細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組合物的方法。在某些實施方式中，本文提供的從胎盤(例如，人胎盤)制備ECM組合物的方法順序地包括以下步驟：(i)從胎盤(例如，從獲自剛生產(chǎn)的母親的胎盤或從存儲的胎盤)除去羊膜、絨毛膜和臍帶；(ii)胎盤組織用引起與胎盤組織相關(guān)的細(xì)胞的滲透破壞的溶液處理；(iii)使胎盤與包含清潔劑的溶液接觸；和(iv)使胎盤與包含堿的溶液接觸。在某些實施方式中，從胎盤制備ECM組合物的方法使用胎盤(例如，人胎盤)的絨毛膜，其中所述方法順序地包括以下步驟：(i)從胎盤(例如，從獲自剛生產(chǎn)的母親的胎盤或從存儲的胎盤)獲得絨毛膜；(ii)絨毛膜用引起與絨毛膜相關(guān)的細(xì)胞的滲透破壞的溶液處理；(iii)使絨毛膜與包含清潔劑的溶液接觸；和(iv)使絨毛膜與包含堿的溶液接觸。在某些實施方式中，從胎盤制備ECM組合物的方法使用胎盤(例如，人胎盤)的絨毛膜，其中所述方法順序地包括以下步驟：(i)從胎盤(例如，從獲自剛生產(chǎn)的母親的胎盤或從存儲的胎盤)獲得絨毛膜；(ii)刮擦和清潔絨毛膜；(iii)絨毛膜用引起與絨毛膜相關(guān)的細(xì)胞的滲透破壞的溶液處理；(iv)使絨毛膜與包含清潔劑的溶液接觸；和(v)研磨和凍干。在某些其它實施方式中，從胎盤制備ECM組合物的方法使用胎盤(例如，人胎盤)的絨毛膜，其中所述方法順序地包括以下步驟：(i)從胎盤(例如，從獲自剛生產(chǎn)的母親的胎盤或從存儲的胎盤)獲得絨毛膜；(ii)刮擦和清潔絨毛膜；(iii)絨毛膜用引起與絨毛膜相關(guān)的細(xì)胞的滲透破壞的溶液處理；(iv)使絨毛膜與包含的第一清潔劑溶液接觸，然后與第二清潔劑溶液接觸，所述溶液包含清潔劑和螯合劑，例如，EDTA；和(v)凍干。重要地，本文描述的制備ECM組合物的方法使用例如，堿、清潔劑、螯合劑的組分，其量導(dǎo)致產(chǎn)生具有本文描述的那些的特定特征的ECM組合物。

本文提供的產(chǎn)生ECM的方法中使用的胎盤一般在足月產(chǎn)后獲得，且可以是新鮮分離的或者之前分離并冷凍保存的。一般地，當(dāng)冷凍的胎盤用于根據(jù)本文描述的方法制備ECM組合物時，胎盤在使用前被解凍，例如，在室溫下。例如，胎盤可以在～22-23℃下解凍～24小時或直到胎盤準(zhǔn)備就緒。

在某些實施方式中，在根據(jù)本文描述的方法從胎盤制備ECM組合物前，胎盤被放血，即，排干在生產(chǎn)后保留的臍帶血。在某些實施方式中，胎盤在用于本文提供的方法中之前是70％放血的、80％放血的、90％放血的、95％放血的或99％放血的。

使胎盤組織(例如，已經(jīng)從其除去羊膜、絨毛膜和臍帶的胎盤組織；或者來自胎盤的絨毛膜)與引起與在本文提供的方法中處理的胎盤組織相關(guān)的細(xì)胞的滲透破壞的溶液接觸的步驟導(dǎo)致除去血液和血液組分以及通常與胎盤組織相關(guān)的細(xì)胞和細(xì)胞碎片。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，能夠引起細(xì)胞的滲透破壞的任何溶液可用于本文描述的方法中。例如，NaCl、氯化鉀(KCl)、硫酸銨、單糖、二糖(例如，20％的蔗糖)、親水聚合物(例如，聚乙二醇)、甘油可以由于其滲透勢而用于破壞細(xì)胞。

在具體的實施方式中，NaCl用于引起與在本文描述的方法中使用的胎盤組織(例如，已經(jīng)從其除去羊膜、絨毛膜和臍帶的胎盤組織；或者來自胎盤的絨毛膜)相關(guān)的細(xì)胞的滲透破壞。在具體的實施方式中，包含約0.25M、0.5M、0.75M、1.0M、1.25M、1.5M、1.75M、2M、2.25M或2.5M NaCl的溶液用于引起與本文描述的方法中使用的胎盤組織相關(guān)的細(xì)胞的滲透破壞。在具體的實施方式中，包含約0.25M-5M、約0.5M-4M、約0.75M-3M或約1.0M-2.0M NaCl的溶液用于引起與本文描述的方法中使用的胎盤組織相關(guān)的細(xì)胞的滲透破壞。

使胎盤組織(例如，已經(jīng)從其除去羊膜、絨毛膜和臍帶的胎盤組織；或者來自胎盤的絨毛膜)與引起滲透破壞的溶液接觸的步驟可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的判斷在任何溫度下進(jìn)行。在某些實施方式中，該步驟在約0℃-30℃、約5℃-25℃、約5℃-20℃或約5℃-15℃的溫度下進(jìn)行。在某些實施方式中，該步驟在約0℃、約5℃、約10℃、約15℃、約20℃、約25℃或約30℃下進(jìn)行。在具體的實施方式中，該步驟在室溫下進(jìn)行。在另一具體實施方式中，該步驟在37℃±5℃下進(jìn)行。

使胎盤組織(例如，已經(jīng)從其除去羊膜、絨毛膜和臍帶的胎盤組織；或者來自胎盤的絨毛膜)與引起滲透破壞的溶液接觸的步驟可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的判斷進(jìn)行合適的時間。在某些實施方式中，該步驟可以進(jìn)行約1-24小時、約2-20小時、約5-15小時、約8-12小時或約2-5小時。在具體的實施方式中，該步驟在室溫下進(jìn)行約18-26小時。在另一具體實施方式中，該步驟在37℃±5℃下進(jìn)行約18-26小時。

使胎盤組織(例如，已經(jīng)從其除去羊膜、絨毛膜和臍帶的胎盤組織；或者來自胎盤的絨毛膜)與清潔劑接觸的步驟導(dǎo)致從本文提供的ECM除去細(xì)胞和細(xì)胞碎片(例如，細(xì)胞膜)以及除去核酸。因此，用于本文描述的方法中的清潔劑可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知能夠破壞細(xì)胞或亞細(xì)胞膜的任何清潔劑。在某些實施方式中，清潔劑是離子型的。例如，在某些實施方式中，清潔劑是脫氧膽酸鈉、脫氧膽酸或十二烷基硫酸鈉。在某些實施方式中，清潔劑是兩性離子的。在某些實施方式中，清潔劑是非離子的。例如，在某些實施方式中，清潔劑可以是清潔劑，如-20或Triton X清潔劑，如Triton X 100。膠原蛋白組合物可以在由本領(lǐng)域技術(shù)人員判斷為適合從組合物除去不希望的組分的條件下與清潔劑接觸。

在具體的實施方式中，本文提供的方法中使用的清潔劑是脫氧膽酸鈉或脫氧膽酸。所述脫氧膽酸鈉或脫氧膽酸可以以合適的濃度用于本文描述的方法中以除去細(xì)胞、細(xì)胞碎片和核酸。在本文描述的方法的特定實施方式中，脫氧膽酸鈉或脫氧膽酸可以以例如，約1.5％、約2％或約2.5％的終濃度使用。在具體的實施方式中，所述脫氧膽酸鈉或脫氧膽酸以約2％的終濃度用于本文描述的方法中。

本文描述的方法的其它特定實施方式中，例如，在第一清潔劑溶液中使用清潔劑，例如脫氧膽酸鈉或脫氧膽酸，以及螯合劑，例如乙二胺四乙酸(EDTA)的方法中，例如，可以以約0.05-約0.1％、約0.05％-約0.2％、約0.2-約0.3％、約0.3％-約0.4％或約0.4-約0.5％的終濃度或者以約0.05％、約0.06％、約0.07％、約0.08％、約0.09％、約0.1％、約0.2％、約0.3％、約0.4％或約0.5％的終濃度使用這樣的脫氧膽酸鈉或脫氧膽酸。在具體的這類實施方式中，脫氧膽酸鈉或脫氧膽酸可以以約0.067％的終濃度使用。對于這樣的第一清潔劑溶液中存在的螯合劑，當(dāng)螯合劑是EDTA時，例如，可以以約1-約5mM、約2-約5mM、約2-約4mM、約3-約4mM、約3mM-約5mM、約5-約10mM、約6-約10mM、約7-約9mM或約8-約10mM的終濃度或者約1mM、約2mM、約3mM、約4mM、約5mM、約6mM、約7mM、約8mM、約9mM或約10mM的終濃度使用這種EDTA。在第一清潔劑溶液的具體實施方式中，溶液可以包含約0.067％的終濃度的脫氧膽酸鈉或脫氧膽酸和約4mM的終濃度的EDTA。

本文描述的方法的實施方式中，例如，在第二清潔劑溶液中使用清潔劑，例如脫氧膽酸鈉或脫氧膽酸，以及螯合劑，例如EDTA的方法中，這樣的脫氧膽酸鈉或脫氧膽酸可以以例如，約0.05-約0.1％、約0.05％-約0.2％、約0.2-約0.3％、約0.3％-約0.4％或約0.4-約0.5％的終濃度；或者約0.05％、約0.06％、約0.07％、約0.08％、約0.09％、約0.1％、約0.2％、約0.3％、約0.4％或約0.5％的終濃度使用。在具體的這類實施方式中，脫氧膽酸鈉或脫氧膽酸(約0.2％-約0.6％)可以以約0.39％的終濃度使用。對于這樣的第二清潔劑溶液中存在的螯合劑，當(dāng)螯合劑是EDTA時，這樣的EDTA可以以例如，約1-約5mM、約2-約5mM、約2-約4mM、約3-約4mM、約3mM-約5mM、約5-約10mM、約6-約10mM、約7-約9mM或約8-約10mM；或者約1mM、約2mM、約3mM、約4mM、約5mM、約6mM、約7mM、約8mM、約9mM或約10mM的終濃度使用。在第一清潔劑溶液的具體實施方式中，溶液可以包含約0.39％的終濃度的脫氧膽酸鈉或脫氧膽酸和約8mM的終濃度的EDTA。

使胎盤組織(例如，已經(jīng)從其除去羊膜、絨毛膜和臍帶的胎盤組織；或者來自胎盤的絨毛膜)與清潔劑接觸的步驟可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的判斷在任何溫度下進(jìn)行。在某些實施方式中，清潔劑處理在約0℃-30℃、約5℃-25℃、約5℃-20℃或約5℃-15℃的溫度下進(jìn)行。在某些實施方式中，清潔劑處理步驟在約0℃、約5℃、約10℃、約15℃、約20℃、約25℃或約30℃的溫度下進(jìn)行。在具體的實施方式中，清潔劑處理步驟在室溫下進(jìn)行。在另一具體實施方式中，清潔劑處理步驟在37℃±5℃下進(jìn)行。

清潔劑處理(具有或不具有螯合劑)可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的判斷進(jìn)行適當(dāng)?shù)臅r間。在某些實施方式中，清潔劑處理可以進(jìn)行約1-24小時、過夜、約24-48小時或約48-72小時。在具體的實施方式中，清潔劑處理步驟進(jìn)行約72小時。在另一具體實施方式中，清潔劑處理步驟在室溫下進(jìn)行約72小時。在另一具體實施方式中，清潔劑處理步驟在37℃±5℃下進(jìn)行約72小時。

使胎盤組織(例如，已經(jīng)從其除去羊膜、絨毛膜和臍帶的胎盤組織；或者來自胎盤的絨毛膜)與堿接觸的步驟導(dǎo)致通過使某些ECM組分變性而從本文提供的ECM組合物除去這些ECM組分，例如，除去纖連蛋白和層粘連蛋白。用于堿處理的示例性的堿包括生物相容性堿、揮發(fā)性堿或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知容易地和安全地從ECM除去的堿。堿可以是例如，0.2M-1.0M濃度的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何有機(jī)或無機(jī)堿。在某些實施方式中，堿是氫氧化銨、氫氧化鉀或氫氧化鈉，例如，氫氧化銨溶液、氫氧化鉀溶液或氫氧化鈉溶液。

在具體的實施方式中，本文提供的方法的堿處理步驟中使用的堿是氫氧化鈉(NaOH)。NaOH可以以適合于從本文提供的ECM組合物除去例如，層粘連蛋白和纖連蛋白的任何濃度用于本文描述的方法中。例如，NaOH可以以約0.1M NaOH、0.25M NaOH、0.5M NaOH、1M NaOH、1.5M NaOH或2M NaOH的濃度用于本文描述的方法中。在具體的實施方式中，NaOH以約1M NaOH的濃度用于本文描述的方法中。

堿處理步驟可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的判斷在任何溫度下進(jìn)行。在某些實施方式中，堿處理在約0℃-30℃、約5℃-25℃、約5℃-20℃或約5℃-15℃下進(jìn)行。在某些實施方式中，堿處理在約0℃、約5℃、約10℃、約15℃、約20℃、約25℃或約30℃下進(jìn)行。在具體的實施方式中，堿處理步驟在室溫下進(jìn)行。在另一具體實施方式中，堿處理步驟在37℃±5℃下進(jìn)行。

堿處理步驟可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的判斷進(jìn)行適宜的時間。在某些實施方式中，堿處理步驟可以進(jìn)行約15分鐘-30分鐘、30分鐘-1小時、1-2小時、2-4小時、4-8小時、8-12小時或約12-24小時。在具體的實施方式中，堿處理步驟進(jìn)行約30分鐘。在另一具體實施方式中，堿處理步驟在室溫下進(jìn)行約30分鐘。在另一具體實施方式中，堿處理步驟在37℃±5℃下進(jìn)行約30分鐘。

在某些實施方式中，本文描述的方法的任何或所有步驟在無菌條件下進(jìn)行。在進(jìn)一步的實施方式中，根據(jù)本文描述的方法制備的ECM組合物按照本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的和以下描述的技術(shù)進(jìn)一步滅菌。

在具體的實施方式中，本文提供了制備ECM組合物的方法，所述方法包括(i)從胎盤(例如，從獲自剛生產(chǎn)的母親的胎盤或從存儲的胎盤)除去羊膜、絨毛膜和臍帶；(ii)將剩余胎盤組織置于引起與胎盤組織相關(guān)的細(xì)胞的滲透破壞的溶液(例如，氯化鈉(NaCl，例如，1M NaCl))中并使胎盤組織均質(zhì)化；(iii)使胎盤組織與包含清潔劑，例如，脫氧膽酸鈉(例如，2％的脫氧膽酸鈉)的溶液接觸；(iv)用例如水洗滌胎盤組織；(v)使胎盤組織與包含堿，例如，氫氧化鈉(NaOH，例如，1M NaOH)的溶液接觸；(vi)向包含胎盤組織的溶液添加酸溶液，例如，鹽酸(HCl)，以使其達(dá)到或接近中性pH(例如，pH 6.0-8.0)；和(vii)將胎盤組織與溶液的液體部分分離(例如，通過離心)并收集胎盤組織，由此制備ECM組合物。根據(jù)該方法產(chǎn)生的ECM組合物一般是糊的形式(ECM糊)，其可以在收集后冷凍和存儲用于隨后使用，或者其可以在收集后直接用于制備本文描述的ECM制劑，例如，ECM薄片的制劑、ECM顆粒物制劑或ECM可流動基質(zhì)。

在另一具體實施方式中，本文提供了制備ECM組合物的方法，所述方法包括(i)從胎盤(例如，從獲自剛生產(chǎn)的母親的胎盤或從存儲的胎盤)除去羊膜、絨毛膜和臍帶；(ii)切割胎盤成條，例如，2x 2厘米條；(iii)將胎盤組織置于1.5升1M NaCl溶液中并使胎盤組織(例如，使用Omni Mixer Homogenizer(Omni International,Kennesaw,GA))均質(zhì)化；(iv)將均質(zhì)化的胎盤組織置于處理容器(例如，袋)中并添加1M NaCl到9.2升的體積；(v)用1M NaCl洗滌均質(zhì)化的胎盤組織三次，其中所述洗滌包括(a)在振動器上攪拌處理容器10分鐘，(b)允許胎盤組織在處理容器中沉降10分鐘，和(c)通過重力排空除去6.2升的上清液；(vi)允許洗滌的胎盤組織在振動器上在剩余的1M NaCl溶液中在室溫下混合～18-26小時；(vii)如上所述用水洗滌胎盤組織四次；(viii)允許洗滌的胎盤組織在振動器上在水中在室溫下混合～18-26小時；(ix)在水中過夜混合后，如上所述用水洗滌最后一次，然后添加6.2L的3％脫氧膽酸鈉到混合物中，達(dá)到2％脫氧膽酸鈉的濃度；(x)允許胎盤組織在振動器上在2％脫氧膽酸鈉溶液中在室溫下混合～72小時；(xi)以如上所述的方式在水中洗滌胎盤組織五次；(xii)在水的最后添加后，通過添加1M NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH到約10-12，得到堿性溶液；(xiii)允許胎盤組織在振動器上在堿性溶液中在室溫下混合～30分鐘；(xiv)使用0.1N HCl調(diào)節(jié)溶液的pH到約7.0-7.5；和(xv)從處理容器移除上清液(例如，通過離心)和收集胎盤組織，從而制備ECM組合物。

在具體的實施方式中，本文提供了制備ECM組合物的方法，所述方法包括(i)從胎盤(例如，從獲自剛生產(chǎn)的母親的胎盤或從存儲的胎盤)獲得絨毛膜；(ii)將胎盤絨毛膜置于引起與胎盤絨毛膜相關(guān)的細(xì)胞的滲透破壞的溶液中，例如，氯化鈉(NaCl，例如，1M NaCl)，并使胎盤絨毛膜均質(zhì)化；(iii)使胎盤絨毛膜組織與包含清潔劑，例如，脫氧膽酸鈉(例如，2％脫氧膽酸鈉)的溶液接觸；(iv)用例如水洗滌胎盤絨毛膜組織；(v)使胎盤絨毛膜組織與包含堿，例如，氫氧化鈉(NaOH，例如，1M NaOH)的溶液接觸；(vi)添加酸溶液，例如，鹽酸(HCl)，到包含胎盤絨毛膜組織的溶液中，以使其達(dá)到或接近中性pH(例如，pH 6.0-8.0)；和(vii)從溶液的液體部分分離胎盤絨毛膜組織(例如，通過離心)并收集胎盤絨毛膜組織，從而制備ECM組合物。根據(jù)該方法產(chǎn)生的ECM組合物一般是糊的形式(ECM糊)，其可以在收集后冷凍和存儲用于隨后使用，或者其可以在收集后直接用于制備本文描述的ECM制劑，例如，ECM薄片的制劑、ECM顆粒物制劑或ECM可流動基質(zhì)。在某些實施方式中，該方法的各個步驟(例如，滲透破壞、清潔劑處理、洗滌、堿處理)在室溫下進(jìn)行。在某些實施方式中，該方法的各個步驟(例如，滲透破壞、清潔劑處理、洗滌、堿處理)在37℃±5℃下進(jìn)行。在某些實施方式中，洗滌步驟使用1/2-2升體積的流體進(jìn)行1-3次。

在另一具體實施方式中，本文提供了制備ECM組合物的方法，所述方法包括(i)從胎盤(例如，從獲自剛生產(chǎn)的母親的胎盤或從存儲的胎盤)獲得絨毛膜；(ii)切割絨毛膜成條，例如，2x 2厘米條；(iii)將胎盤絨毛膜組織置于1.5升1M NaCl溶液中并使胎盤絨毛膜組織(例如，使用Omni Mixer Homogenizer(Omni International,Kennesaw,GA))均質(zhì)化；(iv)將均質(zhì)化的胎盤絨毛膜組織置于處理容器(例如，袋)中并添加1M NaCl到9.2升的體積；(v)用1M NaCl洗滌均質(zhì)化的胎盤絨毛膜組織三次，其中所述洗滌包括(a)在振動器上攪拌處理容器10分鐘，(b)允許胎盤絨毛膜組織在處理容器中沉降10分鐘，和(c)通過重力排空除去6.2升的上清液；(vi)允許洗滌的胎盤絨毛膜組織在振動器上在剩余的1M NaCl溶液中在室溫下混合～18-26小時；(vii)如上所述用水洗滌胎盤絨毛膜組織四次；(viii)允許洗滌的胎盤絨毛膜組織在振動器上在水中在室溫下混合～18-26小時；(ix)在水中混合過夜后，如上所述用水洗滌最后一次，然后添加6.2L的3％脫氧膽酸鈉到混合物中，達(dá)到2％脫氧膽酸鈉的濃度；(x)允許胎盤絨毛膜組織在振動器上在2％脫氧膽酸鈉溶液中在室溫下混合～72小時；(xi)以如上所述的方式在水中洗滌胎盤絨毛膜組織五次；(xii)在水的最后添加后，通過添加1M NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH到約10-12，得到堿性溶液；(xiii)允許胎盤絨毛膜組織在振動器上在堿性溶液中在室溫下混合～30分鐘；(xiv)使用0.1N HCl調(diào)節(jié)溶液的pH到約7.0-7.5；和(xv)從處理容器移除上清液(例如，通過離心)和收集胎盤絨毛膜組織，從而制備ECM組合物。在某些實施方式中，洗滌步驟使用1/2-2升體積的流體進(jìn)行。

在另一具體實施方式中，本文提供了制備ECM組合物的方法，所述方法包括(i)從胎盤(例如，從獲自剛生產(chǎn)的母親的胎盤或從存儲的胎盤)獲得絨毛膜(例如，絨毛膜板)；(ii)刮擦和清潔絨毛膜；(iii)將絨毛膜組織置于引起與絨毛膜組織相關(guān)的細(xì)胞的滲透破壞的溶液中，例如，氯化鈉(NaCl，例如，0.5M NaCl)溶液；(iv)使絨毛膜組織與包含清潔劑的溶液接觸，例如，脫氧膽酸或脫氧膽酸鈉(例如，2％脫氧膽酸或脫氧膽酸鈉)，并清洗，例如，通過水清洗；和(v)研磨和凍干。ECM組合物，一般地糊(ECM糊)，可以配制(例如，碾磨和配制)成多種形狀和形式，例如，ECM薄片、ECM顆粒物制劑或ECM可流動基質(zhì)。在某些實施方式中，該方法的各個步驟(例如，滲透破壞、清潔劑處理、清洗)在室溫下進(jìn)行。在某些實施方式中，該方法的各個步驟(例如，滲透破壞、清潔劑處理、清洗)在37℃±5℃下進(jìn)行。在某些實施方式中，清洗步驟使用1/2-2升體積的流體進(jìn)行1-3次。

在特定的實施方式中，本文提供了制備ECM組合物的方法，所述方法順序地包括：(i)從剛足月生產(chǎn)的母親獲得人胎盤，或獲得先前分離的冷凍人胎盤，其允許解凍，例如，允許在室溫下解凍大約24小時；(ii)在0.5M NaCl中洗滌胎盤；(iii)從胎盤除去羊膜、臍帶和壁蛻膜，并保留胎盤的絨毛膜板；(iv)刮擦和清潔絨毛膜；(v)在0.5M NaCl和水中清洗絨毛膜；(vi)在2％脫氧膽酸中清洗絨毛膜過夜，接著多次水清洗，例如，3、4、5、6、7或更多次水清洗；和(vii)研磨和凍干處理的絨毛膜。ECM組合物，一般地糊(ECM糊)，可以配制(例如，碾磨和配制)成多種形狀和形式，例如，ECM薄片、ECM顆粒物制劑或ECM可流動基質(zhì)。在某些實施方式中，該方法的各個步驟(例如，NaCl處理、脫氧膽酸處理、清洗)在室溫下進(jìn)行。在某些實施方式中，該方法的各個步驟(例如，NaCl處理、脫氧膽酸處理、清洗)在37℃±5℃下進(jìn)行。在某些實施方式中，清洗步驟使用1/2-2升體積的流體進(jìn)行1-3次。

在再另一具體實施方式中，本文提供了制備ECM組合物的方法，所述方法包括(i)從胎盤(例如，從獲自剛生產(chǎn)的母親的胎盤或從存儲的胎盤)獲得絨毛膜(例如，絨毛膜板)；(ii)刮擦和清潔絨毛膜；(iii)將絨毛膜組織置于引起與絨毛膜組織相關(guān)的細(xì)胞的滲透破壞的溶液中，例如，氯化鈉(NaCl，例如，1.0M NaCl)溶液；(iv)使絨毛膜組織與包含清潔劑，例如，脫氧膽酸或脫氧膽酸鈉(例如，0.05％-0.2％或0.3％-0.6％脫氧膽酸或脫氧膽酸鈉)，和EDTA(例如，1-5mM EDTA或5-10mM EDTA)的第一清潔劑溶液接觸；(v)使絨毛膜組織與包含清潔劑，例如，脫氧膽酸或脫氧膽酸鈉(例如，0.05％-0.2％或0.3％-0.6％脫氧膽酸或脫氧膽酸鈉)，和EDTA(例如，1-5mM EDTA或5-10mM EDTA)的第二清潔劑溶液接觸，并清洗，例如，通過水；和(vi)凍干以產(chǎn)生去細(xì)胞的、凍干的全絨毛膜，其可以配制，例如，碾磨到和重懸在溶液(例如，水或磷酸鹽緩沖鹽水)中以形成去細(xì)胞的ECM糊，并配制成多種形狀和形式，例如，ECM薄片、ECM顆粒物制劑或ECM可流動基質(zhì)。在某些實施方式中，該方法的各個步驟(例如，滲透破壞、清潔劑/EDTA處理、清洗)在室溫下進(jìn)行。在某些實施方式中，該方法的各個步驟(例如，滲透破壞、清潔劑/EDTA處理、清洗)在37℃±5℃下進(jìn)行。在某些實施方式中，清洗步驟使用1/2-2升體積的流體進(jìn)行1-3次。

在特定的實施方式中，本文提供了制備ECM組合物的方法，所述方法順序地包括：(i)從剛足月生產(chǎn)的母親獲得人胎盤，或獲得先前分離的冷凍人胎盤，其允許解凍，例如，允許在室溫下解凍大約24小時；(ii)從胎盤除去羊膜、臍帶和壁蛻膜，并保留胎盤的絨毛膜板；(iii)刮擦和清潔絨毛膜；(iv)在1.0M NaCl和水中清洗絨毛膜；(v)在包含0.067％脫氧膽酸和4mM EDTA的第一清潔劑溶液中清洗絨毛膜過夜，接著多次水清洗，例如，3、4、5、6、7或更多次水清洗；(vi)在包含0.39％脫氧膽酸和8mM EDTA的第二清潔劑溶液中清洗絨毛膜過夜，接著多次水清洗，例如，3、4、5、6、7或更多次水清洗；和(vii)凍干處理的絨毛膜。所得的組合物是適合于進(jìn)一步配制(例如，碾磨和配制)的去細(xì)胞的ECM糊。在某些實施方式中，該方法的各個步驟(例如，NaCl處理、脫氧膽酸/EDTA處理、清洗)在室溫下進(jìn)行。在某些實施方式中，該方法的各個步驟(例如，NaCl處理、脫氧膽酸/EDTA處理、清洗)在37℃±5℃下進(jìn)行。在某些實施方式中，清洗步驟使用1/2-2升體積的流體進(jìn)行1-3次。

在具體的實施方式中，本文提供了產(chǎn)生ECM薄片的方法，所述方法包括(i)根據(jù)本文描述的方法制備ECM糊；(ii)懸浮ECM糊在，例如，水中，并添加懸浮的ECM溶液到合適的基材用于形成薄片，例如，添加ECM到模具；(iii)冷凍ECM；(iv)凍干冷凍的ECM；(v)從基材移除凍干的ECM并將其浸沒于水中；和(vi)干燥ECM，例如，使用真空干燥器。在復(fù)水后和在干燥之前，本文提供的ECM薄片可以形成為任何有用的形狀，例如，塊、管或另一形狀。

在具體的實施方式中，本文提供了產(chǎn)生ECM顆粒物的方法，所述方法包括(i)根據(jù)本文描述的方法制備ECM糊；(ii)懸浮ECM糊在，例如，水中；(iii)冷凍ECM；(iv)凍干冷凍的ECM；和(v)碾磨凍干的ECM。

在具體的實施方式中，本文提供了產(chǎn)生ECM可流動基質(zhì)的方法，所述方法包括(i)根據(jù)本文描述的方法制備ECM糊；(ii)懸浮ECM糊在，例如，水中；(iii)冷凍ECM；(iv)凍干冷凍的ECM；和(v)使凍干的ECM微粉化。在微粉化的ECM重懸浮在，例如，鹽水中時，產(chǎn)生ECM可流動基質(zhì)。

按照本文描述的方法產(chǎn)生的ECM組合物的凍干可以通過本領(lǐng)域中已知的任何方式完成，且一般地一直進(jìn)行到ECM組合物基本上干燥，例如，少于約30％、25％、20％、25％、20％、5％、4％、3％、2％或1％重量的水。

4.2.1任選的進(jìn)一步處理

在某些實施方式中，本文提供的方法包括另外的步驟，例如，導(dǎo)致所制備的ECM組合物用能夠引起細(xì)胞滲透破壞的溶液、清潔劑或堿以外的另一試劑進(jìn)行處理的步驟。

在具體的實施方式中，本文提供的方法包括用處理根據(jù)本文描述的方法所制備的ECM組合物的步驟。是源自粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)的遺傳工程化核酸內(nèi)切酶，其攻擊和降解所有形式的DNA和RNA。因此，可以根據(jù)本文描述的方法用于確保所得的ECM組合物不含(或基本上不含)核酸。在用處理后，可以使處理的ECM組合物達(dá)到高pH，然后低pH，這是適合于滅活的條件。

在具體的實施方式中，本文提供的方法包括用乙二胺四乙酸(EDTA)處理根據(jù)本文描述的方法所制備的ECM組合物。EDTA是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的金屬螯合劑，且可以根據(jù)本文提供的方法用于從本文提供的ECM組合物除去二價金屬離子。EDTA可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法從ECM組合物洗掉。

在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物中的膠原蛋白可以交聯(lián)。交聯(lián)可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何交聯(lián)劑，例如，以上所述的交聯(lián)劑進(jìn)行。在某些實施方式中，交聯(lián)劑是戊二醛，且交聯(lián)可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的膠原蛋白的戊二醛交聯(lián)方法進(jìn)行。在其它實施方式中，交聯(lián)劑是1,4-丁二醇二縮水甘油醚或京尼平。

4.2.2儲存

在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物儲存在室溫下(例如，～22-25℃)。在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物冷儲存，例如，在約0℃、約4℃或約8℃的溫度下冷藏。在一些實施方式中，ECM不冷藏。在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物冷凍儲存，即在低于0℃的溫度下，例如，在-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-35℃、-40℃、-45℃、-50℃、-55℃、-60℃、-65℃、-70℃、-75℃、-80℃或-85℃或者更低溫度。在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物的所述冷凍和儲存在0℃至-10℃、-10℃至-20℃、-20℃至-30℃、-30℃至-40℃、-40℃至-50℃、-50℃至-60℃、-60℃至-70℃或-70℃至-80℃之間的溫度下進(jìn)行。

在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物在無菌非氧化條件下儲存。在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物在以上指定的任何溫度下儲存12個月或更長時間。

4.2.3滅菌

在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于對這類組合物除菌的技術(shù)滅菌。在具體的實施方式中，本文提供的ECM組合物通過照射除菌，例如，γ照射。

在具體的實施方式中，本文提供的ECM組合物的滅菌使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法通過電子束照射進(jìn)行，參見，例如，Gorham,D.Byrom(ed.),1991,Biomaterials,Stockton Press,New York,55-122。足以殺死至少99.9％的細(xì)菌或其它潛在污染生物體的任何照射劑量在本文提供的方法的范圍內(nèi)。在特定的實施方式中，至少18-25kGy的劑量用于實現(xiàn)本文提供的ECM組合物的終端滅菌。

在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物通過允許內(nèi)毒素通過和保留ECM組合物的過濾器過濾。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知用于過濾內(nèi)毒素的任何尺寸的過濾器，例如30kDa。在某些實施方式中，過濾器在5kDa和100kDa之間，例如，過濾器為約5kDa、約10kDa、約15kDa、約20kDa、約30kDa、約40kDa、約50kDa、約60kDa、約70kDa、約80kDa、約90kDa或約100kDa。過濾器可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知與本文提供的ECM組合物相容的任何材料，如纖維素或聚醚砜。過濾可以重復(fù)如本領(lǐng)域技術(shù)人員所希望的那么多的次數(shù)。內(nèi)毒素可以按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)檢測以監(jiān)測清除。

在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物被過濾以產(chǎn)生不含病毒顆?；虿《绢w粒減少的ECM組合物。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知可用于清除病毒的任何過濾器。例如，1000kDa過濾器可用于細(xì)小病毒、甲型肝炎病毒和HIV的清除或減少。750kDa過濾器可以用于細(xì)小病毒和甲型肝炎病毒的清除或減少。500kDa過濾器可以用于細(xì)小病毒的清除或減少。過濾器可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知與本文提供的ECM組合物相容的任何材料，如纖維素或聚醚砜。過濾可以重復(fù)如本領(lǐng)域技術(shù)人員所希望的那么多的次數(shù)。病毒的存在可以按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)檢測以監(jiān)測清除。

4.3用途

本文提供的ECM組合物(參見4.1節(jié))可以以多種方式使用和用于許多目的，包括，但不限于ECM組合物用于制造工程化組織和器官，包括如補(bǔ)片或組織栓或基質(zhì)材料的結(jié)構(gòu)，假體和其它植入物；ECM組合物用作組織支架；ECM組合物用于修復(fù)或包扎傷口；ECM組合物用作止血裝置；ECM組合物用作用于組織修復(fù)和支持的裝置，如縫線、手術(shù)和整形螺釘、手術(shù)和整形板、用于合成植入物的天然涂層或組分、美容植入物和支持體；ECM組合物用于器官或組織的修復(fù)或者用作器官或組織的結(jié)構(gòu)支持；ECM組合物用于物質(zhì)遞送；ECM組合物用作生物工程平臺；ECM組合物用作用于測試物質(zhì)對細(xì)胞的作用的平臺；和ECM組合物用于細(xì)胞培養(yǎng)。此外，ECM組合物可用于美容目的。

在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物的使用需要向受試者施用本文提供的ECM組合物。如本文中使用的，術(shù)語“受試者”是指動物，如哺乳動物，包括，但不限于靈長動物(例如，人)、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔、大鼠、小鼠等等。在具體的實施方式中，受試者是人。

向受試者體內(nèi)施用本文提供的ECM組合物的方法包括，但不限于口服施用(例如，口腔或舌下施用)、局部施用、氣霧劑施用、透皮施用、皮內(nèi)施用、皮下施用、肌肉內(nèi)施用和手術(shù)施用。

在某些實施方式中，作為本文提供的用途的部分，本文提供的ECM組合物可以以乳膏、凝膠、溶液、懸浮液、脂質(zhì)體、顆粒的形式或者治療和美容化合物的制劑和遞送領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它方式應(yīng)用。用于皮下施用的適宜制劑的一些實例包括，但不限于植入物、儲庫、針、膠囊和滲透泵。用于口服施用的適宜制劑的一些實例包括，但不限于：糊劑、貼片、薄片、液體、糖漿、懸浮液、氣霧劑和薄霧。用于透皮施用的適宜制劑的一些實例包括，但不限于乳膏、糊劑、貼片、噴霧和凝膠。用于皮下施用的適宜遞送機(jī)制的一些實例包括，但不限于植入物、儲庫、針、膠囊和滲透泵。

本文提供的ECM組合物可以以產(chǎn)生所需的生理或藥理結(jié)果的任何形式和/或濃度施用于受試者。ECM組合物的形式和濃度取決于所希望的治療終點、作用位點處或體液中的所需有效濃度及施用類型。關(guān)于物質(zhì)施用于受試者的信息是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的且可以在如L.S.Goodman和A.Gilman,eds,The Pharmacological Basis of Therapeutics,Macmillan Publishing,New York和Katzung,Basic&Clinical Pharmacology,Appleton&Lang,Norwalk,Conn.,(6th Ed.1995)的參考文獻(xiàn)中找到。所需治療的熟練的臨床醫(yī)生可以選擇特定的形式和濃度及施用頻率，如待施用的環(huán)境和物質(zhì)所需要的。

4.3.1用于傷口的處理

在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物用于傷口的處理。

在一個實施方式中，本文提供的ECM組合物用于通過將ECM組合物直接置于傷口部位的受試者皮膚上而處理傷口，以使得傷口被覆蓋。在另一實施方式中，本文提供的ECM組合物用于通過利用ECM組合物作為植入物，例如，作為皮下植入物而處理傷口。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，ECM組合物的某些制劑適合于這樣的用途。例如，配制為薄片的ECM組合物可以用于通過將ECM薄片置于受試者皮膚上的傷口上而處理傷口。

在某些實施方式中，當(dāng)用于處理傷口時，本文提供的ECM組合物可以配制為包含一種或多種藥理活性劑，包括但不限于，血小板源生長因子、胰島素樣生長因子、表皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子β、血管生成因子、抗生素、抗真菌劑、殺精子劑、激素、酶和酶抑制劑。

可以用本文提供的ECM組合物處理的傷口包括，但不限于表皮傷口、皮膚傷口、慢性創(chuàng)面、急性創(chuàng)面、外傷、內(nèi)傷(例如，ECM組合物可以在手術(shù)過程中包裹在吻合術(shù)部位周圍以防止血液從縫合線泄漏和防止身體形成與縫合材料的粘連)、先天性傷口(congenital wound)(例如，營養(yǎng)不良型大皰表皮松解癥)、壓迫性潰瘍(例如，褥瘡性潰瘍)、部分和全厚度創(chuàng)面、靜脈性潰瘍、糖尿病性潰瘍、慢性血管性潰瘍、管道性/不定性傷口(tunneled/undermined wound)、手術(shù)傷口(例如，供區(qū)/移植物、Moh's手術(shù)后、激光手術(shù)后、足病術(shù)、傷口裂開)、創(chuàng)傷傷口(例如，摩擦、撕裂傷、二級燒傷和皮膚撕裂傷)和引流傷口(draining wound)。

在具體的實施方式中，本文提供的ECM組合物用于處理燒傷和/或與燒傷相關(guān)的狀況，包括但不限于，一級燒傷、二級燒傷(部分厚度燒傷)、三級燒傷(全厚度燒傷)、燒傷創(chuàng)面的感染、切割和未切割的燒傷創(chuàng)面的感染、從先前移植或愈合的燒傷創(chuàng)面的上皮損失和燒傷創(chuàng)面膿皰瘡。

4.3.2牙科

在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物用于治療牙科疾病和障礙。

在一個實施方式中，本文提供的ECM組合物用于牙周手術(shù)、用于再生牙周組織的引導(dǎo)組織再生、引導(dǎo)骨再生和/或牙根覆蓋。這樣的方法涵蓋使用ECM組合物促進(jìn)牙周骨內(nèi)缺損(periodontal intrabony defect)的再生，包括但不限于，匹配的雙側(cè)牙周缺陷、牙間骨內(nèi)缺損(interdental intrabony defect)、深部3-壁骨內(nèi)缺損、2-壁骨內(nèi)缺損及骨內(nèi)缺損2和3。

在另一實施方式中，本文提供的ECM組合物用于治療II類根分叉部缺損(furcation defect)，包括但不限于，雙側(cè)骨缺損、配對的口腔II類下頜磨牙根分叉部缺損(paired buccal Class II mandibular molar furcation defect)和雙側(cè)下頜根分叉部缺損(bilateral mandibular furcation defect)。

在另一實施方式中，本文提供的ECM組合物用于治療牙周疾病，包括但不限于，牙周炎和牙齦炎。在一個實施方式中，本文提供的ECM組合物可以通過，例如，將ECM組合物(其可以用抗生素如葡萄糖酸氯己定浸漬)插入受試者的一個或多個牙周袋(例如，大于或等于5mm)中而用于治療患有牙周疾病的受試者。

4.3.3口腔病變

在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物用于治療口腔病變，其中所述病變不是通過牙科手術(shù)或口腔手術(shù)引起。在某些實施方式中，本文提供的治療是治療具有口腔病變的受試者的方法，包括向受試者施用(例如，施用至口腔病變)治療有效量的本文提供的ECM組合物。在這種情況中，“治療有效量”意思是起到減輕或消除口腔病變的至少一種癥狀或方面的ECM組合物的量。例如，ECM組合物可以施用以修復(fù)病變，或可以作為緩解劑施用，例如，以減輕由口腔病變引起或與口腔病變相關(guān)的疼痛或炎癥。

在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物作為治療手段直接施用到口腔病變中。在其它實施方式中，本文提供的ECM組合物鄰近至少一部分口腔病變或在至少一部分口腔病變的周邊施用。這種施用可以是，例如，通過將ECM組合物的薄片置于至少一部分或整個口腔病變上。在某些實施方式中，ECM組合物作為糊施用于口腔病變。在某些實施方式中，ECM組合物以噴霧或氣霧劑的形式施用于口腔病變。在某些實施方式中，ECM組合物以溶液，例如，以嗽口水的形式施用于口腔病變。

按照本文提供的方法治療的口腔病變可以由本領(lǐng)域中已知引起口腔病變的任何狀況或處理導(dǎo)致。在一個實施方式中，使用本文提供的ECM組合物治療的口腔病變由剝脫(desquamation)，例如，剝脫性口腔障礙引起或與其相關(guān)。在另一實施方式中，使用本文提供的ECM組合物治療的口腔病變是口瘡性潰瘍，例如，由白塞氏病引起或作為白塞氏病的部分的口瘡性潰瘍。在另一實施方式中，使用本文提供的ECM組合物治療的口腔病變由受試者的頜骨壞死引起或與其相關(guān)。

在另一實施方式中，使用本文提供的ECM組合物治療的口腔病變由移植物抗宿主病引起或與其相關(guān)。在另一實施方式中，使用本文提供的ECM組合物治療的口腔病變由患有口腔病變的受試者使用美法侖引起或與其相關(guān)。

在另一實施方式中，使用本文提供的ECM組合物治療的口腔病變由化療引起或與其相關(guān)，例如，已經(jīng)施用于受試者以治療腫瘤、血癌或其它類型的癌癥的化療。在具體的實施方式中，口腔病變由化療后口腔黏膜炎或化療誘導(dǎo)的口腔黏膜炎引起。在另一具體實施方式中，口腔病變是或診斷為口瘡性口炎，例如，特發(fā)性口瘡性口炎。在另一具體實施方式中，口腔病變由患有口腔病變的受試者使用mTOR(雷帕霉素的哺乳動物靶標(biāo))抑制劑引起或與其相關(guān)。在另一具體實施方式中，口腔病變由患有口腔病變的受試者使用5-氟尿嘧啶引起或與其相關(guān)。在其中口腔病變由化療引起或與其相關(guān)(例如，由使用化療劑引起或與其相關(guān))的具體的實施方式中，化療劑是，例如，烷化劑(例如，白消安、順伯、卡鉑、環(huán)磷酰胺、達(dá)卡巴嗪、異環(huán)磷酰胺、氮芥或美法侖)；抗代謝物(例如，5-氟尿嘧啶、甲氨蝶呤、吉西他濱、阿糖胞苷或氟達(dá)拉濱)；具有抗腫瘤作用的抗生素(例如，博萊霉素、更生霉素、道諾霉素、多柔比星或伊達(dá)比星)；或有絲分裂抑制劑(例如，紫杉醇、多西他賽、依托泊苷、長春花堿、長春新堿或長春瑞濱)。在另一具體實施方式中，所述受試者(其中所述受試者正接受或已經(jīng)接受療程，例如，化療療程)中所述口腔病變的發(fā)生已經(jīng)引起或預(yù)期引起所述療程的過早終止。在這種情況中，“過早終止”意思是部分或完全地作為所述口腔病變的結(jié)果而在對于所述受試者規(guī)定的療程之前終止療程。

在另一實施方式中，使用本文提供的ECM組合物治療的口腔病變由施用抗體于需要治療的受試者引起或與其相關(guān)。在某些實施方式中，抗體是抗-CD20抗體。在更具體的實施方式中，抗體是利妥昔單抗(例如，)、奧法木單抗(例如，)、維妥珠單抗(veltuzumab)或奧瑞珠單抗(ocrelizumab)。在另一實施方式中，抗體是抗-腫瘤壞死因子抗體。在更具體的實施方式中，抗體是阿達(dá)木單抗(例如，)、依那西普(例如，)、英夫利昔單抗(例如，)、賽妥珠單抗(certolizumab pegol)(例如，)、那他珠單抗(例如，)或戈利木單抗(例如，)。在另一具體實施方式中，所述受試者(其中所述受試者正接受或已經(jīng)接受抗體療程)中所述口腔病變的發(fā)生已經(jīng)引起所述抗體療程的過早終止。在這種情況中，“過早終止”意思是部分或完全地作為所述口腔病變的結(jié)果而在對于所述受試者規(guī)定的療程之前終止抗體療程。

4.3.4空隙填充

在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物用于密封、填充和/或另外地處理受試者身體內(nèi)的空隙。如本文中使用的，術(shù)語“空隙”意圖包括受試者中由，例如，老化、疾病、手術(shù)、先天性異?；蚱浣M合產(chǎn)生的中空空間。例如，空隙可以在從受試者的身體手術(shù)除去腫瘤或其它團(tuán)塊后產(chǎn)生?？梢杂帽疚奶峁┑腅CM組合物填充的空隙的非限制性實例包括裂隙、瘺管、憩室(divercula)、動脈瘤、囊腫、病變或受試者身體的任何器官或組織中的任何其它不希望的中空空間。

在一些實施方式中，本文提供的ECM組合物可以用于整體地或部分地填充、密封和/或另外地處理身體的組織、器官或其它結(jié)構(gòu)內(nèi)的裂溝、裂隙或瘺管(例如，血管)，或者相鄰組織、器官或結(jié)構(gòu)之間的接縫，以防止生物流體如血液、尿液或其它生物流體的泄漏。例如，本文提供的ECM組合物可以注射、植入、旋入或以其它方式施用到內(nèi)臟之間的瘺管中或者到從內(nèi)臟到受試者身體外部的開口或孔隙中。本文提供的ECM組合物可以用于填充通過這些病理狀態(tài)形成的空隙或其它缺陷并刺激成纖維細(xì)胞浸潤、愈合和組織內(nèi)生。

在一個實施方式中，本文提供了填充、密封和/或另外地處理受試者的瘺管的方法，所述方法包括向受試者注射或另外地施用本文提供的ECM組合物。ECM組合物可以通過用針注射到一個瘺管孔隙中和填充該孔隙的大多數(shù)或所有分支而施用于受試者?；蛘?，ECM組合物的繩或棒可以通過孔隙旋入瘺管病變中，或膠原蛋白可以用套管引入受試者中。各種類型的瘺管可以使用本文提供的ECM組合物填充、密封和/或另外地處理，如肛門的、動靜脈的、膀胱、頸內(nèi)動脈海綿竇的、外部的、胃的、腸的、壁腔的、唾液的、陰道的和肛門直腸的瘺管，或其組合。

在一個實施方式中，本文提供了填充、密封和/或另外地處理受試者的憩室的方法，所述方法包括向受試者注射或另外地施用本文提供的ECM組合物。憩室是作為管狀或囊狀器官(如腸、膀胱等)的袋或囊開口的異常生理結(jié)構(gòu)，且可以使用本文提供的ECM組合物填充或增強(qiáng)。

在另一實施方式中，本文提供了填充、密封和/或另外地處理受試者的囊腫的方法，所述方法包括向受試者注射或另外地施用本文提供的ECM組合物。在一些實施方式中，囊腫是具有例如流體的累積但不包含上皮或其它膜性內(nèi)襯的假囊腫?？梢蕴畛洹⒚芊夂?或另外地處理的囊腫的其它非限制性實例包括皮脂囊腫、皮樣囊腫、骨囊腫或漿液囊腫，或其組合。

在另一實施方式中，本文提供的ECM組合物可以注射或另外地施用以整體地或部分地填充由于從受試者手術(shù)、化學(xué)或生物移除不需要的或不希望的生長、流體、細(xì)胞或組織而產(chǎn)生的任何空隙。ECM組合物可以在空隙部位局部地注射或另外地施用以增強(qiáng)剩余的和周圍的組織、幫助愈合過程和最小化感染的風(fēng)險。這種增強(qiáng)特別地用于在腫瘤切除后產(chǎn)生的空隙部位，如在乳腺癌手術(shù)、除去腫瘤性結(jié)締組織、骨組織或軟骨組織的手術(shù)等后。

4.3.5組織增量

在另一實施方式中，本文提供的ECM組合物可以用于組織增量。如本文中使用的，“組織增量”是指受試者的(例如，人的)非皮膚軟組織的天然狀態(tài)由于外部活動或效應(yīng)導(dǎo)致的任何變化。本文中涵蓋的組織包括，但不限于肌肉組織、結(jié)締組織、脂肪和神經(jīng)組織。該組織可以是許多器官或身體部位的部分，包括但不限于，括約肌、膀胱括約肌和尿道。

4.3.6尿失禁

在另一實施方式中，本文提供的ECM組合物可以用于治療尿失禁(包括應(yīng)激性尿失禁)，其是隨著導(dǎo)致腹內(nèi)壓提高的活動(如咳嗽、噴嚏、笑或運動)而發(fā)生的尿液突然泄漏。按照這樣的實施方式，本文提供的ECM組合物可以例如，注射到受試者中以增強(qiáng)受試者的括約肌組織，由此在受試者中實現(xiàn)改善或恢復(fù)。ECM組合物可以尿道周地注射或另外地施用以增加尿道周圍的組織體量(bulk)而控制和/或治療尿失禁。應(yīng)激性尿失禁的改善可以通過增加組織體量并從而提高尿外流的阻力而實現(xiàn)。

在一些實施方式中，ECM組合物在尿道周圍的區(qū)域中注射或另外地施用于受試者，例如，以封閉尿液通過其泄漏的孔洞或增加尿道壁的厚度，從而在憋尿時緊密地密封。

在另一實施方式中，ECM組合物在尿道周圍恰好于膀胱出口處尿道肌肉外側(cè)注射或另外地施用于受試者。注射增量材料可以通過皮膚、通過尿道或者，在女性中，通過陰道進(jìn)行。

4.3.7膀胱輸尿管反流

在另一實施方式中，本文提供的ECM組合物可以用于治療膀胱輸尿管反流(VUR)(或尿反流)，其特征為尿液從膀胱到腎的返行性流動。按照這樣的實施方式，本文提供的ECM組合物可以注射或另外地施用于需要的受試者，其中受試者的輸尿管壁被增強(qiáng)，且VUR的癥狀減輕或消除。組合物可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法注射(例如，subtrigonal注射)或另外地施用(如在內(nèi)窺鏡指導(dǎo)下)到輸尿管口下方的逼尿肌背層中。

4.3.8胃食管反流病

在另一實施方式中，本文提供的ECM組合物可以用于治療胃食管反流病(GERD)，這是通常因為下食道括約肌(LES)—食管與胃接合處的肌肉瓣膜—未正確關(guān)閉、松弛或弱化及胃內(nèi)容物回漏或回流到食管中而發(fā)生的障礙。按照這樣的實施方式，本文提供的ECM組合物可以注射或另外地施用于需要的受試者，其中受試者的LES增強(qiáng)，且GERD的癥狀減輕或消除。在一些實施方式中，ECM組合物在內(nèi)窺鏡指導(dǎo)下施用到食管胃接合處的食管壁中。為阻止回流，增量效應(yīng)由保留的材料和相應(yīng)的組織反應(yīng)的組合產(chǎn)生。ECM組合物可以通過標(biāo)準(zhǔn)或大口徑(例如，大號)注射針注射。

4.3.9聲帶和喉

在另一實施方式中，本文提供的ECM組合物可以用于控制或治療影響聲帶(聲襞)和/或喉(喉頭)之一或兩者的疾病、障礙(如神經(jīng)障礙)或其它異常。喉和聲帶的這類疾病、障礙或其它異常的非限制性實例包括聲門閉合不全、單側(cè)聲帶麻痹、雙側(cè)聲帶麻痹、麻痹性發(fā)聲障礙、非麻痹性發(fā)聲障礙、痙攣性發(fā)音障礙或其組合。在其它實施方式中，本文提供的ECM組合物可以用于控制或治療導(dǎo)致聲帶不正確關(guān)閉的疾病、障礙或其它異常，如聲帶的不完全麻痹(“輕度麻痹”)、一般弱化聲帶，例如，伴隨老年的聲帶弱化(“presbylaryngis”)和/或聲帶的瘢痕(例如，來自之前的手術(shù)或放射治療)。

本文提供的ECM組合物可以用于對缺乏聲帶曾經(jīng)具有的體量(如在聲帶彎折(vocal fold bowing)或萎縮中)或運動性(如在麻痹中)的受試者的聲襞提供支持或體量。在一些實施方式中，聲帶和/或喉的其它軟組織可以用本文提供的ECM組合物單獨地或者與其它處理或藥物治療組合增強(qiáng)。在一個實施方式中，本文提供的ECM組合物對一個(或兩個)聲襞增強(qiáng)或增大體量以使得其可以與另一聲襞接觸。

本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種過程中的任一種可以用于向受試者的聲帶或喉施用本文提供的ECM組合物。在一些實施方式中，彎曲針用于通過受試者的口注射本文提供的ECM組合物。在其它實施方式中，針(如較高號的短針)可用于直接通過受試者的皮膚和喉結(jié)注射本文提供的ECM組合物。

在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物可以用于控制或治療聲帶麻痹。在一個實施方式中，本文提供的ECM組合物用于通過向受試者注射或另外地施用ECM組合物控制或治療受試者的單側(cè)或雙側(cè)聲帶麻痹或者與其相關(guān)的癥狀，其中聲襞關(guān)閉在受試者中得到改善。在一個實施方式中，ECM組合物增強(qiáng)一個(兩個)麻痹的聲帶或增大其體量以使得其可以與另一聲襞接觸。ECM組合物注射到受試者可以通過受試者的口或直接通過受試者的皮膚和喉結(jié)。

在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物可以用于治療發(fā)聲障礙，其是聲音的任何受損或說話困難。

4.3.10聲門閉合不全

在另一實施方式中，本文提供的ECM組合物可以用于控制或治療聲門閉合不全。經(jīng)皮的喉膠原蛋白增強(qiáng)可以通過使用本領(lǐng)域中已知的方法注射本文提供的ECM組合物到受試者的聲帶中而發(fā)生。在一些情況中，受試者具有發(fā)聲過弱和/或聲門閉合不全(其影響喉的語音功能)、增加的肌強(qiáng)直和降低的甲杓肌的運動能力。在另一實施方式中，發(fā)聲過弱是帕金森病的結(jié)果。在一個實施方式中，ECM組合物可以用于通過向受試者的聲帶注射或另外地施用ECM組合物來控制或治療需要的受試者的聲門閉合不全，其中注射增強(qiáng)聲帶且改善聲門閉合(glottic closure)，以使得受試者中聲門閉合不全減輕或消除。

4.3.11生物工程

在另一實施方式中，本文提供的ECM組合物可以用于組織或器官的生物工程，該組織或器官的生物工程可以用于，例如，組織置換應(yīng)用?？梢允褂帽疚奶峁┑腅CM組合物產(chǎn)生的生物工程化部件的實例包括，但不限于骨、牙結(jié)構(gòu)、關(guān)節(jié)、軟骨、骨骼肌、平滑肌、心肌、肌腱、半月板、韌帶、血管、支架、心臟瓣膜、角膜、耳鼓膜、神經(jīng)導(dǎo)引管(nerve guide)、組織或器官補(bǔ)片或密封劑、缺失組織的填充劑、用于美容修復(fù)的薄片、皮膚(具有添加的細(xì)胞以制備皮膚替代物的薄片)、喉如氣管、會厭和聲帶的軟組織結(jié)構(gòu)、其它軟骨質(zhì)結(jié)構(gòu)如鼻軟骨、瞼板、氣管環(huán)、甲狀軟骨和杓狀軟骨、結(jié)締組織、血管移植物及其部件，及用于局部施用的薄片、和器官如肝、腎和胰腺的修復(fù)或替換。

4.3.12美容應(yīng)用

本文提供的ECM組合物進(jìn)一步可用于美容應(yīng)用。一般地，這類美容用途是基于本文提供的ECM組合物用于填充受試者皮膚中或皮膚上的紋路、皺紋和其它皺褶并因此恢復(fù)更平滑、更年輕的外貌的事實。

在某些實施方式中，本文提供的ECM組合物可以用于受試者的皮膚增強(qiáng)。在一個實施方式中，用于受試者的皮膚增強(qiáng)的方法包括注射或另外地施用本文提供的ECM組合物到需要增強(qiáng)的受試者的面部或身體區(qū)域，其中該受試者的面部或身體區(qū)域與施用膠原蛋白之前的區(qū)域相比得到增強(qiáng)。如本文中使用的“皮膚增強(qiáng)”是指受試者的(例如，人的)皮膚和相關(guān)區(qū)域的天然狀態(tài)由于外部活動或效應(yīng)導(dǎo)致的任何變化?？梢酝ㄟ^皮膚增強(qiáng)改變的非限制性皮膚區(qū)域包括表皮、真皮、皮下層、脂肪、豎毛肌(arrector pill muscle)、毛干、汗孔、皮脂腺或其組合。

本文提供的ECM組合物的示例性美容用途包括使用ECM組合物增強(qiáng)面部的皺紋或凹陷區(qū)域和/或?qū)κ茉囌叩拿娌亢蜕眢w區(qū)域增加或提高豐滿度；使用ECM組合物處理皮膚缺陷，包括但不限于，皺紋、凹陷或其它摺痕(例如，抬頭紋、煩惱紋(worry line)、魚尾紋、嘴角紋)、妊娠紋、內(nèi)部和外部疤痕(如由損傷、傷口、事件、咬傷或手術(shù)產(chǎn)生的)；使用ECM組合物矯正“眍”眼和導(dǎo)致眼睛周圍的黑眼圈的可見血管；使用ECM組合物矯正或補(bǔ)充整形手術(shù)，包括在從下瞼袋切除術(shù)精準(zhǔn)去除眼袋脂肪墊后眼袋的矯正、精準(zhǔn)頰脂抽取后下臉頰的矯正及鼻整形術(shù)、皮膚移植或其它手術(shù)導(dǎo)致的不規(guī)則性的結(jié)果(如由抽脂術(shù)導(dǎo)致的壓痕)的矯正；使用ECM組合物矯正面部或身體疤痕(例如，傷口、水痘或痤瘡疤痕)；和使用ECM組合物進(jìn)行面部整形。

5.試劑盒

在另一方面中，本文提供了包含本文提供的ECM組合物的試劑盒。

在一個實施方式中，本文提供了包含本文提供的ECM組合物的試劑盒，其中所述ECM組合物配制為薄片。ECM薄片以無菌形式提供，且包裝在袋中。在這樣的試劑盒中提供的ECM的薄片可以為不同的尺寸(例如，5x 5cm或9x 9cm)和厚度(例如，1.5-2.5mm)且準(zhǔn)備由實施者使用，例如，用作傷口敷料。

在另一實施方式中，本文提供了包含本文提供的ECM組合物的試劑盒，其中所述ECM組合物可以配制為可流動基質(zhì)。在這樣的試劑盒中，ECM組合物以無菌形式提供，且作為微粉化ECM包裝在玻璃小瓶中。這樣的小瓶可以包含不同量的微粉化ECM，例如，200mg微粉化ECM。包含配制為可流動基質(zhì)的ECM組合物的試劑盒可以進(jìn)一步包含適合用于懸浮微粉化ECM的成分，如懸浮溶液(例如，鹽水)及具有針和柔性施藥器的注射器。

在另一實施方式中，本文提供了包含本文提供的ECM組合物的試劑盒，其中所述ECM組合物配制為顆粒物。在這樣的試劑盒中，ECM組合物以無菌形式提供，且作為碾磨的ECM包裝在玻璃小瓶中。這樣的小瓶可以包含不同量的碾磨的ECM，例如，100mg或200mg碾磨的ECM。

本文提供的試劑盒可以包含關(guān)于使用試劑盒中提供的ECM組合物的說明的標(biāo)簽或標(biāo)記。在某些實施方式中，試劑盒可以包含可用于實施ECM組合物可用的方法的部件，如用于施用試劑盒中的ECM組合物的裝置，例如，一個或多個噴霧瓶、鑷子、抹刀(用于涂布糊或顆粒物)、插管、導(dǎo)管等。

6.實施例

6.1實施例1：產(chǎn)生胎盤ECM的方法

本實施例描述了產(chǎn)生胎盤ECM的方法，最初配制為糊。

方法1：獲得先前分離的冷凍的人胎盤并允許在室溫下解凍～24小時。在胎盤解凍后，從胎盤除去羊膜、絨毛膜和臍帶并丟棄。接下來，胎盤切割成2x 2厘米條用于處理。

胎盤組織然后置于含有1.5升的1M NaCl溶液的容器中，并使用Omni Mixer Homogenizer(Omni International,Kennesaw,GA)均質(zhì)化。接下來，均質(zhì)化的胎盤組織置于處理袋中，且該袋填充1M NaCl溶液到9.2升的總體積。均質(zhì)化的胎盤組織然后如下在1M NaCl溶液中洗滌三次：(i)處理袋在定軌搖床上搖動10分鐘，(ii)允許胎盤組織在處理袋中沉降10分鐘，和(iii)通過重力排空從處理袋除去6.2升的上清液，這是從混合物除去血液和碎片的步驟。

在第三洗滌步驟后，洗滌的胎盤組織允許在室溫下在定軌搖床上1M NaCl溶液中(共3升混合物)混合～18-26小時。接下來，胎盤組織按以上對于NaCl洗滌所述的相同方式用無菌水洗滌四次。在水中第四次洗滌后，胎盤組織允許在室溫下在定軌搖床上在水中(共3升混合物)混合～18-26小時。在水中～18-26小時混合后，胎盤組織如上所述用水洗滌最后一次，然后6.2L的3％脫氧膽酸鈉添加到混合物中達(dá)到混合物中2％脫氧膽酸鈉的終濃度。

胎盤組織允許在室溫下在定軌搖床上于2％脫氧膽酸鈉溶液中混合～72小時。在～72小時混合后，胎盤組織按以上所述的方式用無菌水洗滌五次。在最終的水添加后，通過逐滴添加1M NaOH使溶液的pH達(dá)到約10-12，從而得到堿性溶液。胎盤組織允許在室溫下在定軌搖床上于堿性溶液中混合～30分鐘。在～30分鐘混合后，溶液的pH通過逐滴添加0.1N HCl調(diào)節(jié)到約7.0-7.5。

上清液然后從處理袋移除并收集剩余的胎盤組織和離心。在離心后，上清液移除并作為最終洗滌步驟將收集的胎盤組織重懸在無菌水中，且再次離心，接著丟棄上清液。所得的組合物代表包含膠原蛋白和彈性蛋白的胎盤ECM，且為白色糊的形式。

方法2：在放出用于加工時，冷凍的人胎盤在2-8℃下解凍并然后轉(zhuǎn)移到生物安全柜(BSC)，且然后如方法1中進(jìn)行處理。胎盤從其存儲容器移出并置于無菌的一次性托盤上。胎盤然后進(jìn)行清潔以除去過量的血液和血凝塊，并然后切割成小段。切割的胎盤材料懸浮在無菌水中并然后使用機(jī)械均漿器均質(zhì)化，這產(chǎn)生具有增加的表面積的小的組織顆粒物，從而允許更有效地分離和除去來自胎盤ECM的細(xì)胞和細(xì)胞碎片。來自胎盤的均質(zhì)化的組織轉(zhuǎn)移到具有1M氯化鈉溶液的處理袋中。組織通過在定軌搖床上振搖用無菌的1M氯化鈉(NaCl)洗滌幾次；NaCl溶液通過允許胎盤組織沉降，然后排水和用另外的無菌1M NaCl溶液更新而進(jìn)行交換。胎盤組織在無菌1M NaCl溶液中伴隨振搖保持18-24小時，接著用無菌水重復(fù)洗滌。所有處理步驟在室溫下進(jìn)行。胎盤組織暴露于高濃度氯化鈉和接著暴露于水構(gòu)成對組織的“滲壓震擾”，其用于清除組織的血液、血液成分、細(xì)胞和細(xì)胞碎片。胎盤組織在下一步驟(清潔劑洗滌)之前經(jīng)歷第二“滲壓震擾”。

清洗的胎盤組織在室溫下于生物-處理袋中伴隨振搖用無菌的0.1-0.3％脫氧膽酸(DOC)鈉溶液和4-8mM乙二胺四乙酸(EDTA)溶液保持48-72小時。在無菌水清洗后，組織經(jīng)歷DOC/EDTA的第二洗滌18-24小時。無菌水然后用于清洗組織和除去DOC和EDTA。

在完成水洗滌后，上清液從生物處理袋移除并用2mM氯化鎂和10U/mL的的溶液，pH 8-9代替，且在室溫下混合18-24小時。是降解所有形式的核酸(RNA&DNA)的核酸內(nèi)切酶；所得的較短多核苷酸片段用胎盤組織的順序清洗洗掉。

在胎盤組織清洗以除去殘留核酸后，材料作為病毒滅活步驟經(jīng)歷低和高pH處理。在第一步驟中，胎盤組織在無菌的0.67M NaCl溶液的存在下經(jīng)歷3.3或更低的pH并允許在22+/-1℃下在定軌搖床上振搖24小時。在第二步驟中，溶液的pH使用氫氧化鈉(NaOH)調(diào)節(jié)到≥13并允許在22+/-1℃下在定軌搖床上于生物處理袋中混合最少4小時。在NaOH暴露結(jié)束時，溶液的pH調(diào)節(jié)到5.5-9.0的范圍。

在酸和堿處理完成時，組織用1M NaCl孵育并允許在定軌搖床上混合48-72小時。在NaCl處理后，胎盤ECM用無菌水洗滌18-24hr以除去碎片和殘留污染物。ECM糊通過離心懸浮液產(chǎn)生。ECM糊儲存在-20℃冰箱中直到產(chǎn)物進(jìn)行配制和滅菌。

作為薄片的制劑：為產(chǎn)生ECM薄片，ECM糊在2℃-22℃下解凍24-48小時，并在生物安全柜中重懸在無菌的磷酸鹽緩沖液中。組織均質(zhì)化以制備均勻的ECM懸浮液，其分布到無菌塑料模具中并冷凍。冷凍的ECM的模具使用凍干來脫水。所得的脫水ECM干膠片用無菌水復(fù)水且然后在室溫下在真空輔助干燥器上壓實18-36小時。薄片置于雙重袋(double pouch)中并使用醫(yī)藥級密封劑密封、標(biāo)記和使用γ照射滅菌。

作為顆粒物的制劑：為產(chǎn)生ECM顆粒物，ECM糊重懸于無菌水中，轉(zhuǎn)移到模具中，使用Controlled Rate Freezer(Thermo Scientific,Marietta,OH)冷凍并在凍干機(jī)(LabConco,Kansas City,MO)中凍干48小時。凍干的ECM使用噴射磨機(jī)(Fluid Energy,Telford,PA)碾磨，從而得到ECM顆粒物。碾磨的ECM粉末可以填充到琥珀色玻璃小瓶中并密封。

作為可流動基質(zhì)的制劑：ECM可流動基質(zhì)可以使用ECM顆粒物制備。一般地，ECM可流動基質(zhì)可以通過懸浮凍干的、碾磨的ECM(ECM顆粒物)在例如，無菌水或鹽水溶液中來制備。

6.2實施例2：ECM組合物的膠原蛋白含量的測定

本實施例說明了ECM組合物的膠原蛋白含量的分析。

如實施例1中所述制備成顆粒物、薄片或可流動基質(zhì)形式的ECM組合物使用比色羥脯氨酸測定法分析總膠原蛋白含量。膠原蛋白是獨特的蛋白質(zhì)，因為它具有非常高的脯氨酸濃度。另外，膠原蛋白被翻譯后修飾為羥脯氨酸。如此，可以從在熱鹽酸中水解的膠原蛋白獲得羥脯氨酸的定量，這可以用作膠原蛋白定量的替代。

ECM樣品在110℃下用6N HCl水解，且羥脯氨酸然后使用Chloramine-T(N-氯代4-甲基苯磺酰胺)氧化為吡咯-2-羧酸(吡咯)。使用4-二甲基氨基苯甲醛(DMAB)顯色，且通過讀取550nm下的吸光度測定羥脯氨酸含量。樣品吸光度針對使用已知量的羥脯氨酸的羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)推。

ECM組合物測定為包含ECM組合物重量的31重量％的總膠原蛋白至53重量％的總膠原蛋白(表1)。14/16個樣品落入ECM組合物重量的34％-43％總膠原蛋白的范圍，且12/16個樣品落入ECM組合物重量的37％-42％總膠原蛋白的范圍。相反，源自豬膀胱基質(zhì)的比較基質(zhì)產(chǎn)品(Wound Matrix薄片或MATRISTEM顆粒物)和胎牛真皮基質(zhì)(PRIMATRIX^TM Dermal Repair Matrix)發(fā)現(xiàn)分別包含67重量％、67重量％和69重量％的總膠原蛋白。

表1：作為ECM組合物干重的百分比的總膠原蛋白

6.3實施例3：ECM組合物的彈性蛋白含量的測定

本實施例說明了ECM組合物的彈性蛋白含量的分析。

如實施例1中所述制備為顆粒物或薄片的ECM組合物使用Fastin Elastin Assay試劑盒(BioColor,Ltd.(UK))分析彈性蛋白含量，其使用5,10,15,20-四苯基-21,23-卟吩四-磺酸酯(TPPS)作為染料以染色來自測試樣品的提取的和溶解的α-彈性蛋白。彈性蛋白在100℃下于0.25M草酸中從ECM組合物提取。彈性蛋白然后用三氯乙醇和鹽酸(TCA/HCl)沉淀，且隨后用TPPS染色。TPPS然后從彈性蛋白解離，且釋放的TPPS水平通過分光光度法定量。ECM組合物樣品中的彈性蛋白水平通過針對彈性蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)推來測定。

ECM組合物測定為具有ECM組合物重量的13％-29％范圍的彈性蛋白(表2)。14/16個樣品落入ECM組合物重量的16％-24％彈性蛋白的范圍，13/16個樣品落入ECM組合物重量的17％-24％彈性蛋白的范圍，且10/16個樣品落入ECM組合物重量的20％-24％彈性蛋白的范圍。相反，源自豬膀胱基質(zhì)的比較基質(zhì)產(chǎn)品(Wound Matrix薄片或MATRISTEM顆粒物)發(fā)現(xiàn)包含4％的彈性蛋白。彈性蛋白未在胎牛真皮基質(zhì)(PRIMATRIX^TM Dermal Repair Matrix)中檢測到。

在表2和3中，樣品8代表與表1中的樣品8相同的ECM組合物。但是，分析的ECM組合物類型不同(即，ECM組合物的可流動基質(zhì)形式在表1中分析，而ECM組合物的顆粒物形式在表2和3中分析)。

表2：總ECM組合物干重的彈性蛋白百分比

6.4實施例4：ECM組合物的纖連蛋白含量的測定

本實施例描述了ECM組合物的纖連蛋白含量的分析。

如實施例1中所述制備為顆粒物或薄片的ECM組合物使用TaKaRa Fibronectin EIA試劑盒(Mountain View,CA)分析纖連蛋白含量，其是基于利用兩種小鼠單克隆抗-人纖連蛋白抗體以通過兩步驟過程檢測纖連蛋白的夾心ELISA方法。另外，開發(fā)了使用2M尿素緩沖液的特定的纖連蛋白提取方法。

15mg的ECM組合物與3mL的提取緩沖液(2M尿素,0.05M PO4,2mM PMSF,pH 7.1)混合并在攪拌板上混合4小時。樣品然后以10,000X g離心20分鐘。上清液在–20℃下存儲直到分析時間或直接使用。使用TaKaRa Fibronectin EIA試劑盒分析16個ECM組合物樣品按照制造商的指示進(jìn)行。纖連蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線使用可商購的凍干纖連蛋白構(gòu)建，且樣品纖連蛋白濃度從曲線內(nèi)推。

ECM組合物的纖連蛋白含量低，平均為197ng纖連蛋白每mg ECM組合物(ECM組合物的0.0197重量％)，范圍為21.3ng/mg-361.3ng/mg。測試豬膀胱基質(zhì)(Wound Matrix薄片或MATRISTEM顆粒物)和胎牛真皮基質(zhì)(PRIMATRIX^TM Dermal Repair Matrix)的樣品，但在該試驗中未顯示纖連蛋白含量，可能是因為分析中使用的抗體不與牛或豬基質(zhì)交叉反應(yīng)。

表3：總ECM組合物干重的纖連蛋白百分比

6.5實施例5：ECM組合物的層粘連蛋白組成的測定

如實施例1中所述制備并配制為薄片或顆粒物的十六個ECM組合物樣品使用TaKaRa Laminin EIA試劑盒(Mountain View,CA)按照制造商的指示分析層粘連蛋白含量。試劑盒是基于利用兩種小鼠單克隆抗-人層粘連蛋白抗體以通過兩步驟過程檢測層粘連蛋白的夾心ELISA方法。另外，開發(fā)了使用2M尿素緩沖液的特定的層粘連蛋白提取方法。層粘連蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線使用可商購的凍干層粘連蛋白構(gòu)建，且樣品層粘連蛋白濃度從曲線內(nèi)推。

結(jié)果：層粘連蛋白未在16個ECM樣品中的任何一個中檢測到。

層粘連蛋白也未在用于比較的所分析豬膀胱基質(zhì)(薄片或顆粒物)或胎牛真皮薄片中檢測到。

6.6實施例6：ECM組合物的生物相容性

如實施例1中所述制備并配制為薄片、顆粒物或可流動基質(zhì)的ECM組合物在研究開始時年齡4.7-6.3個月和體重2.4-2.9kg的白化新西蘭白兔中測試生物相容性。作為對照，ECM薄片與Wound Matrix(豬膀胱基質(zhì))比較；ECM顆粒物與MATRISTEM比較，且ECM可流動基質(zhì)與INTEGRA^TMFlowable Wound Matrix(膠原蛋白和糖胺聚糖)比較。

可流動基質(zhì)的制備：ECM可流動和INTEGRA^TM Flowable通過用3mL Vial Access注射器抽吸2mL的注射用水，消除任何氣泡和調(diào)節(jié)體積到2mL而制備。套管然后從Vial Access注射器除去。這一注射器然后尖對尖連接于含有2mL水的ECM注射器。水緩慢地從小瓶連接(vial access)注射器注射到Vial Access注射器中，且使用10-15次往復(fù)移動小心地混合直到粉末均勻地水化。整個重構(gòu)的糊推入注射器之一中。然后丟棄空注射器，空的1mL注射器連接于其余的ECM糊注射器，且1mL的ECM可流動或INTEGRA^TM Flowable糊轉(zhuǎn)移到1mL注射器中。這一最后步驟用第二個1mL注射器重復(fù)。糊對于各劑量在加載到1mL注射器中之前重混合。INTEGRA^TM Flowable與3.0mL注射用鹽水混合。測試和對照品使用填充的1mL注射器直接施用。

植入：對于各動物，2-4cm的皮膚切口在背部中央形成，通過兩個椎旁肌的筋膜延伸。對于各植入位點，5mm切口在椎旁肌中形成且小袋用止血鉗產(chǎn)生用于植入，距中線約2cm且與肌纖維軸平行，從而使得在植入位點之間有至少2.5cm。四個測試或四個對照品在椎旁肌的一側(cè)植入。對于各組，測試品在右側(cè)植入和對照品在左側(cè)植入。所有植入位點然后用非可吸收縫線封閉，且皮膚切口用縫線和/或縫皮釘封閉。50μL的可流動制劑、5mg的顆粒物制劑和1片(1x 3x 10mm)薄片制劑植入所產(chǎn)生的肌肉袋中。對照品是50μL的牛來源的傷口基質(zhì)產(chǎn)物(INTEGRA^TM Flowable)、5mg的源自豬膀胱的細(xì)胞外基質(zhì)(MATRISTEM)的顆粒物制劑和源自豬膀胱的細(xì)胞外基質(zhì)(MATRISTEM)的薄片制劑(1x 3x 10mm)。動物在植入后第1、2或4周殺死，且在進(jìn)行組織學(xué)分析。

結(jié)果：ECM薄片顯示比豬膀胱基質(zhì)明顯較低的組織反應(yīng)性。在植入后第1周，鄰近膀胱基質(zhì)(UBM)薄片的組織顯示肉芽形成和炎癥反應(yīng)的明顯征兆(圖1A)，而ECM薄片顯示散布著粒細(xì)胞的輕度浸潤的肌肉組織。在第2和4周，鄰近UBM薄片的肉芽形成仍然明顯(圖1C和1E)，而鄰近ECM薄片的組織實際上不顯示肉芽形成且看起來是正常的(圖1D和1F)。ECM薄片在植入后第1、2和4周被認(rèn)為是非-刺激性的。

ECM顆粒物和可流動基質(zhì)也工程化為具有比對照顆粒物或可流動基質(zhì)低的組織反應(yīng)性(圖2和3)。例如，在移植后第1周，ECM顆粒物顯示出表明炎癥的肉芽形成(圖2B)，但顯著少于UBM顆粒物(圖2A)，而在第2和4周，ECM顆粒物與UBM顆粒物相比顯示出肉芽形成的顯著減少(分別圖2D和2F)，UBM顆粒物在第2和4周仍顯示顯著的炎癥(分別圖2C和2E)。類似地，盡管牛來源的傷口基質(zhì)產(chǎn)物(INTEGRA^TM Flowable)在第1周時顯示肉芽形成(圖3A)，接著在第2和4周時顯示瘢痕形成(圖3C和3E中的較亮區(qū)域)，但ECM可流動僅在第1周中顯示實質(zhì)的炎性反應(yīng)(圖3B)，接著在第2和4周時接近完全痊愈(分別圖3D和3F)。

6.7實施例7：從胎盤絨毛膜產(chǎn)生胎盤ECM的方法

本實施例描述了從胎盤絨毛膜產(chǎn)生胎盤ECM的方法，最初配制為糊。

方法1：獲得先前分離的冷凍的人胎盤并允許在室溫下解凍～24小時。在胎盤解凍后，從胎盤獲得絨毛膜。接下來，胎盤切割成2x 2厘米條用于處理。

胎盤絨毛膜組織然后置于含有1.5升的1M NaCl溶液的容器中，并使用Omni Mixer Homogenizer(Omni International,Kennesaw,GA)均質(zhì)化。接下來，均質(zhì)化的胎盤絨毛膜組織置于處理袋中，且袋填充1M NaCl溶液到9.2升的總體積。均質(zhì)化的胎盤絨毛膜組織然后如下在1M NaCl溶液中洗滌三次：(i)處理袋在定軌搖床上搖動10分鐘，(ii)允許胎盤絨毛膜組織在處理袋中沉降10分鐘，和(iii)通過重力排空從處理袋除去6.2升的上清液，這是從混合物除去血液和碎片的步驟。

在第三洗滌步驟后，洗滌的胎盤絨毛膜組織允許在室溫下在定軌搖床上1M NaCl溶液中(共3升混合物)混合～18-26小時。接下來，胎盤組織按以上對于NaCl洗滌所述的相同方式用無菌水洗滌四次。在水中第四次洗滌后，胎盤絨毛膜組織允許在室溫下在定軌搖床上水中(共3升混合物)混合～18-26小時。在水中～18-26小時混合后，胎盤絨毛膜組織如上所述用水洗滌最后一次，然后6.2L的3％脫氧膽酸鈉添加到混合物中達(dá)到混合物中2％脫氧膽酸鈉的終濃度。

胎盤絨毛膜組織允許在室溫下在定軌搖床上2％脫氧膽酸鈉溶液中混合～72小時。在～72小時混合后，胎盤絨毛膜組織按以上所述的方式用無菌水洗滌五次。在最終的水添加后，通過逐滴添加1M NaOH使溶液的pH達(dá)到約10-12，從而得到堿性溶液。胎盤絨毛膜組織允許在室溫下在定軌搖床上堿性溶液中混合～30分鐘。在～30分鐘混合后，溶液的pH通過逐滴添加0.1N HCl調(diào)節(jié)到約7.0-7.5。

上清液然后從處理袋移除并收集剩余的胎盤絨毛膜組織和離心。在離心后，上清液移除和作為最終洗滌步驟將收集的胎盤絨毛膜組織重懸在無菌水中，并再次離心，接著丟棄上清液。所得的組合物代表包含膠原蛋白和彈性蛋白的胎盤ECM，且為白色糊的形式。

方法2：在放出用于加工時，冷凍的人胎盤在2-8℃下解凍并然后轉(zhuǎn)移到生物安全柜(BSC)。胎盤從其存儲容器移除并置于無菌的一次性托盤上。胎盤然后清潔以除去過量的血液和血凝塊。獲得胎盤的絨毛膜并切割成小段。切割的胎盤絨毛膜材料懸浮在無菌水中并然后使用機(jī)械均漿器均質(zhì)化，這產(chǎn)生具有增加的表面積的小的組織顆粒物，從而允許更有效地從胎盤ECM分離和除去細(xì)胞和細(xì)胞碎片。來自胎盤絨毛膜的均質(zhì)化的組織轉(zhuǎn)移到具有無菌的1M氯化鈉溶液的無菌處理袋中。組織通過在定軌搖床上振搖用無菌的1M氯化鈉(NaCl)洗滌幾次；NaCl溶液通過允許胎盤組織沉降，然后排水和用另外的無菌1M NaCl溶液更新而進(jìn)行交換。胎盤組織在無菌的1M NaCl溶液中伴隨振搖保持18-24小時，接著用無菌水重復(fù)洗滌。所有處理步驟在室溫下進(jìn)行。胎盤絨毛膜組織暴露于高濃度氯化鈉和接著暴露于水構(gòu)成對組織的“滲壓震擾”，其用于清除組織的血液、血液成分、細(xì)胞和細(xì)胞碎片。胎盤組織在下一步驟(清潔劑洗滌)之前經(jīng)歷第二“滲壓震擾”。

清洗的胎盤絨毛膜組織在室溫下于生物-處理袋中伴隨振搖用無菌0.1-0.3％脫氧膽酸(DOC)鈉溶液和4-8mM乙二胺四乙酸(EDTA)溶液保持48-72小時。在無菌水清洗后，組織經(jīng)歷DOC/EDTA的第二洗滌18-24小時。無菌水然后用于清洗組織并除去DOC和EDTA。

在完成水洗滌后，上清液從生物處理袋移除并用2mM氯化鎂和10U/mL的的溶液，pH 8-9代替，且在室溫下混合18-24小時。是降解所有形式的核酸(RNA&DNA)的核酸內(nèi)切酶；所得的較短多核苷酸片段用胎盤組織的順序清洗洗掉。

在胎盤絨毛膜組織清洗以除去殘留核酸后，材料作為病毒滅活步驟經(jīng)歷低和高pH處理。在第一步驟中，胎盤絨毛膜組織在無菌的0.67M NaCl溶液的存在下經(jīng)歷3.3或更低的pH并允許在22+/-1℃下在定軌搖床上振搖24小時。在第二步驟中，溶液的pH使用氫氧化鈉(NaOH)調(diào)節(jié)到≥13并允許在22+/-1℃下在定軌搖床上生物處理袋中混合最少4小時。在NaOH暴露結(jié)束時，溶液的pH調(diào)節(jié)到5.5-9.0的范圍。

在酸和堿處理完成時，組織用1M NaCl孵育并允許在定軌搖床上混合48-72小時。在NaCl處理后，胎盤絨毛膜ECM用無菌水洗滌18-24hr以除去碎片和殘留污染物。ECM糊通過離心懸浮液產(chǎn)生。ECM糊可以儲存在-20℃冰箱中直到產(chǎn)物進(jìn)行配制和滅菌。

作為薄片的制劑：為產(chǎn)生ECM薄片，ECM糊在2℃-22℃下解凍24-48小時，并在生物安全柜中重懸在無菌的磷酸鹽緩沖液中。組織均質(zhì)化以制備均勻的ECM懸浮液，其分布到無菌塑料模具中并冷凍。冷凍的ECM的模具使用凍干來脫水。所得的脫水ECM干膠片用無菌水復(fù)水且然后在室溫下在真空輔助干燥器上壓實18-36小時。薄片置于雙重袋中并使用醫(yī)藥級密封劑密封、標(biāo)記和使用γ照射滅菌。

作為顆粒物的制劑：為產(chǎn)生ECM顆粒物，ECM糊重懸于無菌水中，轉(zhuǎn)移到模具中，使用Controlled Rate Freezer(Thermo Scientific,Marietta,OH)冷凍并在凍干機(jī)(LabConco,Kansas City,MO)中凍干48小時。凍干的ECM使用噴射磨機(jī)(Fluid Energy,Telford,PA)碾磨，從而得到ECM顆粒物。碾磨的ECM粉末可以填充到琥珀色玻璃小瓶中并密封。

作為可流動基質(zhì)的制劑：ECM可流動基質(zhì)可以使用ECM顆粒物制備。一般地，ECM可流動基質(zhì)可以通過懸浮凍干的、碾磨的ECM(ECM顆粒物)在例如，無菌水或鹽水溶液中來制備。

ECM的膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白和/或?qū)诱尺B蛋白含量可以分別以實施例2、3、4和5中描述的方式分析。此外，ECM的生物相容性可以以實施例6中描述的方式評價。

6.8實施例8：從胎盤絨毛膜產(chǎn)生胎盤ECM的方法(2)

本實施例描述了用于從胎盤絨毛膜產(chǎn)生胎盤ECM組合物的方法，最初配制為糊。

使用從剛足月生產(chǎn)的母親獲得的人胎盤或先前分離的冷凍人胎盤(其允許解凍)。胎盤在0.5M NaCl中洗滌。羊膜、臍帶和壁蛻膜從胎盤除去，且保留絨毛膜板，其然后刮擦和清潔。刮擦的、清潔的絨毛膜在0.5M NaCl和水中清洗，且然后在2％脫氧膽酸中清洗過夜，接著幾次水清洗。處理的絨毛膜然后研磨和凍干。所得的組合物是適合于進(jìn)一步配制(例如，研磨和配制)的去細(xì)胞ECM糊。

作為薄片的制劑：為產(chǎn)生ECM薄片，ECM糊在2℃-22℃下解凍24-48小時，并在生物安全柜中重懸在無菌的磷酸鹽緩沖液中。組織均質(zhì)化以制備均勻的ECM懸浮液，其分布到無菌塑料模具中并冷凍。冷凍的ECM的模具使用凍干來脫水。所得的脫水ECM干膠片用無菌水復(fù)水且然后在室溫下在真空輔助干燥器上壓實18-36小時。薄片置于雙重袋中并使用醫(yī)藥級密封劑密封、標(biāo)記和使用γ照射滅菌。

作為顆粒物的制劑：為產(chǎn)生ECM顆粒物，ECM糊重懸于無菌水中，轉(zhuǎn)移到模具中，使用Controlled Rate Freezer(Thermo Scientific,Marietta,OH)冷凍并在凍干機(jī)(LabConco,Kansas City,MO)中凍干48小時。凍干的ECM使用噴射磨機(jī)(Fluid Energy,Telford,PA)碾磨，從而得到ECM顆粒物。碾磨的ECM粉末可以填充到琥珀色玻璃小瓶中并密封。

作為可流動基質(zhì)的制劑：ECM可流動基質(zhì)可以使用ECM顆粒物制備。一般地，ECM可流動基質(zhì)可以通過懸浮凍干的、碾磨的ECM(ECM顆粒物)在例如，無菌水或鹽水溶液中來制備。

ECM的膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白和/或?qū)诱尺B蛋白含量可以分別以實施例2、3、4和5中描述的方式分析。此外，ECM的生物相容性可以以實施例6中描述的方式評價。

6.9實施例9：從胎盤絨毛膜產(chǎn)生胎盤ECM的方法(3)

本實施例描述了用于從胎盤絨毛膜產(chǎn)生胎盤ECM組合物的方法。

使用了從剛足月生產(chǎn)的母親獲得的人胎盤。羊膜、臍帶和壁蛻膜從胎盤除去，且保留絨毛膜板，其然后刮擦和清潔。刮擦的、清潔的絨毛膜在1.0M NaCl和水中清洗，且然后在含有0.067％脫氧膽酸和4mM EDTA的溶液中清洗過夜，接著幾次水清洗。絨毛膜然后在含有0.39％脫氧膽酸和8mM EDTA的溶液中清洗過夜，接著幾次水清洗。處理的全絨毛膜然后凍干。

作為薄片的制劑：為產(chǎn)生ECM薄片，ECM在2℃-22℃下解凍24-48小時，并在生物安全柜中重懸在無菌的磷酸鹽緩沖液中以形成ECM糊。組織均質(zhì)化以制備均勻的ECM懸浮液，其分布到無菌塑料模具中并冷凍。冷凍的ECM的模具使用凍干來脫水。所得的脫水ECM干膠片用無菌水復(fù)水且然后在室溫下在真空輔助干燥器上壓實18-36小時。薄片置于雙重袋中并使用醫(yī)藥級密封劑密封、標(biāo)記和使用γ照射滅菌。

作為顆粒物的制劑：為產(chǎn)生ECM顆粒物，ECM重懸于無菌水中以形成ECM糊，轉(zhuǎn)移到模具中，使用Controlled Rate Freezer(Thermo Scientific,Marietta,OH)冷凍并在凍干機(jī)(LabConco,Kansas City,MO)中凍干48小時。凍干的ECM使用噴射磨機(jī)(Fluid Energy,Telford,PA)碾磨，從而得到ECM顆粒物。碾磨的ECM粉末可以填充到琥珀色玻璃小瓶中并密封。

作為可流動基質(zhì)的制劑：ECM可流動基質(zhì)可以使用ECM顆粒物制備。一般地，ECM可流動基質(zhì)可以通過懸浮凍干的、碾磨的ECM(ECM顆粒物)在例如，無菌水或鹽水溶液中來制備。

ECM的膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白和/或?qū)诱尺B蛋白含量可以分別以實施例2、3、4和5中描述的方式分析。此外，ECM的生物相容性可以以實施例6中描述的方式評價。

使用這種方法產(chǎn)生、預(yù)除菌的ECM組合物的表征表現(xiàn)出以下表4中總結(jié)的干重特征：

表4

本說明書中引用的所有公開出版物和專利申請通過引用并入本文，正如各單個出版物或?qū)＠暾埦唧w地和單獨地表明通過引用并入。雖然本發(fā)明已經(jīng)為清楚理解的目的通過例示和實施例的方式相當(dāng)詳細(xì)地進(jìn)行描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員參照本文提供的教導(dǎo)很容易理解，可以對其進(jìn)行某些改變和修飾而不脫離所附權(quán)利要求的精神或范圍。