本發(fā)明是在STTR贊助號為No.R41GM099174和來自國家健康研究所(NIH)的VITA合同號為No.HHSN268201400006C的政府支持下進(jìn)行的。

相關(guān)申請

本申請要求于2014年8月6日提交的美國臨時申請?zhí)枮镹o.62/034，046和于2015年5月13日提交的美國臨時申請?zhí)枮镹o.62/161，121的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容通過引用并入本發(fā)明。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明一般涉及藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的領(lǐng)域，特別關(guān)注選擇性定位、結(jié)合和內(nèi)化入患病細(xì)胞和組織的分子。

背景技術(shù)：

藥效團被定義為分子發(fā)揮其生物學(xué)活性所必需的治療性活性分子的保守分子特征?；衔锏慕Y(jié)構(gòu)-功能關(guān)系研究可以提供對化合物及其特定生物靶標(biāo)之間的最佳相互作用所需的特定空間和電子特征有價值的提示。

藥效團的鑒定有助于設(shè)計具有相似生物活性的不同結(jié)構(gòu)的分子。對藥效團的理解可以帶來關(guān)于受體-配體相互作用和未知受體活性位點的其它化學(xué)和結(jié)構(gòu)特性的進(jìn)一步細(xì)節(jié)。正確鑒定藥效團還將允許通過產(chǎn)生具有增強的治療選擇性或更理想的藥理學(xué)特性的類似物來進(jìn)行化合物的潛在優(yōu)化。

治療疾病的主要障礙是相對缺乏可以選擇性靶向患病組織而非健康組織的藥劑。需要用于選擇性靶向患病組織并減少與全身性治療相關(guān)的副作用的治療新策略。還需要選擇性識別患病組織的診斷試劑。包含具有疾病選擇性和內(nèi)化特性的一類分子的藥效團的確定將使開發(fā)具有顯著治療和診斷潛力的化合物成為可能。本發(fā)明通過確定對患病組織具有選擇性的藥效團來滿足了上述需要。本發(fā)明還確定了匹配該藥效基團并且可用于治療或診斷目的的分子。這些化合物還適合作為單獨的治療，在患病組織中作為與治療相偶聯(lián)的歸巢基團或用于選擇性增強聯(lián)合給藥的效果。

敗血癥是由對感染的強烈免疫應(yīng)答而引起的危及生命的醫(yī)學(xué)病癥。釋放于血液中以抵抗感染的天然化學(xué)物質(zhì)觸發(fā)了全系統(tǒng)的炎癥，這可導(dǎo)致多器官衰竭和死亡(National Institute of General Medical Sciences國家綜合醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，2014)。由于敗血癥的非特異性癥狀與許多其他病癥重疊使得敗血癥難以診斷，據(jù)估計敗血癥的發(fā)生率被嚴(yán)重低報。即使如此，據(jù)估計敗血癥發(fā)生率占所有住院治療的約2％，并且僅在美國每年便影響約75萬人(Martin2012；Lever et al.，2007)。敗血癥的發(fā)病率也在上升，從1979年到2000年，每年的病例數(shù)從164，072例增加到659，935例，死亡人數(shù)從43，579增加到120，491例(Lever et al.，2007)。此外，敗血癥通常具有高死亡率，從最溫和癥狀的10％死亡率，增加至敗血性休克患者的接近80％的死亡率(Lever et al.，2007)。

目前用于治療敗血癥的一種藥物治療是西維來司鈉(sivelestat)，一種嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑。然而，西維來司鈉作為敗血癥的治療其功效尚未令人信服地證明。一項系統(tǒng)綜述和薈萃分析檢查了8項使用西維來司鈉的獨立試驗，發(fā)現(xiàn)西維來司鈉在隨機分組后的28-30天內(nèi)死亡率沒有差異，機械通氣天數(shù)沒有差異，并且可能增加了180天死亡的死亡率(Iwata et al.，2010)。研究結(jié)果表明，短期內(nèi)西維來司鈉可能與氧合的改善有關(guān)，并且如果西維來司鈉有任何效果，其效果并不大(Iwata et al.，2010)。

抗凝血酶III也已被用于敗血癥的治療。最近的數(shù)據(jù)表明，除了其抗凝血功能，抗凝血酶是有效的抗炎劑，且研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抗凝血酶III顯著地降低了動物研究中使用致死劑量的大腸桿菌(Dept.Haematology，Royal Free University College London Medical School，2001)引發(fā)的多器官功能衰竭和死亡率?？紤]到這些結(jié)果，一些臨床試驗用抗凝血酶治療了敗血癥患者。幾個較小的研究發(fā)現(xiàn)，雖然抗凝血酶治療確實顯示30天死亡率減少，但差異不具備統(tǒng)計學(xué)的顯著性(Dept.Haematology，Royal Free University College London Medical School，2001)。較大的臨床試驗沒有發(fā)現(xiàn)在接受抗凝血酶治療的組和安慰劑組之間的存活差異，但是使用亞組分析確實發(fā)現(xiàn)抗凝血酶治療在敗血性休克——最嚴(yán)重形式的敗血癥患者中顯示出顯著的存活效果(Dept.Haematology，Royal Free University College London Medical School，2001)。另一項隨機對照試驗在超過2000名嚴(yán)重敗血癥患者的樣本中測試了高劑量抗凝血酶III，并發(fā)現(xiàn)抗凝血酶III組的死亡率為38.9％，安慰劑組的死亡率為38.7％，而且兩組之間次要終點沒有顯示差異(Warren et al.，2001)。

經(jīng)常用于治療敗血癥的一種最終治療是類固醇治療。然而，研究尚未找到顯示類固醇治療有助于敗血癥的確定結(jié)果，在一些情況下，研究發(fā)現(xiàn)類固醇治療實際上導(dǎo)致繼發(fā)感染，并對生存沒有影響。在一項針對敗血性休克患者測試低劑量氫化可的松(hydrocortisone)治療的研究中，結(jié)果顯示氫化可的松不能改善敗血性休克患者的生存，而且氫化可的松治療組發(fā)生更多超感染癥狀(Spring et al.，2008)。其他研究測試氫化可的松或其他皮質(zhì)類固醇也未發(fā)現(xiàn)有益的存活效果，氫化可的松或皮質(zhì)類固醇組實際上比安慰劑組經(jīng)歷了更多的并發(fā)癥(Rakela et al.，1991；Hotchkiss et al.，2003)。

盡管大量使用醫(yī)療資源，包括血液動力學(xué)支持、液體復(fù)蘇、血管加壓藥治療、增強氧氣輸送、經(jīng)驗性抗微生物治療、和皮質(zhì)類固醇治療(Claessens et al.，2007；Kilal et al.，2014)，敗血癥的死亡風(fēng)險為30-80％(Jawad et al.，2012)。對能夠改善敗血癥存活的創(chuàng)新方法有迫切的、未滿足的需求。

CAR在廣泛的損傷，炎癥和纖維化疾病包括傷口愈合方面(Jarvinen et al.，2007)，肺動脈高壓(Urakami et al.，2011；Toba et al.，2014)，急性肺損傷，肺纖維化，慢性腎臟疾病和三陰性乳腺癌誘導(dǎo)的惡病質(zhì)(Mann et al.，2015)提供和呈現(xiàn)臨床前有效性。這些看似不同的疾病具有改變的糖萼的共同特征。敗血癥的特征還在于改變的糖萼(Chelazzi et al.，2015)，使CAR成為通過與現(xiàn)有藥物共同給藥，作為與治療劑偶聯(lián)的歸巢部分，或作為通過單獨施用CAR治療而有效降低與敗血癥相關(guān)的死亡率的強有力的候選藥物。

發(fā)明概述

本發(fā)明公開了對于疾病的歸巢和內(nèi)化特性必需的CAR藥效團的特征，并且進(jìn)一步公開了落入CAR藥效團范圍內(nèi)的分子實體。

本發(fā)明公開了含有確定的CAR藥效團的化合物。本發(fā)明公開了選擇性靶向腫瘤血管系統(tǒng)、再生組織、受傷組織、發(fā)炎組織、纖維化組織、重建組織、以升高的乙酰肝素酶水平為特征的組織，并且具有內(nèi)化入這樣的患病細(xì)胞的能力的肽。所公開的化合物還可以介導(dǎo)其他偶聯(lián)的、結(jié)合的或聯(lián)用的化合物的選擇性靶向、內(nèi)化和組織穿透。

本發(fā)明公開了含有環(huán)狀、線性或截短的CAR藥效團的化合物。

本發(fā)明還公開了含有具有SEQ ID NO：1-8、12和16-33的序列的氨基酸片段、相關(guān)氨基酸序列或CAR藥效團的任何肽或蛋白質(zhì)。所述肽或蛋白質(zhì)可以由包含SEQ ID NO：1-8、12和16-33的氨基酸序列或具有一個或多個保守氨基酸取代SEQ ID NO：1-8、12和16-33的氨基酸序列的氨基酸片段組成。

本發(fā)明還公開了含有具有SEQ ID NO：1-8、12和16-33的序列的氨基酸片段，相關(guān)氨基酸序列或CAR藥效團的任何肽或蛋白質(zhì)，其氨基酸序列已經(jīng)經(jīng)歷取代、插入或缺失修飾。本發(fā)明公開了含有具有SEQ ID NO：2-8、12和16-33的序列的氨基酸片段、相關(guān)氨基酸序列或CAR藥效團的任何保守變種。本發(fā)明還公開了具有CAR藥效團的偶聯(lián)化合物，以及含有經(jīng)歷化學(xué)衍生化的CAR藥效團的化合物。

本發(fā)明公開的組合物可以與任何分子模擬、計算化學(xué)或計算機輔助藥物設(shè)計(CADD)技術(shù)一起使用，以確定SEQ ID NO：1-33的結(jié)構(gòu)或含有CAR藥效團的任何其它化合物。本發(fā)明公開了通過使用肽模擬物已經(jīng)發(fā)現(xiàn)或開發(fā)的含有CAR藥效團的化合物。

本發(fā)明公開了具有增強的或理想性能的分子，例如更經(jīng)濟的生產(chǎn)、更大的化學(xué)穩(wěn)定性、降低的毒性或副作用、增強的藥理學(xué)性質(zhì)(例如半衰期、吸收、分布、代謝、排泄、效價強度、效能、靶結(jié)合或親和力等)、改變的特異性(例如，廣譜的生物活性)、降低的抗原性和其它。本發(fā)明還公開了具有增強的或理想性能的分子，例如更經(jīng)濟的生產(chǎn)、更大的化學(xué)穩(wěn)定性、降低的毒性或副作用、增強的藥理學(xué)性質(zhì)(例如半衰期、吸收、分布、代謝、排泄、效價強度、效能、靶結(jié)合或親和力等)、改變的特異性(例如，廣譜的生物活性)、降低的抗原性和其它。

本發(fā)明公開了包含與具有獨立功能的第二肽融合的歸巢肽的雙功能肽。還公開了通過組合技術(shù)或篩選技術(shù)鑒定的組合物，其中SEQ ID NO：2-33中公開的組合物或其部分被用于組合或篩選方案中的靶標(biāo)。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了確定環(huán)狀CAR藥效團的方法，所述方法包括：

a)對環(huán)狀CAR肽(SEQ ID NO：1)進(jìn)行置換以合成至少七個另外的緊密相關(guān)的肽(SEQ ID NO：2-8)；

b)對SEQ ID NO：1-8進(jìn)行細(xì)胞結(jié)合和內(nèi)化測定；

c)確定來自步驟b)的需要CAR保守以保留生物活性的任何殘基和序列模式；

d)對SEQ ID NO：1-8進(jìn)行計算機模擬以產(chǎn)生小的化合物文庫并進(jìn)一步確定CAR藥效團的保守分子特征；

e)將類似物模型疊加到SEQ ID NO：1上；和

f)分析所述疊加的類似物的保守結(jié)構(gòu)模式。

本發(fā)明還公開了確定至少一種治療活性分子的藥效團的方法；所述方法包括：

a)對所述至少一種治療活性分子進(jìn)行置換以合成所述分子的類似物；

b)對治療活性分子和合成的類似物進(jìn)行細(xì)胞結(jié)合和內(nèi)化測定；

c)確定需要分子保守以保留治療活性的來自步驟b)的任何殘基和序列模式；

d)對治療活性分子和類似物進(jìn)行計算機模擬以產(chǎn)生小的化合物文庫并進(jìn)一步確定藥效團的保守分子特征；

e)將類似物模型疊加到治療活性分子模型上；和

f)分析所述疊加的類似物的保守結(jié)構(gòu)模式。

在一個實施例中，向疾病傳達(dá)可測量的治療效果的至少一種治療分子可以選自一組肽，這組肽選擇性靶向腫瘤血管系統(tǒng)、再生組織、受傷組織、發(fā)炎組織、纖維化組織、重建組織、受損內(nèi)皮、以升高的乙酰肝素酶水平為特征的組織，并且具有內(nèi)化入這樣的患病細(xì)胞的能力。

在另一個實施例中，所述疾病可以選自一個群組，所述群組由肺部疾病，肺動脈高血壓，間質(zhì)性肺病，急性肺損傷，急性呼吸窘迫綜合征，哮喘，敗血癥，敗血性休克，感染，肺結(jié)節(jié)病，結(jié)締組織疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病和多發(fā)性肌炎、皮肌炎的肺部表現(xiàn)，支氣管擴張，石棉肺，鈹中毒，矽肺，X組織細(xì)胞增多癥，肺實變性炎癥，肺組織炎癥，吸煙性肺炎，閉塞性細(xì)支氣管炎，肺纖維化，其它纖維化疾病如心肌梗塞、心內(nèi)膜心肌纖維化、縱隔纖維化、骨髓纖維化、腹膜后纖維化、進(jìn)行性大塊纖維化、塵肺病、腎源性系統(tǒng)性纖維化、瘢痕形成、瘢痕疙瘩、關(guān)節(jié)纖維化、粘連性囊炎、放射性纖維化、纖維囊性乳腺病癥、肝硬化、肝炎、肝纖維化、非酒精性脂肪肝病、急性肝衰竭、非酒精性脂肪性肝炎、淋巴結(jié)或其他器官的結(jié)節(jié)病，炎癥性腸病，克羅恩病，惡病質(zhì)，慢性腎臟疾病，急性腎損傷，急性腎衰竭，多囊腎病，潰瘍性結(jié)腸炎，原發(fā)性膽汁性肝硬化，胰腺炎，間質(zhì)性膀胱炎，慢性阻塞性肺病，動脈粥樣硬化，缺血性心臟病，血管炎，贅生的/轉(zhuǎn)移性/腫瘤性疾病(包括癌癥)，塵肺病，自身免疫性疾病，血管生成疾病，傷口愈合，感染，外傷損傷和系統(tǒng)性結(jié)締組織疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎硬皮病、多發(fā)性肌炎、皮肌炎，囊性纖維化，勃起功能障礙，α1-抗胰蛋白酶缺乏癥，糖尿病，以高乙酰肝素酶水平為特征的疾病，神經(jīng)炎性病癥，中風(fēng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病如阿爾茨海默氏病、帕金森病(PD)、亨廷頓舞蹈病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥，多發(fā)性硬化、創(chuàng)傷性腦損傷，組織缺氧，腦老化，濕性黃斑變性，新生血管性老年性黃斑變性，糖尿病性視網(wǎng)膜病，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和衰老相關(guān)疾病組成。

在優(yōu)選的實施例中，所述疾病可以選自由肺動脈高壓、敗血癥、腎臟疾病、癌癥和惡病質(zhì)組成的群組。

本發(fā)明還公開了治療患有疾病的個體的方法，所述方法包括：

a)提供包含與CAR藥效團的序列基本上相同的靶向肽，所述序列選自由SEQ ID NO：16-SEQ ID NO：33或其變體組成的群組；

b)提供對疾病傳達(dá)可測量的治療效果的至少一種治療性分子，其疾病選自一個群組，所述群組由肺部疾病，肺動脈高血壓，間質(zhì)性肺病，急性肺損傷，急性呼吸窘迫綜合征，哮喘，敗血癥，敗血性休克，感染，肺結(jié)節(jié)病，結(jié)締組織疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病和多發(fā)性肌炎、皮肌炎的肺部表現(xiàn)，支氣管擴張，石棉肺，鈹中毒，矽肺，X組織細(xì)胞增多癥，肺實變性炎癥，肺組織炎癥，吸煙性肺炎，閉塞性細(xì)支氣管炎，肺纖維化，其它纖維化疾病如心肌梗塞、心內(nèi)膜心肌纖維化、縱隔纖維化、骨髓纖維化、腹膜后纖維化、進(jìn)行性大塊纖維化、塵肺病、腎源性系統(tǒng)性纖維化、瘢痕形成、瘢痕疙瘩、關(guān)節(jié)纖維化、粘連性囊炎、放射性纖維化、纖維囊性乳腺病癥、肝硬化、肝炎、肝纖維化、非酒精性脂肪肝病、急性肝衰竭、非酒精性脂肪性肝炎、淋巴結(jié)或其他器官的結(jié)節(jié)病，炎癥性腸病，克羅恩病，惡病質(zhì)，慢性腎臟疾病，急性腎損傷，急性腎衰竭，多囊腎病，潰瘍性結(jié)腸炎，原發(fā)性膽汁性肝硬化，胰腺炎，間質(zhì)性膀胱炎，慢性阻塞性肺病，動脈粥樣硬化，缺血性心臟病，血管炎，贅生的/轉(zhuǎn)移性/腫瘤性疾病(包括癌癥)，塵肺病，自身免疫性疾病，血管生成疾病，傷口愈合，感染，外傷損傷和系統(tǒng)性結(jié)締組織疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎硬皮病、多發(fā)性肌炎、皮肌炎，囊性纖維化，勃起功能障礙，α1-抗胰蛋白酶缺乏癥，糖尿病，以高乙酰肝素酶水平為特征的疾病，神經(jīng)炎性病癥，中風(fēng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病如阿爾茨海默氏病、帕金森病(PD)、亨廷頓舞蹈病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥，多發(fā)性硬化、創(chuàng)傷性腦損傷，組織缺氧，腦老化，濕性黃斑變性，新生血管性老年性黃斑變性，糖尿病性視網(wǎng)膜病，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和衰老相關(guān)疾病組成；

c)將包含a)和b)的組合物共同施用給有需要的個體；和

d)測量對個體的治療效果。

本發(fā)明還公開了治療患有疾病的個體的方法，所述方法包括：

a)提供包含與CAR藥效團的序列基本上相同的靶向肽，所述序列選自由SEQ ID NO：16-SEQ ID NO：33或其變體組成的群組；

b)提供對疾病傳達(dá)可測量的治療效果的至少一種治療性分子，所述疾病選自由肺動脈高壓(PAH)，敗血癥和惡病質(zhì)組成的群組；

c)將包含a)和b)的組合物聯(lián)用給予有需要的個體；和

d)測量對個體的治療效果。

在一個實施例中，至少一種治療性分子可以選自由伊馬替尼、西維來司鈉、紫杉醇、抗凝血酶III、氫化可的松組成的群組。

本發(fā)明還公開了治療患有疾病的個體的方法，所述方法包括：

a)提供包含與CAR藥效團的序列基本上相同的靶向肽，所述序列選自有SEQ ID NO：16-SEQ ID NO：33或其變體組成的群組；

b)施用a)中的靶向肽，其中所述肽向選自群組的疾病傳遞可測量的治療效果，所述群組由：肺部疾病，肺動脈高血壓，間質(zhì)性肺病，急性肺損傷，急性呼吸窘迫綜合征，哮喘，敗血癥，敗血性休克，感染，肺結(jié)節(jié)病，結(jié)締組織疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病和多發(fā)性肌炎、皮肌炎的肺部表現(xiàn)，支氣管擴張，石棉肺，鈹中毒，矽肺，X組織細(xì)胞增多癥，肺實變性炎癥，肺組織炎癥，吸煙性肺炎，閉塞性細(xì)支氣管炎，肺纖維化，其它纖維化疾病如心肌梗塞、心內(nèi)膜心肌纖維化、縱隔纖維化、骨髓纖維化、腹膜后纖維化、進(jìn)行性大塊纖維化、塵肺病、腎源性系統(tǒng)性纖維化、瘢痕形成、瘢痕疙瘩、關(guān)節(jié)纖維化、粘連性囊炎、放射性纖維化、纖維囊性乳腺病癥、肝硬化、肝炎、肝纖維化、非酒精性脂肪肝病、急性肝衰竭、非酒精性脂肪性肝炎、淋巴結(jié)或其他器官的結(jié)節(jié)病，炎癥性腸病，克羅恩病，惡病質(zhì)，慢性腎臟疾病，急性腎損傷，急性腎衰竭，多囊腎病，潰瘍性結(jié)腸炎，原發(fā)性膽汁性肝硬化，胰腺炎，間質(zhì)性膀胱炎，慢性阻塞性肺病，動脈粥樣硬化，缺血性心臟病，血管炎，贅生的/轉(zhuǎn)移性/腫瘤性疾病(包括癌癥)，塵肺病，自身免疫性疾病，血管生成疾病，傷口愈合，感染，外傷損傷和系統(tǒng)性結(jié)締組織疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎硬皮病、多發(fā)性肌炎、皮肌炎，囊性纖維化，勃起功能障礙，α1-抗胰蛋白酶缺乏癥，糖尿病，以高乙酰肝素酶水平為特征的疾病，神經(jīng)炎性病癥，中風(fēng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病如阿爾茨海默氏病、帕金森病(PD)、亨廷頓舞蹈病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥，多發(fā)性硬化、創(chuàng)傷性腦損傷，組織缺氧，腦老化，濕性黃斑變性，新生血管性老年性黃斑變性，糖尿病性視網(wǎng)膜病，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和衰老相關(guān)疾病組成，和

c)測量對個體的治療效果。

在優(yōu)選的實施例中，所述疾病可以選自由肺動脈高壓、敗血癥、癌癥和惡病質(zhì)組成的群組。

本發(fā)明還公開了偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物包含與本發(fā)明公開的肽連接的基團。所述基團可以是抗血管生成劑、促血管生成劑、癌癥化療劑、細(xì)胞毒劑、抗炎劑、抗關(guān)節(jié)炎劑、多肽、核酸分子、小分子、熒光團、熒光素、羅丹明、放射性核素、釓、氧化鐵、含碘造影劑、硫酸鋇、鎵、¹⁸F-氟脫氧葡萄糖、⁶⁴Cu-氯化銅(Cuprymina)、3'-脫氧-3'-[¹⁸F]氟胸苷、銦111、锝-99、碳-11、碳-13、或其組合。所述基團可以是治療劑、試劑、可檢測試劑、病毒、或噬菌體。本發(fā)明公開了偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物包含與包含氨基酸片段的肽連接的基團，所述氨基酸片段包含，例如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：33的氨基酸序列。

本發(fā)明公開了包含基團和歸巢分子的偶聯(lián)物，例如本發(fā)明公開的肽。例如，公開了含有與選擇性地歸巢于再生組織、傷口組織或腫瘤的歸巢分子連接的治療劑的偶聯(lián)物。公開的偶聯(lián)物可以包含，例如，與包含氨基酸片段的肽連接的基團，所述氨基酸片段包含例如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：33的氨基酸序列。

本發(fā)明公開的任何形式或類型的歸巢分子可用于所公開的偶聯(lián)物。所述基團可以是任何分子。優(yōu)選地，所述基團是有效地靶向歸巢分子的靶的分子。例如，影響靶的基團，例如具有治療效果的基團，或促進(jìn)靶的檢測，顯像或成像，例如熒光分子，放射性造影劑或放射性核素。本發(fā)明公開的歸巢于再生組織、傷口組織或腫瘤的公開的肽可以有效地與例如可以促進(jìn)傷口愈合、治療炎癥或疼痛、或治療癌癥的基團組合。多種治療劑可用于偶聯(lián)物，包括但不限于作為抗血管生成劑、促血管生成劑、癌癥化療劑、細(xì)胞毒劑、抗炎劑、抗關(guān)節(jié)炎劑試劑、多肽、核酸分子、小分子、熒光團、熒光素、羅丹明、放射性核素、釓、氧化鐵、含碘造影劑、硫酸鋇、鎵、¹⁸F-氟脫氧葡萄糖、⁶⁴Cu-氯化銅(Cuprymina)、3'-脫氧-3'-[¹⁸F]氟胸苷、銦-111、锝-99、碳-11、碳-13的基團、或其組合。

偶聯(lián)物可以包含，例如，連接到至少兩個歸巢分子的脂質(zhì)體或其他聚合物基質(zhì)。如果需要，脂質(zhì)體或其它聚合物基質(zhì)可以與至少10個，至少100個或至少1000個歸巢分子連接。脂質(zhì)體可用于此類偶聯(lián)物；脂質(zhì)體由磷脂或其他脂質(zhì)組成，是無毒的，生理上可接受的和可代謝的載體，其制備和給藥相對簡單(Gregoriadis，Liposome Technology，第1卷(CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)la.(1984))。脂質(zhì)體或其它聚合物基質(zhì)可任選地包括另一種組分例如，但不限于，治療劑、癌癥化療劑、細(xì)胞毒劑、診斷劑、抗血管生成劑、多肽或核酸分子。

在一些實施例中，偶聯(lián)物可以含有癌癥化療劑。如本發(fā)明所用，“癌癥化療劑”是抑制癌細(xì)胞的增殖、生長、壽命或轉(zhuǎn)移活性的化學(xué)劑。這樣的癌癥化療劑可以是，但不限于，紫杉烷，例如多西紫杉醇、蒽環(huán)類如阿霉素、烷基化劑、長春花生物堿、抗代謝物、鉑劑如順鉑或卡鉑、類固醇例如甲氨蝶呤、抗生素如亞德里亞霉素、異丙酰胺、或選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、抗體如曲妥珠單抗。

偶聯(lián)物可用于治療或診斷本發(fā)明公開的任何疾病、病癥或失調(diào)、例如肺動脈高壓、敗血癥、癌癥和惡病質(zhì)。

所述組合物可以通過口服(例如舌下)、腸胃外(例如靜脈內(nèi))，通過肌內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、經(jīng)皮、體外、局部或類似的給藥，包括局部鼻內(nèi)給藥或通過吸入給藥。如本發(fā)明所用，“局部鼻內(nèi)給藥”是指將組合物通過一個或兩個鼻孔遞送到鼻和鼻道中，并且可包括通過噴霧機制或液滴機制遞送，或通過核酸或載體的霧化遞送。通過吸入劑施用組合物可以通過經(jīng)由噴霧或液滴機制遞送的鼻或口。遞送也可以通過吸入或插管直接到達(dá)呼吸系統(tǒng)的任何區(qū)域(例如肺)。所需組合物的精確的量將根據(jù)受試者不同而變化，取決于受試者的物種、年齡、體重和總體情況，所治療的過敏性疾病的嚴(yán)重性，所用的特定核酸或載體，其給藥方式等。因此，不可能為每種組合物指定精確的量。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員僅使用給出本發(fā)明教導(dǎo)的常規(guī)實驗可以確定適當(dāng)?shù)牧俊?/p>

本發(fā)明還公開了將基團引導(dǎo)至再生組織的方法，包括向受試者施用如本發(fā)明所公開的偶聯(lián)物。公開了其中治療效果包括炎癥減輕、傷口愈合速度增加、瘢痕組織量減少、疼痛減少、腫脹減少、感染減少或壞死減少的方法。

本發(fā)明還公開了將基團定向至腫瘤的方法，包括向受試者施用本發(fā)明公開的偶聯(lián)物。所述偶聯(lián)物可以具有治療效果，并且受試者可以具有一個或多個待靶向的位點，其中所述基團定向至待靶向的一個或多個位點。所述受試者可以具有癌癥，其中所述基團定向至受試者中的腫瘤血管生成。偶聯(lián)物可對癌癥具有治療作用，例如減小腫瘤的大小或生長。所述基團還可以用于檢測癌癥，可視化一個或多個腫瘤，或兩者兼顧。

在一個實施例中，變體可以具有式CxRxRxR，所述R選自由K或R組成的群組，并且進(jìn)一步所述X選自由T、S、N、Q、A、I、L或V組成的群組。

在另一個實施例中，本發(fā)明提供了分離的多肽，其包含的氨基酸序列至少90％相似于至少一個選自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8組成的群組。

附圖簡要說明

附圖與說明書一起闡明了所公開的方法和組合物的幾個實施例，并用于解釋應(yīng)用于相應(yīng)方法和/或組合物的原理。

圖1.測試環(huán)狀肽以確定環(huán)狀CAR藥效團。

圖2. CAR肽的變體結(jié)合和內(nèi)化到CHO-K細(xì)胞中。如圖所示，F(xiàn)AM偶聯(lián)的肽以5μM濃度與CHO-K細(xì)胞溫育2小時。洗滌、固定、并用核染色DAPI染色細(xì)胞。原始放大倍數(shù)x400。

圖3. CAR變體攝入到人肺成纖維細(xì)胞(CCL-210)中。將細(xì)胞與5μM肽在無血清DMEM中37℃溫育24小時。溫育后，用含有100μg/ml肝素的冰冷緩沖液將細(xì)胞洗滌3-4次，以除去任何非內(nèi)化的肽。使用胰蛋白酶-EDTA分離細(xì)胞，并將細(xì)胞懸浮液用7AAD染料染色以確定細(xì)胞活力。然后立即使用FACS分析細(xì)胞以確定肽內(nèi)化的水平。

圖4.所有8種測試的變體(SEQ ID NO：1-8)，包括原始cCAR的疊加。該圖疊加SEQ ID NO：1-8以說明CAR藥效團的保守特征。

圖5.環(huán)CAR(SEQ ID NO：1)以及CAR-利福布汀，CAR-雷帕霉素和CAR-伏環(huán)孢菌素(Voclosporin)類似物(SEQ ID NO：9-11)。這些化合物已經(jīng)從現(xiàn)有大環(huán)化合物結(jié)構(gòu)修飾以產(chǎn)生含有CAR藥效團的化合物并且將具有與SEQ ID NO：1類似的歸巢和內(nèi)化特性。

圖6.線性9氨基酸CAR(SEQ ID NO：12)，以及線性CAR-利福布汀，線性CAR-雷帕霉素和線性CAR-伏環(huán)孢菌素(Voclosporin)類似物(SEQ ID NO：13-15)。此處顯示的結(jié)構(gòu)修飾再次闡明了可以對現(xiàn)有分子進(jìn)行某些修飾，以產(chǎn)生含有CAR藥效團的化合物。

圖7. cCAR和非天然cCAR類似物(SEQ ID NO：1和16-19)的疊加。在各種位置的取代包括：1)D-氨基酸；2)D-烯丙基甘氨酸；3)二氨基酸(Arg位置的Asn取代-難以看到)；4)N-甲基氨基酸。再次，這些化合物已經(jīng)被結(jié)構(gòu)修飾，以說明對CAR肽進(jìn)行修飾以產(chǎn)生具有幾乎與CAR相同的性質(zhì)的“新”化合物。

圖8. 9個氨基酸的線性CAR(SEQ ID NO：12)連同9個氨基酸的線性CAR類似物(非天然置換；SEQ ID NO：20-23)的疊加。在各種位置的取代包括：1)D-氨基酸；2)D-烯丙基甘氨酸；3)二氨基酸(Arg位置的Asn取代)；4)N-甲基氨基酸。

圖9. 7個氨基酸線性CAR(SEQ ID NO：24)連同非天然線性7個氨基酸CAR類似物(SEQ ID NO：25-28)的疊加。在各種位置的取代包括：1)D-氨基酸；2)D-烯丙基甘氨酸；3)二氨基酸(Arg位置的Asn取代)；4)N-甲基氨基酸。原始線性7氨基酸CAR用較大的“棒”渲染顯示，而所有變體以“線”渲染顯示。

圖10. CAR靶向中心性腎小球腎炎。Masson的毛狀體染色(A)。纖連蛋白免疫染色(B)。CAR累積(C)。對照組積累(D)。

圖11.在敗血癥中CAR藥效團作用的假設(shè)機制。

圖12.在西維來司鈉中添加CAR藥效團對LPS誘導(dǎo)的敗血癥小鼠的影響。

圖13.在ATIII中加入CAR藥效團對LPS誘導(dǎo)的敗血癥小鼠的影響。

圖14.在氫化可的松中加入CAR藥效團對LPS誘導(dǎo)的敗血癥小鼠的影響。

圖15. A)LPS誘導(dǎo)的敗血癥小鼠的存活率；B)來自LPS誘導(dǎo)的敗血癥小鼠的肺、肝和腎組織的組織學(xué)。

圖16.來自LPS誘導(dǎo)的敗血癥小鼠的腎組織中CAR藥效團的定位。

圖17.來自對照、西維來司鈉和CAR藥效團+西維來司鈉治療的小鼠的肺組織的掃描電子顯微照片。

圖18.來自對照、西維來司鈉和CAR藥效團+西維來司鈉處理的小鼠的肝組織的掃描電子顯微照片。

圖19.來自對照、西維來司鈉和CAR+西維來司鈉治療的小鼠的腎組織的掃描電子顯微照片。

圖20. CAR藥效團對急性腎損傷標(biāo)記物(KIM-1)的影響。

圖21. CAR藥效團對三陰性乳腺癌小鼠中癌癥相關(guān)性惡病質(zhì)的影響。

圖22. CAR藥效團佐劑對右心臟肥大的影響。

圖23. CAR藥效團佐劑對肺動脈高壓模型大鼠體重的影響。

圖24.口服CAR藥效團對右心臟肥大的作用。

圖25.在肺動脈高壓模型(PAH)大鼠中CAR藥效團對肺動脈(PA)肌型化的影響。

本發(fā)明的詳細(xì)描述

定義

本發(fā)明所用的術(shù)語“CAR藥效團”定義為環(huán)狀(SEQ ID NO：1)、線性(SEQ ID NO：12)和截短的(SEQ ID NO：24)CAR肽的保守分子特征，其是CAR疾病歸巢、靶標(biāo)結(jié)合、內(nèi)化和生物活性所必需的。我們在本發(fā)明中將截短的、線性的和環(huán)狀的CAR藥效團統(tǒng)稱為“CAR藥效團”。

如本發(fā)明采用的，術(shù)語“肽”廣義地用于表示肽、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段等。本發(fā)明所用的術(shù)語“肽模擬物”是指具有其結(jié)構(gòu)上基于的肽的活性的肽樣分子。

I.概述

最近的研究(Jarvinen 2007；Urakami 2011；Toba 2014；美國專利申請公開號2009/0036349A1)已經(jīng)確定了具有序列CARSKNKDC(CAR；SEQ ID NO：1)的疾病歸巢和細(xì)胞穿透肽。另外的實驗研究已經(jīng)確定線性CAR(SEQ ID NO：12)和截短的CAR(tCAR；SEQ ID NO：24)也具有相似的生物活性(美國專利申請公開號2012/0034164A1)。盡管我們對于CAR的生物活性有了解，但其精確的受體仍然未知。CAR的藥效團的確定不論是在探索CAR的受體，還是在闡明其作用機制(MOA)和設(shè)計其它可能更有用的化合物方面都具有非常重要的價值。

為了確定環(huán)CAR藥效團，對環(huán)CAR肽(SEQ ID NO：1)和七個密切相關(guān)的肽(SEQ ID NO：2-8)的進(jìn)行了細(xì)胞結(jié)合和內(nèi)化測定。除了環(huán)狀CAR(SEQ ID NO：1)外，還合成了在Lys或Arg殘基上含有置換的七種其他環(huán)狀肽(SEQ ID NO：2-8)，并通過將熒光胺(FAM)基團連接到該分子(圖1)。細(xì)胞結(jié)合和內(nèi)化測定用作初始測試以將置換的化合物與原始CAR肽進(jìn)行比較。先前已用于研究CAR結(jié)合共聚焦顯微鏡和中國倉鼠卵巢(CHO-K)細(xì)胞被用于研究肽的細(xì)胞結(jié)合和內(nèi)化。熒光激活細(xì)胞分選(FACS)也用于測定SEQ ID NO：1-8的細(xì)胞內(nèi)化。細(xì)胞結(jié)合和內(nèi)化測定確定了保守殘基和序列模式的CAR藥效團的某些特征，其保守性是化合物保持其生物活性所必須的。

為了進(jìn)一步確定CAR藥效團的保守分子特征，使用計算建模技術(shù)在計算機中生成SEQ ID NO：1-8。多種渲染被展示來比較/對比SEQ ID NO：1-8的各種分子特征。疊加的CAR類似物的分析(圖4)揭示了已被作為環(huán)狀CAR藥效團確定出的保守的環(huán)狀CAR結(jié)構(gòu)模式。這是由于SEQ ID NO：1-8的顯著的結(jié)構(gòu)、電子、空間和順序相似性。

計算機模擬用于進(jìn)一步定義先前確定的CAR藥效團，其不僅可以根據(jù)精確的序列和殘基模式來定義，而且還可以根據(jù)如線性、截短和環(huán)狀CAR肽具有相似的三維，空間和電子模式的更廣義的結(jié)構(gòu)來定義。這些結(jié)果證實了在細(xì)胞結(jié)合和內(nèi)化測定中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，其中SEQ ID NO：2-8顯示與SEQ ID NO：1類似的生物活性。因此，其結(jié)論是，SEQ ID NO：2-8將具有與原始CAR序列(SEQ ID NO：1)具有相似的治療活性，并且所有序列都屬于CAR藥效團。

CAR藥效團已基于實驗研究和計算模擬的結(jié)果而確定。在分析這些分子時，已經(jīng)確定了它們各自的生物活性所必需的保守特征。此外，由于tCAR具有與cCAR相似的性質(zhì)，因此可推斷線性和截短的CAR藥效團(除了環(huán)狀CAR藥效團外)的同一性。這進(jìn)一步證明，盡管線性化、CAR藥效團的保守特征仍然可以存在于線性和截短的變體中，但仍然可以保留原始環(huán)狀CAR肽的性質(zhì)。

在確定了環(huán)狀、線性和截短的CAR藥效團(統(tǒng)稱為CAR藥效團)之后，獲得了保留這些必要分子特征的額外的結(jié)構(gòu)?；衔镂膸?SEQ ID NO：9-33)利用分子模擬/計算化學(xué)、肽模擬物、序列變異技術(shù)和計算機輔助的藥物設(shè)計產(chǎn)生，該文庫已被特別設(shè)計為含有疾病歸巢和選擇性內(nèi)化所需的CAR藥效團。產(chǎn)生這些結(jié)構(gòu)以說明可產(chǎn)生具有CAR藥效團，以及CAR肽的疾病歸巢和內(nèi)化特性的新化合物多樣性。

II.材料

A.肽和蛋白質(zhì)

本發(fā)明公開了包含具有SEQ ID NO：1-8、12和16-33的序列的氨基酸片段，相關(guān)氨基酸序列或CAR藥效團的任何肽或蛋白質(zhì)。所述肽或蛋白質(zhì)可以由包含SEQ ID NO：1-8、12和16-33的氨基酸序列或SEQ ID NO：1-8、12和16-33的氨基酸序列具有一個或多個保守氨基酸取代的的氨基酸片段組成。氨基酸片段可以由與SEQ ID NO：1-8、12和16-33的氨基酸序列有60％，70％，80％，90％或100％相似性的氨基酸序列組成，或表示一個或多個氨基酸殘基的變化的任何百分比，其變化包括添加、缺失或取代。所述氨基酸片段可以包含具有一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個或九個保守氨基酸取代的SEQ ID NO：1-8、12和16-33的氨基酸序列。所述氨基酸片段可以包含氨基酸序列SEQ ID NO：1-8、12和16-33的嵌合體。這種嵌合體可以是添加的，其中一個序列的序列添加到另一個序列，或替換，其中一個序列的序列替換另一個序列的序列，或其組合。

本發(fā)明還公開了含有CAR藥效團的氨基酸片段，其中所述片段可以是線性(包括截短的線性肽)或環(huán)狀的。所述氨基酸片段可以通過任何合適的連接，例如二硫鍵或肽鍵。所述肽可以具有任何長度。

本發(fā)明還公開了含有CAR藥效團的肽或蛋白質(zhì)，其可以選擇性地歸巢于再生組織、傷口組織、或腫瘤。所公開的肽可以選擇性地與再生組織、傷口組織或腫瘤相互作用。

本發(fā)明還公開了具有小于100個殘基的長度并且包括SEQ ID NO：1-8、12和16-33的氨基酸序列或CAR藥效團的分離的肽或蛋白質(zhì)。如本發(fā)明中關(guān)于所公開的肽所使用的，術(shù)語“分離的”是指肽相對不含材料如污染性多肽、脂質(zhì)、核酸和通常與細(xì)胞中肽或與文庫或粗制劑中的肽相關(guān)的其它細(xì)胞材料。

本發(fā)明公開的肽和蛋白質(zhì)包含具有SEQ ID NO：1-8、12和16-33的序列的氨基酸片段、相關(guān)氨基酸序列、或CAR藥效團，所述肽和蛋白質(zhì)可以具有任何合適的長度。

B.計算建模

本發(fā)明所公開的組合物可以與任何分子模擬、計算化學(xué)或計算機輔助藥物設(shè)計(CADD)技術(shù)一起使用，以鑒定SEQ ID NO：1-33的結(jié)構(gòu)或鑒定含有CAR藥效團的任何其它化合物。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)在建模技術(shù)中使用所公開的組合物(SEQ ID NO：1-33)時，將確定到具有特別期望的性質(zhì)例如選擇性歸巢到疾病部位和細(xì)胞內(nèi)化到疾病部位的化合物。

本發(fā)明還公開了通過使用合理設(shè)計發(fā)現(xiàn)的含有CAR藥效團的化合物。這可以通過結(jié)構(gòu)信息和/或計算機建模來實現(xiàn)。計算機建模技術(shù)允許所選擇分子的三維原子結(jié)構(gòu)的可視化，并且該三維原子結(jié)構(gòu)的知識可以允許在新化合物的合理設(shè)計中確定和優(yōu)化化學(xué)官能團的位置。三維構(gòu)建體可以從含有CAR藥效團的分子的X射線晶體學(xué)分析或NMR成像中獲得。分子動力學(xué)和力場數(shù)據(jù)的使用也可以用于發(fā)現(xiàn)含有CAR藥效團的化合物。計算機圖形系統(tǒng)能夠預(yù)測化合物如何結(jié)合其各自的受體，并且可以進(jìn)行化合物結(jié)構(gòu)/序列的實驗操作以優(yōu)化結(jié)合特異性。還可以進(jìn)行化合物文庫的虛擬篩選，包括合成化學(xué)品、肽、蛋白質(zhì)和其它生物活性材料，以發(fā)現(xiàn)含有CAR藥效團的新化合物。

C.肽模擬物

本發(fā)明還公開了已經(jīng)通過使用肽模擬物發(fā)現(xiàn)或開發(fā)的含有CAR藥效團的化合物。肽模擬物包括化學(xué)修飾的肽，含有非天然存在的氨基酸的肽樣分子、以及蛋白質(zhì)。肽模擬化合物可以具有例如SEQ ID NO：1選擇性的疾病歸巢活性和/或靶細(xì)胞內(nèi)化能力。

本發(fā)明還公開了分離的多價肽，其包括各自獨立地含有一個歸巢分子(例如，氨基酸序列SEQ ID NO：2-33或其保守性變體或肽模擬物)的至少兩個子序列。多價肽可具有例如至少三個、至少五個或至少十個這種子序列，其各自獨立地含有一個歸巢分子(例如，SEQ ID NO：2-33的氨基酸序列或保守變體或其肽模擬物)。在具體的實施例中，多價肽可以具有兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十五個或二十個相同或不相同的子序列。在另一個實施例中，多價肽可以包含相同的子序列，其由一個歸巢分子(例如，氨基酸序列SEQ ID NO：2-33，或其保守變體或擬肽)組成。在另一個實施例中，多價肽含有連續(xù)的相同或不相同的子序列，其不被任何插入氨基酸分開。在另外的實施例中，多價肽可以是環(huán)狀的或以其他方式構(gòu)象受限的。在一個實例中，肽可以通過二硫鍵環(huán)化。

已知多種肽模擬物，包括含有受限氨基酸、模擬肽二級結(jié)構(gòu)的非肽組分或酰胺鍵電子等排體的肽樣分子。包含受約束的，非天然存在的氨基酸的肽模擬物可包括，例如，α擬甲基化的氨基酸；α,α-二烷基甘氨酸或α烷氨基環(huán)烷烴羧酸；N^α---C^α環(huán)化氨基酸；N^α---甲基化氨基酸；β基或γ-氨基環(huán)烷烴羧酸；α,β-不飽和氨基酸；β,β-二甲基或β-甲基氨基酸；β-取代-2，3-亞甲基氨基酸；N---C^ε或C^α---C^Δ環(huán)化氨基酸；取代的脯氨酸或另一種氨基酸模擬物。模擬肽二級結(jié)構(gòu)的肽模擬物可以包含，例如，非肽類β化轉(zhuǎn)角模擬物；γ轉(zhuǎn)角模擬；β折疊結(jié)構(gòu)模擬；或模擬螺旋結(jié)構(gòu)，它們中的每一個是本領(lǐng)域公知的。肽模擬物也可以是包含例如酰胺鍵電子等排體的肽樣分子，例如逆-反轉(zhuǎn)修飾；還原酰胺鍵；亞甲基亞硫醚或亞甲基-亞砜鍵；亞甲基醚鍵；乙烯鍵；硫代酰胺鍵；反式烯烴或氟烯烴鍵；1，5-二取代四唑環(huán)；酮亞甲基或氟酮亞甲基鍵或另一酰胺電子等排物。

本發(fā)明還公開了用于確定含有CAR藥效團的肽模擬物的方法，并且可以包括，例如，篩選含有潛在的CAR藥效團肽模擬物的文庫的數(shù)據(jù)庫。作為示例，劍橋結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫包含具有已知晶體結(jié)構(gòu)的大于300,000種化合物的集合(Allen等人，Acta Crystalloqr.BectionB，35：2331(1979))。當(dāng)確定新的晶體結(jié)構(gòu)并且可以篩選具有合適形狀，例如與所公開的肽相同的形狀，以及與靶分子的潛在幾何和化學(xué)互補性的化合物時，該結(jié)構(gòu)存儲不斷更新。當(dāng)沒有肽或結(jié)合肽的靶分子的晶體結(jié)構(gòu)可用時，可以使用例如程序CONCORD(Rusinko等人，J.Chern.Inf.Comput.Sci.29：251(1989))產(chǎn)生一個結(jié)構(gòu)。另一個數(shù)據(jù)庫，可用化學(xué)品目錄(Molecular Design Limited，Information Systems；San Leandro Calif。)包含約100，000種市售的化合物，并且還可以用于搜索鑒定，例如，在選擇性歸巢到腫瘤基質(zhì)，傷口和血漿凝塊中具有活性的肽的潛在肽模擬物。

D.取代變體

本發(fā)明還公開了含有具有SEQ ID NO：1-8、12和16-33的序列的氨基酸片段，相關(guān)氨基酸序列，或CAR藥效團的任何肽或蛋白質(zhì)，其中氨基酸序列已經(jīng)經(jīng)歷取代、插入或缺失修飾。插入包括氨基和/或羧基末端融合以及單個或多個氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。插入通常是比氨基或羧基末端融合的插入更小的插入，例如，大約1至4個殘基。缺失的特征在于從蛋白質(zhì)或肽序列中去除一個或多個氨基酸殘基。在蛋白質(zhì)或肽分子內(nèi)的任何位點處通常不超過約2至6個殘基缺失。這些變體可以通過在編碼蛋白質(zhì)或肽的DNA中的核苷酸的位點特異性誘變來制備，從而產(chǎn)生編碼變體的DNA，然后在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)DNA。取代、插入或缺失修飾可以包括但不限于非天然氨基酸，D-氨基酸或任何其它殘基，其可導(dǎo)致產(chǎn)生仍然具有CAR藥效團的改變或改善的化合物。

在具有已知序列的DNA中的預(yù)定位點處產(chǎn)生取代突變的技術(shù)是公知的。氨基酸取代通常是單個殘基，但可以同時在多個不同位置發(fā)生；插入通常將在約1至10個氨基酸殘基的數(shù)量級；并且缺失將在約1至10個殘基的范圍內(nèi)。缺失或插入優(yōu)選在相鄰對中進(jìn)行，即缺失2個殘基或插入2個殘基。取代、缺失、插入或其任何組合可以組合以得到含有CAR藥效團的最終構(gòu)建體。取代變體是其中至少一個殘基已被除去并且不同殘基插入其位置的變體。

E.保守變體

本發(fā)明還公開了含有具有SEQ ID NO：1-8、12和16-33的序列的氨基酸片段、相關(guān)氨基酸序列或CAR藥效團的任何保守變體。保守變體是其中第一氨基酸被具有與第一氨基酸至少一種生物化學(xué)性質(zhì)相似的另一氨基酸或氨基酸類似物替換的序列；相似的性質(zhì)包括例如相似的大小、電荷、疏水性或氫鍵結(jié)合能力。保守變體可以是這樣的序列，其中第一個不帶電的極性氨基酸用第二(非同一的)不帶電極性氨基酸例如半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺或其類似物保守取代。保守變體還可以是其中第一堿性氨基酸被第二堿性氨基酸例如精氨酸、賴氨酸、組氨酸、5-羥賴氨酸、N-甲基賴氨酸或其類似物保守性取代的序列。類似地，保守變體可以是其中第一疏水性氨基酸被第二疏水性氨基酸例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸或色氨酸或其類似物保守性取代的序列。以相同的方式，保守變體可以是這樣的序列，其中第一酸性氨基酸被第二酸性氨基酸例如天冬氨酸或谷氨酸或其類似物保守取代；其中芳族氨基酸如苯丙氨酸被第二芳族氨基酸或氨基酸類似物保守取代的序列，例如酪氨酸；或其中第一相對小的氨基酸如丙氨酸被第二相對小的氨基酸或氨基酸類似物如甘氨酸或纈氨酸或其類似物取代的序列。例如，用生物學(xué)和/或化學(xué)相似的另一氨基酸殘基替換一個氨基酸殘基對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的保守取代。例如，保守取代將用一個疏水殘基替換另一個疏水殘基，或用一個極性殘基替換另一個。取代包括組合，例如，Gly，Ala；Val，Ile，Leu；Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr；Lys，Arg；和Phe，Tyr。每個明確公開的序列的這種保守取代的變體包括在本發(fā)明提供的嵌合多肽內(nèi)。SEQ ID NO：1-8、12和16-33的保守變體包括相對于SEQ ID NO：1-8、12和16-33包含一個、兩個、三個、四個或更多個氨基酸取代的序列，并且這些變體可以包括天然和非天然存在的氨基酸類似物。

本發(fā)明還公開了含有CAR藥效團的化合物，其中進(jìn)行了較不保守的氨基酸取代。這可以包括選擇在其對保持(a)取代區(qū)域中多肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如折疊或螺旋構(gòu)象，(b)靶標(biāo)位點的分子的電荷或疏水性或(c)側(cè)鏈的大體積區(qū)別更顯著的殘基。通常期望產(chǎn)生蛋白質(zhì)性質(zhì)最大變化的取代將是其中(a)親水殘基，例如絲氨?；蛱K氨酰，為(或被)疏水殘基，例如，亮氨酰、異亮氨酰、苯丙氨酰、纈氨?；虮滨Ｈ〈?；(b)半胱氨酸或脯氨酸為(或被)任何其它殘基取代；(c)具有正電性側(cè)鏈的殘基，例如賴氨酰、精氨?；蚪M氨酰為(或被)負(fù)電性殘基取代，例如谷氨?；蛱於滨；?；或(d)具有大體積側(cè)鏈的殘基，例如苯丙氨酸，為(或被)不具有側(cè)鏈的殘基，例如甘氨酸取代，在這種情況下，(e)通過增加硫酸化和/或糖基化的位點。

替代或缺失誘變可用于插入N-糖基化(Asn-X-Thr/Ser)或O-糖基化(Ser或Thr)的位點。半胱氨酸或其它不穩(wěn)定殘基的缺失也是可行的。潛在蛋白水解位點的缺失或取代，例如，Arg，通過例如缺失一個堿性殘基或者通過谷氨酰胺?；蚪M氨酰殘基取代實現(xiàn)。

F.衍生化

衍生化是將化合物轉(zhuǎn)化成相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物的過程。某些翻譯后衍生化是重組宿主細(xì)胞對表達(dá)的多肽的作用的結(jié)果。谷氨酰胺和天冬酰胺酰殘基通常經(jīng)翻譯后脫酰胺成相應(yīng)的谷氨酰和天冬酰胺殘基?；蛘?，這些殘基在弱酸性條件下脫酰胺。其他翻譯后修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化，絲氨?；蛱K氨酰殘基的羥基的磷酸化，賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈的鄰氨基的甲基化(TE Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，WH Freeman&Co.，San Francisco第79-86頁；1983)，N-末端胺的乙?；驮谝恍┣闆r下C-末端羧基的酰胺化。

應(yīng)理解，定義本發(fā)明公開的蛋白質(zhì)的變體和衍生物的一種方式是通過在與特定的已知序列的同源性/同一性方面定義變體和衍生物。具體公開的是本發(fā)明公開的這些和其它蛋白質(zhì)的變體，其與所述序列具有至少70％或75％或80％或85％或90％或95％的同源性，或其間的任何百分比表示氨基酸的改變，包括取代、添加或缺失。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解如何確定兩種蛋白質(zhì)的同源性。例如，可以在比對兩個序列之后計算同源性，使得同源性處于其最高水平。

應(yīng)理解，保守突變和同源性的描述可以以任何組合組合在一起，例如與特定序列具有至少70％同源性的實施例，其中所述變體是保守突變。

由于本說明書討論了各種蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)序列，因此可以編碼那些蛋白質(zhì)序列的核酸也被公開了。這將包括與特定蛋白質(zhì)序列相關(guān)的所有簡并序列，即，具有編碼一個特定蛋白質(zhì)序列的序列的所有核酸，以及編碼所公開蛋白質(zhì)序列的變體和衍生物的所有核酸，包括簡并核酸。因此，雖然每個特定核酸序列可能不在本發(fā)明中記載，但應(yīng)理解每一個序列已經(jīng)事實上通過公開的蛋白質(zhì)序列在本發(fā)明中公開和描述。

應(yīng)理解，有許多氨基酸和肽類似物可以摻入所公開的組合物中。例如，存在許多D-氨基酸或具有與上述那些不同的功能性取代基的氨基酸。本發(fā)明公開了天然存在的肽相反的立體異構(gòu)體，以及肽類似物的立體異構(gòu)體。這些氨基酸可以容易地?fù)饺氲蕉嚯逆溨?，其摻入是通過tRNA分子和選擇的氨基酸加載，并且利用例如琥珀密碼子將氨基酸類似物以位點特異性的方式插入肽鏈中來構(gòu)建基因構(gòu)造(Thorson et al.,Methods in Molec.BioI.77:43-73(1991),Zoller,Current Opinion in Biotechnology,3:348-354(1992)；Ibba,Biotechnology&Genetic Engineering Reviews 13:197-216(1995),Cahill et al.,TIBS,14(10):400-403(1989)；Benner,TIB Tech,12:158-163(1994)；Ibba and Hennecke,Bio/technology,12:678-682(1994)所有這些文獻(xiàn)通過引用至少與氨基酸類似物有關(guān)的材料而并入本發(fā)明)。

本發(fā)明還公開了可以產(chǎn)生類似肽但不通過天然肽鍵連接的分子。例如，氨基酸或氨基酸類似物的鍵可包括：CH₂NH---,---CH₂S---,---CH₂---CH₂---,---CH＝＝CH---(順式和反式)，---COCH₂---,---CH(OH)CH₂---,和---CHH₂SO---(這些和其它可以在Spatola,A.F.in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides,and Proteins,B.Weinstein,eds.,Marcel Dekker,New York,p.267(1983)；Spatola,A.F.,Vega Data(1983年3月),Vol.1,Issue 3,Peptide Backbone Modifications(綜述)；Morley,Trends Pharm Sci(1980)pp.463-468；Hudson,D.et al.,Int J Pept Prot Res 14:177-185(1979)(---CH₂NH---,CH₂CH₂---)；Spatola et al.Life Sci 38:1243-1249(1986)(---CH H₂---S)；Harm J.Chem.Soc Perkin Trans.I 307-314(1982)(---CH---CH---,順式和反式)；Almquist et al.J.Med.Chem.23:1392-1398(1980)(---COCH₂---)；Jennings-White et al.Tetrahedron Lett 23:2533(1982)(---COCH₂---)；Szelke et al.EuropeanAppln,EP45665CA(1982):97:39405(1982)(---CH(OH)CH₂---)；Holladay et al.Tetrahedron.Lett 24:4401-4404(1983)(---C(OH)CH₂---)；and Hruby Life Sci31:189-199(1982)(---CH₂---S---)被發(fā)現(xiàn)；其各自通過引用并入本發(fā)明。特別優(yōu)選的非肽鍵是---CH₂NH---。應(yīng)當(dāng)理解，肽類似物可以在鍵原子之間具有多于一個原子，例如b-丙氨酸，g-氨基丁酸等。

G.偶聯(lián)物

本發(fā)明還公開了具有CAR藥效團的偶聯(lián)化合物。偶聯(lián)物可以是CAR藥效團的線性或環(huán)狀變體，并且可以使用二硫鍵，肽鍵或任何其它類型的共價或非共價化學(xué)修飾連接到另一化合物，造成CAR藥效團變體連接到一個或多個其它化合物，或造成CAR藥物載體的線性或環(huán)狀變體連接到含有治療或診斷有效載荷的脂質(zhì)體、納米紅細(xì)胞膜質(zhì)體(nanoerythrosome)或微團。在一個實施例中，截短的CAR(tCAR；SEQ ID NO：24)已經(jīng)通過二硫鍵在人血清白蛋白(HSA)的Cys34殘基處與游離巰基偶聯(lián)(Sugio 1999)。該HSA-tCAR偶聯(lián)物可以延長tCAR的半衰期(Dennis 2002)，并且說明了可以用于增強CAR藥效團變體的性質(zhì)(例如半衰期)的更廣泛的方法。

在另一個實施例中，CAR藥物載體可以連接到抗纖維化化合物例如核心蛋白聚糖，以產(chǎn)生針對纖維化的抑制，例如瘢痕減少。

將含有CAR藥效團的分子偶聯(lián)到另一分子的想法可以具有延長半衰期、改善對患病組織的親和力、改善毒性或藥代動力學(xué)性質(zhì)、改善選擇性、改善結(jié)合和/或內(nèi)化、或改善任一種偶聯(lián)化合物的治療效果。在另一個實施例中，環(huán)狀CAR(SEQ ID NO：1)已經(jīng)與單克隆抗癌抗體B1的Fv片段共價連接(通過肽鍵)。該抗體對人癌細(xì)胞具有親和力。這可以導(dǎo)致高度特異的對人癌細(xì)胞的偶聯(lián)，并且闡釋了具有改善疾病歸巢特性的包含CAR藥效團的更廣泛的化合物類型。

H.優(yōu)化的化合物

本發(fā)明還公開了具有增強的或期望的性質(zhì)的氨基酸和肽類似物，例如，更經(jīng)濟的生產(chǎn)、更大的化學(xué)穩(wěn)定性、降低的毒性或副作用、增強的藥理學(xué)性質(zhì)(例如半衰期、吸收、分布、代謝、排泄、效力、靶結(jié)合或親和力等)、改變的特異性(例如，廣譜的生物活性)、降低的抗原性等。在一個實施例中，D-氨基酸可用于產(chǎn)生更穩(wěn)定的肽，因為D-氨基酸不被肽酶識別。用相同類型的D-氨基酸(例如，D-賴氨酸代替L-賴氨酸)系統(tǒng)取代共有序列的一個或多個氨基酸可以用于產(chǎn)生更穩(wěn)定的肽(SEQ ID NO：16、20和25)(Molhoek2011)。在另一個實施例中，亞甲基橋，酰胺(肽)鍵或半胱氨酸殘基(二硫鍵)可用于將兩個或更多個肽環(huán)化或連接在一起(SEQ ID NO：29)。這可有利于將肽限制為更穩(wěn)定的構(gòu)象(Clark 2005)。這還包括具有改善的靶特異性或結(jié)合的肽或蛋白質(zhì)，例如氨基酸殘基的最佳排列以增強配體和受體之間的分子相互作用。在另一個實施例中，堿性殘基(Lys、Arg或His)已經(jīng)排列使得受體和配體之間的相互作用將是最佳的(SEQ ID NO：30)。本發(fā)明還公開了具有改善的(降低的)全身毒性的蛋白質(zhì)和肽。在肽中占主導(dǎo)地位的半胱氨酸殘基通常發(fā)現(xiàn)相對于其他殘基是有毒的(Gupta 2013)。在一個這樣的實施例中，SEQ ID NO：1的側(cè)翼半胱氨酸殘基已經(jīng)被側(cè)翼亮氨酸殘基取代，并且通過側(cè)翼亮氨酸殘基(SEQ ID NO：29)之間的亞甲基橋?qū)崿F(xiàn)環(huán)化。

本發(fā)明還公開了氨基酸序列修飾或改變的肽和蛋白質(zhì)帶來更好的生物藥理學(xué)性質(zhì)。例如，酸性或堿性側(cè)鏈的引入，可以改善肽和蛋白質(zhì)的水性或非水性溶解度，以及增強的配方或藥代動力學(xué)性質(zhì)(Rand 2012)。在一個實施例中，具有低分配系數(shù)(log D)的殘基，如天冬氨酸的置換，可以用具有更大log D值的殘基，例如亮氨酸(SEQ ID NO：31)代替。

本發(fā)明還公開了具有改善的細(xì)胞通透性的肽和蛋白質(zhì)。向肽或蛋白質(zhì)添加多聚精氨酸序列可以極大地實現(xiàn)細(xì)胞攝取和通透性(Fuchs 2007)，并且還包括用精氨酸殘基替代非堿性殘基。在一個這樣的實施例中，SEQ ID NO：1中包含的九個現(xiàn)有殘基中的四個已被精氨酸殘基取代，使得能夠在保留功效的同時增強通透性(SEQ ID NO：32)。

本發(fā)明還公開了包含與異源蛋白融合的公開的肽的嵌合蛋白。在一個實施例中，異源蛋白可以具有治療活性，例如細(xì)胞因子活性、細(xì)胞毒活性或促凋亡活性。在另一個實施例中，異源蛋白質(zhì)可以是抗體或其抗原結(jié)合片段。在其它實施例中，嵌合蛋白包括與異源蛋白融合的含有氨基酸序列SEQ ID NOs：2-34的肽或其保守性變體或肽模擬物。本發(fā)明使用的術(shù)語“異源”，即與所公開的肽融合的蛋白質(zhì)，是指來自除了編碼肽的基因之外的來源或者來自于肽模擬物的蛋白質(zhì)。所公開的嵌合蛋白可以具有多種長度，包括但不限于小于100個殘基，小于200個殘基，小于300個殘基，小于400個殘基，小于500個殘基，小于800個殘基或小于1000個殘基。

如本發(fā)明所用，“嵌合體”和“嵌合”是指衍生自兩種或更多種來源的序列的任何組合。這包括，例如，從亞單位的單個基團(例如，核苷酸、氨基酸)到添加、插入和/或取代入其他序列的全部來源序列。嵌合體可以是例如添加劑，其中一個序列的一個或多個部分被添加到一個或多個其他序列的一個或多個部分；替代的，其中一個序列的一個或多個部分被取代為一個或多個其它序列的一個或多個部分；或其組合?！氨Ｊ刂脫Q嵌合體”可用于指替代嵌合體，其中嵌合體的源序列具有一些結(jié)構(gòu)和/或功能關(guān)系，并且其中具有相似或類似結(jié)構(gòu)和/或功能的序列部分彼此替換。典型的嵌合和人源化抗體是保守取代的嵌合體的實例。

I.雙功能化合物

本發(fā)明還公開了包含與具有單獨功能的第二個肽融合的歸巢肽的雙功能肽。這種雙功能肽具有由全長分子的不同部分賦予的至少兩種功能，并且除了選擇性歸巢活性外，還可以顯示例如抗血管生成活性或促凋亡活性。

如果需要，如本發(fā)明其它地方所討論的，分離的肽或歸巢分子可以是環(huán)狀或以其他方式構(gòu)象約束的。如本發(fā)明所用，“構(gòu)象約束的”分子，例如肽，其中三維結(jié)構(gòu)在一段時間內(nèi)基本上保持在一個空間排列中。構(gòu)象約束的分子可以具有改進(jìn)的性質(zhì)，例如增加的親和力、代謝穩(wěn)定性、膜通透性或溶解度。構(gòu)象限制的方法是本領(lǐng)域公知的，并且包括如本發(fā)明其它地方進(jìn)一步討論的環(huán)化。

如本發(fā)明關(guān)于肽所使用的，術(shù)語“環(huán)狀”是指包括兩個非相鄰氨基酸或氨基酸類似物之間的分子內(nèi)鍵的結(jié)構(gòu)。所述環(huán)化可以通過共價或非共價鍵影響。分子內(nèi)鍵包括但不限于主鏈到主鏈，側(cè)鏈到主鏈和側(cè)鏈到側(cè)鏈鍵。優(yōu)選的環(huán)化方法是通過在非相鄰氨基酸或氨基酸類似物的側(cè)鏈之間形成二硫鍵。能夠形成二硫鍵的殘基包括，例如，半胱氨酸(Cys)，青霉胺(Pen)，β,β-環(huán)戊烷半胱氨酸(Pmc)，β,β-環(huán)戊烷-β-巰基丙酸(Pmp)及其功能等同物。

肽還可以例如經(jīng)由內(nèi)酰胺鍵環(huán)化，其可以利用一個氨基酸或其類似物的側(cè)鏈基團形成與氨基末端殘基的N-末端胺的共價連接。能夠形成內(nèi)酰胺鍵的殘基包括天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、賴氨酸(Lys)、鳥氨酸(om)、α,β-二氨基丙酸、γ-氨基己二酸(Adp)和M-(氨甲基)苯甲酸(Mamb)。另外可以影響環(huán)化，例如，通過在賴氨酸(Lys)和亮氨酸(Leu)殘基之間形成賴氨酸-亮氨酸鍵或在兩個酪氨酸(Tyr)殘基之間形成二酪氨酸鍵。技術(shù)人員理解，這些和其它鍵可以包括在環(huán)肽中。

J.組合技術(shù)

所公開的組合物可以用作任何組合技術(shù)的靶，以確定與所公開的組合物以期望的方式相互作用的分子或高分子的分子。本發(fā)明還公開了通過組合技術(shù)或篩選技術(shù)鑒定的組合物，其中組合物公開為SEQ ID NO：2-33中公開的或其部分，用作組合或篩選方案中的靶。

應(yīng)理解，當(dāng)在組合技術(shù)或篩選方法中使用所公開的組合物時，具有特定所需性質(zhì)例如抑制或刺激或靶分子功能的分子，例如高分子的分子將被鑒定。還公開了當(dāng)使用所公開的組合物例如CAR時鑒定和分離到的分子。因此，使用涉及所公開的組合物例如SEQ ID NO：2-33的組合或篩選方法產(chǎn)生的產(chǎn)物也在本發(fā)明中被考慮。

K.疾病

本發(fā)明所公開的含有CAR藥效團的化合物可用于治療和/或診斷疾病，例如：肺部疾病，肺動脈高血壓，間質(zhì)性肺病，急性肺損傷，急性呼吸窘迫綜合征，哮喘，敗血癥，敗血性休克，感染，肺結(jié)節(jié)病，結(jié)締組織疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、硬皮病和多發(fā)性肌炎、皮肌炎的肺部表現(xiàn)，支氣管擴張，石棉肺，鈹中毒，矽肺，X組織細(xì)胞增多癥，肺實變性炎癥，肺組織炎癥，吸煙性肺炎，閉塞性細(xì)支氣管炎，肺纖維化，其它纖維化疾病如心肌梗塞、心內(nèi)膜心肌纖維化、縱隔纖維化、骨髓纖維化、腹膜后纖維化、進(jìn)行性大塊纖維化、塵肺病、腎源性系統(tǒng)性纖維化、瘢痕形成、瘢痕疙瘩、關(guān)節(jié)纖維化、粘連性囊炎、放射性纖維化、纖維囊性乳腺病癥、肝硬化、肝炎、肝纖維化、非酒精性脂肪肝病、急性肝衰竭、非酒精性脂肪性肝炎、淋巴結(jié)或其他器官的結(jié)節(jié)病，炎癥性腸病，克羅恩病，惡病質(zhì)，慢性腎臟疾病，急性腎損傷，急性腎衰竭，多囊腎病，潰瘍性結(jié)腸炎，原發(fā)性膽汁性肝硬化，胰腺炎，間質(zhì)性膀胱炎，慢性阻塞性肺病，動脈粥樣硬化，缺血性心臟病，血管炎，贅生的/轉(zhuǎn)移性/腫瘤性疾病(包括癌癥)，塵肺病，自身免疫性疾病，血管生成疾病，傷口愈合，感染，外傷損傷和系統(tǒng)性結(jié)締組織疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎硬皮病、多發(fā)性肌炎、皮肌炎，囊性纖維化，勃起功能障礙，α1-抗胰蛋白酶缺乏癥，糖尿病，以高乙酰肝素酶水平為特征的疾病，神經(jīng)炎性病癥，中風(fēng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病如阿爾茨海默氏病、帕金森病(PD)、亨廷頓舞蹈病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥，多發(fā)性硬化、創(chuàng)傷性腦損傷，組織缺氧，腦老化，濕性黃斑變性，新生血管性老年性黃斑變性，糖尿病性視網(wǎng)膜病，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤和衰老相關(guān)疾病和作為基因治療佐劑。

實施例

以下實施例旨在為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供如何制備和評價本發(fā)明要求保護(hù)的一些化合物，組合物和/或方法的披露和說明。這些實施例旨在說明可以使用的更廣泛的方法，并且無意以任何方式限制本公開。

實施例1環(huán)狀CAR藥效團的確定

為了確定環(huán)CAR藥效團，進(jìn)行CAR肽(SEQ ID NO：1)和七個密切相關(guān)的肽(SEQ ID NOs：2-8)的細(xì)胞結(jié)合和內(nèi)化測定。

1A.共聚焦顯微鏡

合成了在賴氨酸或精氨酸殘基上具有置換的八個CAR變體(SEQ ID NO：1-8)(圖1)。所述肽通過將熒光胺(FAM)基團連接到分子上來標(biāo)記。

初始測試中用細(xì)胞結(jié)合和內(nèi)化測定來比較變體與原始CAR肽。用中國倉鼠卵巢(CHO-K)細(xì)胞通過共聚焦顯微鏡研究了CAR肽變體的細(xì)胞結(jié)合/內(nèi)化，所述細(xì)胞以前已用于研究CAR結(jié)合。

將所示的FAM偶聯(lián)的肽以5μM濃度與CHO-K細(xì)胞溫育2小時。洗滌、固定，并用核染色DAPI染色細(xì)胞。CHO細(xì)胞結(jié)合和內(nèi)化結(jié)果(圖2)表明將肽的第一個精氨酸變?yōu)橘嚢彼釟埢纳屏伺cCHO細(xì)胞的結(jié)合，且該肽應(yīng)具有至少一個精氨酸。

1B.熒光激活細(xì)胞分選(FACS)

合成了在賴氨酸或精氨酸殘基上具有置換的八個CAR變體(SEQ ID NO：1-8)(圖1)。肽通過將熒光胺(FAM)基團連接到分子上來標(biāo)記。

為測定SEQ ID NO：1-8的細(xì)胞內(nèi)化，使用了熒光激活細(xì)胞分選(FACS)。選擇人肺成纖維細(xì)胞(CCL-210)是因為它們似乎是比CHO細(xì)胞更好的CAR靶標(biāo)。與共焦顯微鏡實驗(實施例1A)不同，F(xiàn)ACS分析完全集中于肽內(nèi)化，而不是肽結(jié)合。

將細(xì)胞與5μM肽在無血清DMEM中在37℃下溫育24小時。孵育后，用含有100μg/ml肝素的冰冷緩沖液將細(xì)胞洗滌3-4次，以除去任何非內(nèi)化的肽。使用胰蛋白酶-EDTA分離細(xì)胞，并將細(xì)胞懸浮液用7AAD染料染色以確定細(xì)胞活力。然后立即使用FACS分析細(xì)胞以確定肽內(nèi)化的水平。

FACS結(jié)果基于每個序列中存在的氨基酸取代(圖3)確定了SEQ ID NO：1-8的肽內(nèi)化譜的變化。變化發(fā)生在肽結(jié)合的強度以及肽結(jié)合的定位。有趣的是，具有保守氨基酸取代的CAR藥效團肽變體顯示了在CHO細(xì)胞和人肺成纖維細(xì)胞之間的差異結(jié)合和內(nèi)化特征(分別如圖2和3所示)，表明對原始CAR肽的保守氨基酸取代在結(jié)合和內(nèi)化中產(chǎn)生了意想不到的差異。這些結(jié)果意外地遠(yuǎn)離了Ruoslahti在美國專利No.8,188,220中的公開內(nèi)容的教導(dǎo)，其教導(dǎo)為保守性氨基酸取代被指示對肽內(nèi)化幾乎沒有或沒有影響。

FACS結(jié)果(實施例1B)不同于共聚焦分析(實施例1A)，因為雙精氨酸，單賴氨酸肽是最有效的(圖2)。然而，該測定中的背景高，差異小于50％并且不具有統(tǒng)計學(xué)顯著性。與共聚焦研究(實施例1A)相比，精氨酸殘基的更大需求可能與在FACS實驗(實施例1B)中我們僅測量內(nèi)化，而不測量結(jié)合和內(nèi)化的事實有關(guān)。眾所周知，多個精氨酸殘基促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)化。

1C.計算模型研究以確定環(huán)狀CAR藥效團。

來自實施例1A和1B的實驗研究揭示SEQ ID NO：2-8顯示與SEQ ID NO：1類似的生物活性?；赟EQ ID NO：2-8與SEQ ID NO：1的結(jié)構(gòu)的相似性，獲得了賦予SEQ ID NO：1生物活性的基本特征(藥效團)的一些初步線索。

雖然在CAR變體之間存在結(jié)合和內(nèi)化的差異，但是所有變體都是結(jié)合和內(nèi)化的，并且變體之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性。因此，所有8種變體都具有與原始CAR序列相似的生物活性。接下來，CAR藥效團的基本特征將通過計算機模擬確定。

使用PyMOL分子圖形系統(tǒng)，1.2r2版(PyMOL 2014)，在計算機上產(chǎn)生所有8種CAR類似物(SEQ ID NO：1-8)。研究了所產(chǎn)生的變體的各種特征，例如空間性質(zhì)、分子量、氫鍵供體和受體、溶劑可及表面積、序列關(guān)系、肽骨架結(jié)構(gòu)和空間中的氨基酸側(cè)鏈位置。使用自適應(yīng)泊松-玻爾茲曼解算器(APBS)1.2.1版(Baker 2001)研究SEQ ID NO：1-8之間的電子相似性，該程序是計算分子的大分子靜電的程序。計算結(jié)果表示為靜電勢分子表面，并且可用于發(fā)現(xiàn)所有八種變體的靜電荷分布的相似性。

展示了多種效果圖以比較SEQ ID NO：1-8的各種分子特征。特別重要的是SEQ ID NO：1-8的疊加，其證明了CAR肽(SEQ ID NO：1)和CAR肽類似物(SEQ ID NO：2-8)之間的不重要的和微妙的相似性。

在疊加的CAR類似物的分析(圖4)中，觀察到保守的環(huán)狀CAR結(jié)構(gòu)模式，其被鑒定為環(huán)狀CAR藥效團。這是由于SEQ ID NO：1-8的顯著的結(jié)構(gòu)、電子、空間和順序相似性。這些結(jié)果證實了實施例1中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，其中SEQ ID NO：2-8顯示與SEQ ID NO：1，即原始CAR序列(SEQ ID NO：1)類似的生物活性，并且所有序列都適合于CAR藥效團。

實施例2使用肽模擬物創(chuàng)建具有環(huán)狀或線性CAR藥效團的新型非肽化合物

2A.SEQ ID NO：9-11和13-15的計算機生成和虛擬渲染。

為了說明可用于產(chǎn)生具有CAR藥效團的新型化合物的肽模擬方法，使用PyMOL分子圖形系統(tǒng)，版本1.2r2(PyMOL 2014)在計算機中生成了小化合物文庫。已經(jīng)設(shè)計了六種結(jié)構(gòu)以包含疾病歸巢和選擇性內(nèi)化所需的CAR藥效團。利用合理的方法模擬CAR的分子性質(zhì)，所有六種類似物均由三種現(xiàn)有的，廣泛使用的治療劑：伏環(huán)孢菌素(voclosporin)，雷帕霉素和利福布汀產(chǎn)生。產(chǎn)生含有環(huán)狀CAR藥效團(SEQ ID NO：9-11)的三個環(huán)狀變體，并產(chǎn)生含有線性CAR藥效團(SEQ ID NO：13-15)的三個線性變體。

雖然伏環(huán)孢菌素(voclosporin)，雷帕霉素和利福布汀的某些方面可能不同于CAR的某些方面(例如，雷帕霉素和利福布汀是非肽化合物)，但是這些分子可以是生產(chǎn)CAR類似物的肽模擬方法的起點?；谒鼈兊沫h(huán)狀性質(zhì)，分子量(約1kDa)和口服生物利用度等CAR肽的特征來選擇這些化合物。

研究了SEQ ID NO：9-11和SEQ ID NO：13-15的各種特征，例如空間特性、分子量、氫鍵供體和受體、可及溶劑表面積、序列關(guān)系、環(huán)狀環(huán)骨架結(jié)構(gòu)和氨基酸側(cè)鏈/空間中的官能團位置。將觀察到的SEQ ID NO：9-11和13-15的特征與環(huán)狀CAR和線性CAR分別進(jìn)行比較，以確定這些類似物是否仍然具有CAR藥效團和CAR肽的疾病歸巢和選擇性內(nèi)化特性。對類似物的修飾將使這些化合物具有與CAR藥效團類似的結(jié)合，內(nèi)化和疾病選擇性。

2B.結(jié)果分析。

當(dāng)比較環(huán)CAR(SEQ ID NO：1)與環(huán)狀CAR-雷帕霉素(SEQ ID NO：9)，環(huán)狀CAR-利福布汀(SEQ ID NO：10)和環(huán)狀CAR-伏環(huán)孢菌素(voclosporin)(SEQ ID NO：11)可以看出，所有四種化合物之間存在相似性和差異。顯然地，SEQ ID NO：9和10的非肽/小分子性質(zhì)導(dǎo)致其與SEQ ID NO：1之間的大部分可觀察到的差異。然而，在仔細(xì)檢查SEQ ID NO：1和9-11時，可以看出它們之間存在空間特征的保守模式。更具體地，在每個環(huán)肽模擬物中明顯存在三個全部具有帶正電荷末端的特異性官能團。每個類似物的官能團全部以與SEQ ID NO：1類似的方式，從核心主鏈結(jié)構(gòu)(環(huán)狀環(huán))突出到空間中。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：9-11之間也存在靜電相似性，特別是在擴展官能團的帶正電荷的組分。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：9-11之間的其他相似性也存在，包括分子量和包含核心主鏈結(jié)構(gòu)的保留的環(huán)，和環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

分析線性CAR(SEQ ID NO：12)，線性CAR-雷帕霉素(SEQ ID NO：13)，線性CAR-利福布汀(SEQ ID NO：14)和線性CAR-伏環(huán)孢菌素(voclosporin)(SEQ ID NO：15)，結(jié)果表明所有四種化合物之間均存在相似性和差異。與之前觀察到的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(SEQ ID NO：9-11)一樣，可以看出，在線性CAR(SEQ ID NO：12)和線性類似物(SEQ ID NO：13-15)之間存在著空間特征的保守模式。都具有帶正電荷末端的三個獨特的官能團，存在于每個線性肽模擬物中。每個類似物的這些官能團都以與SEQ ID NO：12類似的方式從結(jié)構(gòu)的線性主鏈突出到空間中。SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13-15之間還可以看到靜電相似性，所有四種化合物在延伸的三個官能團的末端具有帶正電荷的區(qū)域。

來自線性和環(huán)狀CAR肽模擬物文庫的結(jié)果可作為非限制性的說明性的方法，其可以在利用肽模擬物產(chǎn)生CAR肽的CAR藥效團，疾病歸巢和選擇性內(nèi)化特性的化合物，包括小分子時使用。分子還可以具有原始治療性質(zhì)，并與CAR藥效團的歸巢和疾病選擇性性質(zhì)結(jié)合。此外，實施例3用于進(jìn)一步限定先前鑒定的CAR藥效團，其不僅根據(jù)精確的序列和殘基模式來定義，而且還可以根據(jù)更廣義的具有相似的三維空間、立體、以及作為線性，截短和環(huán)狀CAR肽的電子模式的結(jié)構(gòu)來定義。

實施例3產(chǎn)生含有環(huán)狀、線性和截短的CAR藥效團的新型肽置換變體

3A.SEQ ID NO：16-19、20-23和25-28的計算機生成和虛擬渲染。

為了說明可用于產(chǎn)生具有CAR藥效團的新肽的取代方法，使用PyMOL分子圖形系統(tǒng)，1.2r2版(PyMOL 2014)在計算機生成了關(guān)注的化合物文庫。在該實施例中，產(chǎn)生的所有環(huán)狀，線性和截短的類似物均包含非天然氨基酸取代。使用的特定非天然氨基酸殘基以及它們在CAR肽序列內(nèi)的位置都是精心選擇的，以便產(chǎn)生仍保留CAR藥效團的新型類似物。設(shè)計SEQ ID NO：16-19以匹配環(huán)CAR藥效團，設(shè)計SEQ ID NO：20-23以匹配線性CAR藥效團，并且為截短的CAR藥效團設(shè)計SEQ ID NO：25-28。

總共產(chǎn)生12個取代變體：4個環(huán)狀、4個線性和4個截短。對于環(huán)狀、線性和截短的變體所進(jìn)行的取代的類型是相同的。更具體地，在每個類別(環(huán)狀、線性和截短的)內(nèi)，通過改變CAR氨基酸序列中第一個Lys殘基的立體化學(xué)產(chǎn)生一個類似物，導(dǎo)致在該位置的D-氨基酸取代。為每個類別制備另一類似物，其含有D-烯丙基甘氨酸殘基(一種甘氨酸衍生物)取代正常的Ala殘基。在每個類別中也產(chǎn)生二氨基酸取代，其中CAR序列的Arg殘基被Asn殘基取代。最后，產(chǎn)生取代變體，其中CAR序列的Cys殘基(其通常含有帶電荷或乙?；疦-末端)取代了N-甲基化的Cys殘基。

研究了SEQ ID NO：16-19、20-23和25-28的分子特征，包括空間特性、分子量、氫鍵供體和受體、可及的溶劑表面積、序列關(guān)系、主鏈結(jié)構(gòu)和氨基酸側(cè)鏈/官能團在空間中的位置。將SEQ ID NO：16-19、20-23和25-28的觀察到的特征與其相應(yīng)的環(huán)狀，線性或截短的CAR對應(yīng)物進(jìn)行比較，以確定類似物是否仍然具有CAR藥效團并因此具有CAR肽的疾病歸巢和選擇性內(nèi)化特性。

為傳達(dá)環(huán)狀、線性和截短的CAR肽與它們各自的取代類似物的各種分子相似性，創(chuàng)建了幾種虛擬渲染。

3B.結(jié)果分析。

環(huán)狀CAR(SEQ ID NO：1)與環(huán)狀取代類似物(SEQ ID NO：16-19)的疊加，使得所有五種化合物的相似性被觀察到(圖7)。SEQ ID NO：16-19中的氨基酸取代不會導(dǎo)致環(huán)狀環(huán)結(jié)構(gòu)或帶正電荷的堿性殘基的空間位置的丟失。所有三個堿性殘基(Arg、Lys1和Lys2)具有與SEQ ID NO：1幾乎相同的側(cè)鏈空間布局的事實證明SEQ ID NO：16-19具有環(huán)狀CAR藥效團。另外，可以看到SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：16-19之間的靜電相似性，特別是延伸側(cè)鏈的帶正電荷的組分。還存在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：16-19之間的其他更細(xì)微的相似性，包括分子量和包含核心主鏈結(jié)構(gòu)的保留的環(huán)，環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

當(dāng)分析線性CAR(SEQ ID NO：12)和線性取代變體(SEQ ID NO：20-23)時，在所有五種化合物之間可以看到大量的相似性(圖8)。SEQ ID NO：20-23中的氨基酸取代不導(dǎo)致線性主鏈結(jié)構(gòu)的損失，其與SEQ ID NO：12的帶正電荷的堿性殘基(Arg、Lys1和Lys2)的三維空間位置幾乎一致。SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：20-23之間的靜電包括延伸的Arg和Lys側(cè)鏈的帶正電荷的組分的相似性也是明顯的。分析結(jié)果顯示SEQ ID NO：20-23具有線性CAR藥效團。

截短的CAR(SEQ ID NO：24)與截短的取代類似物(SEQ ID NO：25-28)的疊加使得所有五種化合物的相似性能被看到(圖9)。與產(chǎn)生的線性類似物一樣，SEQ ID NO：25-28中的殘基取代不導(dǎo)致線性主鏈結(jié)構(gòu)的損失，其與SEQ ID NO：24的帶正電荷的堿性殘基(Arg、Lys1和Lys2)的三維空間位置幾乎相同。SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25-28之間的靜電相似性可以被看到，這包括延伸的Arg和Lys側(cè)鏈的帶正電荷的組分。鑒于SEQ ID NO：25-28和SEQ ID NO：24之間的這些基本相似性，可以推斷出SEQ ID NO：25-28具有截短的CAR藥效團。

實施例4具有環(huán)狀和截短的CAR藥效團的偶聯(lián)化合物的開發(fā)

4A.偶聯(lián)化合物(SEQ ID NO：29和30)的計算機生成和虛擬渲染。

使用PyMOL分子圖形系統(tǒng)，1.2r2版(PyMOL 2014)，在計算機中生成兩種包含CAR藥效團的新化合物(SEQ ID NO：29和30)。SEQ ID NO：29由已經(jīng)與截短的CAR肽(tCAR；SEQ ID NO：24)連接(偶聯(lián))的人血清白蛋白(HSB)蛋白組成。SEQ ID NO：29由已經(jīng)與環(huán)CAR(SEQ ID NO：1)偶聯(lián)的單克隆抗癌抗體B1的Fv片段組成。因此，SEQ ID NO：29和30都在其序列內(nèi)分別具有截短的和環(huán)狀的CAR藥效團。

SEQ ID NO：29通過經(jīng)由二硫鍵將tCAR偶聯(lián)至人血清白蛋白(HSB)的Cys34殘基處的游離巰基而產(chǎn)生。此HSA-tCAR偶聯(lián)物先前已顯示可延長tCAR的半衰期(Dennis 2002)，且說明可用于增強CAR藥效團變體的性質(zhì)，例如半衰期的更廣泛方法。通過將環(huán)狀CAR肽與單克隆抗癌抗體B1的Fv片段共價連接(通過肽鍵)產(chǎn)生SEQ ID NO：30。該抗體對人癌細(xì)胞具有親和力。雙功能化合物將產(chǎn)生對人癌細(xì)胞具有高度特異性的藥物偶聯(lián)物，并且說明包含具有疾病歸巢和治療性質(zhì)的CAR藥效團的更廣泛類型的化合物。

實施例5產(chǎn)生具有包含環(huán)狀CAR藥效團的優(yōu)化性質(zhì)的肽

5A.SEQ ID NO：31-33的計算機生成和虛擬渲染。

為了說明可用于開發(fā)具有環(huán)狀CAR藥效團的新型肽的計算機輔助的優(yōu)化方法，使用PyMOL分子圖形系統(tǒng)，1.2r2版本(PyMOL 2014)在計算機中生成化合物文庫。除了具有CAR藥效團之外，產(chǎn)生的所有三種類似物(SEQ ID NO：31-33)含有一種或多種化學(xué)修飾，其將導(dǎo)致產(chǎn)生具有改善的或增強的性質(zhì)的結(jié)構(gòu)。所產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)可具有由單一類型的序列修改產(chǎn)生的多于一個的改進(jìn)特征。在產(chǎn)生SEQ ID NO：31-33的過程中，經(jīng)常使用先前公開的技術(shù)，例如置換修飾。

SEQ ID NO：31通過用Leu殘基取代SEQ ID NO：1的C末端和N末端的側(cè)翼Cys殘基產(chǎn)生氨基酸序列：LARSKNKDL而產(chǎn)生。在這種情況下，環(huán)化通過連接與SEQ ID NO：1的正常二硫鍵相對的兩個側(cè)翼Leu殘基的亞甲基橋?qū)崿F(xiàn)。與SEQ ID NO：1中的二硫鍵相同，修飾用于限制肽成為更穩(wěn)定的構(gòu)象。然而，與SEQ ID NO：1中的二硫鍵不同，兩個Leu殘基可潛在地減少與SEQ ID NO：1相關(guān)的任何全身毒性，這是由于Leu殘基通常比Cys殘基具有較低水平的全身毒性(Gupta 2013)。

SEQ ID NO：32通過重排和替換SEQ ID NO：1的原始氨基酸序列而產(chǎn)生序列：CAKSRNHDC。更具體地，SEQ ID NO：1的Arg1已經(jīng)被Lys殘基取代；SEQ ID NO：1的Lys1已經(jīng)被Arg殘基取代；并且SEQ ID NO：1的Lys2已經(jīng)被His殘基取代。鑒于未經(jīng)證實的CAR肽受體的性質(zhì)和內(nèi)化的機制，這種重排/置換可以產(chǎn)生氨基酸殘基的最佳排列，其將增強配體和受體之間的分子相互作用。這最終可以導(dǎo)致包含環(huán)狀CAR藥效團的該化合物的靶特異性，結(jié)合或內(nèi)化的改善。

通過用疏水性Leu殘基取代SEQ ID NO：1的帶負(fù)電荷的Asp殘基產(chǎn)生SEQ ID NO：33，產(chǎn)生氨基酸序列：CARSKNKLC。用具有較大log D值的殘基(例如亮氨酸)取代具有低分布系數(shù)的殘基(log D)，例如天冬氨酸，將改善肽的非水溶性，并可潛在地導(dǎo)致產(chǎn)生的能夠增強制劑或改善藥代動力學(xué)性質(zhì)的類似物(Rand 2012)。

5B.結(jié)果分析。

環(huán)狀CAR(SEQ ID NO：1)與優(yōu)化的肽類似物(SEQ ID NO：31-33)的疊加允許所有五種化合物(未顯示)之間相似性的可視化。SEQ ID NO：31-33中的氨基酸取代不導(dǎo)致環(huán)狀環(huán)結(jié)構(gòu)的損失或帶正電荷的堿性殘基的空間排列。所有三個堿性殘基(Arg、Lys1和Lys2)具有與SEQ ID NO：1幾乎相同的側(cè)鏈空間布置的事實證明SEQ ID NO：31-33具有環(huán)狀CAR藥效團。

另外，可以看到SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：31-33之間的靜電相似性，特別是延伸側(cè)鏈的帶正電荷的組分。還存在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：31-33之間的其他更細(xì)微的相似性，包括分子量和包含核心主鏈結(jié)構(gòu)的保留的環(huán)、環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

實施例6開發(fā)潛在的CAR變體

CAR在Basic-X-Basic-X-Basic-X排列中含有3個堿性殘基。該基序與許多蛋白質(zhì)中的肝素結(jié)合基序相似?？紤]到硫酸乙酰肝素結(jié)合CAR的需要(Jarvinen和Ruoslahti，2008)，為原始位置保留堿性氨基酸(精氨酸或賴氨酸)而進(jìn)行了置換。其余位置隨機變化。進(jìn)行噬菌體中的突變分析，因其是進(jìn)行這種分析的最簡便的方式。測試噬菌體克隆與CHO細(xì)胞的結(jié)合(Jarvinen和Ruoslahti，2010)，并且當(dāng)其活躍時，用于體內(nèi)歸巢。同時，還檢查了截短的CAR序列。先前的實驗發(fā)現(xiàn)，在C末端截短為CARSKNK(來自CARSKNKDC)的線性肽在細(xì)胞結(jié)合和組織歸巢中是高度活躍的。相反，N末端的截短降低了活性。這些結(jié)果將藥效團定義為XXBXBXB，其中B是堿性氨基酸。隨機突變X殘基，并測試噬菌體以獲得最短和/或最具活性的肽。

結(jié)果表明，在基序CXRXRXR中，“R”可以是賴氨酸K殘基或精氨酸R殘基，即具有正電荷側(cè)基的殘基。在“R”為氨基酸殘基D、E、H、T、S、N、I、V、G、Q、L和P的情況下，細(xì)胞結(jié)合和細(xì)胞歸巢效果未得到改善。更難以解釋的是，“X”中的哪些殘基導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)合和細(xì)胞歸巢效果的改善。結(jié)果表明“X”代表的氨基酸殘基不為脯氨酸P。當(dāng)“X”為K、H、R、D、E、C、F、W或Y時，通常是靜電的差異、而不是其實際結(jié)合距離，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)合和細(xì)胞歸巢的效果不佳。最終地，結(jié)果顯示“X”可以是T、S、N、Q、A、I、L或V等具有極性、不帶電荷的側(cè)基的氨基酸殘基和具有疏水側(cè)基的氨基酸殘基。

實施例7CAR藥物基團靶向慢性腎臟疾病

使用中心性腎小球的腎炎大鼠模型(抗腎小球基底膜抗體誘導(dǎo)的腎小球損傷)來觀察CAR藥效團靶向慢性腎臟疾病的效用。在大鼠腎中通過靜脈內(nèi)注射抗腎小球基底膜抗體誘導(dǎo)腎小球腎炎。誘導(dǎo)后14天，靜脈注射以3.3mg/kg B.W.CAR藥效團肽或?qū)φ?CGGGGGGGC)肽，在CAR藥效團或?qū)φ兆⑸浜笕r收獲腎臟，并使用Massontrichrome(collogen)染色和纖連蛋白免疫染色來測定腎病和纖維化形成的發(fā)展。

圖10中顯示的結(jié)果表明CAR藥效團用于靶向慢性腎臟疾病的效用。CAR藥效團在病變腎臟的腎小球毛細(xì)血管，腎小球腔中的新月體，腎小管上皮和間質(zhì)(C)中廣泛累積(紫色)。CAR藥效團在新月及腎管中積累。腎小管蓄積可能與再吸收有關(guān)。相比之下，在施藥3小時之時，對照肽大部分從腎中清除(D)。

實施例8在野百合堿誘導(dǎo)(MCT)肺動脈高壓的大鼠模型中與伊馬替尼共施用CAR藥效團用于觀察CAR靶向肺動脈高壓的治療效用。CAR藥效團肽在MCT誘導(dǎo)后4周開始與10mg/kg或50mg/kg伊馬替尼靜脈內(nèi)共施用14天。

結(jié)果表明，在共同施用CAR藥效團和伊馬替尼后，MCT誘導(dǎo)的肺動脈高壓的嚴(yán)重性不如先前報道的誘導(dǎo)后4周的研究那樣大(數(shù)據(jù)未顯示)。CAR藥效團的共同施用增強了伊馬替尼的作用以減少右心臟肥大。

類似地，當(dāng)在本實驗中測量肺動脈肌化程度時，CAR藥效團的共施用增強了伊馬替尼的效果(數(shù)據(jù)未顯示)。

令人驚訝的結(jié)果是發(fā)現(xiàn)CAR藥效團對體重的有益效果。右心臟肥大和肺動脈肌化的減少與高血壓大鼠的體重恢復(fù)改善相吻合。惡病質(zhì)或消耗綜合征在沒有主動嘗試減肥的個體中出現(xiàn)體重減輕、肌肉萎縮、疲勞、虛弱和食欲不振。惡病質(zhì)在患有癌癥、AIDS、慢性阻塞性肺病、多發(fā)性硬化、充血性心力衰竭、結(jié)核病、家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病、汞中毒(肢端痛)和激素缺乏的患者中見到。CAR藥效團對體重的有益效果的發(fā)現(xiàn)提供了CAR藥效團總體上能改善由MCT注射誘導(dǎo)和甚至惡病質(zhì)引起的體重減輕能力的初步證據(jù)。

實施例9CAR藥效團在敗血癥的脂多糖內(nèi)毒素(LPS)小鼠模型中改善敗血癥存活的能力。

敗血癥中CAR作用的假設(shè)機制(圖11)。(A)內(nèi)皮膜的健康糖萼不結(jié)合CAR肽。一些藥物分子被動擴散通過質(zhì)膜，但大多數(shù)藥物保留在血流中。(B)敗血癥后，肝素酶表達(dá)引起硫酸乙酰肝素(HS)鏈的選擇性酶裂解和糖萼的修飾?？骨懈畹腍S變體保持完整，使得CAR能結(jié)合其HS受體。(C)CAR的結(jié)合引發(fā)膜起皺和脂筏形成，引起質(zhì)膜的內(nèi)向折疊和對包括CAR和藥物分子的細(xì)胞外組分的吞噬。(D)含有CAR和藥物分子的巨胞囊泡被內(nèi)化到細(xì)胞中。(E)降低的細(xì)胞內(nèi)pH導(dǎo)致巨胞飲小體解離，釋放CAR和藥物進(jìn)入細(xì)胞。雖然這仍然只是一個假設(shè)，它可以解釋如何CAR選擇性地增強藥物在敗血癥組織中的局部活性，而不增加血管通透性。

50％具有LPS-誘導(dǎo)的敗血癥的未處理的小鼠在48小時內(nèi)死亡。當(dāng)這些LPS小鼠用臨床相關(guān)劑量的常見和實驗性敗血癥藥物氫化可的松，抗凝血酶III或西維來司鈉治療時，存活范圍為40-56％，類似于當(dāng)前的臨床結(jié)果。相比之下，當(dāng)LPS小鼠在與氫化可的松，抗凝血酶III或西維來司鈉相同的時間共同施用CAR時，實驗性敗血癥存活改善至83-89％。

CAR藥效團顯著改善了用西維來司鈉治療的敗血癥小鼠的存活。注射細(xì)菌蛋白，脂多糖(LPS)，用于在小鼠中誘導(dǎo)敗血癥。在3、6、9和12小時給予劑量以匹配西韋來特的臨床應(yīng)用。在注射LPS后48小時測量存活。在48小時時，CAR藥效團+西維來司鈉治療的動物的存活率為89％，相比之下，在對照和僅西維來司鈉(sivelestat)組中為50％，表示用CAR藥效團處理的動物的存活率增加了78％(圖12)。

CAR藥效團顯著改善了用抗凝血酶III(ATIII)處理的敗血癥小鼠的存活。誘導(dǎo)敗血癥，在3和24小時給予匹配ATIII臨床使用的劑量，并測量存活率。在48小時，CAR藥效團+ATIII治療的動物的存活率為83％，相比之下，對照組為50％，僅有ATIII治療的組為40％，相對于僅ATIII組，CAR藥效團處理的動物的存活增加66％(圖13)。僅ATIII治療的動物，其存活降低可能是由于ATIII的抗凝血活性引起的出血。CAR藥效團似乎完全逆轉(zhuǎn)了這種效應(yīng)。

CAR藥效團顯著提高用氫化可的松類固醇治療的敗血癥小鼠的存活率。誘導(dǎo)敗血癥，在3和24小時給予匹配氫化可的松臨床使用的劑量，并測量存活。在48小時時，CAR藥效團處理的動物的存活率為83％，相比之下在對照中為50％和僅在氫化可的松組中為56％，表示CAR藥效團處理的動物相對于僅使用氫可皮酮組的存活增加57％(圖14)。

受該結(jié)果的鼓勵，隨后我們在LPS敗血癥小鼠中測試CAR藥效團，其存活提高至80％。CAR藥效團作為敗血癥中的獨立治療劑，通過以20mg/kg(或500μg/小鼠)單獨施用的CAR藥效團通過腹腔注射，發(fā)現(xiàn)在48小時CAR藥效團將LPS小鼠存活率從50％(無治療)提高至80％。這表明CAR藥效團在增強現(xiàn)有的敗血癥療法以及其有潛力作為改善敗血癥存活的獨立試劑的效用。所給予的CAR藥效團劑量，即500μg/20-25g小鼠，相當(dāng)于20-25mg/kg體重的CAR藥效團，支持CAR藥效團本身作為強大的抗炎劑的潛力，誘導(dǎo)發(fā)炎組織中的局部微胞飲作用，其特征在于改變的糖萼，導(dǎo)致發(fā)炎組織能夠以與正常組織更相似的速率吸收細(xì)胞外分子，從而使得組織從炎癥中愈合。

實施例10CAR藥效團靶向敗血癥和損傷的肺、肝和腎內(nèi)皮的恢復(fù)。

LPS注射用于在10周齡雄性C57BL6大鼠(20mg/kg，腹腔)中誘導(dǎo)敗血癥。注射后48小時評價動物存活：PBS 100％(n＝10)，LPS 21.4％(n＝28)，p<0.05(圖15A)。為了確認(rèn)CAR藥效團是否內(nèi)在于內(nèi)皮細(xì)胞，在接受PBS或LPS后12小時用熒光CAR藥效團-FAM(8mg/kg腹腔注射)處理動物。1小時后處死動物、處理肺、肝和腎組織用于組織學(xué)。僅在敗血癥動物肺部血管和肝臟中的門管鞘中觀察到CAR陽性染色(圖15B，箭頭)。在腎臟中，在敗血癥動物的腎小球中集中了較高水平的CAR藥效團(箭頭)。如圖16所示，CAR藥效團與腎臟中的內(nèi)皮特異性標(biāo)記凝集素共定位。在敗血癥動物中，CAR藥效團歸巢于損壞的內(nèi)皮細(xì)胞并與凝集素共定位(箭頭)。

來自對照組，西維來司鈉和CAR藥效團+西維來司鈉治療的小鼠的肺組織的掃描電子顯微照片表明，單獨的西維來司鈉不阻止連續(xù)肺動脈內(nèi)皮的降解(圖17)。當(dāng)CAR藥效團與西維來司鈉共同施用時，內(nèi)皮的降解被阻止，并且其連續(xù)外觀與對照組相似。

來自對照組，西維來司鈉和CAR藥效團+西維來司鈉治療的小鼠的肝臟組織的掃描電子顯微照片表明，單獨的西維來司鈉不能防止敗血癥動物中的篩板的脫離，如對照中所示(圖18)。當(dāng)將CAR藥效團與西維來司鈉共同施用于敗血癥動物時，篩板簇的大小和數(shù)量恢復(fù)幾乎至對照組水平。

來自對照組，西維來司鈉和CAR藥效團+西維來司鈉治療的小鼠的腎組織的掃描電子顯微照片表明，單獨的西維來司鈉不能防止如對照組中所示的總體組織損傷(箭頭)(圖19)，可能是由于嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的活化導(dǎo)致蛋白水解關(guān)鍵細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的降解。當(dāng)CAR藥效團與西維來司鈉共同施用時，西維來司鈉的抗彈性蛋白酶似乎通過CAR藥效團選擇性歸巢到腎中的受損內(nèi)皮糖萼而有效地增強。

在CAR藥效團處理的動物中，急性腎損傷標(biāo)記(KIM-1)表達(dá)降低(圖20)。在腎臟損傷的近端小管中上調(diào)的KIM-1的組織學(xué)染色在CAR藥效團處理的動物中顯著降低。

實施例11CAR藥效團在三陰性乳腺癌模型中的作用。

在雌性無胸腺裸鼠(CRL：NU(NCr)-Foxn1nu，11周齡，Charles River)中，通過向右脅皮下注射5中，通過5×10⁶MDA-MB-231細(xì)胞來誘導(dǎo)三陰性乳腺癌腫瘤。監(jiān)測腫瘤生長直到平均腫瘤大小接近100-150mm³。在腫瘤植入后二十一天(研究的第1天，體重范圍為20.6至27.3克)，將動物分成三組(n＝3)，接受紫杉醇和CAR藥效團(每種3mg/kg)，紫杉醇(3mg/kg)或鹽水載體。每隔一天靜脈內(nèi)給予動物總共15次劑量。使用卡尺每周兩次測量腫瘤體積，在第1-5天每天稱重動物，然后每周兩次的計劃。

CAR藥效團與紫杉醇的聯(lián)合給藥與單獨的紫杉醇相比減少了超過15天時的平均腫瘤體積(圖21)，并且提供了改善癌癥誘導(dǎo)的體重減輕的額外的益處。在32天后，CAR藥效團處理的動物相對于其平均起始體重增加11％，而單獨紫杉醇組增加5％，鹽水載體對照組增加6％(數(shù)據(jù)未顯示)。

實施例12在肺動脈高血壓中的選擇性藥物功效。

用單次腹腔內(nèi)注射劑量的野百合堿(60mg/kg)在雄性Sprague-Dawley大鼠(300-330g，10周齡，Harlan)中誘導(dǎo)肺動脈高壓。在誘導(dǎo)肺動脈高壓之后4周用伊馬替尼(50mg/kg或10mg/kg)或伊馬替尼(50mg/kg或10mg/kg)+CAR藥效團組合(3mg/kg)開始治療，持續(xù)2周，(圖22和23)或每日舌下施用。

CAR藥效團的共同施用增強了伊馬替尼的治療效果，如通過右心臟肥大(圖22和24)和肺動脈肌化(圖25)的改善所測量的。值得注意的是，即使在減少80％的伊馬替尼(10mg/kg)劑量時，將CAR藥效團佐劑加入到治療中產(chǎn)生的效力等于或大于全劑量50mg/kg伊馬替尼單一療法(圖22和25)。長期靜脈內(nèi)施用伊馬替尼似乎對體重具有顯著的負(fù)面影響。CAR藥效團肽的共同給藥似乎緩解了這種副作用。加入CAR藥效團作為伊馬替尼治療的佐劑增加了MCT大鼠的體重，表明動物的整體健康有顯著的改善。

詞匯表

1、DMEM-Dulbecco's Modified Eagle's培養(yǎng)基-含有氨基酸、鹽、葡萄糖和維生素的細(xì)胞培養(yǎng)基。

2、FAM-羧基熒光素?zé)晒馊玖嫌米魇聚檮?/p>

3、DAPI-4'，6-二脒基-2-苯基吲哚，在DNA中強烈結(jié)合A-T富集區(qū)的熒光染料，并廣泛用于熒光顯微鏡。

4、NIH-國家健康研究所。

5、STTR-小型商業(yè)技術(shù)轉(zhuǎn)移-由NIH贊助的一個計劃，旨在增加小型企業(yè)在聯(lián)邦研發(fā)中的參與度，并增加私營部門通過聯(lián)邦研發(fā)開發(fā)的技術(shù)的商業(yè)化。

6、CAR-具有序列CARSKNKDC的九個氨基酸肽；可以是環(huán)狀或線性的。

7、cCAR-具有序列CARSKNKDC的環(huán)狀，九氨基酸肽。

8、tCAR-具有序列CARSKNK的截短的，線性的，7個氨基酸的肽。

9、SEQ ID NO-序列識別號的縮寫，用于識別某些公開的序列。

10、CADD-計算機輔助藥物設(shè)計。

11、CHO-K1-來自親本中國Hampster Ovary細(xì)胞系的亞克隆衍生物；來源于1957年由T.T.Puck的成年中國倉鼠的卵巢活檢。

12、FACS-熒光激活細(xì)胞分選。

13、HS-硫酸乙酰肝素

14、HSA-人血清白蛋白。

15、HSA-tCAR-通過二硫鍵將截短的CAR(tCAR；SEQ ID NO：24)與人血清白蛋白(HSA)的Cys34殘基處的游離巰基共價連接產(chǎn)生的偶聯(lián)化合物。

16、ATIII-抗凝血酶III。

17、AB1-單克隆抗癌抗體B1。

18、CAR-AB1-通過將環(huán)狀CAR(SEQ ID NO：1)與單克隆抗癌抗體B1的Fv片段共價連接產(chǎn)生的偶聯(lián)的化合物。

19、CNS-中樞神經(jīng)系統(tǒng)。

20、Cyclic CAR Rifa-環(huán)狀CAR-利福布汀肽模擬物。

21、Cyclic CAR-Rapa-環(huán)狀CAR-雷帕霉素肽模擬物。

22、Cyclic CAR-Voclo-環(huán)狀CAR-伏環(huán)孢菌素(Voclosporin)肽模擬物。

23、Linear CAR-Rifa-線性CAR-利福布汀肽模擬物。

24、Linear CAR-Rapa-線性CAR-雷帕霉素肽模擬物。

25、LinearCAR-Voclo-線性CAR-伏環(huán)孢菌素(Voclosporin)肽模擬物。

26、PAH-肺動脈高壓。

27、DNA-脫氧核糖核酸。

28、LPS-脂多糖內(nèi)毒素。

29、MCT-野百合堿。

30、NM-核磁共振。

31、PBS-磷酸鹽緩沖鹽水。

32、Arg-精氨酸。

33、His-組氨酸。

34、Lys-賴氨酸。

35、Asp-天冬氨酸。

36、Glu-谷氨酸。

37、Ser-絲氨酸。

38、Thr-蘇氨酸。

39、Gln-谷氨酰胺。

40、Cys-半胱氨酸。

41、Gly-甘氨酸。

42、Pro-脯氨酸。

43、Ala-丙氨酸。

44、Val-纈氨酸。

45、Ile-異亮氨酸。

46、Leu-亮氨酸。

47、Met-甲硫氨酸。

48、Phe-苯丙氨酸。

49、Tyr-酪氨酸。

50、Trp-色氨酸。

51、LogD-分配系數(shù)(P)的對數(shù)，其是化合物在親脂性有機相和極性水相之間分配的趨勢的量度。

SEQUENCE LISTING

<110> 血管生物科學(xué)；桑福德伯納姆普利柏斯藥物探索研究所；大衛(wèi)·曼；埃爾基·魯奧斯拉蒂；小松政信

<120> 含有對患病組織具有選擇性的藥效團的組合物及其制備方法

<130> P1710116WP

<150> US 62/034,046

<151> 2014-08-06

<150> US 62/161,121

<151> 2015-05-13

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

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<223> X is equal to D-amino acid N

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<223> X is equal to HSA, human serum albumin

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Xaa Cys Ala Arg Ser Lys Asn Lys

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<223> cyclic peptide

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> X is equal to Fv fragment of B1 antibody

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Cys Ala Arg Ser Lys Asn Lys Asp Lys Xaa

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Cys Ala Lys Ser Arg Asn His Asp Cys

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<220>

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Cys Ala Arg Ser Lys Asn Lys Leu Cys

1 5