本公開(kāi)涉及用于處理受試者中的癌細(xì)胞的組合物及其方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本公開(kāi)的一個(gè)方面是用于處理在具有免疫系統(tǒng)的受試者中的癌細(xì)胞的組合物。組合物包括具有至少一種突變的亞塔痘病毒(Yatapoxvirus)屬中的病毒。至少一種突變通過(guò)該病毒導(dǎo)致TNF結(jié)合蛋白表達(dá)抑制。

本公開(kāi)的另一方面是用于處理在具有免疫系統(tǒng)的受試者中的癌細(xì)胞的組合物，包括亞塔痘病毒屬中的病毒，其中病毒具有至少一種突變，所述至少一種突變導(dǎo)致胸苷激酶(“TK”)的表達(dá)抑制。

在本公開(kāi)的又一方面，用于處理在具有免疫系統(tǒng)的受試者中的癌細(xì)胞的組合物包括編碼表達(dá)細(xì)菌鞭毛蛋白的轉(zhuǎn)基因的痘病毒。

在本公開(kāi)的再一方面，一種用于治療具有癌細(xì)胞的受試者的方法包括將組合物給藥至受試者，其中組合物包括具有至少一種突變的亞塔痘病毒屬中的病毒，至少一種突變通過(guò)病毒導(dǎo)致TNF結(jié)合蛋白的表達(dá)抑制。

根據(jù)本公開(kāi)的另一方面，通過(guò)使所述病毒突變來(lái)修飾亞塔痘病毒屬的病毒將至少一種基因遞送至受試者中的癌細(xì)胞以抑制具有能夠結(jié)合MHC-1輕鏈的結(jié)構(gòu)的TNF結(jié)合蛋白的表達(dá)。病毒也通過(guò)編碼病毒中的至少一種基因而被修飾，其中病毒中所編碼的至少一種基因?qū)е铝税┘?xì)胞的凋亡增加或激活了受試者中的免疫應(yīng)答。將所修飾的病毒給藥至受試者。

本文所述的用于治療癌性腫瘤的藥物組合物和方法允許了具有嚴(yán)重感染或副作用的有限風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)癌細(xì)胞潛在有效處理，這些嚴(yán)重感染或副作用可以在傳統(tǒng)治療方法中經(jīng)歷，并且在一些情況下藥物組合物和方法可以與傳統(tǒng)治療方法結(jié)合使用。與未修飾的痘病毒相比，本文所述的經(jīng)修飾的痘病毒已經(jīng)表現(xiàn)出表明增強(qiáng)的腫瘤選擇性和增強(qiáng)的腫瘤致死性，并且預(yù)期保持優(yōu)選的OV特性，諸如在所感染的受試者中僅引起輕度和自限發(fā)熱性疾病(self-limiting febrile illness)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員在研究以下說(shuō)明書(shū)、權(quán)利要求書(shū)和附圖時(shí)將進(jìn)一步理解和領(lǐng)會(huì)本策略(device)的這些和其他特征、優(yōu)點(diǎn)和目的。

附圖說(shuō)明

圖1是說(shuō)明如通過(guò)p2KO方法改變?yōu)椴迦氡磉_(dá)的轉(zhuǎn)基因和熒光報(bào)告物的重組塔那痘病毒(tanapoxvirus)(TPV)的一種實(shí)施方式的示意圖。

圖2A是說(shuō)明用HCT 116細(xì)胞異種移植的并用僅載體對(duì)照溶液處理的無(wú)胸腺裸小鼠中平均腫瘤體積的圖；

圖2B是說(shuō)明與僅載體對(duì)照溶液相比，用HCT 116細(xì)胞異種移植的并用重組TPV(TPV/egfp)的一種實(shí)施方式處理的無(wú)胸腺裸小鼠中平均腫瘤體積的圖；

圖2C是說(shuō)明與僅載體對(duì)照溶液相比，用HCT 116細(xì)胞異種移植的并用重組TPV(TPV-p2KO/Δ66R/mMCP-1)的一種實(shí)施方式處理的無(wú)胸腺裸小鼠中平均腫瘤體積的圖；

圖2D是說(shuō)明與僅載體對(duì)照溶液相比，用HCT 116細(xì)胞異種移植的并用重組TPV(TPV-p2KO/Δ66R/mGM-CSF)的一種實(shí)施方式處理的無(wú)胸腺裸小鼠中平均腫瘤體積的圖；

圖2E是說(shuō)明與僅載體對(duì)照溶液相比，用HCT 116細(xì)胞異種移植的并用重組TPV(TPV-p2KO/Δ66R/fliC)的一種實(shí)施方式處理的無(wú)胸腺裸小鼠中平均腫瘤體積的圖；

圖2F是說(shuō)明與僅載體對(duì)照溶液相比，用HCT 116細(xì)胞異種移植的并用重組TPV(TPV-p2KO/Δ66R)的一種實(shí)施方式處理的無(wú)胸腺裸小鼠中平均腫瘤體積的圖；

圖2G是說(shuō)明與僅載體對(duì)照溶液相比，用HCT 116細(xì)胞異種移植的并用重組TPV(TPV-p2KO/Δ2L)的一種實(shí)施方式處理的無(wú)胸腺裸小鼠中平均腫瘤體積的圖；

圖2H是說(shuō)明與僅載體對(duì)照溶液相比，用HCT 116細(xì)胞異種移植的并用重組TPV(TPV-p2KO/Δ2L/Δ66R/fliC)的一種實(shí)施方式處理的無(wú)胸腺裸小鼠中平均腫瘤體積的圖；以及

圖3包括通過(guò)已被改變?yōu)楸磉_(dá)熒光報(bào)告物的重組TPV的一種實(shí)施方式的感染而產(chǎn)生的在2天、4天和6天時(shí)病毒斑塊(viral plaque)的一種實(shí)施方式的視圖。

發(fā)明內(nèi)容

出于本文描述的目的，術(shù)語(yǔ)“上”、“下”、“右”、“左”、“后”、“前”、“垂直”、“水平”及它們的派生詞將涉及如圖1所取向的組合物。然而，應(yīng)當(dāng)理解，組合物可采取多種替代的取向，并且方法可以包括多種步驟順序，除非明確地相反指出。還應(yīng)當(dāng)理解，在附圖中示出的并在下面的說(shuō)明書(shū)中描述的具體裝置和過(guò)程僅僅是所附權(quán)利要求中限定的發(fā)明構(gòu)思的示例性實(shí)施方式。因此，與本文公開(kāi)的實(shí)施方式相關(guān)的具體尺寸和其他物理特性不被認(rèn)為是限制性的，除非權(quán)利要求另有明確說(shuō)明。

盡管已經(jīng)在一些諸如VACV的病毒的溶瘤變體(oncolytic variant)中顯示出對(duì)癌細(xì)胞和/或轉(zhuǎn)化細(xì)胞的感染的一些偏好(preference)，但是野生型痘病毒諸如亞塔痘病毒(Yatapoxvirus)屬中的那些病毒(包括但不限于塔那痘病毒(“TPV”))通常不被認(rèn)為具有高度的天然腫瘤特異性。在沒(méi)有顯著的天然腫瘤特異性的病毒中，基因工程已經(jīng)被使用來(lái)增加癌細(xì)胞選擇性。

盡管它們不一定具有高度的腫瘤特異性，但痘病毒，且更特別地是亞塔痘病毒屬中的痘病毒，具有幾個(gè)固有的性質(zhì)，這些性質(zhì)使得它們非常適合用作OV的修飾。痘病毒具有能夠容納大量添加的遺傳物質(zhì)的病毒基因組，并且具有進(jìn)攻能力和防御能力的內(nèi)置的陣列。痘病毒基因組編碼多種免疫調(diào)節(jié)蛋白，多種免疫調(diào)節(jié)蛋白專(zhuān)用于隱藏感染相關(guān)的細(xì)胞表面表位免受宿主的免疫監(jiān)視，一些宿主免疫和炎癥反應(yīng)的抑制和逃避，以及借助于模擬宿主細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的病毒編碼的肽的來(lái)自細(xì)胞外環(huán)境的信號(hào)的中斷。痘病毒還產(chǎn)生兩種不同類(lèi)型的子代病毒粒子(成熟病毒粒子(MV)形式和包膜病毒粒子(EV)形式)。病毒的MV形式被封閉(包裹)在單脂質(zhì)雙層中，并且僅通過(guò)細(xì)胞溶解從宿主細(xì)胞釋放。在其已經(jīng)獲得了可能來(lái)自宿主細(xì)胞反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)的第二外部包膜之后，EV形式從宿主細(xì)胞活躍地被輸出，并且被稱(chēng)為包裹病毒粒子(wrapped virion)(WV)，直至其從已感染的細(xì)胞中被輸出，在此時(shí)間之后它被稱(chēng)為EV形式。痘病毒EV形式是該病毒的特定(specialized)形式，其負(fù)責(zé)通過(guò)經(jīng)由血流和淋巴網(wǎng)絡(luò)的通行(traffick)將痘病毒擴(kuò)散到宿主內(nèi)的遠(yuǎn)端位點(diǎn)。EV形式非常適合于該任務(wù)，因?yàn)槠鋬H具有6個(gè)暴露于細(xì)胞外環(huán)境的跨膜蛋白，而相對(duì)于MV形式約為20個(gè)。更少的暴露的表位意味著該EV形式比MV形式更能夠逃避中和免疫。

另外，TPV(亞塔痘病毒(Yatapoxvirus)屬的成員和野生痘病毒)具有有利于發(fā)展OV的其他特征，使其成為用于發(fā)展OV的亞塔痘病毒屬的優(yōu)選成員。感染有TPV的人僅經(jīng)歷輕度的和自限性的發(fā)熱性疾病，可能是因?yàn)門(mén)PV感染通常局限于身體的外周區(qū)域。除了赤道非洲地區(qū)(在那里它是地方性的)，人類(lèi)對(duì)TPV是免疫原性的。此外，TPV從未被觀察到從人到人傳播，在OV中是非常期望的安全特征。

本文公開(kāi)了痘病毒的基因工程化的樣品，包括亞塔痘病毒(Yatapoxvirus)屬的樣品，用作OV，以被摻入組合物中來(lái)處理癌細(xì)胞，以及以被用于處理癌細(xì)胞的方法中。本文還描述了若干優(yōu)選的實(shí)施方式，包括摻入重組TPV的若干優(yōu)選實(shí)施方式。

總之，如下文進(jìn)一步描述的，本公開(kāi)的一個(gè)方面是用于處理在具有免疫系統(tǒng)的受試者中的癌細(xì)胞的組合物。在一個(gè)方面，組合物包括具有至少一種突變的亞塔痘病毒屬中的病毒。至少一種突變通過(guò)病毒導(dǎo)致了TNF結(jié)合蛋白的表達(dá)抑制。本公開(kāi)的另一方面是一種用于處理在具有免疫系統(tǒng)的受試者中的癌細(xì)胞的組合物，包括亞塔痘病毒(Yatapoxvirus)屬中的病毒，其中病毒具有至少一種導(dǎo)致胸苷激酶(“TK”)的表達(dá)抑制的突變。在另一方面，組合物包括一種編碼表達(dá)細(xì)菌鞭毛蛋白的轉(zhuǎn)基因的痘病毒。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“受試者”包括人和動(dòng)物受試者，并且優(yōu)選為哺乳動(dòng)物受試者。

也如下文更詳細(xì)描述的，治療具有癌細(xì)胞的受試者的方法包括將一種組合物給藥至受試者，其中組合物是如本文所述的。例如，在一種實(shí)施方式中，組合物包括具有至少一種突變的亞塔痘病毒(Yatapoxvirus)屬中的一種病毒，該突變通過(guò)病毒導(dǎo)致了TNF結(jié)合蛋白的表達(dá)抑制。在另一實(shí)施方式中，組合物包括亞塔痘病毒(Yatapoxvirus)屬中的一種病毒，其中病毒具有至少一種導(dǎo)致TK的表達(dá)抑制的突變。在又一實(shí)施方式中，組合物包括編碼表達(dá)細(xì)菌鞭毛蛋白的轉(zhuǎn)基因的一種痘病毒。任何的或所有的這些突變可以單獨(dú)地存在或以任何組合存在于組合物中。另外，組合物可以以靶向方式遞送至一組癌細(xì)胞，或可以全身地(系統(tǒng)地，systemically)遞送至受試者。

根據(jù)本公開(kāi)的另一方面，如下文更詳細(xì)描述的，通過(guò)修飾亞塔痘病毒(Yatapoxvirus)屬的一種病毒(該過(guò)程通過(guò)使病毒突變)將至少一種基因遞送至受試者中的癌細(xì)胞以抑制具有能夠結(jié)合MHC-1輕鏈的結(jié)構(gòu)的TNF結(jié)合蛋白的表達(dá)。病毒也通過(guò)編碼病毒中的至少一種基因而被修飾，其中病毒中編碼的至少一種基因?qū)е铝嗽摪┘?xì)胞的增加凋亡或激活了受試者中的免疫應(yīng)答。將所修飾的病毒被給藥至受試者。

在某些實(shí)施方式中，痘病毒被遺傳修飾(genetically modified)以抑制具有TNF結(jié)合活性的宿主范圍因子的表達(dá)，本文也稱(chēng)為T(mén)NF結(jié)合蛋白。被抑制的TNF結(jié)合蛋白在結(jié)構(gòu)上與MHC-1重鏈蛋白相似，并且該所編碼的TNF結(jié)合蛋白可以與MHC-1輕鏈相互作用。在TPV中，TNF結(jié)合蛋白在2L基因中被編碼。重組TPV(其中2L基因已經(jīng)被切除或以其他方式突變以抑制TNF結(jié)合蛋白的表達(dá))在本文中有時(shí)被稱(chēng)為“2L缺失的”或“Δ2L”。在正常的痘病毒感染中，所分泌的TNF結(jié)合蛋白通過(guò)結(jié)合于存在的TNF并有效地減少存在的TNF的量以與所感染的細(xì)胞相互作用來(lái)減弱宿主炎癥和抗病毒免疫應(yīng)答。盡管對(duì)于痘病毒這是期望的結(jié)果，但當(dāng)痘病毒用作OV時(shí)，這對(duì)于增加而不是減少由所治療的腫瘤經(jīng)歷的炎癥量可能有利的。在用基于重組TPV作為痘病毒的OV來(lái)治療其腫瘤的人類(lèi)受試者中，重組TPV中2L基因的切除可以導(dǎo)致處于腫瘤位點(diǎn)的TNF濃度的有效增加(與用攜帶2L的TPV所感染的腫瘤相比)。TNF的增加水平可最終起作用以增加腫瘤清除率。因?yàn)?L基因先前已顯示與人TNF結(jié)合而不與小鼠TNF結(jié)合，所以本文所述的一些重組TPV中的2L基因的切除預(yù)期在小鼠實(shí)驗(yàn)期間不是腫瘤清除的重要因素，但是預(yù)期在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物和人類(lèi)中的腫瘤清除中是更重要的因素。在異種移植的無(wú)胸腺裸小鼠中使用的重組TPV的特定實(shí)例中進(jìn)行2L基因的切除，其中異種移植物由人類(lèi)癌細(xì)胞組成，正如本文所述的，因?yàn)樾∈鬁y(cè)試對(duì)于在更相關(guān)的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的癌癥病毒療法(cancer virotherapy)的模型中進(jìn)一步測(cè)試基于痘病毒的OV是重要的步驟。

在某些實(shí)施方式中，痘病毒的腫瘤選擇性是通過(guò)修飾該痘病毒以抑制胸苷激酶(TK)的表達(dá)來(lái)增加的。在TPV中，TK編碼基因被稱(chēng)為66R。其中66R基因已被切除或以其他方式突變以抑制TK表達(dá)的重組TPV在本文中有時(shí)被稱(chēng)為“66R缺失的”或“Δ66R”。由于細(xì)胞TK1在癌細(xì)胞中的作用，癌細(xì)胞中的TK活性是組成性高的。這與正常的細(xì)胞相反，其中TK活性水平在細(xì)胞周期的S期期間達(dá)到峰值，并且在其他時(shí)間幾乎檢測(cè)不到。細(xì)胞TK1催化核苷酸合成中的一個(gè)步驟(胸苷向胸苷單磷酸的轉(zhuǎn)化)。由于這個(gè)原因，癌細(xì)胞在整個(gè)細(xì)胞周期中表達(dá)TK1，并因此傾向于具有大量在細(xì)胞周期的所有階段可用的單磷酸胸苷(thymidine monophosphate)的細(xì)胞質(zhì)庫(kù)。通過(guò)抑制該TK編碼基因，特別是在亞塔痘病毒(Yatapoxvirus)屬中的痘病毒中，相比如果TK編碼基因保持完整，痘病毒具有更大的癌細(xì)胞選擇性。在本文所述的異種移植的無(wú)胸腺裸鼠中使用的重組TPV的一些具體實(shí)例中進(jìn)行66R基因的切除，盡管小鼠通常不是TPV的動(dòng)物宿主。66R基因在這種環(huán)境中的切除表明66R基因的切除不會(huì)在受納細(xì)胞(諸如人癌性腫瘤細(xì)胞)中導(dǎo)致非復(fù)制型TPV。

此外，痘病毒的腫瘤致死性可以通過(guò)用轉(zhuǎn)基因編碼該痘病毒來(lái)增加，以增加癌細(xì)胞的凋亡或以激活受試者的免疫系統(tǒng)?？捎糜诰幋a痘病毒的轉(zhuǎn)基因的實(shí)例包括但不限于表達(dá)細(xì)胞因子、趨化因子、抗原呈遞多肽或細(xì)菌抗原的基因。如本文所用的，細(xì)胞因子是指具有免疫細(xì)胞或調(diào)節(jié)作用(諸如刺激免疫細(xì)胞、促進(jìn)免疫細(xì)胞生長(zhǎng)或?qū)⒚庖呒?xì)胞導(dǎo)向特定位點(diǎn))的系統(tǒng)的蛋白質(zhì)或多肽。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所用的痘病毒是具有粒細(xì)胞-單核細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細(xì)胞趨化蛋白1(CCL2，也稱(chēng)為MCP-1和MCF-1)或細(xì)菌鞭毛蛋白(FliC，腸道沙門(mén)氏菌中fliC基因的產(chǎn)物)的重組TPV。當(dāng)使用用于小鼠的重組TPV進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，這些轉(zhuǎn)基因的小鼠(m)版本(version)被使用，其中在重組TPV(即，mGM-CSF、mCCL2、mMCP1、mMCF-1)中相關(guān)。使用這些轉(zhuǎn)基因的適當(dāng)?shù)幕蛴行У陌姹?型)用于受試者是優(yōu)選的，其中在受試者上將要進(jìn)行測(cè)試或治療。

聚合鞭毛蛋白是根據(jù)本公開(kāi)使用的細(xì)菌鞭毛的主要成分。用于本文所述的特定實(shí)驗(yàn)的鞭毛蛋白是沙門(mén)氏菌腸道血清型(serovar)鼠傷寒沙門(mén)氏菌基因fliC的產(chǎn)物。FliC和其他細(xì)菌鞭毛蛋白是toll樣受體5(TLR5)的同源配體，并且是通過(guò)MyD88依賴(lài)性的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(signaling)和最終轉(zhuǎn)錄因子NFκB的激活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中先天免疫應(yīng)答的強(qiáng)激活劑。鞭毛蛋白是有力的和多效的毒力因子，其在細(xì)菌發(fā)病機(jī)理中具有其他的重要作用。

除了上述痘病毒實(shí)施方式中基因組的修飾之外，可選地將熒光報(bào)告轉(zhuǎn)基因(fluorescent reporter transgene)插入痘病毒的基因組中。通過(guò)包含熒光報(bào)告轉(zhuǎn)基因，大大地促進(jìn)了培養(yǎng)的細(xì)胞中的病毒感染的可視化，從而促進(jìn)使用本文所述的痘病毒變體的研究。優(yōu)選的熒光報(bào)告轉(zhuǎn)基因包括報(bào)告子mCherry(激發(fā)/發(fā)射587nm/610nm)和增強(qiáng)的綠色熒光蛋白(GFP，激發(fā)/發(fā)射475nm/509nm)。

痘病毒的優(yōu)選的實(shí)施方式包括病毒(優(yōu)選是亞塔痘病毒(Yatapoxvirus)屬的)，其具有任何的或所有的上述突變或插入，并且突變和插入優(yōu)選地使用p2KO載體方法進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，重組TPV(亞塔痘病毒(Yatapoxvirus)屬的成員)通過(guò)本文所用的p2KO方法被改變，其示意圖示于圖1中。如圖所示，兩種源自牛痘苗病毒(VACV)的早期/晚期合成啟動(dòng)子被用于驅(qū)動(dòng)所需表達(dá)的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)以編碼病毒(例如，mGM-CSF、mCCL2、mMCP1、mMCF-1、fliC)和可選的熒光報(bào)告轉(zhuǎn)基因。圖1中描述的p2KO載體方法的實(shí)施方式包括將p2KO表達(dá)盒(cassette)(包括左側(cè)翼和右側(cè)翼，包含所表達(dá)的轉(zhuǎn)基因或熒光報(bào)道轉(zhuǎn)基因的至少一個(gè)插入開(kāi)放閱讀框(ORF)和至少一個(gè)啟動(dòng)子)通過(guò)在轉(zhuǎn)染/感染過(guò)程期間的同源重組雙交換事件(double-crossover event)轉(zhuǎn)移至TPV的病毒基因組，如下文更詳細(xì)描述的。以這種方式，通過(guò)使用病毒基因組側(cè)翼序列，p2KO表達(dá)盒被引導(dǎo)至TPV的病毒基因組中的特定點(diǎn)，導(dǎo)致所需的一種或多種基因的靶向切除，伴隨重組TPV中所需表達(dá)的轉(zhuǎn)基因和可選的熒光報(bào)告轉(zhuǎn)基因的同時(shí)表達(dá)。

在如圖1所示的TPV p2KO表達(dá)盒的實(shí)施方式中，多個(gè)痘病毒早期/晚期合成啟動(dòng)子允許多種轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。p2KO表達(dá)盒通過(guò)使用來(lái)源于靶基因的病毒基因組側(cè)翼序列來(lái)引導(dǎo)插入病毒基因組中的特定點(diǎn)，導(dǎo)致所需一種或多種基因的靶向切除，伴隨熒光報(bào)告轉(zhuǎn)基因和該所表達(dá)的轉(zhuǎn)基因的同時(shí)表達(dá)，以裝備病毒。在圖1所示的實(shí)施方式中，顯示了熒光報(bào)告轉(zhuǎn)基因和所表達(dá)的轉(zhuǎn)基因。在可替換的實(shí)施方式中，熒光報(bào)告轉(zhuǎn)基因或該所表達(dá)的轉(zhuǎn)基因中的任一者可以存在于p2KO表達(dá)盒中用于插入病毒基因組中。左側(cè)翼和右側(cè)翼被獨(dú)特的限制性位點(diǎn)(限制性內(nèi)切位點(diǎn)，restriction site)對(duì)限定。將側(cè)翼區(qū)連接到5'(左)側(cè)翼上的Sac I限制性位點(diǎn)和Not I限制性位點(diǎn)之間以及3'(右)側(cè)翼上的EcoRI限制性位點(diǎn)和Hind III限制性位點(diǎn)之間的p2KO載體中。待表達(dá)的一種或多種基因(熒光報(bào)告物和/或所表達(dá)的轉(zhuǎn)基因)被獨(dú)特的5'-BamH I限制性位點(diǎn)和3'-Xma I限制性位點(diǎn)限定。這些允許了由適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c(diǎn)所限定的PCR擴(kuò)增子的簡(jiǎn)單的和定向的連接。

本文所述實(shí)施例的p2KO方法中使用的相關(guān)引物示于下面表1中。在每種情況下，所插入的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)用下劃線表示。在適當(dāng)?shù)那闆r下，在正向引物中，起始密碼子用帶灰色陰影的粗體表示，以及在反向引物中，終止密碼子用帶灰色陰影的粗體表示。本文所述實(shí)施例中使用的左側(cè)翼引物和右側(cè)翼引物不包括起始密碼子或終止密碼子。

表1：用于制備p2KO切除/插入載體的引物

用于所表達(dá)的轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)的p2KO方法的各種實(shí)施方式中的ORF包括mCCL2轉(zhuǎn)基因、mGM-CSF轉(zhuǎn)基因和fliC轉(zhuǎn)基因。下面引用的實(shí)施例中使用的mCCL2轉(zhuǎn)基因是使用作為攜帶ORF的質(zhì)粒所購(gòu)買(mǎi)的(可從Sino Biological，Incorporated獲得)mCCL2cDNA克隆ORF而產(chǎn)生的。下面引用的實(shí)施例中使用的mGM-CSF轉(zhuǎn)基因是使用由Grant McFadden博士提供的mGM-CSF的cDNA克隆ORF而產(chǎn)生的。mCCL2、mGM-CSF和fliC ORF通過(guò)PCR從它們的載體擴(kuò)增，并在產(chǎn)物擴(kuò)增子的5'-和3'-末端上分別給予BamHI限制性序列和XmaI限制性序列。mCCL2、mGM-CSF和fliC ORF被連接到p2KO切除/插入載體中。

如下表2中所示的，以下縮寫(xiě)在本文中用于描述使用p2KO方法產(chǎn)生的重組TPV的各種實(shí)施方式。雖然本文描述了p2KO切除/插入方法，但是應(yīng)當(dāng)理解，任何已知的用于從基因組切除基因或?qū)⑥D(zhuǎn)基因插入基因組的方法可用于形成本文所述的重組TPV。

表2：重組TPV縮寫(xiě)

為了選擇用于在小鼠宿主中測(cè)試重組TPV的合適的細(xì)胞系，針對(duì)一組人結(jié)直腸癌細(xì)胞系測(cè)試最小改變的重組TPV/egfp，以選擇允許最佳病毒復(fù)制的細(xì)胞系，從而使直接病毒腫瘤細(xì)胞裂解的效果最大化。用于TPV/egfp復(fù)制所測(cè)試的hCRC細(xì)胞系包括HCT 116、COLO205、SW1463和WiDr。腫瘤細(xì)胞的病毒裂解對(duì)于在一些情況下的腫瘤清除是重要的，但是病毒細(xì)胞溶解僅是影響腫瘤存活和清除的許多因素之一，并且免疫細(xì)胞募集(聚集，recruitment)也可以起作用。雖然HCT 116比對(duì)照細(xì)胞系OMK產(chǎn)生了更少的子代病毒粒子，但HCT 116是所測(cè)試的hCRC細(xì)胞系中產(chǎn)量最高的。此外，在用HCT 116誘導(dǎo)的腫瘤中已經(jīng)表征了許多OV。由于這些原因，HCT 116被用于實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步表征重組TPV在體內(nèi)的溶瘤潛力。

為了評(píng)價(jià)重組TPV的各種實(shí)施方式，通過(guò)將5×10⁶個(gè)HCT 116細(xì)胞皮下注射到無(wú)胸腺裸小鼠的背部表面上，用HCT 116細(xì)胞系在無(wú)胸腺裸小鼠中誘導(dǎo)腫瘤。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到75mm³時(shí)，小鼠被隨機(jī)分為對(duì)照組或?qū)嶒?yàn)組，每組5只小鼠。在第0天(達(dá)到75mm³的腫瘤體積后)給藥僅含有100μL的載體(a組)或重組TPV(b-h組)的單次注射，并且之后以三天的間隔來(lái)測(cè)量腫瘤體積。使用下式計(jì)算平均腫瘤體積：

平均腫瘤體積＝(長(zhǎng)度)×(寬度)×(高度)×π/6 (1)

在用重組TPV治療期間，HCT 116誘導(dǎo)的腫瘤異種移植物的體積沒(méi)有增加到預(yù)期水平。然而，在用重組TPV治療的小鼠中發(fā)生了多發(fā)性繼發(fā)性腫瘤。此外，在一些體外研究中，包括HCT 116原位異種移植模型，HCT 116細(xì)胞已經(jīng)被報(bào)道為是高度運(yùn)動(dòng)性(motile)和侵入性的(invasive)。

圖2A示出了在用5×10⁶個(gè)HCT 116細(xì)胞異種移植并且隨后用僅載體對(duì)照(空白對(duì)照)溶液處理的無(wú)胸腺裸小鼠中，在36天(從腫瘤質(zhì)量超過(guò)75mm³時(shí)開(kāi)始)的時(shí)間跨度期間所觀察到的平均腫瘤發(fā)展。以空心圓圈顯示的平均腫瘤體積增加直到約15天，在該時(shí)間點(diǎn)其體積穩(wěn)定在約100mm³持續(xù)達(dá)剩余的時(shí)間跨度。平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差以棒(bar)(+/-1SEM)顯示。腫瘤體積的穩(wěn)定與一些先前的研究形成對(duì)比，這些研究已經(jīng)表明，當(dāng)在初始異種移植物中使用相同或相似數(shù)目的HCT 116細(xì)胞時(shí)，裸鼠中未處理的HCT 116腫瘤的體積在相同的間隔時(shí)間期間逐漸增加。例如，已經(jīng)報(bào)道HCT 116誘導(dǎo)的腫瘤具有約8天的倍增時(shí)間。此外，檢測(cè)VACV作為針對(duì)裸鼠中HCT 116異種移植物的OV治療劑的最近研究顯示，在類(lèi)似于圖2A中所示的時(shí)間跨度的時(shí)間間隔中，HCT 116腫瘤生長(zhǎng)高達(dá)4000mm³。

在圖2B中所示的實(shí)施方式中，黑色實(shí)心方塊示出了用TPV/egfp處理的B組中小鼠的平均腫瘤體積和對(duì)照組A中小鼠的平均腫瘤體積。棒示出了對(duì)于對(duì)照組A中的腫瘤體積和B組中的腫瘤體積的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(+/-1SEM)。

在圖2C中所示的實(shí)施方式中，黑色實(shí)心方塊示出了用TPV-p2KO/Δ66R/mMCP-1處理的C組中小鼠的平均腫瘤體積和對(duì)照組Aa中小鼠的平均腫瘤體積。棒示出了對(duì)于對(duì)照組A中的腫瘤體積和C組中的腫瘤體積的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(+/-1SEM)。

在圖2D中所示的實(shí)施方式中，黑色實(shí)心方塊示出了用TPV-p2KO/Δ66R/mGM-CSF處理的D組中的小鼠的平均腫瘤體積和對(duì)照組A中的小鼠的平均腫瘤體積。棒示出了對(duì)于對(duì)照組A中的腫瘤體積和D組中的腫瘤體積的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(+/-1SEM)。

在圖2E中所示的實(shí)施方式中，黑色實(shí)心方塊示出了用TPV-p2KO/Δ66R/fliC處理的E組中的小鼠的平均腫瘤體積和對(duì)照組A中的小鼠的平均腫瘤體積。棒示出了對(duì)于對(duì)照組A中的腫瘤體積和E組中的腫瘤體積的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(+/-1SEM)。

在圖2F中所示的實(shí)施方式中，黑色實(shí)心方塊示出了用TPV-p2KO/Δ66R處理的F組中小鼠的平均腫瘤體積和對(duì)照組A中小鼠的平均腫瘤體積。棒示出了對(duì)于對(duì)照組A中的腫瘤體積和F組中的腫瘤體積的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(+/-1SEM)。

在圖2G中所示的實(shí)施方式中，黑色實(shí)心方塊示出了用TPV-p2KO/Δ2L處理的G組中的小鼠的平均腫瘤體積和對(duì)照組A中的小鼠的平均腫瘤體積。棒示出了對(duì)于對(duì)照組A中的腫瘤體積和G組中的腫瘤體積的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(+/-1SEM)。

在圖2H中所示的實(shí)施方式中，黑色實(shí)心方塊示出了用TPV-p2KO/Δ2L/Δ66R/fliC處理的H組中的小鼠的平均腫瘤體積和對(duì)照組H中的小鼠的平均腫瘤體積。棒示出了對(duì)于對(duì)照組A中的腫瘤體積和H組中的腫瘤體積的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差(+/-1SEM)。

用于本文的重組TPV的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式是具有添加至雙敲除背景(Δ66R和Δ2L)的fliC轉(zhuǎn)基因的重組TPV。我們的結(jié)果證明表達(dá)了fliC轉(zhuǎn)基因的刪除了2L和66R的重組TPV對(duì)HCT 116腫瘤異種移植物產(chǎn)生了強(qiáng)大和持久的治療效果。用于本文的重組TPV的另一優(yōu)選實(shí)施方式是具有添加到單敲除病毒(Δ66R)的filC轉(zhuǎn)基因的重組TPV。兩種單敲除重組TPV的實(shí)施方式(TPV-p2KO/Δ66R和TPV-p2KO/Δ2L)在至少兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)都顯示了腫瘤體積的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著減小，并且在每種情況下所觀察到的腫瘤體積的顯著減小在時(shí)間上遠(yuǎn)離病毒治療接種的時(shí)刻。兩種單敲除重組TPV都似乎趨向于在這些后來(lái)的時(shí)間點(diǎn)的效果。事實(shí)上，除了TPV/egfp病毒之外，所測(cè)試的重組TPV的所有實(shí)施方式都似乎產(chǎn)生一定程度的腫瘤消融(ablation)，同時(shí)優(yōu)選上述重組TPV。由于T細(xì)胞依賴(lài)性適應(yīng)性免疫應(yīng)答在裸鼠中嚴(yán)重受損，本文所述的實(shí)施例證明先天免疫應(yīng)答潛在地能夠降低受試者中的腫瘤負(fù)荷，因此具有先天免疫應(yīng)答激活劑的重組TPV被預(yù)期在具有免疫缺陷綜合征的受試者中是有用的。因此，我們得出結(jié)論，具有先天免疫應(yīng)答激活劑的OV在具有免疫缺陷綜合征的個(gè)體中也將是有用的。

作為高度保守的病原體相關(guān)的分子模式(PAMP)，鞭毛蛋白是參與胞質(zhì)免疫監(jiān)視的檢測(cè)分子的靶點(diǎn)。例如，通過(guò)Nod樣受體NCLR4(也稱(chēng)為Ipaf)的鞭毛蛋白的檢測(cè)觸發(fā)了Ipaf炎癥小體的活化，其依次激活了半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)和巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β(IL-1β)的成熟。盡管在OV感染過(guò)程中所產(chǎn)生的FliC的預(yù)期量被預(yù)期是小的，但在小鼠中，通過(guò)尾靜脈注射所給藥的甚至微量的細(xì)菌鞭毛蛋白(≤5μg/動(dòng)物)引起了細(xì)胞因子TNF、IL-1β、IL-6和趨化因子MIP-2(IL-8)的全身的(即，在器官和血漿二者中)升高以及MEK細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(signaling pathway)的變化。因此FliC在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的作用部分地不依賴(lài)于基于TLR的PAMP檢測(cè)器，并且尚未完全闡明。然而，基于本文所述的結(jié)果，通過(guò)表達(dá)FliC的重組TPV的先天免疫應(yīng)答的激活似乎有助于具有完整先天免疫應(yīng)答的裸鼠中腫瘤質(zhì)量的減少。

非限制性實(shí)施方式的列表

實(shí)施方式A是一種用于處理在具有免疫系統(tǒng)的受試者中的癌細(xì)胞的組合物，包括：具有至少一種突變的亞塔痘病毒(Yatapoxvirus)屬中的病毒，其中至少一種突變通過(guò)病毒導(dǎo)致了TNF結(jié)合蛋白的表達(dá)抑制。

實(shí)施方式A的組合物，其中抑制TNF結(jié)合蛋白的表達(dá)的病毒具有能夠結(jié)合到MHC-1輕鏈的結(jié)構(gòu)。

實(shí)施方式A或具有一個(gè)或多個(gè)插入特征(intervening feature)的實(shí)施方式A的組合物，其中病毒是編碼表達(dá)細(xì)菌鞭毛蛋白的轉(zhuǎn)基因的亞塔痘病毒(Yatapoxvirus)。

實(shí)施方式A或具有一個(gè)或多個(gè)插入特征的實(shí)施方式A的組合物，其中聚合的鞭毛蛋白是細(xì)菌鞭毛蛋白的主要成分。

實(shí)施方式A或具有一個(gè)或多個(gè)插入特征的實(shí)施方式A的組合物，其中轉(zhuǎn)基因是沙門(mén)氏菌腸道血清型鼠傷寒沙門(mén)氏菌基因(“fliC”)的產(chǎn)物。

實(shí)施方式A或具有一個(gè)或多個(gè)插入特征的實(shí)施方式A的組合物，其中病毒是塔那痘病毒(TPV)，并且其中至少一種突變抑制由TPV的2L基因編碼的TNF結(jié)合蛋白的表達(dá)。

實(shí)施方式A或具有一個(gè)或多個(gè)插入特征的實(shí)施方式A的組合物，其中病毒具有第二突變，并且其中第二突變通過(guò)病毒導(dǎo)致胸苷激酶的表達(dá)抑制。

實(shí)施方式A或具有一個(gè)或多個(gè)插入特征的實(shí)施方式A的組合物，其中病毒是塔那痘病毒(TPV)，并且其中第二突變抑制由TPV的66R基因所編碼的胸苷激酶的表達(dá)。

實(shí)施方式A或具有一個(gè)或多個(gè)插入特征的實(shí)施方式A的組合物，其中病毒進(jìn)一步編碼轉(zhuǎn)基因以增加癌細(xì)胞的凋亡。

實(shí)施方式A或具有一個(gè)或多個(gè)插入特征的實(shí)施方式A的組合物，其中病毒進(jìn)一步編碼轉(zhuǎn)基因以激活受試者的免疫系統(tǒng)。

實(shí)施方式A或具有一個(gè)或多個(gè)插入特征的實(shí)施方式A的組合物，其中病毒進(jìn)一步編碼轉(zhuǎn)基因以引入mCherry熒光報(bào)告物。

實(shí)施方式A或具有一個(gè)或多個(gè)插入特征的實(shí)施方式A的組合物，其中病毒進(jìn)一步編碼轉(zhuǎn)基因以引入綠色熒光蛋白熒光報(bào)告物。

實(shí)施方式B是一種用于處理在具有免疫系統(tǒng)的受試者中的癌細(xì)胞的組合物，包括：具有至少一種突變的亞塔痘病毒(Yatapoxvirus)屬中的病毒，其中至少一種突變導(dǎo)致胸苷激酶(TK)的表達(dá)抑制。

實(shí)施方式B的組合物，其中病毒是編碼表達(dá)細(xì)菌鞭毛蛋白的轉(zhuǎn)基因的痘病毒。

實(shí)施方式B或具有一個(gè)或多個(gè)插入特征的實(shí)施方式B的組合物，其中轉(zhuǎn)基因是沙門(mén)氏菌腸道血清型鼠傷寒沙門(mén)氏菌基因(“fliC”)的產(chǎn)物。

實(shí)施方式B或具有一個(gè)或多個(gè)插入特征的實(shí)施方式B的組合物，其中病毒是塔那痘病毒(TPV)，并且其中至少一種突變抑制由TPV的66R基因所編碼的胸苷激酶的表達(dá)。

實(shí)施方式B或具有一個(gè)或多個(gè)插入特征的實(shí)施方式B的組合物，其中病毒具有第二突變，并且其中第二突變通過(guò)病毒導(dǎo)致TNF結(jié)合蛋白的表達(dá)抑制。

實(shí)施方式B或具有一個(gè)或多個(gè)插入特征的實(shí)施方式B的組合物，其中病毒是塔那痘病毒(TPV)，并且其中第二突變抑制由TPV的2L基因所編碼的TNF結(jié)合蛋白的表達(dá)。

實(shí)施方式B或具有一個(gè)或多個(gè)插入特征的實(shí)施方式B的組合物，其中抑制TNF結(jié)合蛋白表達(dá)的病毒具有能夠結(jié)合到MHC-1輕鏈的結(jié)構(gòu)。

實(shí)施方式B或具有一個(gè)或多個(gè)插入特征的實(shí)施方式B的組合物，其中病毒進(jìn)一步編碼轉(zhuǎn)基因以增加癌細(xì)胞的凋亡。

實(shí)施方式B或具有一個(gè)或多個(gè)插入特征的實(shí)施方式B的組合物，其中病毒進(jìn)一步編碼轉(zhuǎn)基因以激活受試者的免疫系統(tǒng)。

實(shí)施方式C是一種將至少一種基因遞送至受試者中的癌細(xì)胞的方法，其包括：通過(guò)使亞塔痘病毒(Yatapoxvirus)屬的病毒突變來(lái)修飾病毒，以抑制具有能夠結(jié)合MHC-1輕鏈的結(jié)構(gòu)的TNF結(jié)合蛋白的表達(dá)；以及將所修飾的亞塔痘病毒(Yatapoxvirus)屬病毒全身性給藥至受試者。

實(shí)施方式C的方法，進(jìn)一步包括：通過(guò)編碼病毒中的至少一種基因來(lái)修飾病毒，其中至少一種基因?qū)е铝税┘?xì)胞的凋亡增加或激活了受試者中的免疫應(yīng)答。

實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)說(shuō)明：

使用來(lái)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)的OMK(貓頭鷹猴腎)細(xì)胞、HCT 116、COLO 205、SW1463和WiDr細(xì)胞系(作為美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心產(chǎn)品編號(hào)CRL-1556、CCL-247、CCL-222、CCL-234和CCL-218分別可用)。OMK細(xì)胞被用于本文所述的病毒擴(kuò)增和病毒滴定。將細(xì)胞系在完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基中增殖，完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基由補(bǔ)充有10％(體積/體積)的胎牛血清(可得自Atlanta Biologicals公司)的DMEM(可得自Gibco/生物技術(shù)公司)、2mM的L-谷氨酰胺(可得自Sigma-Aldrich公司)和50μg/ml的硫酸慶大霉素(可得自AMRESCO公司)組成。在病毒感染后，將細(xì)胞系的細(xì)胞單層維持在維持培養(yǎng)基中，除了胎牛血清的濃度降低至2％之外，維持培養(yǎng)基與生長(zhǎng)培養(yǎng)基相同。將細(xì)胞在37℃下在5％的CO₂氣氛中孵育。使用改進(jìn)的Neubauer血細(xì)胞計(jì)數(shù)器，使用0.2％(質(zhì)量/體積)的臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞活力測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)1：對(duì)照

野生型TPV(肯尼亞株)由Joseph Esposito博士(疾病控制中心的，亞特蘭大，佐治亞州，美國(guó))提供。如本文所述的，修飾野生型TPV以形成表達(dá)熒光報(bào)道物EGFP的對(duì)照重組TPV(沒(méi)有其他遺傳修飾)。簡(jiǎn)言之，兩種相同的痘苗病毒(VACV)衍生的早期/晚期合成啟動(dòng)子被用于驅(qū)動(dòng)在使用p2KO方法的對(duì)照重組TPV中的熒光報(bào)告基因的表達(dá)。在轉(zhuǎn)染/感染過(guò)程期間，通過(guò)同源重組雙交換事件將p2KO表達(dá)盒(包括左側(cè)翼和右側(cè)翼，加上插入的開(kāi)放閱讀框(ORF)和啟動(dòng)子)轉(zhuǎn)移到野生型TPV的病毒基因組，以形成對(duì)照重組TPV。將用于重組的側(cè)翼區(qū)連接到5'-(左)側(cè)翼上的Sac I限制性位點(diǎn)和Not I限制性位點(diǎn)之間以及3'-(右)側(cè)翼上的EcoRI限制性位點(diǎn)和Hind III限制性位點(diǎn)之間的p2KO載體。

實(shí)驗(yàn)2：轉(zhuǎn)染/感染過(guò)程

轉(zhuǎn)染/感染過(guò)程被用于產(chǎn)生在這些實(shí)施例中使用的重組TPV。簡(jiǎn)言之，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑制造商的轉(zhuǎn)染方案，使用jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑(可得自PolyPlus Transfection SA公司)以每μg純化的p2KO載體1μl轉(zhuǎn)染試劑的濃度轉(zhuǎn)染OMK細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后約5小時(shí)，用每個(gè)細(xì)胞1個(gè)斑塊形成單位(pfu/細(xì)胞)的野生型TPV肯尼亞株(非熒光的)接種OMK單層。在接種后5天，用橡膠細(xì)胞刮刀在冰上刮擦所感染的單層，在-80℃下進(jìn)行三個(gè)循環(huán)的冷凍和解凍，在4℃下超聲處理15秒，連續(xù)稀釋并以約90％的匯合鋪于新鮮接種的OMK單層之上，并用含有0.5％的甲基纖維素的維持培養(yǎng)基覆蓋。挑選有熒光的、分離良好的斑塊，并對(duì)每個(gè)挑選(菌落，pick)進(jìn)行至少三輪的斑塊純化以產(chǎn)生不含可見(jiàn)的野生型(非熒光的)斑塊的病毒制備物。僅當(dāng)在培養(yǎng)物中沒(méi)有可見(jiàn)的野生型斑塊并且通過(guò)PCR沒(méi)有野生型TPV DNA可檢測(cè)到時(shí)，樣品才被認(rèn)為是純的。

實(shí)驗(yàn)3：病毒轉(zhuǎn)基因表達(dá)的確認(rèn)

FliC表達(dá)的驗(yàn)證是通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)完成的。mCCL2和mGM-CSF表達(dá)的驗(yàn)證是通過(guò)Luminex多分析物細(xì)胞因子檢測(cè)測(cè)定(由馬里蘭大學(xué)細(xì)胞因子核心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行)完成的。通過(guò)在具有TPV-p2KO/Δ66R/mCCL2、TPV-p2KO/Δ66R/mGM-CSF和TPV-p2KO/Δ2L/Δ66R/fliC的60mm組織培養(yǎng)皿(具有22.1cm²可用于細(xì)胞生長(zhǎng)的表面積)中使用10pfu/細(xì)胞感染半?yún)R合的OMK細(xì)胞單層來(lái)制備用于分析的樣品。在感染后指定的時(shí)間制備上清液(3ml/皿)和細(xì)胞質(zhì)提取物。對(duì)于FliC檢測(cè)，通過(guò)Western印跡法分析所提取的裂解物。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜(可得自Millipore公司)，并用1:2000稀釋度(體積/體積)的抗FliC單克隆抗體(可得自BioLegend公司)進(jìn)行探測(cè)。使用5％(重量/體積)的奶粉作為封閉劑。二級(jí)抗體是與辣根過(guò)氧化物酶綴合的單克隆抗小鼠IgG(可從Abcam公司獲得)，以1:2500稀釋度使用?？梢暬峭ㄟ^(guò)ECL(Thermo Scientific/Pierce)。含有p2KO載體但不含fliC、mGM-CSF或mCCL2插入片段的TPV重組體的實(shí)施方式作為對(duì)照。

實(shí)驗(yàn)4：細(xì)胞密度測(cè)定

將四種人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系和OMK細(xì)胞對(duì)照分別接種到12孔板(每種細(xì)胞系3個(gè)孔)中，使得一天后細(xì)胞達(dá)到90％的匯合。對(duì)每個(gè)孔(具有3.8cm²可用于細(xì)胞生長(zhǎng)的表面積)進(jìn)行胰蛋白酶化、計(jì)數(shù)并通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排除對(duì)活力進(jìn)行評(píng)分。這樣做是為了確保每種細(xì)胞系在特定數(shù)目的病毒pfu/細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)將是準(zhǔn)確的。

實(shí)驗(yàn)5：病毒滴定

為了測(cè)定樣品中存在的可存活的重組TPV病毒顆粒的數(shù)量，使用了斑塊測(cè)定法。簡(jiǎn)言之，將病毒樣品在冰上超聲處理15秒，在維持培養(yǎng)基中連續(xù)稀釋?zhuān)⒔臃N到6孔板中的幾乎匯合的OMK單層上(對(duì)于樣品的每個(gè)稀釋度，n＝3)。使病毒在室溫下輕輕搖動(dòng)吸附1小時(shí)。然后移除接種物，并用1ml的預(yù)熱的維持培養(yǎng)基將每個(gè)孔輕輕洗滌兩次。洗滌后，加入2ml的覆蓋培養(yǎng)基，并將感染的OMK單層在37℃孵育10天。然后除去該覆蓋培養(yǎng)基，并對(duì)單層染色(使用在37％的甲醛中的0.1％的結(jié)晶紫)。將板用蒸餾水洗滌，在空氣中干燥，并計(jì)數(shù)斑塊。

實(shí)驗(yàn)6：動(dòng)物

在四周齡時(shí)接受雄性新生兒無(wú)胸腺裸(Nude-Foxn1^nu/nu)小鼠(可通過(guò)Harlan Laboratories獲得)，并使其在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前適應(yīng)一周。在12小時(shí)/12小時(shí)光/暗循環(huán)下將小鼠單獨(dú)地飼養(yǎng)在透明的聚碳酸酯籠中。食物和水隨意獲得。根據(jù)由西密歇根大學(xué)的機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)(Institutional Animal Care and Use Committee of Western Michigan University)批準(zhǔn)的方案(IACUC方案號(hào)13-07-01)進(jìn)行所有的動(dòng)物飼養(yǎng)條件、操作和處理。

實(shí)驗(yàn)7：對(duì)用于裸鼠中腫瘤異種移植物的細(xì)胞系的選擇

在開(kāi)始在無(wú)胸腺裸鼠中進(jìn)行體內(nèi)研究之前，我們確定了當(dāng)用TPV/egfp感染時(shí)，哪種hCRC細(xì)胞系具有最高的病毒生產(chǎn)力(生產(chǎn)率，productivity)。測(cè)定TPV/egfp在四種hCRC衍生的細(xì)胞系：HCT 116、WiDr、SW1463和COLO 205中復(fù)制的能力。OMK細(xì)胞被用作陽(yáng)性對(duì)照。將每種細(xì)胞系接種到12孔組織培養(yǎng)板(具有3.8cm²的可用于細(xì)胞生長(zhǎng)的表面積)中，并將0.1pfu/細(xì)胞的TPV/egfp接種到每個(gè)孔中。在感染后4天，收集裂解物并通過(guò)斑塊測(cè)定法測(cè)定。

實(shí)驗(yàn)8：腫瘤誘導(dǎo)和測(cè)量

腫瘤是在無(wú)胸腺裸小鼠中通過(guò)在背部表面(大約在第一腰椎上方)皮下注射5×10⁶個(gè)HCT 116細(xì)胞產(chǎn)生的。每次注射后通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)排除來(lái)評(píng)估活力，以確保細(xì)胞在注射時(shí)及注射后是存活的。一旦可見(jiàn)，使用數(shù)字卡尺(匹茲堡模型6ZBTMCO)沿著長(zhǎng)軸(長(zhǎng)度)、短軸(寬度)和z維度(高度)測(cè)量腫瘤。然后使用本文提供的式1估計(jì)腫瘤的體積。當(dāng)腫瘤大小的估計(jì)值達(dá)到或超過(guò)75mm³時(shí)，將每只動(dòng)物隨機(jī)分入對(duì)照組(a組)或7個(gè)實(shí)驗(yàn)組(b-h組)之一。

實(shí)驗(yàn)9：HCT 116異種移植物在裸鼠中的病毒療法

每個(gè)治療組由5個(gè)或6個(gè)攜帶腫瘤的無(wú)胸腺裸鼠組成。一旦腫瘤體積達(dá)到或超過(guò)75mm³，則對(duì)每個(gè)攜帶腫瘤的小鼠給藥單一病毒療法注射。病毒療法注射以單次注射懸浮于稀釋在生理鹽水中的100μl的原始OMK細(xì)胞裂解物5×10⁶pfu在腫瘤內(nèi)給予。測(cè)量每只小鼠的體重和腫瘤體積，然后以三天的間隔記錄。在總共39天中收集13個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)。為了控制由給藥重組TPV注射所產(chǎn)生的未預(yù)期的炎癥或其他注射效應(yīng)，使用了載體對(duì)照組，在本文中表示為a組。該對(duì)照組由接受HCT116細(xì)胞但僅經(jīng)歷模擬重組TPV注射(僅100μl的載體)的動(dòng)物組成。將該組稱(chēng)為“模擬病毒療法”組或A組。將所有實(shí)驗(yàn)組與A組進(jìn)行比較，以評(píng)估重組TPV的治療效果。

為了評(píng)估治療效果，使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)(有時(shí)稱(chēng)為Wilcoxon秩和檢驗(yàn))將每個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組a進(jìn)行比較。如果當(dāng)與模擬物注射的對(duì)照相比時(shí)組內(nèi)的平均腫瘤體積顯著減少，則用重組TPV的治療被判斷為產(chǎn)生了顯著的治療效果。在整個(gè)研究中使用了p<0.05的顯著性水平。

結(jié)果：p2KO痘病毒切除/插入載體

設(shè)計(jì)和構(gòu)建p2KO痘病毒切除/插入載體以提供一種快速和可靠的方式來(lái)同時(shí)切除任何所需的一個(gè)或多個(gè)TPV基因并用所需的所表達(dá)的熒光報(bào)告物和/或所需的所表達(dá)的轉(zhuǎn)基因來(lái)取代所切除的一個(gè)或多個(gè)基因。所培養(yǎng)的細(xì)胞中病毒感染的可視化通過(guò)包含熒光報(bào)告物、mCherry和EGFP而被極大地促進(jìn)。兩種熒光報(bào)告物的使用使得鑒定和分離具有fliC插入片段的雙缺失重組TPV(TPV-p2KO/Δ2L/Δ66R/fliC)成為可能。在圖3中示出了由用OMV細(xì)胞單層上的TPV-p2KO/Δ2L/Δ66R/fliC病毒感染所產(chǎn)生的病毒斑塊，并證明了分別與mCherry和EGFP相關(guān)的亮橙-紅色和綠色的同時(shí)表達(dá)。

通過(guò)對(duì)M13正向和反向引物結(jié)合序列之間的區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增所產(chǎn)生的擴(kuò)增子的DNA測(cè)序來(lái)驗(yàn)證了堿基載體(base vector)(即，具有熒光報(bào)告物但不具有待表達(dá)的可選的轉(zhuǎn)基因)的總體序列。編碼mCCL2、mGM-CSF或fliC的ORF的插入片段通過(guò)p2KO載體的DNA測(cè)序來(lái)驗(yàn)證，以確保在它們用于轉(zhuǎn)染/感染過(guò)程之前的正確布置和取向。通過(guò)使用重組病毒DNA作為模板的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠分析，驗(yàn)證了重組TPV是2L敲除或者66R敲除，或者是二者都敲除。

結(jié)果：轉(zhuǎn)染/感染

在接種后4-5天，熒光報(bào)告物的表達(dá)在OMK細(xì)胞單層中是明顯的，表明來(lái)自野生型TPV感染的細(xì)胞的胞質(zhì)區(qū)室(compartment)中的p2KO載體的基因表達(dá)。在用p2KO載體轉(zhuǎn)染但沒(méi)有隨后用野生型TPV接種的對(duì)照培養(yǎng)物中，未觀察到熒光。然后在進(jìn)一步使用前，使用重組病毒基因組DNA作為模板通過(guò)PCR驗(yàn)證了該病毒樣品的純度。探測(cè)所有病毒DNA樣品中是否存在氨芐青霉素抗性基因，在任何重組TPV中均未檢測(cè)到。這表明所有的重組TPV由雙交換事件而不是單交換事件產(chǎn)生。

結(jié)果：病毒轉(zhuǎn)基因表達(dá)的確認(rèn)

為了證明所插入的ORF在用重組TPV(包括TPV-p2KO/Δ66R/mCCL2、p2KO/Δ66R/mGM-CSF和TPV-p2KO/Δ2L/Δ66R/fliC)感染的細(xì)胞中被表達(dá)，60mm培養(yǎng)皿(具有20cm²生長(zhǎng)面積)中的OMK單層用相關(guān)的重組TPV接種，并如前所述地測(cè)定細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)上清液中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。來(lái)自接種了TPV-p2KO/Δ2L/Δ66R/fliC的OMK細(xì)胞的裂解物的Western印跡用單克隆抗FliC抗體探測(cè)。觀察到具有50kDa的表觀分子量的單一條帶，與FliC陽(yáng)性對(duì)照相同，正如所預(yù)期的。該條帶的強(qiáng)度在感染后第3天和第6天之間逐漸增加。在模擬感染的細(xì)胞中未檢測(cè)到FliC轉(zhuǎn)基因。所感染的細(xì)胞裂解物和它們的培養(yǎng)上清液被測(cè)定以確定mCCL2和mGM-CSF的存在。兩個(gè)轉(zhuǎn)基因都被高度表達(dá)，并且大量存在于所感染的細(xì)胞上清液中(4.9ng/ml的mCCL2和大于10.0ng/ml的mGM-CSF)。在所感染的細(xì)胞或?qū)φ瘴锤腥镜募?xì)胞的細(xì)胞質(zhì)提取物中以及用不表達(dá)這些轉(zhuǎn)基因的TPV感染的細(xì)胞中，mGM-CSF和mCCL2都僅微弱地可檢測(cè)到或不可檢測(cè)到。該數(shù)據(jù)表明mCCL2和mGM-CSF都是從縮感染的細(xì)胞分泌的，正如所預(yù)期的，而FliC在所感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中積累，再次正如所預(yù)期的。

結(jié)果：細(xì)胞密度測(cè)定

本研究中使用的每種細(xì)胞系具有其在接近匯合時(shí)所測(cè)定的匯合密度(細(xì)胞/cm²)。OMK對(duì)照細(xì)胞系具有約1.0×10⁵個(gè)細(xì)胞/cm²的匯合密度。對(duì)于結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系確定的密度如下：HCT 116具有約1.4×10⁵個(gè)細(xì)胞/cm²的匯合密度；COLO205具有約6.9×10⁵個(gè)細(xì)胞/cm²的匯合密度；SW1463具有約4.5×10⁵個(gè)細(xì)胞/cm²的匯合密度；WiDr具有約2.5×10⁵個(gè)細(xì)胞/cm²的匯合密度。這些值用于計(jì)算當(dāng)接種這些細(xì)胞系時(shí)使用的pfu的數(shù)量。

結(jié)果：在裸鼠中的病毒療法HCT 116異種移植物

在開(kāi)始在無(wú)胸腺裸小鼠中的體內(nèi)研究之前，發(fā)現(xiàn)了當(dāng)用TPV/egfp感染時(shí)，OMK細(xì)胞是具有最高病毒生產(chǎn)力的hCRC細(xì)胞系，如上所述的。OMK細(xì)胞是最好的宿主細(xì)胞，允許產(chǎn)生約3×10⁶個(gè)子代pfu/孔。在所測(cè)試的hCRC細(xì)胞系中，HCT 116產(chǎn)生了具有約7×10⁵個(gè)子代pfu/孔的平均產(chǎn)量(n＝3)的最多后代病毒顆粒。因此，我們選擇HCT 116用于本研究的體內(nèi)階段。

為了評(píng)價(jià)重組TPV的溶瘤潛力，在無(wú)胸腺裸鼠(Nude-Foxn1^nu/nu)中誘導(dǎo)腫瘤。HCT 116細(xì)胞的活力計(jì)數(shù)表明>99％在注射時(shí)是活的。在注射HCT 116后一至三周內(nèi)，腫瘤通常達(dá)到75mm³。當(dāng)與模擬注射對(duì)照相比時(shí)，用TPV/Δ66R(F組)、TPV/Δ2L(G組)和TPV/Δ2L/Δ66R/fliC(H組)的處理在2個(gè)或更多個(gè)時(shí)間點(diǎn)都產(chǎn)生了腫瘤大小的顯著減小。在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)(處理后33天(減少47.6％)和36天(減少65.2％))，TPV/Δ2L處理的腫瘤(G組)顯著小于模擬注射的腫瘤。在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)(處理后27天(減少34.9％)和36天(減少52％))，TPV/Δ66R處理的腫瘤(F組)顯著小于模擬注射的腫瘤。TPV/Δ2L/Δ66R/fliC-處理的腫瘤(H組)顯示出強(qiáng)有力且持久的治療效果，并且在六個(gè)時(shí)間點(diǎn)(處理后15天(減少56.1％)、21天(減少62.0％)、24天(減少63.8％)、27天(減少59.5％)、33天(減少55.3％)和36天(減少69.6％))，當(dāng)與模擬注射的腫瘤相比，在體積上顯著減小。

盡管使用人類(lèi)結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系進(jìn)行了初始測(cè)試，但本文所述的藥物病毒療法旨在用于治療廣泛的癌癥。將用如本文所述的藥物組合物治療的癌癥的非限制性清單包括：基底細(xì)胞癌、癌、絨毛膜癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、上皮內(nèi)腫瘤、白血病、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(眼癌，retinoblastoma)、橫紋肌肉瘤、肉瘤以及膽道、膀胱、骨、腦、乳腺、CNS、子宮頸、結(jié)腸和直腸、結(jié)締組織、消化系統(tǒng)、子宮內(nèi)膜細(xì)胞、食道、眼、胃、頭和頸、腎、喉、肝、肺、胰腺、前列腺、口腔、卵巢、呼吸系統(tǒng)、皮膚、胃、睪丸、甲狀腺、子宮和泌尿系統(tǒng)的癌癥。

本文所述的藥物組合物以治療有效劑量給藥。本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療有效劑量”是指在給藥后有效實(shí)現(xiàn)所需治療結(jié)果的藥物的量。治療有效劑量可根據(jù)諸如個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重、藥物的形式以及劑型在個(gè)體中引起所需反應(yīng)的能力等因素而在患者之間變化。治療有效劑量可以通過(guò)以低的、安全的劑量開(kāi)始并升高至更高劑量，同時(shí)監(jiān)測(cè)治療效果(例如癌細(xì)胞生長(zhǎng)的減少)連同任何有害副作用的存在來(lái)確定。藥物組合物可以包括痘病毒、病毒核酸或產(chǎn)生所期望的病毒治療效應(yīng)的表達(dá)載體。

藥物組合物可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何合適的劑型或途徑給藥，包括但不限于腸胃外的、口服的、腸內(nèi)的、頰的、鼻的、局部的、直腸的、陰道的、透粘膜的、表皮的、經(jīng)皮的、真皮的、眼部的、肺部的和皮下的給藥途徑以提供全身的或局部的治療有效劑量。藥物將以適于特定給藥途徑的制劑或制備物給藥至受試者。適于給藥所述藥物劑型的制劑可包括但不限于：氣溶膠、分散體、乳液(emulsion)、植入物、基于脂質(zhì)體的制劑、滴鼻劑、貼劑、粉劑、溶液、噴霧劑、栓劑和混懸劑。制劑可以以單位劑型存在，并且可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法制備。制備這些制劑或劑型的方法包括將本公開(kāi)的痘病毒或核酸與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體組合的步驟，并且還可以包含添加劑，例如但不限于：穩(wěn)定劑、防腐劑和轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑，其有助于藥物的細(xì)胞攝取。合適的穩(wěn)定劑可包括但不限于：白蛋白、EDTA、甘氨酸和谷氨酸單鈉。合適的防腐劑可包括但不限于：抗生素、羥基苯甲酸甲酯(methyl hydroxybenzoate)、苯酚、2-苯氧基乙醇、山梨酸鉀、苯甲酸鈉和硫柳汞。

藥物組合物可以局部遞送到需要治療的受試者的腫瘤部位的靶組織或器官中。有效劑量的組合物通過(guò)受試者的皮膚或在暴露的手術(shù)區(qū)域使用注射器將被直接注射到腫瘤部位。在某些實(shí)施方式中，可以使用可植入劑量裝置注射藥物組合物。

也重要的是，注意如在示例性實(shí)施方式中示出的和描述的組合物的要素(element)的構(gòu)造和布置僅是說(shuō)明性的。盡管在本公開(kāi)中僅詳細(xì)描述了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，但是審閱本公開(kāi)的本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解，許多修改是可能的(例如，各種要素的大小、尺寸、結(jié)構(gòu)，形狀和比例的變化，參數(shù)值的變化，安裝布置的變化，材料使用的變化，顏色的變化，取向的變化等)，而沒(méi)有實(shí)質(zhì)上偏離詳述主題的新穎性教導(dǎo)和優(yōu)點(diǎn)。例如，顯示為一體形成的元件可以由多個(gè)部分構(gòu)成，或者顯示為多個(gè)部分的元件可以一體形成，接口的操作可以顛倒或者改變，結(jié)構(gòu)和/或構(gòu)件或連接器或系統(tǒng)的其他元件的長(zhǎng)度或?qū)挾瓤梢愿淖?，在元件之間提供的調(diào)節(jié)位置的性質(zhì)或數(shù)量可以改變。應(yīng)當(dāng)注意，系統(tǒng)的元件和/或組件可以由以很多種顏色、紋理和組合中的任何提供足夠強(qiáng)度或耐久性的多種材料中的任一種構(gòu)造。因此，所有這些修改旨在包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在不脫離本發(fā)明的精神的情況下，可以在期望的和其他示例性實(shí)施例的設(shè)計(jì)、操作條件和布置中進(jìn)行其他替換、修改、改變和省略。

應(yīng)當(dāng)理解，所描述的過(guò)程中的任何所描述的過(guò)程或步驟可以與其他公開(kāi)的過(guò)程或步驟組合以形成本裝置(device)的范圍內(nèi)的結(jié)構(gòu)。本文公開(kāi)的示例性結(jié)構(gòu)和方法是為了說(shuō)明性目的，而不應(yīng)解釋為限制。

還應(yīng)當(dāng)理解，在不脫離本裝置的構(gòu)思的情況下，可以對(duì)上述結(jié)構(gòu)和方法進(jìn)行變化和修改，并且進(jìn)一步地，應(yīng)當(dāng)理解的是，這些構(gòu)思旨在由下面權(quán)利要求覆蓋，除非這些權(quán)利要求通過(guò)其語(yǔ)言明確聲明。

以上描述僅被視為所說(shuō)明的實(shí)施方式的描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員以及制造或使用該裝置的人員將會(huì)想到該裝置的修改。因此，應(yīng)當(dāng)理解，附圖中所示的和上面所描述的實(shí)施方式僅用于說(shuō)明性目的，并不旨在限制由根據(jù)專(zhuān)利法原則解釋的所附權(quán)利要求限定的裝置的范圍，包括等同原則。