專利名稱：避免癌細(xì)胞中多藥物抗性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明針對癌癥化療期間避免腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)多藥物抗性的方法。具體說來，它涉及使用蛋白激酶抑制劑來避免由化療藥物對多藥物抗性(MDR1)基因的誘導(dǎo)作用。本文已證明，在對用各種細(xì)胞毒性藥物治療產(chǎn)生反應(yīng)時將會誘導(dǎo)MDR1基因表達(dá)(它在腫瘤細(xì)胞中引起隨后對某些化療藥物治療的抗性)。本文也證明，蛋白激酶抑制劑能抑制該細(xì)胞反應(yīng)。因此在給癌癥患者施以細(xì)胞毒性藥物以前和/或同時，可將蛋白激酶抑制劑用于避免在各種腫瘤細(xì)胞中，由化療藥物引起的MDR1誘導(dǎo)作用。
化療是現(xiàn)今常規(guī)癌癥治療的主要形式。然而伴隨癌癥化療的一個主要問題是，在治療過程中，腫瘤細(xì)胞就產(chǎn)生針對抗癌藥物細(xì)胞毒性作用的抗性。業(yè)已觀察到，腫瘤細(xì)胞甚至可以同時產(chǎn)生對結(jié)構(gòu)不同及作用機(jī)理不同的幾種化療藥物的抗性。這種現(xiàn)象稱之為多藥物抗性。有關(guān)腫瘤細(xì)胞中多藥物抗性的大多數(shù)文獻(xiàn)及臨床相關(guān)機(jī)理均關(guān)系到P-糖蛋白的表達(dá)物，即MDR1基因產(chǎn)物。
P-糖蛋白是位于細(xì)胞膜的一種廣泛特異性流向泵，它通過減少許多親脂細(xì)胞毒性藥物(包括某些廣泛使用的抗癌劑例如蒽環(huán)類抗生素，長春生物堿、表鬼臼脂素、放線菌素D及紅豆杉醇)在細(xì)胞內(nèi)積累而發(fā)揮功能，由此便產(chǎn)生對這些藥物的細(xì)胞抗性(PastanandGottesman，1991，Annu.Rev.Med.42277-286;Roninson(Ed.)，1991，MolecularandCellularBiologyofMultidrugResistanceinTumorcells，plenumPress，NewYork;SchinkelandBorst1991，SeminarsinCancerBiology2213-226)。
在幾種類型的正常表皮和內(nèi)皮組織(Cordon-Cardo等人，1990J.Histochem.Cytochem.381277-1287;Thiebaut等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA847735-7738)，以及在生血干細(xì)胞中(ChaudharyandRoninson，1991，Cell6685-94)和成熟淋巴細(xì)胞的亞群體中(Neyfakh等人，1989，Exp.CellRes.185496-505)表達(dá)人P-糖蛋白。更重要的是，在化療前或化療后，在大多數(shù)類型人腫瘤中都檢測出MDR1mRNA或P-糖蛋白(Goldstein等人，1989，J.Natl.CancerInst.81116-124;Noonan等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA877160-7164)。MDR1的最高水平表達(dá)通常在表達(dá)MDR1的正常組織衍生的腫瘤中發(fā)現(xiàn)，例如胃癌、腎上腺皮質(zhì)癌或結(jié)腸直腸癌。在其它類型的實(shí)體腫瘤及白血病中，治療前MDR1表達(dá)通常相當(dāng)?shù)突虿豢蓹z測出來，但經(jīng)化療之后，則這些惡性病灶的實(shí)質(zhì)部分表達(dá)極高水平的MDR1(Goldstein等人，1989，J.Natl.CancerInst.81116-124)。在本發(fā)明以前，人們通常相信化療后MDR1表達(dá)增加，是由于體內(nèi)選擇了因MDR1表達(dá)已經(jīng)產(chǎn)生對化療藥物抗性的稀有預(yù)存在的腫瘤細(xì)胞所致。
即使低水平的MDR1表達(dá)，也會引起幾種不同類型癌癥對化療失去反應(yīng)(Chan等人，1990，J.Clin.Oncol.8689-704;Chan等人，1991，N.Engl.J.Med.3251608-1614;Musto等人，1991，Brit.J.Haematol.7750-53)，這一事實(shí)表明P-糖蛋白介導(dǎo)的多藥物抗性代表臨床藥物抗性的一種重要組成。鑒于許多臨床及臨床研究強(qiáng)調(diào)為抑制P-糖蛋白功能而采用藥物學(xué)策略(FordandHiat，1990，Pharmacol.Rev.42155-199)，而本發(fā)明以前，很少了解有關(guān)在癌癥化療的相應(yīng)條件下，對誘導(dǎo)或上調(diào)腫瘤中P-糖蛋白表達(dá)起作用的種種因素。了解這些因素，可以提供研究避免腫瘤中P-糖蛋白出現(xiàn)的改進(jìn)方法，由此降低癌癥的多藥物抗性發(fā)生，并導(dǎo)致癌癥化療更為有效。
許多基因轉(zhuǎn)移研究證明，提高的MDR1基因表達(dá)足以造成多藥物抗性表型(Roninson(Ed.)，1991，MolecularandCellularBiologyofMultidrugResistanceinTumorCell，PlenumPress，NewYork)。例如用攜帶人MDR1cDNA的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的小鼠NIH3T3細(xì)胞、與其表面人P-糖蛋白的密度成比例地轉(zhuǎn)變成多藥物抗性。此種相關(guān)性不受是否存在細(xì)胞毒性選擇所影響(Choi等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA887386-7390)。
此外，某些其它生物化學(xué)變化與多藥物抗性細(xì)胞始終相關(guān)這一事實(shí)，表明這樣的變化對多藥物抗性也可起作用，可能通過影響P-糖蛋白的表達(dá)或功能來起作用。這些變化最突出的是增加蛋白激酶C(PKC)的活性，所說蛋白激酶在許多(盡管不是全部)多步驟細(xì)胞毒素選擇之后獲得的多藥物抗性細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)(Aguino等人，1990，CanerCommun.2243-247;Fine等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85582-586;O′Brian等人，1989，F(xiàn)EBSLett.24678-82;Posada等人，1989，CancerCommun.1285-292)。PKC激活表明要增加某些藥物敏感和多藥物抗性細(xì)胞系中的藥物抗性水平(FergusonandCheng，1987，CancerRes.47433-441;Fine等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85582-586;Yu等人，1991，CancerCommun.3181-189)。雖然PCK很明顯可磷酸化為P-糖蛋白(Chambers等人，1990，Biochem.Biophys.Res.Commun.169253-259;Chambers等人，1990，J.Biol.Chem.2657679-7686;Hamada等人，1987，CancerRes.472860-2865)，但不知道是否這樣的磷酸化作用要對所觀察到的藥物抗性變化負(fù)全部責(zé)任。雖然業(yè)已表明某些PKC抑制劑能逆轉(zhuǎn)某些P-糖蛋白表達(dá)細(xì)胞系中的多藥物抗性(O′Brian等人，1989，F(xiàn)EBSLett.24678-82;Posada等人，1989，CancerCommun.1285-292;Palayoor等人，1987，Biochem.Biophys.Res.Commun.148718-725)，但已有證據(jù)表明，至少某些觀察到的影響是由于試驗(yàn)化合物對P-糖蛋白功能的直接抑制，而非對PKC介導(dǎo)的磷酸化作用的抑制(Ford等人，1990，CancerRes.501748-1756;Sato等人，1990，Biochem.Biophys.Res.Commun.1731252-1257)。上面的研究未證明PKC相互作用因子可能對表達(dá)而不是對P-糖蛋白的磷酸化作用或功能有影響。
有幾個實(shí)驗(yàn)室已對正常細(xì)胞和惡性細(xì)胞中調(diào)節(jié)MDR1基因表達(dá)的因素進(jìn)行過研究。一個MDR1同系物的正常生理調(diào)節(jié)的明顯例子是在鼠子宮內(nèi)膜發(fā)現(xiàn)的，其中在懷孕開始時小鼠mdr基因的表達(dá)由類固醇激素所誘導(dǎo)(Arceci等人，1990，Mol.Repro.Dev.25101-109;Bates等人，1989，Mol.Cell.Biol.94337-4344)。在大鼠肝中，發(fā)現(xiàn)mdr基因的表達(dá)可由幾種致癌的或細(xì)胞毒性的異生物素所誘導(dǎo)，相似的誘導(dǎo)作用也在肝再生期間觀察到(Fairchild等人，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA847701-7705;Thorgeirsson等人，1987，Science，2361120-1122)。此外MDR1的一種嚙齒類的同系物，也能在對使用某些細(xì)胞毒性藥物治療產(chǎn)生反應(yīng)的幾種細(xì)胞系中誘導(dǎo)出來(Chin等人，1990，CellGrowthDiff.1361-365)。相反，在同樣研究中，任何試驗(yàn)的人細(xì)胞系中都沒有檢測出細(xì)胞毒性藥物對人MDR1基因的誘導(dǎo)作用。其它的研究人員也沒檢測出由于以細(xì)胞毒性藥物治療所產(chǎn)生的MDR1誘導(dǎo)作用(SchinkelandBorst，1991，Sem.CancerBiol.2213-226)。
然而幾種研究已表明，在一定條件下人的MDR1基因也可能對所強(qiáng)調(diào)的誘導(dǎo)作用是敏感的。這樣在某些人細(xì)胞系中MDR1的表達(dá)會由于以熱休克，亞砷酸鹽(Chin等人，1990J.Biol.Chem.265221-226)或某些分化劑治療(Mickley等人，1989，J.Biol.Chem.26418031-18040;Bates等人，1989，Mol.CellBiol.94337-4344)而提高。某些細(xì)胞毒性P-糖蛋白底物，據(jù)報(bào)道能刺激從人MDR1啟動子轉(zhuǎn)錄報(bào)告基因(Kohno等人，1989，Biochem.Biophys.Res.Commun.1651415-1421;Tanimura等人，1992，Biochem.Biophys.Res.Commun.183917-924)，并且在延長暴露之后可提高間皮瘤細(xì)胞系中P-糖蛋白的表達(dá)(Licht等人，1991，Int.J.Cancer49630-637)。盡管有MDR1誘導(dǎo)作用的這類報(bào)道，但還從來沒有肯定，在短期暴露于癌癥化療所使用的任何藥劑時，是否可以誘導(dǎo)人細(xì)胞中MDR1基因的表達(dá)，以及是否這樣的誘導(dǎo)作用可以通過藥劑來避免。
最近，Kioka等人已報(bào)道，加入類黃酮，五羥黃酮可以避免由亞砷酸鹽(一種不用于治療癌癥的化合物，但已知它能激活啟動子的熱休克反應(yīng)成分介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄途徑)所誘導(dǎo)的MDR1在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)(Kioka等，1992FEBSLett301307-309)。雖然Kioka等人的文獻(xiàn)中并未提到，但PKC活性的抑制作用是五羥黃酮的生物學(xué)作用之一(Gschwendt等人，1984，Biochem.Biophys.Res.Commun.12463)，因此由五羥黃酮產(chǎn)生的PCK抑制作用，可能要對觀察到的由亞砷酸鹽所產(chǎn)生的MDR1誘導(dǎo)作用的抑制作用負(fù)部分責(zé)任。但是值得注意的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員相信五羥黃酮抑制由熱休克反應(yīng)成分介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的能力與PKC抑制作用無關(guān)(KantengwaandPolla1991，Biochem.Biophys.Res.Commun.180308-314)。而且Kioka等人的文獻(xiàn)也未提出非類黃酮PKC抑制劑能抑制亞砷酸鹽的MDR1誘導(dǎo)作用，或當(dāng)與化療藥劑或任何不知道可激活熱休克反應(yīng)成分介導(dǎo)途徑的其它藥劑結(jié)合使用時，五羥黃酮能抑制MDR1表達(dá)的誘導(dǎo)作用。
本發(fā)明涉及使用蛋白激酶抑制劑來避免癌細(xì)胞中多藥物抗性出現(xiàn)，以及體外鑒定為實(shí)現(xiàn)該目的有用的蛋白激酶抑制劑的方法。
本發(fā)明部分(無論是否由P-糖蛋白運(yùn)輸?shù)?抗癌藥物可以誘導(dǎo)MDR1基因在各種組織來源的人腫瘤細(xì)胞中表達(dá)這一發(fā)現(xiàn)。MDR1基因表達(dá)的增加在RNA和蛋白水平均觀察到。MDR1誘導(dǎo)作用當(dāng)以PKC激動劑處理細(xì)胞時也觀察到。而且，由細(xì)胞毒性藥物或PKC激動劑所產(chǎn)生的該誘導(dǎo)作用，可以通過以蛋白激酶抑制劑處理細(xì)胞而避免，這表明在MDR1基因誘導(dǎo)作用中卷入了蛋白激酶介導(dǎo)途徑，并且蛋白激酶抑制劑可以用來阻止MDR1基因在暴露于化療劑的癌細(xì)胞中表達(dá)。特別是，因?qū)KC無活性的蛋白激酶抑制劑不能抑制MDR1誘導(dǎo)作用，該抑制作用便與PKC抑制作用相關(guān)，因而對PKC具有效作用的蛋白激酶抑制劑則有效地抑制該反應(yīng)。
當(dāng)于體外短期暴露，化療藥物能誘導(dǎo)MDR1在人細(xì)胞中的表達(dá)這一事實(shí)表明，癌癥化療可直接誘導(dǎo)多藥物抗劑，而不是通過預(yù)先存在的稀有變種的選擇來進(jìn)行。這種直接誘導(dǎo)多在患者的藥物治療過程中出現(xiàn)，這至少部分是經(jīng)治療的惡性病變相對于未經(jīng)治療的惡性病變來說，出現(xiàn)MDR1表達(dá)增加這一現(xiàn)象的原因。因此在涉及用細(xì)胞毒性藥物的化療以前或同時施用蛋白激酶抑制劑，對于避免MDR1誘導(dǎo)是有用的，并且由此避免了多藥物抗性癌細(xì)胞的出現(xiàn)，從而收到更好的治療效果。
本發(fā)明以實(shí)施例的方法來加以評述，在這些實(shí)施例中表明PKC激動劑可誘導(dǎo)MDR1在正常外周血淋巴細(xì)胞(PBL)及腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，此外，各種細(xì)胞毒性抗癌藥物也表明能激活MDR1基因。更重要的是，蛋白激酶抑制劑被證明能阻止由PKC激動劑或細(xì)胞毒性藥物介導(dǎo)的該MDR1誘導(dǎo)作用，特別是治療以前腫瘤細(xì)胞中只有很少或者沒有可檢測的P-糖蛋白的情況下更是如此。各種用途包括在本文描述的本發(fā)明中，包括(但并不只限于)防止在癌癥化療期間多藥物抗性腫瘤細(xì)胞的出現(xiàn)。
有關(guān)附圖的簡要介紹

圖1.佛波醇酯(TPA)、二?；视?DOG)及Staurospcrine(staur)對P-糖蛋白功能及在H9細(xì)胞系表達(dá)的影響。
A.未處理及經(jīng)TPA或DOG處理的細(xì)胞3hr的Rh123積累。
B.未處理的細(xì)胞及以Staurosporine予處理然后以TPA或DOG處理的細(xì)胞3hrRh123積累。
C.以IgG2a同型對照物染色未處理及以TFA或DOG處理的細(xì)胞。
D.同C，以UIC2抗體染色。
E.未處理細(xì)胞及僅以Staurosporine處理或以Staurosporine予處理后再以TPA或DOG處理的細(xì)胞經(jīng)UIC2沾染。
圖2.cDNA-PCR分析TPA、DOG及Staurosporine對MDR1 mRNA在不同細(xì)胞系中表達(dá)的影響。每一泳道中，上譜帶(167bp)相應(yīng)于MDR1，而下譜帶(120bp)相應(yīng)于β2-微球蛋白特異性的PCR產(chǎn)物。
A.TPA或DOF(用或不用Staurosporine予處理)對MDR1mRNA在H9細(xì)胞中表達(dá)的影響。
B.TPA在H9細(xì)胞中對MDR1mRNA的誘導(dǎo)時間過程。兩個陰性對照(neg.con.)相應(yīng)于以無RNA的水或反轉(zhuǎn)錄酶混合物代替cDNA完成的PCR。
C.TPA或DOG在K562細(xì)胞中以及TPA在MCF-7細(xì)胞中對MDR1mRNA的誘導(dǎo)作用。
圖3.藥物誘導(dǎo)的MDR1表達(dá)的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。
A.在不存在30μM異博停(VER)(左)或存在30μM異博停(右)情況下，從K562細(xì)胞中P-糖蛋白-輸送螢光染料的流出物。上圖從未處理細(xì)胞(-)流出的Rh123及從以50μM Ara-C(ARA)處理細(xì)胞12小時或以10μM Ara-C處理2天或3天細(xì)胞流出的Rh123。下圖從未處理細(xì)胞及從以1μg/ml長春堿(VBL)處理36小時的細(xì)胞流出的DiOC2(3)。
B.在Ara-C處理過的KGI白血病細(xì)胞中增加的P-糖蛋白表達(dá)。左圖未處理細(xì)胞中或以10μMAra-C處理1.5天的細(xì)胞中Rh123的積累。右圖相同細(xì)胞以抗P-糖蛋白UIC2抗體或IgG2a同型對照物進(jìn)行的間接免疫螢光法標(biāo)記。
C.暴露于不同藥劑已經(jīng)保持于無藥物介質(zhì)中的，并由使用DiOC2(3)(橫軸)和UIC2抗體雙標(biāo)記或以藻赤蘚素(PE)(垂軸)間接標(biāo)記的IgG2a同型對照(右圖)分析得出的K562細(xì)胞的計(jì)數(shù)密度(左圖)。從上到下未處理的細(xì)胞，以60ng/ml阿霉素處理3天并無藥生長5周的細(xì)胞、以30μM苯丁酸氮芥(CHL)處理5天并無藥生長2周的細(xì)胞，以10μM Ara-C處理3天并無藥生長5周(該實(shí)驗(yàn)使用其它檢測中所用抗體一半之量)的細(xì)胞、以Ara-C按上面所述處理并在從藥物中移出后周以螢光激活細(xì)胞分類術(shù)分離的灰暗Rh123細(xì)胞解體。
圖4.在藥物處理過的細(xì)胞中MDR1 mRNA表達(dá)的cDNA-PCR分析。每一泳道中上譜帶(167bp)相應(yīng)于MDR1，下譜帶(120bp)相應(yīng)于β2-微球蛋白特異性的PCR產(chǎn)物，在分開的管中擴(kuò)增。
A.在K562細(xì)胞中Ara-C對MDR1的誘導(dǎo)作用。細(xì)胞暴露于所示Ara-C濃度4.5天。與未處理細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞生長由與RNA提取同時的MTT試驗(yàn)測定。
B.用不同藥物處理的K562細(xì)胞中MDR1的誘導(dǎo)作用。暴露于藥品的時間被標(biāo)出。藥品及其濃度如下一未處理過的細(xì)胞;DAU，250ng。ml柔紅霉素;ADR，500ng/ml阿霉素;VBL，20ng/ml長春堿;VP，1μg/ml鬼臼乙叉甙;MTX，200ng/ml氨甲蝶呤，CDDP，3μg/ml順氯氨鉑;CHL，50μM苯丁酸氮芥;5FU，2μg/ml5-氟尿嘧啶，HU30μM羥基脲。
C.KB-3-1癌細(xì)胞中MDR1的誘導(dǎo)作用，未處理過的或以200ng/ml阿霉素或10μMAra-C處理2天的情況。
D.在EJ癌細(xì)胞中MDR1的誘導(dǎo)作用，未處理過的(-)或以10μMAra-C處理4天的情況。
E.藥物誘導(dǎo)MDR1在K562細(xì)胞中表達(dá)的維持。細(xì)胞以60ng/ml阿霉素、10μMAra-C或200ng/ml氨甲蝶呤處理3天，并且在無藥物介質(zhì)中培養(yǎng)所標(biāo)明的時間。
圖5.蛋白激酶抑制劑對H9細(xì)胞中細(xì)胞毒性藥物對MDR1mRNA誘導(dǎo)作用的影響。在每個試驗(yàn)中，抑制劑Staurosporine(ST)、H7、ISO-H7(IH7)或HA1004(HA)加入過兩次，第一次在緊接相應(yīng)藥物加入之前，第二次在特定一段時間之后。
A.H9細(xì)胞，未處理的或以50μMAra-C處理過22小時的。抑制劑按所標(biāo)明的濃度在實(shí)驗(yàn)開始及16小時后加入。
B.H9細(xì)胞，未經(jīng)處理的或以200ng/ml阿霉素處理過22小時的。相等量的抑制劑(0.03μMStaurosporine，10μMH7，HA-1004和ISO-H7)在實(shí)驗(yàn)開始及16小時后加入。
C.H9細(xì)胞，未經(jīng)處理過的或以40ng/ml長春堿或200ng/ml氨甲蝶蛉處理過36小時的。相等量抑制劑(0.1μMStaurosporine;50μMH7)在實(shí)驗(yàn)開始及24小時后加入。
圖6.在Ara-C或阿霉素處理過的K562細(xì)胞中的長春堿抗性。
A.在未經(jīng)處理過的及以Ara-C或阿霉素(ADR)處理過的細(xì)胞中，長春堿的生長抑制作用。細(xì)胞按圖3C處理，并于無藥條件下生長6周。長春堿抑制作用檢測進(jìn)行10天。
B.在未經(jīng)處理過的細(xì)胞中及Ara-C處理過的細(xì)胞的Rh123灰暗群體和Rh123明亮群體中，長春堿的生長抑制作用。Ara-C處理過的細(xì)胞從藥物中移出后六個星期由Rh123流出方法染色并由螢光激活細(xì)胞分類法分成Rh123灰暗群體和Rh123明亮群體。該Rh123灰暗群體的純度>60%(FIG.3C)，而Rh123明亮群體純度是90-95%。分類后一周，長春堿抑制作用檢測進(jìn)行7天。
本發(fā)明涉及使用蛋白激酶抑制劑避免在癌細(xì)胞中出現(xiàn)多藥物抗性表現(xiàn)型。細(xì)胞毒性藥物對MDR1的誘導(dǎo)以及蛋白激酶抑制劑避免該誘導(dǎo)作用的能力的發(fā)現(xiàn)在下面將給以充分?jǐn)⑹霾⑴e例說明。為便于討論，本發(fā)明就抗PKC活性的二種蛋白酶抑制劑及一組專門的人腫瘤細(xì)胞系來加以介紹。但其原則適用于使用任何蛋白激酶抑制劑用于以任何化療藥物治療的很寬范圍的各種體外細(xì)胞系及體內(nèi)腫瘤。
MDR1基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用TPA(12-O-十四烷基佛波醇-13-乙酸酯)，一種有效的PKC激活劑，及二?；视停环NPKC生理刺激劑，在下面實(shí)施例1中表明能增加在正常人PBL中及從不同類型白血病或?qū)嶓w腫瘤衍生的細(xì)胞系中MDR1基因的表達(dá)。TPA的作用在治療前表達(dá)P-糖蛋白的所有實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系中均觀察到，并且也在不帶有可檢測出的P-糖蛋白的某些其它細(xì)胞系(但不是所有該其它細(xì)胞系)中觀察到。但是使用比本文所述實(shí)驗(yàn)濃度更高的TPA，MDR1表達(dá)可能在無反應(yīng)的細(xì)胞系中被誘導(dǎo)出。所觀察到的TPA和二?；视偷淖饔帽砻鳎谌思?xì)胞中MDR1的表達(dá)可以通過PKC介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)節(jié)。
以PKC激動劑處理的細(xì)胞中，在P-糖蛋白及MDR1 mRNA水平均觀察到MDR1表達(dá)的增加，增加的穩(wěn)定狀態(tài)水平的MDR1 mRNA降解募跎佟SΦ弊(14)獾餃耍停模遙被
虻鬧餐O掠紋舳ˇ櫻(Ueda等人，1987，J.Biol Chem.262505-508)包含負(fù)責(zé)由TPA刺激轉(zhuǎn)錄的AP-1位點(diǎn)(Angel等人，1987，Cell，49729-739;Lee等人，1987，Cell，49741-752)。該AP-1位點(diǎn)及其周圍序列在人MDR1基因和其嚙齒類同系物中是保守的。(Hsu等人，1990，Mol.Cell.Biol.103596-3606;Teeter等人，1991，CellGrothDiff.2429-437)。倉鼠pgp1基因的AP-1序列表明基本上是其啟動子的正性調(diào)節(jié)子(Teeter等人，1991，CellGrowthDiff.2429-437)，但該同系物小鼠mdrla(mdr3)基因的相應(yīng)成分則具負(fù)性調(diào)節(jié)作用(Ikeguchi等人，1991，DNACellBiol.10639-649)。因此，本文介紹人MDR1啟動子的AP-1成分可能對由PKC激動劑刺激的MDR1表達(dá)起直接作用。
通過PKC-介導(dǎo)途徑對MDR1基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用可以解釋以前的發(fā)現(xiàn)，即選擇性地增加P-糖蛋白表達(dá)的多藥物抗性細(xì)胞系常常會有高水平PKC(Aquino等人，1990，CancerCommun.2243-247;Fine等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85582-586;O′Brian等人，1989，F(xiàn)EBSLett.24678-82;Posada等人，1989，CancerCommun.1285-292)。據(jù)推測，PKC活性增加，可以代表在該細(xì)胞系的選擇期間，對MDR1基因表達(dá)增加負(fù)責(zé)的早期結(jié)果。然而，該解釋不能排除由PKC誘導(dǎo)的磷酸化作用可以更進(jìn)一步提高P-糖蛋白的活性。該后一假設(shè)以Yu等人(CancerCommun.3181-189)的研究中找到證據(jù)，他們發(fā)現(xiàn)，MCF-7細(xì)胞(以異源啟動子轉(zhuǎn)錄的MDR1cDNA轉(zhuǎn)染后獲得)的多藥物抗性亞系中，藥物抗性的水平可以因引入表達(dá)高水平PKC2載體而增加。在該P(yáng)KC2轉(zhuǎn)染體中抗性增加伴隨著P-糖蛋白磷酸化作用增加，而不明顯改變其表達(dá)水平。
PKC在與不同適應(yīng)、增殖及分化過程相關(guān)的各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起中心作用。即使已發(fā)現(xiàn)PKC激動素誘導(dǎo)MDR1在正常和腫瘤造血細(xì)胞中的表達(dá)，但也可使用通過PKC介導(dǎo)途徑起作用的造血生長因子，卻沒得到同樣結(jié)果。而且，PKC激動劑不僅誘導(dǎo)MDR1在造血源細(xì)胞系中的表達(dá)，也誘導(dǎo)在上皮源細(xì)胞系中的表達(dá)，這表明MDR1表達(dá)的PKC介導(dǎo)調(diào)節(jié)作用可以起一般的生理作用。
PKC介導(dǎo)機(jī)理已連系到受UV射線或烷基化試劑損害的DNA的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答(Kaina等人，1989，InM.W.LambertandJ.Laval(Ed.)，DNARepairMechanismandTheirBialogicalImplicationinMammalianCells，PlenumPress，NewYork;PapathanasiouandFornace，1991，PP.13-36InR.F.Ozols(Ed.)，MolecularandClinicalAdvancesinAnticancerDrugResistance，KluwerAcademicPullishers，Boston，MA)。PKC激活也關(guān)聯(lián)到對其它細(xì)胞毒性藥物例如胞嘧啶阿糖苷(Kharbanda等人，1991，Biochemistry307947-7952)或阿霉素(Posada等人，1989，CuncerRes.496634-6639)的細(xì)胞反應(yīng)。因此，PKC介導(dǎo)的MDR1表達(dá)的誘導(dǎo)作用，可能是對不同類型的細(xì)胞損害(包括由細(xì)胞毒性化療藥物引起的損害)產(chǎn)生的一般應(yīng)激反應(yīng)的一部分。
事實(shí)上，本發(fā)明公開了MDR1在人白血病和實(shí)體腫瘤衍生細(xì)胞系中的表達(dá)，可由短期暴露于癌癥化療使用的各種細(xì)胞毒性藥物而誘導(dǎo)(見下面實(shí)施例2)。MDR1在RNA水平及蛋白質(zhì)水平的誘導(dǎo)，可在以P-糖蛋白輸送劑(阿霉素、柔紅霉素、長春堿、鬼臼乙叉甙)治療的或不由P-糖蛋白輸送的化療藥物(Ara-C，氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、苯丁酸氮芥、順鉑、羥基脲)治療的細(xì)胞亞群體中觀察到。因?yàn)镸DR1表達(dá)不提供對第二組藥物的抗性，并且因?yàn)镸DR1誘導(dǎo)可在短時間暴露于藥物后產(chǎn)生(在許多病例中短于一代細(xì)胞繁殖時間)，這些發(fā)現(xiàn)表明表達(dá)MDR1細(xì)胞的細(xì)胞毒性選擇可能并未造成觀察到的MDR1表達(dá)的增加。在可見的細(xì)胞損傷同時，MDR1誘導(dǎo)即變得可檢查，這表明它很可能是該損傷的間接結(jié)果，而不是對特異試劑的直接反應(yīng)。
更為重要的是，以細(xì)胞毒性藥物治療誘導(dǎo)的MDR1表達(dá)在撤去藥物之后并不消失，而在無藥物培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)可維持至少幾個星期。在無藥物條件下生長的P-糖蛋白陽性細(xì)胞表明在其分化方面無明顯變化。因此，藥物誘導(dǎo)的MDR1表達(dá)是一種穩(wěn)定現(xiàn)象，它并不限于死亡或終止分化的細(xì)胞。除了增加MDR1表達(dá)外，藥物處理的細(xì)胞也表現(xiàn)出對長春堿(一種P-糖蛋白輸送藥物)的抗性提高2-3倍，該抗性特別與表達(dá)MDR1的細(xì)胞相關(guān)。此外，藥物處理細(xì)胞也表現(xiàn)出對苯丁酸氮芥(一種不由P-糖蛋白輸送的化療藥物)的抗性有所增加。后一發(fā)現(xiàn)表明，在以細(xì)胞毒性藥物治療之后，某些其它臨床相關(guān)的藥物抗性機(jī)理可與MDR1表達(dá)共同被誘導(dǎo)出來。
綜上述，這些發(fā)現(xiàn)表明以癌癥化療使用的各種藥物治療人腫瘤細(xì)胞，可以直接誘導(dǎo)MDR1表達(dá)，而并不通過選擇予先存在的遺傳變種來實(shí)現(xiàn)(正如以前人們所誤信的)。在多藥物抗性方面產(chǎn)生的增加是穩(wěn)定的，并足以降低體外及體內(nèi)對化療藥物的反應(yīng)。藥物介導(dǎo)的MDR1表達(dá)的誘導(dǎo)作用似乎是很可能出現(xiàn)在癌癥化療期間，并且至少部分可以解釋在藥物治療人腫瘤中所觀察到的MDR1表達(dá)增加的發(fā)生率。因此本發(fā)明提供了在臨床相關(guān)條件下MDR1誘導(dǎo)作用的第一份材料，并指出PKC在該誘導(dǎo)作用中起中心作用。這后一假定提供了通過PKC抑制作用避免癌癥化療期間MDR1誘導(dǎo)的化療法的基礎(chǔ)。
使用蛋白激酶抑制劑避免MDR1誘導(dǎo)本發(fā)明證明蛋白激酶抑制劑，特別是有抗PKC活性的抑制劑，能阻止誘導(dǎo)MDR1基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。例如，Staurosporine，一種有效的但非選擇性的PKC抑制劑(RüeggandBurgess，1989，TrendsPharmac.Sci.10218-220)，能阻止以TPA，二?；视图霸S多化療細(xì)胞毒性藥物，包括Ara-C，長春堿，氨甲蝶呤和阿霉素治療的P-糖蛋白陰性細(xì)胞中的MDR1誘導(dǎo)。另一種蛋白激酶抑制劑，H7也能阻止由化療藥品產(chǎn)生的MDR1誘導(dǎo)。這些發(fā)現(xiàn)提供了PKC可與參與該誘導(dǎo)作用的證據(jù)，并提供使用蛋白激酶抑制劑抑制MDR1基因表達(dá)的可能性。而且，觀察到化療藥品誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中對不由P-糖蛋白輸送的至少一種藥物的抗性，暗示通過化療藥物治療，其它產(chǎn)生藥物抗性的途徑可與MDR1表達(dá)被共誘導(dǎo)，并且產(chǎn)生在腫瘤細(xì)胞中使用蛋白激酶抑制劑抑制出現(xiàn)藥物抗性的種種機(jī)制，而不只是MDR1的誘導(dǎo)。
然而在某些P-糖蛋白陽性細(xì)胞系中，當(dāng)單獨(dú)使用Staurosporine時，顯著地增加P-糖蛋白的表達(dá)，應(yīng)當(dāng)注意到，Staurosporine是P-糖蛋白抑制劑，可以直接與P-糖蛋白結(jié)合(Sato等人，1990，Biochem.Biophys.Res.Commun.1731252-1257)。此外，兩種其它的P-糖蛋白結(jié)合化合物、環(huán)鏈菌素A和異博停(也稱作PKC抑制劑)，在某些P-糖蛋白陽性細(xì)胞系中也增加P-糖蛋白的表達(dá)。因此可以相信，這些藥劑及Staurosporine是通過一個共同的，現(xiàn)在還未知的機(jī)理來起作用。這些結(jié)果說明，將蛋白激酶抑制劑用于P-糖蛋白陰性或接近陰性腫瘤中來避免增加MDR1，比用于大部分腫瘤細(xì)胞中已表達(dá)P-糖蛋白的腫瘤中可能更為有效。然而，應(yīng)當(dāng)注意到，Staurosporine只在少數(shù)造血細(xì)胞系中增加P-糖蛋白表達(dá)這一發(fā)現(xiàn)，不表示由PKC抑制劑產(chǎn)生的P-糖蛋白表達(dá)增加是P-糖蛋白陽性腫瘤細(xì)胞的一般性質(zhì)，并且也不表明患P-糖蛋白陽性腫瘤的病人，不可能從使用蛋白激酶抑制劑避免腫瘤細(xì)胞中進(jìn)一步由藥物誘導(dǎo)的多藥物抗性而受益。
P-糖蛋白陰性實(shí)體腫瘤或白血病可通過患者的腫瘤的活檢材料，手術(shù)或血液學(xué)樣品，使用本領(lǐng)域已知技術(shù)來分析，而加以鑒定(Roninson(Ed.)，1991，MolewlarandCellularBiologyofMultidrugResistanceinTumorCells，PlenumPress，NewYork)。這些技術(shù)包括(但不限于)以P-糖蛋白特異性抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫組織化學(xué)或免疫螢光檢測，以P-糖蛋白輸送螢光染料進(jìn)行活力染色;Northern點(diǎn)印跡或以MDR1-特異性核酸探針進(jìn)行狹線印跡雜交;或MDR1mRNA的cDNA-PCR分析等。上面檢測的某些操作例如在下面實(shí)施例1和2中加以介紹。應(yīng)當(dāng)指出某些以蛋白或功能檢測為基礎(chǔ)看似P-糖蛋白陰性的細(xì)胞系，仍然可顯示出由cDNA-PCR檢測出的MDR1mRNA(見表1)。這表明以蛋白或功能為基礎(chǔ)的檢測，作為鑒定可能從使用蛋白酶抑制劑受益的腫瘤的主要標(biāo)準(zhǔn)是較好的。此外，cDNA-PCR或其它測定MDR1mRNA的方法都可以使用，但同時要清楚MDR1在K562細(xì)胞的水平或稍高(例如2倍)水平表達(dá)仍可能是P-糖蛋白陰性腫瘤的表征。
因?yàn)楸疚闹性囼?yàn)的蛋白酶抑制劑，在其抑制活性上是非選擇性的，即它們的作用不是對PKC特異性的，本文所介紹的研究提供了證據(jù)它們抑制PKC活性的能力可能是阻止MDR1誘導(dǎo)的關(guān)鍵因素。例如，兩種有效的PKC抑制劑，Staurosporine和H9能抑制由細(xì)胞毒性藥物產(chǎn)生的MDR1誘導(dǎo)作用。相反的，HA1004，一種無抗PKC活性的蛋白激酶抑制劑，表明對阻止MDR1誘導(dǎo)完全無效。因此，任何能抑制PKC的蛋白激酶抑制劑，不管其是否對PKC具特異性，都對避免腫瘤細(xì)胞中MDR1的誘導(dǎo)極有可能是有用的。
因此，任何能阻止化療藥物對MDR1產(chǎn)生誘導(dǎo)的蛋白激酶催化劑(正如由下述實(shí)施例1所介紹的任何方法所測定的，例如螢光染料沉積、MDR1mRNA的cDNA-PCR或以P-糖蛋白特異性抗體染色)都可用在本發(fā)明方法的實(shí)踐中。該抑制劑可在患實(shí)體腫瘤或白血病的癌癥病人進(jìn)行化療藥物治療之前或同時給藥。任何普通用于癌癥化療的抗癌藥物都包括在本發(fā)明范圍內(nèi)，包括(但不限于)Ara-C、阿霉素、柔紅霉素、長春堿、鬼臼乙叉甙、氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶苯丁酸氮芥、順鉑及羥基脲。
對很多能抑制PKC的化合物進(jìn)行過體內(nèi)體外的癌癥化療中可能的應(yīng)用研究。然而，應(yīng)當(dāng)注意到，當(dāng)發(fā)現(xiàn)這樣的化合物對于與正常細(xì)胞有關(guān)的腫瘤表現(xiàn)出選擇性生長抑制作用時(PowisandKozikowski，1991，ClinBiochem.24385-397;Grunicke等，1989，Adv.EnzymeRegul.28201-216)，它們并不見得顯示或意味著能避免MDR1在癌細(xì)胞中的表達(dá)。體外研究表明，與其PKC抑制活性劑量大約相同的劑量可出現(xiàn)PKC抑制劑的抗增殖效果(Grunicke等人，1989，Adv.EnzymeRegul.28201-216)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的化合物包括Staurosporine及其苯甲?；苌顲GP41 251，發(fā)現(xiàn)它們在裸鼠中以其最大耐受劑量(MTD)的1/10處表現(xiàn)出抗腫瘤效果(MTD Staurosporine是1mg/Kg，而CGP41 251是250mg/Kg)(Meyer等人，1989，Int.J.Cancer 43851-856)，在體內(nèi)表現(xiàn)出有抗腫瘤活性的其它Staurosporine類似物包括UCN-01(Takahashi等人，1987，J.Antibiot.401782-1784)和8-N-(二乙基氨基乙基)rebeccamycin.(BMY 27557)(Schurig等人，1990，Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.31Abs 2469)。后一化合物腹腔內(nèi)給藥的優(yōu)選劑量在12mg/Kg/注射每日×9至64mg/Kg單劑量范圍內(nèi)。另一組經(jīng)研究的PKC有效抑制劑作為抗癌劑用包括醚脂類似物，包括十六烷基磷酸膽堿，ET-18-OCH3，ilmfosine，SRI62-834及BM41440(Powis和Kozikowski，1991，Clin Biochem.24385-397;Grunicke等人，1989，Adv.Enzyme Regul.28201-216)。這些藥劑中的某些已用于臨床試驗(yàn)中。在這些試驗(yàn)中口服的MTD值ilmofosine是200mg/每天(Berdel等人，1988，Proc.Amer.Cancer Res 29Abs.2050)，而BM41440是5mg/Kg體重(Herrmann等人，1987，Lipids 22962-966)。
十六烷基磷酸膽堿也局部用于乳房癌的皮膚轉(zhuǎn)移治療上，劑量范圍0.2-38.5g/每個病人，施用3-128周(Unger等人，1990，CancerTreatRev.17243-246)。這組化合物也被試驗(yàn)用作自體骨髓移植的瀉劑(Vogler等人，1991，Exp.Hematol，99557Abs.)。另一種PKC抑制劑、蘇拉明，已用于寄生蟲病，并正對其用作抗腫瘤劑的臨床試驗(yàn)作出評估。將蘇拉明連續(xù)輸注，其速度為14天，結(jié)束時達(dá)到峰值300μg/ml，表明對激素不應(yīng)的前列腺癌有活性(Meyer等人，1992，J.Clin.Oncol.10875-877)。另一類PKC抑制劑之一，類黃酮櫟皮酮、當(dāng)按20mg/Kg劑量經(jīng)腹腔內(nèi)給裸鼠施用時，表明能提高順鉑的抗腫瘤效力，是一種不由P-糖蛋白輸送的藥物，(Grunicke等人，1989，Adv.EnzymeRegul.28201-216)。
雖然除了下面實(shí)例1和2所述Staurosporine外，上面的化合物還沒有一種被試驗(yàn)過避免由細(xì)胞毒性藥物引起的MDR1誘導(dǎo)的能力，但從本發(fā)明公開的結(jié)果很有力地表明它們很可能具有這樣的作用，因?yàn)樗鼈兯械木芤种芇KC。有關(guān)這些以及其它PKC抑制劑的動物體內(nèi)及臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可用性使本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可將這些化合物與常規(guī)的抗癌藥物結(jié)合使用，從而避免化療期間出現(xiàn)多藥物抗性。這些化合物可在化療藥物治療之前和/或同時施與癌癥患者，其劑量范圍為約1-250mg/Kg體重，采用反復(fù)注射/連續(xù)輸注或局部治療。
此外，可以研制體外檢測技術(shù)，以便快速鑒別能阻止由化療藥物引起的誘導(dǎo)MDR1基因表達(dá)的任何化合物。例如，可將H-9或K562白血病細(xì)胞系，在暴露于調(diào)節(jié)組織培養(yǎng)條件下的10μMAra-C，200ng/ml阿霉素，200ng/ml氨甲蝶呤或40ng/ml長春堿10-36小時(雖然超過1小時的任何培養(yǎng)時間均可，見圖2B)之前，用試驗(yàn)化合物處理約30分鐘，然后與對照樣比較，評價該化合物阻止由藥物產(chǎn)生的MDR1誘導(dǎo)的能力。由此種檢測法鑒定出能阻止化療藥物誘導(dǎo)MDR1的化合物，不一定是蛋白激酶抑制劑，但可以按與蛋白激酶抑制劑相同的方式用于患者治療中。
實(shí)施例1蛋白激酶抑制劑阻止正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中蛋白激酶C激動劑介導(dǎo)的MDR1誘導(dǎo)1.1材料與方法1.1.1細(xì)胞系及藥物處理正常人PBL是在征得同意后通過靜脈穿刺從健康自愿受試者獲得、然后在Histopaque-1077(Sigma，St.Louis，MO)上經(jīng)密度梯度離心將低密度單核細(xì)胞分離。KG1細(xì)胞系保持在加有20%胎牛血清(FCS)和2mML-谷氨酰胺，100單位/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的Iscove′smodifaedDulbecco培養(yǎng)基中(GIBCOLab.，GrandIsland，NY)。MCF-7，EJ，KB-3-1，Hela及HT-1080細(xì)胞系保持在加有10%FCS和2mML-谷氨酰胺，100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMTM中。所有其它細(xì)胞系保持在加有10%FCS和2mML-谷氨酰胺，100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI培養(yǎng)基中。
在二甲基亞砜(DMSO)中配制含100μg/mlTPA(Sigma，St.Louis，MO)和30mM1，2-二辛基?；视?DOG或DiCg)(MolecularProbes，Eugene，OR)的原液，貯存于-30℃。以DMSO溶液作對照實(shí)驗(yàn)證明DMSO對P-糖蛋白的功能及表達(dá)均無影響。用不同濃度的TPA處理不同細(xì)胞系，取決于所觀察到的細(xì)胞毒性。PBL用1ng/mlTPA處理，H9和K562細(xì)胞用10ng/ml處理，KG1a和KG1細(xì)胞以100ng/ml處理而其它的細(xì)胞用10μg/ml處理。同樣不同濃度的DOG用于處理不同的細(xì)胞系。這樣PBL用75μMDOG處理，而H9和K562細(xì)胞用二份75μM劑量DOG(間隔2小時)處理。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析或RNA提取以前將細(xì)胞暴露于TPA或DOG8-12小時。Staurosporine(Sigma，St.Louis，MO)以100mM濃度用于KG1a細(xì)胞，而以30mM濃度處理其它細(xì)胞;在加入TPA或DOG以前30分鐘將其加入。
1.1.2流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測以若丹明123(Rh123)積累試驗(yàn)來檢測P-糖蛋白活性。在該檢測中，將經(jīng)藥物處理或未經(jīng)處理的細(xì)胞洗滌三次，在含100ng/mlRh123(Sigma，St.Louis，MO)的培養(yǎng)基中將其于37℃保溫1.5-2小時。然后洗滌細(xì)胞，以Propidiumiodide(PI)染色并置于冰中直至分析中。將單層生長的細(xì)胞以磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)(PH7.4)中的20mM亞乙基-二氧基四乙酸(Sigma)懸浮，并于Rh123染色前洗滌3次。在某些實(shí)驗(yàn)中使用Rh123流出物檢測(ChaudharyandRoninson，1991，Cell6685-94)而不是Rh123積累。
利用P-糖蛋白特異性的小鼠IgG2a單克隆抗體(mAB)UIC2來分析P-糖蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)(Mechetner and Roninson，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA895824-5828)與鼠IgG2a同型對照抗體從Sigma公司得到。在以UIC2mAB或同型對照物染色PBL時，于4℃，以10μg抗體染色106個細(xì)胞30分鐘，并且洗滌二次以后以10μg FITC結(jié)合的山羊抗小鼠IgG2a抗體(Fisher Scientific，F(xiàn)airlann，NJ)染色30分鐘，用PBS加2%FCS按1∶2加以稀釋。用冰冷卻的PBS加2%FCS將細(xì)胞洗滌2次，以PI染色并于冰上保溫至直分析用。染色其它類型的細(xì)胞基本上使用同樣方法，除了每106個細(xì)胞使用2μg第二種抗體這點(diǎn)不用。在某些實(shí)驗(yàn)中，使用藻赤蘚素(PE)結(jié)合的山羊抗鼠IgG2a作為第二種抗體，這種情況下不加入PI。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析在Coulter Epics 753流式細(xì)胞計(jì)數(shù)器上進(jìn)行。
1.1.3RNA提取和cDNA-PCR分析采用小規(guī)模十二烷基磺酸鈉提取法(Peppel and Baglioni，1990，Bio Techniques 9711-713)從約106個細(xì)胞中提取RNA。MDR1和β2-微球蛋白cDNA序列的cDNA合成聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增基本上按文獻(xiàn)記載進(jìn)行(Noonan等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA877160-7164;Noonan和Roninson，1991，PP.319-333 In Roninson(Ed.)，Melecular and Cellular Biology of Multidrug Resistance in Tumor Cells，Plenum Press，New York)，同時進(jìn)行如下改進(jìn)(ⅰ)在最初加熱樣品到94℃之后將Taq DNA聚合酶加入到PCR混合物中。(ⅱ)為計(jì)算出在經(jīng)過不同類型處理的細(xì)胞中，不同RNA的退化，將28個PCR循環(huán)之后獲得的β2-微球蛋白帶產(chǎn)率作為使不同制劑中cDNA模板起始量均衡的主要標(biāo)準(zhǔn)。用放射自顯影照相法檢測32P標(biāo)記的PCR產(chǎn)物。
1.2實(shí)施例詳述使用功能性檢測法來檢測以能誘導(dǎo)淋巴樣分化或激活的不同藥劑處理人PBL時，P-糖蛋白活性的改變，該法基于流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析Rh123(一種P-糖蛋白輸送的螢光線粒體染料)的細(xì)胞積累量。在該檢測中，表達(dá)很少或無P-糖蛋白表達(dá)的細(xì)胞被Rh123染成很鮮亮的顏色，而具較高水平P-糖蛋白活性的細(xì)胞呈現(xiàn)Rh123暗淡色。以鈣離子載體A23187、IL-12或IL-2處理的細(xì)胞沒觀察到對P-糖蛋白有明顯影響。相反，用佛波醇酯TPA處理PBL則引起Rh123暗淡細(xì)胞數(shù)顯著增加。加入30μM異博停(一種P-糖蛋白抑制劑)即可阻止Rh123暗淡色群體的增加。因?yàn)橐亚宄私釺PA的細(xì)胞作用是刺激PKC，由此也試驗(yàn)是否DOG(一種細(xì)胞通透性二酰基甘油及PKC的生理刺激劑)對PBL中Rh123沉積也有影響。用DOG處理PBL也能降低由PBL產(chǎn)生的Rh123積累。
為確定是否所觀察到的PKC刺激劑對P-糖蛋白活性的影響是由于P-糖蛋白表達(dá)增加的結(jié)果，以單克隆抗體UIC2(識別由人MDR1基因編碼的P-糖蛋白細(xì)胞外抗原基)間接標(biāo)記免疫螢光法染色未經(jīng)處理的PBL及以TPA處理的PBL。以TPA處理過的明顯地增加細(xì)胞表面的P-糖蛋白水平。如用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增MDR1cDNA序列來對檢測的那樣，該P(yáng)-糖蛋白的增加伴隨著TPA處理的PBL總?cè)后w中MDR1mRNA水平相應(yīng)增加。因此TPA誘導(dǎo)的P-糖蛋白活性的增加，至少部分是由于在RNA水平及蛋白水平MDR1基因表達(dá)被激活的緣故。
因?yàn)镻BL包含許多不同亞型的異源導(dǎo)體，因此將一系列白血病衍生克隆細(xì)胞系進(jìn)行試驗(yàn)，測定其以TPA處理后的P-糖蛋白表達(dá)的變化。如表1中所歸納的，在以TPA處理以前所有P-糖蛋白陽性的細(xì)胞系表現(xiàn)出在暴露于TPA之任其P-糖蛋白表達(dá)大大增加。該類細(xì)胞包括人KG1及KG1a干細(xì)胞，像白血病細(xì)胞系，其相對高水平的P-糖蛋白很可能反映出該蛋白在正常造血干細(xì)胞中的表達(dá)(ChaudharyandRoninson，1991，Cell，6685-94)，這類細(xì)胞還包括鼠EL4胸腺瘤和LBRM33胸腺瘤細(xì)胞系。
表1.TPA對MDR1表達(dá)的影響細(xì)胞系未處理的TPA檢測處理的正常細(xì)胞PBL+++F,A,R人造血細(xì)胞系KG1(急性骨髓性白血病)+++++F,AKG1a(急性骨髓性白血病)+++++F,AK562(慢性骨髓性白血病)-++F,A,RH9(T細(xì)胞白血病)-++F,A,RHL-60(早幼粒細(xì)胞白血病)--FTHP-1(早幼粒細(xì)胞白血病)--FJurkat,克隆E6-1(T細(xì)胞白血病)--FMolt-4(T細(xì)胞白血病)--FU937(組織細(xì)胞淋巴瘤)--F
表1(續(xù)).TPA對MDR1表達(dá)的影響細(xì)胞系未處理的TPA檢測處理的鼠造血細(xì)胞系KL4(胸腺瘤)+++++FLBRM33,clone4A2(淋巴瘤)+++F人實(shí)體腫瘤細(xì)胞系EJ(膀胱癌)+++FMCF-7(乳癌)--RHeLa(宮頸癌)--F,RKB-3-1(Hela亞系)--F,RHT1080(纖維肉瘤)--F,R在表1中，MDR1表達(dá)由Rh123積累的功能檢測(F)，UIC2抗體染色(A)或cDNA-PCR檢測MDR1mRNA(R)來評價，并且表示為相對值。由Rh123或UIC2染色檢測如果沒有可檢測出的P-糖蛋白表達(dá)，并且其MDR1mRNA水平不高于KB-3-1細(xì)胞的該值，那么認(rèn)為該細(xì)胞為陰性。
在無可檢測出的P-糖蛋白表達(dá)的細(xì)胞系中，H9和K562白血病細(xì)胞系已明顯表現(xiàn)出由TPA或DOG誘導(dǎo)MDR1mRNA及P-糖蛋白。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析表明以TPA或DOG處理這些細(xì)胞系便出現(xiàn)表達(dá)P-糖蛋白的主要細(xì)胞群體(圖1)。這些變化伴隨著TPA或DOG處理的細(xì)胞中，穩(wěn)定狀態(tài)的MDR1mRNA水平的提高(圖2A，B)。正如圖2B表明，MDR1mRNA在加TPA后2小時于H9細(xì)胞中變得可檢測，并，繼續(xù)增加直至至少5小時點(diǎn)為止，這表明對TPA反應(yīng)很快，與這些細(xì)胞中由TPA引起MDR1轉(zhuǎn)錄激活的可能性一致。
TPA處理后MDR1表達(dá)增加并不只限于造血細(xì)胞，在某些實(shí)體癌衍生的細(xì)胞系中也觀察到，包括表達(dá)低水平P-糖蛋白的EJ膀胱癌細(xì)胞，以及無TPA處理時MDR1表達(dá)檢測不出的MCF-7乳房癌細(xì)胞(圖2C)。如表1中所歸納的，大部分試驗(yàn)的P-糖蛋白陰性細(xì)胞系在TPA處理后表現(xiàn)出不誘導(dǎo)MDR1表達(dá)。然而應(yīng)當(dāng)指示，這些細(xì)胞系代以TPA濃度的反應(yīng)能力。
為試圖抵消由PKC激動劑引起的MDR1基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用，用一種有效的蛋白激酶抑制劑Staurosporine處理各細(xì)胞系。出乎意料的是，Staurosporine單獨(dú)引起P-糖蛋白已呈陽性的細(xì)胞系(KG1，KG1a，鼠EL4和LBRM33細(xì)胞系)中P-糖蛋白表達(dá)明顯增加。兩種其它化合物環(huán)孢菌素A和異博停(是已知的P-糖蛋白抑制劑及PKC抑制劑)也發(fā)現(xiàn)增加P-糖蛋白表達(dá)和/或KG1和EL4細(xì)胞中染料流出物。PKC抑制劑在P-糖蛋白陽性細(xì)胞系中對P-糖蛋白表達(dá)的該作用，使得很能分析這樣一些細(xì)胞系中Staurosporine和PKC激動劑之間的相互作用。但是Staurosporine不誘導(dǎo)MDR1在P-糖蛋白陰性的H9細(xì)胞中表達(dá)。用TPA或DOG處理前30分鐘，加入Staurosporine到H9細(xì)胞中，則完全消除了由這些藥劑引起的MDR1誘導(dǎo)，正如流式細(xì)胞計(jì)數(shù)(圖1)和cDNA-PCR檢測(圖2A)所證明的。Staurosporine也抑制正常細(xì)胞中TPA和DOG的作用。
實(shí)施例2蛋白激酶抑制劑阻止腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞毒性藥物介導(dǎo)的MDR1誘導(dǎo)作用2.1材料和方法2.1.1流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析用加有10%胎牛血清的5ml DMEM中的100ng/ml Rh123或10ng/ml DiOC2(3)于37℃將K562細(xì)胞染色10分鐘。洗滌2次后，于37℃，在5ml無染料介質(zhì)中使細(xì)胞流出染料3小時(對Rh123來說)或2小時(對DiOC2(3)來說)，正如已有文獻(xiàn)所記載的(Chaudhary and Roninson，1991，Cell，6685-94)。在雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，用5ml介質(zhì)中的3ng/ml DiOC2(3)染色。每種流出試驗(yàn)均分別在存在30μM異博停及不存在異博停的情況下進(jìn)行。KG1細(xì)胞于37℃用5ml介質(zhì)中的100ng/ml Rh123染色3小時，并于無流出物情況下分析。間接免疫螢光標(biāo)記(Chaudhary and Roninson，1991，Cell，6685-94)，是每2×106個細(xì)胞使用2μg一級抗體(UIC2或鼠IgG2a同型對照物，購自Sigma公司)及10μg二級抗體(羊抗小鼠IgG PE-結(jié)合的F[ab′]z片斷(Sigma))來完成的。對KG1細(xì)胞系來說每2×106個細(xì)胞使用1μg二級抗體。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析及流式分類術(shù)按文獻(xiàn)記載進(jìn)行(Chaudhary and Roninson，1991，Cell，6685-94);非活力細(xì)胞根據(jù)其非正常體積或顆粒度，或者在不使用藻赤鮮素的實(shí)驗(yàn)中通過propidium iodide積累來從分析中排出。
2.1.2生長抑制作用檢測按每孔3000細(xì)胞將細(xì)胞鋪敷于96孔微滴平板上(同時制兩份相同試樣)，并使其在提高濃度的各藥物中生長。細(xì)胞生長7-10天后由MTT檢測法加以分析(PauWels等人，1988，J.Virol.Meth.20309-321)。
2.2實(shí)施例詳述前述實(shí)施例1中研究證明PKC激動劑能誘導(dǎo)MDR1表達(dá)，表明PKC在激活腫瘤細(xì)胞中多藥物抗性反應(yīng)中起重要作用。PKC也影響對不同類型細(xì)胞應(yīng)激的細(xì)胞反應(yīng)(Papathanasiou and Fornace，1991，PP.13-36 In R.F.Ozols(Ed.)，Molecular and Clinical Advances in Anticancer Drug Resistance，Kluwer Academic Publishers，Boston，MA)。尤其是PKC由以1-β-D-阿糖胞苷(Ara-C)，一種有效的抗白血病藥物治療而激活(Kharbanda等人，1991，Biochemistry，307947-7952)。因此，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以試驗(yàn)是否Ara-C(它不由P-糖蛋白輸送)在K562白血病細(xì)胞中對P-糖蛋白功能具任何作用。正如圖3a所示，K562細(xì)胞暴露于Ara-C12-72小時，導(dǎo)致3-17%活細(xì)胞亞群體出現(xiàn)(由若丹明-123(Rh123)流出表現(xiàn)出)。Rh123流出對P-糖蛋白制劑異博停是敏感的。Rh123暗淡色細(xì)胞的出現(xiàn)伴隨Ara-C處理K562細(xì)胞中，關(guān)系到β2-微球蛋白的MDR1 mRNA表達(dá)的劑量依賴性增加，正如由cDNA序列的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增所檢測的結(jié)果所示(圖4a)。
也試驗(yàn)其它許多化療藥物對誘導(dǎo)MDR1在K562細(xì)胞中的表達(dá)之能力。發(fā)現(xiàn)阿霉素、柔紅霉素、長春堿、鬼臼乙叉甙、氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、苯丁酸氮芥、順鉑及羥基脲所有均能誘導(dǎo)MDR1 mRNA表達(dá)(圖4b)，及Rh123或DiOC2(3)(另一種P-糖蛋白輸送染料，Chaudhary and Roninson，1991，Cell，6685-94)以3-10%經(jīng)處理的細(xì)胞量流出(圖3a)。而這些藥物僅有前4種是由P-糖蛋白輸送的(Roninson(Ed.)，1991，Molecular and Cellular Biology of Multidrug Resistance in Tumor Cells，Plenum Press，New York)。將以上結(jié)果與MDR1誘導(dǎo)僅需短時間藥物暴露這一事實(shí)結(jié)合起來，表明表達(dá)MDR1細(xì)胞的細(xì)胞毒性選擇作用并不對P-糖蛋白陽性亞群體的出現(xiàn)負(fù)主要責(zé)任。
細(xì)胞毒性藥物誘導(dǎo)MDR1表達(dá)的能力并不只限于K562細(xì)胞。Ara-C提高P-糖蛋白在KG1白血病細(xì)胞(它在藥物處理以前含相當(dāng)多該蛋白)中的表達(dá)，正如由Rh123積累或單克隆抗體UIC2免疫活性所示(圖3a)。Ara-C也激活MDR1mRNA在H9T細(xì)胞白血病(圖5)KB-3-1表皮樣癌(圖4C)，及EJ膀胱癌細(xì)胞(圖4d)中的表達(dá)，盡管在這些癌細(xì)胞系中誘導(dǎo)的幅度較低些。此外，MDR1在以阿霉素、長春堿及氨甲蝶呤處理的H9細(xì)胞系中被誘導(dǎo)(圖5)，并在以阿霉素處理的KB-3-1細(xì)胞中被誘導(dǎo)(圖4C)。但在以上述同樣藥劑處理的HL60白血病細(xì)胞中未檢測出P-糖蛋白誘導(dǎo)作用。在所有情況下，在可見性細(xì)胞損傷的同時誘導(dǎo)作用便變得可檢測出，所謂可見性細(xì)胞損傷表現(xiàn)為細(xì)胞腫大，顆粒性增加，細(xì)胞形狀改變以及生長受到抑制(圖4A)。此外，在不存在藥物時，某些細(xì)胞系連續(xù)傳代幾個月，也能導(dǎo)致MDR1表達(dá)少量增加，這是因?yàn)槲刺幚砑?xì)胞中基本MDR1mRNA水平的可變性所致。
接著，試驗(yàn)細(xì)胞毒性處理之后藥物誘導(dǎo)的MDR1表達(dá)是否保持下來，為此，用細(xì)胞毒性濃性的Ara-C，阿霉素，苯丁酸氮芥或氨甲蝶呤處理K562細(xì)胞3-5天，然后使其在無藥物條件下生長。通過染料流出及以UIC2標(biāo)記的免疫螢光測試法(圖3C)或通過cDNA-PCR擴(kuò)增(圖4e)法分析不同時間點(diǎn)時，存活細(xì)胞中MDR1的表達(dá)。在經(jīng)處理的細(xì)胞亞群體中MDR1的表達(dá)在藥物除去后至少保持幾個星期(在Ara-C處理群體中高達(dá)11星期)。P-糖蛋白陽性的K562細(xì)胞在其大小，顆粒性及分化相關(guān)的抗原標(biāo)記表達(dá)方面均無明顯變化。以長春堿、P-糖蛋白底物進(jìn)行的生長抑制檢測，也證明除去Ara-C或阿霉素之后六星期仍存在多藥物抗性細(xì)胞。以ID10值增加約2-3倍為特征的長春堿抗性，特別關(guān)聯(lián)到細(xì)胞的Rh123暗淡色亞群體(圖6)。因此，藥物處理導(dǎo)致MDR1表達(dá)的持續(xù)誘導(dǎo)以及在經(jīng)處理細(xì)胞的亞群體中引起其相關(guān)的藥物抗性。并且也發(fā)現(xiàn)，對苯丁酸氮芥(一種不由P-糖蛋白輸送的化療烷基化藥劑)的細(xì)胞毒性作用的抗性，經(jīng)Ara-C和阿霉素處理的K562細(xì)胞比未處理過的細(xì)胞更高。該結(jié)果表明，以化療藥物治療之后，臨床相關(guān)藥物抗性的其它途徑或機(jī)理，可以與MDR1表達(dá)一起被共誘導(dǎo)出。
為測定PKC是否參與由細(xì)胞毒性藥物引起的誘導(dǎo)作用，將兩種KPC抑制劑，Staurosporine和H7用來阻滯H9細(xì)胞中的MDR1mRNA誘導(dǎo)。該兩化合物的加入阻滯了由Ara-C，阿霉素、氨甲蝶呤及長春堿引起的MDR1誘導(dǎo)，正如由cDNA-PCR(圖5)及以Ara-C處理細(xì)胞進(jìn)行的染料流出試驗(yàn)所檢測出的。但使用ISO-H7，一種H7的結(jié)構(gòu)類似物，對蛋白激酶的作用要弱10倍，未觀察到明顯的抑制作用(Pelosin等人，1990，Biochem.Biophys.Res.Commun.1691040-1048)。用Ara-C處理K562細(xì)胞也觀察到相似結(jié)果。為研究對PKC所起抑制作用的特異性，將提高劑量的H7(對PKC IC50＝40μM，對蛋白激酶A為2.3μM)和HA1004，一種非PKC特異性蛋白激酶抑制劑(對PKC IC50＝40μM，對蛋白激酶A為2.3μM)(Hidaka等人，1984，Biochemistry，235036-5041)二者的效果進(jìn)行比較，正如圖5a所示，H7抑制由Ara-C引起的MDR1誘導(dǎo)所用濃度為10μM或較高，但HA1004即使用60μM也顯示無明顯的抑制作用。這些結(jié)果與細(xì)胞毒性藥物引起MDR1誘導(dǎo)時PKC所起作用是一致的。
本文所提供的數(shù)據(jù)證明，各種化療藥物，包括不由P-糖蛋白輸送的那些藥物，均可直接誘導(dǎo)MDR1表達(dá)，而并不是通過選擇預(yù)存在的基因變種來實(shí)現(xiàn)的。藥物誘導(dǎo)的MDR1表達(dá)局限于經(jīng)處理的細(xì)胞亞群體，并伴隨P-糖蛋白輸送藥物的抗性適度增加(K562的情況下約2-3倍)。這種增加足以降低體內(nèi)對化療的反應(yīng)，并提高具較高水平藥物抗性的基因突變體的選擇。藥物介導(dǎo)的MDR1表達(dá)誘導(dǎo)作用可出現(xiàn)于癌癥化療期間，并很可能計(jì)算出經(jīng)治療的腫瘤中增加MDR1表達(dá)的出現(xiàn)率。因此，PKC抑制劑可阻止MDR1誘導(dǎo)作用這一事實(shí)表明，在癌癥化療中將此類藥劑與細(xì)胞毒性藥物結(jié)合使用，以達(dá)到高水平治愈癌細(xì)胞的可能性。
本發(fā)明并不受例舉的實(shí)施方案范圍所限，這些方案只不過試圖作為本發(fā)明各方面的詳細(xì)說明用。實(shí)際上，從前面的描述及所附各圖，除本文所表明以及新介紹之外的本發(fā)明的各種修改，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。這類修改都勢必落入所附權(quán)利要求范圍之中。
本文所摘引的所有文獻(xiàn)均全文引入本文作為參考。
權(quán)利要求
1.一種避免誘導(dǎo)MDR1基因在以化療藥劑治療的癌細(xì)胞中表達(dá)的方法，包括對進(jìn)行癌癥化療的個體施用蛋白激酶抑制劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中該蛋白激酶抑制劑抑制蛋白激酶C活性。
3.權(quán)利要求1的方法，其中當(dāng)應(yīng)用抗P-糖蛋白抗體進(jìn)行免疫活性測定，P-糖蛋白輸送染料的積累或流出物測定，或?qū)DR1mRNA表達(dá)試驗(yàn)測定時，該癌細(xì)胞含很少或檢測不出的MDR1P-糖蛋白。
4.權(quán)利要求3的方法，其中的癌細(xì)胞來自造血腫瘤。
5.權(quán)利要求3的方法，其中的癌細(xì)胞來自實(shí)體腫瘤。
6.權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中抑制劑在化療藥物之前給藥和與其同時給藥。
7.權(quán)利要求1、2、3、4或5的方法，其中抑制劑與化療藥物同時給藥。
8.鑒定由化療藥物引起MDR1基因誘導(dǎo)作用的抑制劑的方法，包括(a).將腫瘤細(xì)胞系暴露于試驗(yàn)抑制劑;(b).將細(xì)胞毒性藥物加入該細(xì)胞中;(c).在試驗(yàn)抑制劑和細(xì)胞毒性藥物存在下將該細(xì)胞培養(yǎng)至少一小時;以及(d).通過其mRNA水平、P-糖蛋白水平或者P-糖蛋白輸送染料的積累或流出，測量MDR1基因在該培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)。
9.權(quán)利要求8的方法，其中藥物是Ara-C。
10.權(quán)利要求8的方法，其中藥物是長春堿。
11.權(quán)利要求8的方法，其中藥物是阿霉素。
12.權(quán)利要求8的方法，其中藥物是氨甲喋呤。
13.權(quán)利要求8的方法，其中腫瘤細(xì)胞系是H9白血病。
14.權(quán)利要求8的方法，其中腫瘤細(xì)胞系是K562白血病。
15.避免以化療藥物治療的癌癥細(xì)胞中，MDR1基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用的方法，包括給進(jìn)行癌癥化療的個體施用抑制劑，其中抑制劑是由權(quán)利要求8、9、10、11、12、13或14確定的。
全文摘要
本發(fā)明針對避免癌癥化療期間腫瘤細(xì)胞中多藥物抗性出現(xiàn)的方法。具體說來，它關(guān)系到使用蛋白激酶抑制劑，來抑制由化療藥物引起的多藥物抗性(MDR1)基因的誘導(dǎo)作用。本文中證明MDR1基因表達(dá)(它引起對隨后經(jīng)以某些化療藥物治療的腫瘤細(xì)胞抗性)將在以各種細(xì)胞毒性藥物治療產(chǎn)生反應(yīng)時誘導(dǎo)出來。本文中也證明蛋白激酶抑制劑能抑制該細(xì)胞反應(yīng)。因此，當(dāng)?shù)鞍准っ敢种苿┰谝约?xì)胞毒性藥物治療癌癥病人前給藥或/和同時給藥時，可用于避免各種腫瘤細(xì)胞中，由化療藥物引起的MDR1誘導(dǎo)作用。
文檔編號A61KGK1092321SQ9311962
公開日1994年9月21日 申請日期1993年9月18日 優(yōu)先權(quán)日1992年9月17日
發(fā)明者P·M·喬哈利, I·羅寧森 申請人:伊利諾伊大學(xué)評議會