本專利申請(qǐng)要求于2014年6月25日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)No.62/016,947的優(yōu)先權(quán)利益，所述美國臨時(shí)專利申請(qǐng)的公開內(nèi)容以引用的方式全文并入本文。政府補(bǔ)助本發(fā)明在政府支持下由美國國立衛(wèi)生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的授權(quán)號(hào)R01CA134519和R01GM096060作出。政府在本發(fā)明中擁有某些權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域：
：本公開內(nèi)容涉及治療癌癥以及減少腫瘤生長、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括施用抑制劑，所述抑制劑阻斷異粘蛋白(MTDH)和含葡萄球菌核酸酶結(jié)構(gòu)域1(SND1)的相互作用，并且抑制MTDH-SND1復(fù)合物的功能?？紤]抑制劑包括MTDH的肽或片段，所述MTDH的肽或片段結(jié)合SND1或者來源于SND1的肽或片段，所述SND1的肽或片段結(jié)合異粘蛋白。以引用的方式并入以引用的方式全文并入的是隨同同時(shí)提交且如下鑒定的計(jì)算機(jī)可讀的核苷酸/氨基酸序列表：名稱為“48166_SeqListing.txt”；17,037字節(jié)；2015年6月24日創(chuàng)建的ASCII文本文件。
背景技術(shù)：
：：癌癥的特征在于無法控制的遺傳和表觀遺傳改變。重現(xiàn)性的DNA拷貝數(shù)改變通常指示受累基因座中的癌癥的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)物的存在。異粘蛋白(MTDH；也稱為AEG1、LYRIC)先前已鑒定為位于8q22中的促轉(zhuǎn)移基因，所述8q22是與乳腺癌的弱無復(fù)發(fā)存活聯(lián)系的頻繁擴(kuò)增的基因組基因座(Hu等人，2009)。MTDH的過表達(dá)在超過40％的原發(fā)性腫瘤中觀察到，并且是獨(dú)立的預(yù)后不良因素(Hu等人，2009)。驅(qū)動(dòng)MTDH在原發(fā)性乳腺腫瘤中的強(qiáng)選擇的原因尚不明確，并且MTDH在正常發(fā)育和腫瘤生成中的功能意義仍知之甚少。使用細(xì)胞培養(yǎng)或異種移植物模型的近期研究已牽涉幾種癌癥相關(guān)過程中的MTDH，所述癌癥相關(guān)過程包括增殖、細(xì)胞死亡、侵入和血管生成(Emdad等人，2013)，盡管MTDH在這些過程中的潛在機(jī)制理解迄今為止仍是有限的。在乳腺癌中，MTDH假定為介導(dǎo)癌細(xì)胞粘附至肺內(nèi)皮的跨膜蛋白質(zhì)(Brown和Ruoslahti，2004)。在某些癌癥類型中，MTDH已聯(lián)系至多重致癌途徑，例如PI3K/AKT和NF-κB(Emdad等人，2013)。MTDH如何調(diào)節(jié)這些途徑仍然難以捉摸。盡管在高等脊椎動(dòng)物中是進(jìn)化保守的，但MTDH含有不可識(shí)別的功能結(jié)構(gòu)域，使對(duì)其生物功能的理解有挑戰(zhàn)性。多個(gè)團(tuán)體已鑒定幾個(gè)MTDH結(jié)合配偶體，包括PLZF、BCCIPα和含葡萄球菌核酸酶結(jié)構(gòu)域1(SND1)(Wan和Kang，2013)。然而，與這些蛋白質(zhì)的相互作用是否以及如何介導(dǎo)MTDH的功能很大程度上是未知的。乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病，其可基于基因表達(dá)譜廣泛地分類為管腔和基底樣亞型(Perou等人，2000)。已推測(cè)不同的致癌信號(hào)傳導(dǎo)可靶向不同起源的細(xì)胞，從而導(dǎo)致形成不同亞型的乳腺癌。然而，腫瘤起始細(xì)胞(TIC)在不同癌基因誘導(dǎo)的乳腺腫瘤中的起源、身份和調(diào)節(jié)仍得到很少表征。小鼠中的自身腫瘤生成提供了用于跟蹤腫瘤起始期間的早期變化以及用于研究目的基因在介導(dǎo)TIC的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增中的作用的良好模型。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本公開內(nèi)容已顯示異粘蛋白(MTDH)對(duì)于管腔和基底乳腺腫瘤起始細(xì)胞(TIC)以及前列腺腫瘤兩者的擴(kuò)增和功能是重要的，并且強(qiáng)調(diào)了過表達(dá)MTDH在不同腫瘤亞型中的選擇壓力。MTDH對(duì)其與SND1的保守相互作用的功能依賴性表明，靶向MTDH-SND1復(fù)合物可通過防止TIC的擴(kuò)增而提供控制腫瘤起始、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)，伴隨對(duì)正常組織的最低限度影響。本公開內(nèi)容提供了用于預(yù)防或減少受試者中的腫瘤起始細(xì)胞的復(fù)發(fā)或擴(kuò)增的方法，所述方法包括施用干擾MTDH和SND1的相互作用的試劑。本公開內(nèi)容還提供了用于治療患有癌癥的受試者中的癌癥的方法，所述方法包括給受試者施用破壞MTDH和SND1之間的相互作用的抑制劑。在各個(gè)實(shí)施例中，抑制劑結(jié)合SEQIDNO:1中所示的MTDH的殘基364-582(例如MTDH的氨基酸364-407)內(nèi)的人MTDH區(qū)域。在一些實(shí)施例中，抑制劑結(jié)合SND1SN1/2結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，抑制劑結(jié)合SEQIDNO:2中所示的SND1的殘基16-339(例如SND1的氨基酸39-43)內(nèi)的人MTDH區(qū)域。在各個(gè)實(shí)施例中，本公開內(nèi)容提供了用于減少或降低受試者中的腫瘤起始細(xì)胞擴(kuò)增的方法，所述方法包括施用異粘蛋白(MTDH)和含葡萄球菌核酸酶結(jié)構(gòu)域1(SND1)之間的相互作用的抑制劑，其中所述抑制劑抑制異粘蛋白(SEQIDNO:1)的殘基364至407內(nèi)的SND1蛋白質(zhì)相互作用。在各個(gè)實(shí)施例中，受試者患有癌癥。本文考慮的示例性癌癥包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、鱗狀細(xì)胞癌、宮頸癌、膀胱癌以及詳述中列出的那些。在各個(gè)實(shí)施例中，癌癥選自乳腺癌和前列腺癌。在一些實(shí)施例中，癌癥是肝癌?？紤]MTDH/SND1抑制劑是MTDH的肽、SND1的肽、與包含MTDH的殘基393-403的肽具有相似結(jié)構(gòu)的肽模擬物、與包含MTDH的殘基393-403的肽具有相似結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)部分的小分子化合物、或含有本文描述的肽或肽模擬物的納米顆粒綴合物。在各個(gè)實(shí)施例中，抑制劑是肽。例如，在各個(gè)實(shí)施例中，肽包含共有序列XWXXXXXXWXX(SEQIDNO:3)，其中X是任何氨基酸。在各個(gè)實(shí)施例中，肽包含來自MTDH(SEQIDNO:2)的殘基393-403的共有序列XWXXXXXXWXX(SEQIDNO:3)，其中X是任何氨基酸。在各個(gè)實(shí)施例中，抑制劑是包含共有序列XWXXXXXWXX(SEQIDNO:4)的肽，其中X是任何氨基酸。在各個(gè)實(shí)施例中，抑制劑是選自下述的MTDH的肽：i)在MTDH的殘基364-582內(nèi)的肽，ii)在MTDH的殘基364-407內(nèi)的肽，iii)包含MTDH的殘基386-407的肽，或iv)包含MTDH的殘基393-403的肽。在各個(gè)實(shí)施例中，抑制劑是選自下述的MTDH的肽：i)基本上由SEQIDNO:1的殘基364-582組成的肽，ii)具有MTDH的殘基364-407的肽，iii)基本上由SEQIDNO:1的殘基386-407組成的肽，或iv)基本上由SEQIDNO:1的殘基393-403組成的肽。在一些實(shí)施例中，肽是本文描述的野生型MTDH肽中任一種的變體，其中變體肽保留W394和W401，其中位置基于野生型MTDH的氨基酸序列(即SEQIDNO:1)。在各個(gè)實(shí)施例中，肽包含DWNAPAEEWGN(SEQIDNO:5)的序列或其變體，其中變體肽包含在除了W殘基之外的任何位置處的至少一個(gè)(例如2、3、4、5、6、7、8或9中任一個(gè))突變。在一些實(shí)施例中，肽長約11至約22個(gè)氨基酸(例如長約15至約22個(gè)氨基酸)。在一些實(shí)施例中，肽包含對(duì)DWNAPAEEWGN(SEQIDNO:5)的序列N末端的約1、2、3、4、5、6或7個(gè)氨基酸中的任一種或其變體。在一些實(shí)施例中，肽包含對(duì)DWNAPAEEWGN(SEQIDNO:5)的序列C末端的約1、2、3或4個(gè)氨基酸中的任一種或其變體。在一些實(shí)施例中，肽包含DWNAPEEWGN(SEQIDNO:20)的序列或其變體，其中變體肽包含在除了W殘基之外的任何位置處的至少一個(gè)(例如2、3、4、5、6、7、8或9中任一個(gè))突變。在一些實(shí)施例中，肽長約10至約21個(gè)氨基酸(例如長約14至約21個(gè)氨基酸)。在一些實(shí)施例中，肽包含對(duì)DWNAPEEWGN(SEQIDNO:20)的序列N末端的約1、2、3、4、5、6或7個(gè)氨基酸中的任一種或其變體。在一些實(shí)施例中，肽包含對(duì)DWNAPEEWGN(SEQIDNO:20)的序列C末端的約1、2、3或4個(gè)氨基酸中的任一種或其變體。在各個(gè)實(shí)施例中，肽包含在選自D389、A392、D393、N395、E399、E400、W404、D406和E407的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處的在MTDH中的突變，其中氨基酸位置基于野生型MTDH序列(即SEQIDNO:1)。在各個(gè)實(shí)施例中，肽包含在選自D389R、D393R、E399R、E400R、W404D、D406R和E407R的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處的在MTDH中的突變，其中位置基于野生型MTDH序列(即SEQIDNO:1)。在各個(gè)實(shí)施例中，突變選自SEQIDNO:1的D389R、D393R、E399R、E400R、W404D、D406R和E407R。在各個(gè)實(shí)施例中，抑制劑是在SND1(即SEQIDNO:2)的殘基16至339內(nèi)的SND1的肽。在一個(gè)實(shí)施例中，SND1肽包含在選自F250、R324、R255、R327、R324、P39、P43、E247、L256、H279、I284、L287、R259和N281的一個(gè)或多個(gè)殘基處的突變，其中位置基于野生型SND1序列(即SEQIDNO:2)。在各個(gè)實(shí)施例中，SND1中的突變選自SEQIDNO:2的F250AR324E和R255E。本文考慮抑制劑肽是融合蛋白的部分。在某些實(shí)施例中，肽融合至FC結(jié)構(gòu)域。本公開內(nèi)容還提供了包含本文描述的MTDH/SND1抑制劑和藥學(xué)可接受的載體的組合物(例如藥物組合物)。本發(fā)明還提供了經(jīng)分離的肽抑制劑(例如本文描述的肽中的任何一種)。本專利申請(qǐng)還提供了制備且使用本文描述的肽抑制劑(以及包含此類肽抑制劑的組合物)中的任何一種的方法。因此，例如，在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了破壞受試者中的MTDH和SND1之間的相互作用的方法，所述方法包括給受試者施用上文描述的肽抑制劑(或包含此類肽抑制劑的藥物組合物)中的任何一種。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了抑制受試者中的促存活基因的SND1依賴性表達(dá)的方法，所述方法包括給受試者施用上文描述的肽抑制劑(或包含此類肽抑制劑的藥物組合物)中的任何一種。本發(fā)明還考慮了可用于研究MTDH和SND1的抑制劑的動(dòng)物，包括本文描述的MTDH敲除和擊倒模型以及本文描述的SND1擊倒模型。本發(fā)明還考慮了在MTDH和SND1之間結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)，所述晶體結(jié)構(gòu)可用于鑒定MTDH和SND1之間的相互作用的抑制劑。附圖說明圖1A-O顯示了Mtdh的系統(tǒng)缺失抑制乳房腫瘤形成和轉(zhuǎn)移。(圖1A)WT和突變型Mtdh等位基因的圖示。綠色框代表外顯子1-12。用于基因分型的引物(F，正向；R，反向)指示在相應(yīng)的基因組序列上方。(圖1B)通過X-gal染色顯現(xiàn)的在第10.5天時(shí)的WT和KO胚胎中的LacZ表達(dá)。(圖1C)從具有所示Mtdh基因型的8周齡雌性小鼠中新鮮解離的MEC中的MTDH蛋白質(zhì)免疫印跡。(圖1D)具有所示Mtdh基因型的MMTV-PyMT雌性中的乳房腫瘤發(fā)作的動(dòng)力學(xué)。Mtdh+/+(n＝13)，Mtdh+/-(n＝26)和Mtdh-/-(n＝30)。(圖1E)與(圖1D)中相同的小鼠群組在所示年齡時(shí)的無腫瘤乳腺百分比。(圖1F)在所示年齡時(shí)評(píng)估的PyMT；Mtdh+/+、PyMT；Mtdh+/-和PyMT；Mtdh-/-群組的總腫瘤負(fù)荷。統(tǒng)計(jì)學(xué)比較在Mtdh+/+和Mtdh-/-組之間完成。數(shù)據(jù)代表平均值±SEM(n>20)。(圖1G)在PyMT；Mtdh+/+(n＝15)、PyMT；Mtdh+/-(n＝11)和PyMT；Mtdh-/-(n＝14)動(dòng)物中的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)目。誤差條代表5-95百分位數(shù)。(H)在具有所示基因型的MMTV-ErbB2小鼠中的乳房腫瘤發(fā)作的動(dòng)力學(xué)。Mtdh+/+(n＝22)，Mtdh+/-(n＝31)和Mtdh-/-(n＝27)。(圖1I)在300日齡時(shí)荷有所示腫瘤數(shù)目的來自與(圖1H)中相同群組的小鼠百分比。(圖1J)來自Mtdh+/+(n＝30)和Mtdh-/-(n＝23)組的荷瘤MMTV-ErbB2小鼠中的肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生率。(圖1K)來自(圖1J)的相同小鼠群組中的轉(zhuǎn)移病灶數(shù)目/肺切片。誤差條代表5-95百分位數(shù)。(圖1L)在具有所示基因型的MMTV-Wnt小鼠中的乳房腫瘤發(fā)作的動(dòng)力學(xué)。Mtdh+/+(n＝31)，Mtdh+/-(n＝48)和Mtdh-/-(n＝31)。(圖1M)在300日齡時(shí)荷有所示腫瘤數(shù)目的來自與(L)中相同群組的小鼠百分比。(圖1N)如所示的(頂部)用MPA和DMBA處理的具有所示Mtdh基因型的小鼠中的乳房腫瘤發(fā)作的動(dòng)力學(xué)。腫瘤潛伏期記錄為第一次DMBA處理后的天數(shù)。Mtdh+/+(n＝19)，Mtdh+/-(n＝13)和Mtdh-/-(n＝10)。(圖1O)在4月齡時(shí)荷有所示腫瘤數(shù)目的來自與(圖1N)中相同群組的小鼠百分比。統(tǒng)計(jì)學(xué)：(圖1D、圖1H、圖1L、圖1N)時(shí)序檢驗(yàn)。(圖1E、圖1I、圖1J、圖1M、圖1O)卡方檢驗(yàn)。(圖1G、圖1K)曼懷二氏檢驗(yàn)。(圖1F)斯氏t檢驗(yàn)。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。圖2A-H顯示了來自Mtdh-/-小鼠的乳腺顯示出在癌基因誘導(dǎo)的擴(kuò)增和致瘤潛力中的缺陷。(圖2A)來自具有所示基因型的6周齡雌性的乳腺的CD45-CD31-TER119-(Lin-)MEC的流式細(xì)胞術(shù)。(圖2B、圖2C)在(圖2A)(n＝4)中分析的管腔(圖2B)和基底(圖2C)細(xì)胞的定量。(圖2D)用從MMTV-PyMT(n＝6)、MMTV-Wnt(n＝4)、MMTV-ErbB2(n＝6)小鼠的腫瘤前腺體解離的WT或KOMEC的乳房球(mammosphere)形成測(cè)定。測(cè)定對(duì)于每個(gè)乳腺一式三份執(zhí)行。(圖2E)在從PyMT；Mtdh+/+和PyMT；Mtdh-/-小鼠的腫瘤前腺體解離的未分選MEC的原位移植后3個(gè)月的乳房腫瘤發(fā)生率(左)和大小(右)。(圖2F)在來自PyMT；Mtdh+/+小鼠的腫瘤前腺體的所示分選的CD24+CD29低管腔或CD24+CD29高基底MEC的原位移植后8周的乳房腫瘤發(fā)生率(左)和大小(右)。(圖2G、圖2H)在來自PyMT；Mtdh+/+和PyMT；Mtdh-/-小鼠的腫瘤前腺體的Lin-CD24+CD29低管腔細(xì)胞的原位移植后8周的乳房腫瘤發(fā)生率(圖2G)和體積(圖2H)。統(tǒng)計(jì)學(xué)：(圖2B-D)斯氏t檢驗(yàn)。(圖2E-H)，基于有限稀釋分析的腫瘤發(fā)生率和基于曼懷二氏檢驗(yàn)的腫瘤體積。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。數(shù)據(jù)代表平均值±SEM。圖3A-L還顯示了MTDH是癌基因誘導(dǎo)的管腔和基底TIC而不是MaSC的活性所需的。(圖3A、圖3B)在來自6月齡ErbB2；Mtdh+/+(n＝14)、ErbB2；Mtdh+/-(n＝26)和ErbB2；Mtdh-/-(n＝16)小鼠的無腫瘤乳腺中的增生發(fā)生率(圖3A)和嚴(yán)重性(B)。(圖3C)使用CD29和CD61標(biāo)記物來自具有所示基因型的6周齡雌性的乳腺的CD45-CD31-TER119-CD24+MEC的流式細(xì)胞術(shù)。注意，這是與圖3B中所示相同的分批實(shí)驗(yàn)。(圖3D)在(圖3A)(n＝4)中分析的CD24+(上圖)、CD24+CD29低管腔細(xì)胞(中圖)和CD24+CD29hi基底細(xì)胞(下圖)中的CD61+細(xì)胞百分比。數(shù)據(jù)代表平均值±SEM。(圖3E)來自從Wnt增生腺體解離的所示細(xì)胞群的CD61+或CD61-細(xì)胞的乳房球形成測(cè)定。數(shù)據(jù)代表平均值±SEM。(圖3F、圖3G)來自7個(gè)月無腫瘤乳腺的所示分選管腔和基底群的10000個(gè)細(xì)胞的原位移植到NSG小鼠內(nèi)之后2個(gè)月的乳腺腫瘤發(fā)生率(圖3F)和腫瘤體積(圖3G)。(圖3H)自發(fā)性ErbB2誘導(dǎo)的腫瘤和通過所示移植細(xì)胞生成的腫瘤的H&E染色。比例尺：200μm(上)和100μm(下)。(圖3I)在(圖3J-K)中使用的乳腺重構(gòu)測(cè)定的示意圖。(圖3J、圖3K)顯示從WT或KO雌性處女小鼠的乳腺解離的Lin-MEC(圖3J)或Lin-CD24+CD29hiMEC(圖3K)的有限數(shù)目移植到WT接受者的清除乳房脂肪墊內(nèi)的表。組合且顯示了三個(gè)獨(dú)立分批的實(shí)驗(yàn)。(圖3L)在(圖3K)中重構(gòu)的乳房生長的定量(填充有生長的脂肪墊面積％)。實(shí)驗(yàn)組無一通過曼懷二氏檢驗(yàn)是有意義的。統(tǒng)計(jì)學(xué)：(圖3D、圖3E)斯氏t檢驗(yàn)。(圖3G)曼懷二氏檢驗(yàn)。(圖3A、圖3F)Fisher氏精確檢驗(yàn)。(圖3B)卡方檢驗(yàn)。(圖3J、圖3K)有限稀釋分析。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。圖4A-O顯示了MTDH是癌基因誘導(dǎo)的TIC功能性固有需要的。(圖4A)用于生成具有(Mtdh-/-+Tg)或不具有MMTV-Mtdh轉(zhuǎn)基因的PyMT；Mtdh-/-小鼠的MMTV-Mtdh轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體和育種計(jì)劃的示意圖。(圖4B)來自Mtdh+/+、Mtdh-/-或Mtdh-/-+Tg小鼠的PyMT誘導(dǎo)腫瘤中的MTDH蛋白質(zhì)水平。(圖4C)來自具有所示基因型的6周齡雌性的腫瘤前乳腺的Lin-MEC(n＝4)中的CD24+CD29低管腔群的定量(左側(cè)柱：Mtdh-/-小鼠；右側(cè)柱：Mtdh-/-+Tg小鼠)。(圖4D)具有所示基因型的MMTV-PyMT雌性中的乳房腫瘤發(fā)作的動(dòng)力學(xué)。Mtdh-/-(n＝21)，Mtdh-/-+Tg(n＝20)。圖4(E)與(圖4D)中相同的小鼠群組在所示年齡(左側(cè)柱：Mtdh-/-小鼠；右側(cè)柱：Mtdh-/-+Tg小鼠)時(shí)的無腫瘤乳腺的平均數(shù)目。(圖4F)與(圖4D)中相同的小鼠群組的腫瘤負(fù)荷。(圖4G、圖4H)MTDH在新鮮解離的PyMT；Mtdh+/+pMEC和體外乳房球中被兩種獨(dú)立shRNA(KD1和KD2)擊倒(圖4G，n＝5，各自一式三份；左側(cè)柱：對(duì)照；中間柱：KD1；右側(cè)柱：KD2)，并且執(zhí)行體內(nèi)腫瘤形成測(cè)定(圖4H，在3個(gè)月時(shí)的發(fā)生率)。FC，倍數(shù)變化。(圖4I、圖4J)小鼠MTDH在經(jīng)由慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的新鮮解離的PyMT；Mtdh-/-pMEC中以及體外乳房球(圖4I，n＝4，各自一式三份；左側(cè)柱：載體；右側(cè)柱：MTDH)中表達(dá)，并且執(zhí)行體內(nèi)腫瘤形成(圖4J)測(cè)定。(圖4K)L-O中的實(shí)驗(yàn)的示意圖。(圖4L)來自PyMT；Mtdh+/+腫瘤的ALDH陽性或ALDH陰性腫瘤細(xì)胞的乳房球形成。(圖4M)MTDH在來自PyMT；Mtdh+/+腫瘤的分選ALDH+細(xì)胞中被擊倒，并且執(zhí)行乳房球測(cè)定。(圖4N)來自Wnt；Mtdh+/+腫瘤的Lin-CD24+CD61+或Lin-CD24+CD61-腫瘤細(xì)胞的乳房球形成。(圖4O)MTDH在來自Wnt；Mtdh+/+腫瘤的分選Lin-CD24+CD61+細(xì)胞中被擊倒，并且執(zhí)行乳房球測(cè)定。統(tǒng)計(jì)學(xué)：(圖4C、圖4G、圖4I、圖4L-O)斯氏t檢驗(yàn)。(圖4D)時(shí)序檢驗(yàn)。(圖4E)卡方檢驗(yàn)。(圖4F)曼懷二氏檢驗(yàn)。(圖4H、圖4J)有限稀釋分析。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。數(shù)據(jù)代表平均值±SEM。圖5A-H顯示了MTDH是乳房上皮細(xì)胞的腫瘤起始活性固有需要的。(圖5A)包括MMTV-LTR(小鼠乳房腫瘤病毒長末端重復(fù))啟動(dòng)子、小鼠Mtdh編碼序列和SV40多腺苷酸化序列的MMTV-Mtdh轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的示意圖。HindIII和EcoRI限制性位點(diǎn)用于克隆Mtdh；SalI和SpeI限制位點(diǎn)用于使片段線性化用于顯微注射到小鼠受精卵內(nèi)。(圖5B)由轉(zhuǎn)基因小鼠尾剪純化的基因組DNA經(jīng)歷DNA印跡。顯示的是在通過兩種獨(dú)立的限制性酶消化后的一個(gè)陽性創(chuàng)立者系18和兩個(gè)陽性對(duì)照。(圖5C)來自8周齡轉(zhuǎn)基因陽性或陰性雌性同窩者的器官中的MtdhmRNA水平(左側(cè)柱：9077MMTV-Mtdh-/-；中間柱：9078MMTV-Mtdh-/-；右側(cè)柱9079MMTV-Mtdh-/-)。所有小鼠均具有野生型內(nèi)源Mtdh等位基因。(圖5D)來自具有或不具有MMTV-Mtdh轉(zhuǎn)基因的PyMT；Mtdh-/-小鼠的自發(fā)性PyMT誘導(dǎo)腫瘤的H&E染色。比例尺：200μm(上)和100μm(下)。(圖5E)MTDH在ErbB2；Mtdh+/+pMEC(n＝5)中被兩種shRNA(KD1和KD2)擊倒，并且乳房球形成測(cè)定對(duì)于每種獨(dú)立樣品一式三份執(zhí)行(左側(cè)柱：對(duì)照；中間柱：KD1；右側(cè)柱：KD2)。數(shù)據(jù)代表平均值±SEM，通過斯氏t檢驗(yàn)***p<0.001。(圖5F)在用PyMT；Mtdh-/-腫瘤細(xì)胞注射的FVB小鼠中的乳房腫瘤發(fā)作(左)和生長(右)的動(dòng)力學(xué)，所述PyMT；Mtdh-/-腫瘤細(xì)胞用載體對(duì)照或Mtdh表達(dá)慢病毒(n＝10)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。p值基于時(shí)序檢驗(yàn)(左)和斯氏t檢驗(yàn)(右)。(圖5G、圖5H)在用載體對(duì)照或Mtdh表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的pMEC(來自兩只獨(dú)立的PyMT；Mtdh-/-小鼠)的原位移植后的乳房腫瘤發(fā)生率。(圖5I)在來源于PyMT；Mtdh+/+腫瘤的細(xì)胞中的ALDH活性的代表性流式細(xì)胞術(shù)分析。DEAB抑制劑處理的樣品充當(dāng)門控對(duì)照。(圖5J)在用來自(圖5I)的ALDH陽性和陰性腫瘤細(xì)胞移植的小鼠中的乳房腫瘤發(fā)作(n＝10)的動(dòng)力學(xué)。p值基于時(shí)序檢驗(yàn)。圖6A-F顯示了SND1是MTDH介導(dǎo)的腫瘤起始所需的。(圖6A)在PyMT；Mtdh-/-腫瘤細(xì)胞中的MTDH再表達(dá)和SND1擊倒組合。SND1KD和MTDH再表達(dá)的效率通過蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行評(píng)價(jià)。(圖6B、圖6C)體外乳房球(圖6B)和體內(nèi)腫瘤形成(圖6C，6周)測(cè)定用(圖6A)中生成的細(xì)胞執(zhí)行。+/-指示所示蛋白質(zhì)基于(圖6A)中的蛋白質(zhì)印跡存在(+)還是不存在(-)。(圖6D)SND1在PyMT；Mtdh+/+或Wnt；Mtdh+/+pMEC細(xì)胞中被擊倒，并且乳房球測(cè)定一式三份執(zhí)行。(圖6E、圖6F)在對(duì)照或SND1-KDPyMT；Mtdh+/+pMEC的原位移植后的腫瘤發(fā)生率(圖6E)和體積(圖6F)。統(tǒng)計(jì)學(xué)：(圖6B、圖6D)斯氏t檢驗(yàn)。(圖6C、圖6E)有限稀釋分析。(圖6F)曼懷二氏檢驗(yàn)。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。數(shù)據(jù)代表平均值±SEM。圖7A-E代表介導(dǎo)MTDH-SND1相互作用的關(guān)鍵區(qū)和殘基的測(cè)定。(圖7A)具有所示SND1結(jié)合能力的MTDH片段和突變體的示意圖?；谙挛乃镜慕Y(jié)果，+指示結(jié)合，并且-指示無結(jié)合。兩個(gè)假定的核定位信號(hào)是關(guān)于NLS2的殘基432–451和關(guān)于NLS3的殘基561–580。在最低限度結(jié)合區(qū)386-407的放大視圖中，靶向9個(gè)殘基用于目前研究中的誘變。W394D和W401D分別完全或強(qiáng)烈減少結(jié)合。(圖7B)通過具有所示邊界的加上GST標(biāo)簽的MTDH片段的His6-SND1ΔC下拉。結(jié)合的蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE進(jìn)行檢查并且通過考馬斯藍(lán)染色進(jìn)行顯現(xiàn)。(圖7C)通過加上GST標(biāo)簽的WT或三重突變體MTDH片段(364-582)的His6-SND1ΔC下拉。對(duì)于(圖7B)和(圖7C)，顯示了His6-SND1ΔC輸入的1/10，并且GST單獨(dú)用作陰性對(duì)照。顯示了3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。(圖7D、圖7E)來自表達(dá)所示異位人SND1、AGO2或MTDH的HEK293T細(xì)胞的裂解產(chǎn)物用抗Myc進(jìn)行免疫沉淀，并且用所示抗體進(jìn)行免疫印跡。圖8A-H顯示了SND1結(jié)合缺陷MTDH未能促進(jìn)MEC的腫瘤起始潛力。(圖8A、圖8E)來自用載體對(duì)照、WT或突變型鼠MTDH重構(gòu)的PyMT；Mtdh-/-MEC的裂解產(chǎn)物用抗MTDH抗體進(jìn)行免疫沉淀，并且就所示蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫印跡。(圖8B、圖8F)乳房球測(cè)定用由所示Mtdh構(gòu)建體重構(gòu)的PyMT；Mtdh-/-pMEC執(zhí)行。(圖8C、圖8D、圖8G、圖8H)體內(nèi)腫瘤形成(圖8C、圖8G關(guān)于腫瘤發(fā)生率；圖8D、圖8H關(guān)于腫瘤體積)使用由所示W(wǎng)T或突變型MTDH重構(gòu)的PyMT；Mtdh-/-pMEC以有限數(shù)目執(zhí)行。*注：小鼠W391DMTDH對(duì)應(yīng)于人W394DMTDH；并且小鼠W398DMTDH對(duì)應(yīng)于人W401DMTDH。統(tǒng)計(jì)學(xué)：(圖8B、圖3F)斯氏t檢驗(yàn)。(圖8C、圖8G)有限稀釋分析。(圖8D、圖8H)曼懷二氏檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)代表平均值±SEM。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。圖9A-I示出了MTDH通過在應(yīng)激下與促存活蛋白質(zhì)SND1相互作用且穩(wěn)定促存活蛋白質(zhì)SND1來賦予存活優(yōu)點(diǎn)。(圖9A)來自WT(左側(cè)柱)或KO雌性(右側(cè)柱)的正?；騇MTV-PyMT腫瘤前腺體(n>3)的切割的半胱天冬酶3-陽性MEC的定量。(圖9B)CPT對(duì)用所示Mtdh構(gòu)建體重構(gòu)的PyMT；Mtdh-/-pMEC的細(xì)胞凋亡的作用(左側(cè)柱：VEC；中間柱：WT；右側(cè)柱：W391D)通過PI和Hoechst染色進(jìn)行測(cè)定。(圖9C)CPT對(duì)于對(duì)照(左側(cè)柱)或SND1-KD(右側(cè)柱)PyMT；Mtdh+/+pMEC的細(xì)胞凋亡的作用。(圖9D)在用所示濃度的CPT處理36小時(shí)的對(duì)照或MTDH-KDPyMT；Mtdh+/+pMEC中的SND1和β-肌動(dòng)蛋白(上樣對(duì)照)的蛋白質(zhì)水平。降解曲線(右側(cè))代表3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。(圖9E)在CPT處理48小時(shí)后，在用所示構(gòu)建體重構(gòu)的PyMT；Mtdh-/-MEC中的SND1、MTDH和β-肌動(dòng)蛋白(上樣對(duì)照)的蛋白質(zhì)印跡。降解曲線(右側(cè))代表3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。(圖9F)在CPT(50μM)處理36小時(shí)后，在對(duì)照相對(duì)于SND1-KDPyMT；Mtdh+/+pMEC中展示SND1上調(diào)基因(n＝504，倍數(shù)變化>2，p<0.05)的表達(dá)的微陣列數(shù)據(jù)的熱圖表示。色鍵指示log2值。(圖9G)Ingenuity途徑分析顯示(圖9F)中所示的SND1上調(diào)基因的頂部5種分子和細(xì)胞功能以及每個(gè)類別中牽涉的分子/基因數(shù)目。(圖9H)SND1上調(diào)基因在細(xì)胞存活和細(xì)胞死亡功能中的效應(yīng)。Z得分基于如通過ingenuity知識(shí)庫指定的基因表達(dá)變化和基因功能進(jìn)行計(jì)算。給定功能當(dāng)z>2時(shí)預(yù)測(cè)為顯著增加的，或者當(dāng)z<-2時(shí)預(yù)測(cè)為減少的。(圖9I)GSEA圖顯示了與用W391D突變型MTDH援救的那些相比較，在用小鼠WTMTDH援救的PyMT；Mtdh-/-MEC中的SND1上調(diào)基因標(biāo)記(signature)的富集。所有細(xì)胞均用CPT(50μM)進(jìn)行處理。NES：標(biāo)準(zhǔn)化的富集得分。統(tǒng)計(jì)學(xué)：(圖9A-C)斯氏t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)代表平均值±SEM。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。圖10A-K顯示了MTDH和SND1對(duì)于人乳腺癌細(xì)胞的體外球形成和體內(nèi)腫瘤起始活性是重要的。(圖10A、圖10B)MTDH(圖10A)或SND1(圖10B)在HMLE-Neu細(xì)胞中被擊倒，并且腫瘤球測(cè)定一式三份執(zhí)行。(圖10C、圖10D)MTDH(圖10C)或SND1(圖10D)在BCM-4013患者來源的異種移植的(PDX)腫瘤細(xì)胞中被擊倒，并且腫瘤球測(cè)定一式三份執(zhí)行。(圖10E)MTDH或SND1在MDA-MB-231細(xì)胞中被擊倒，并且KD效率通過免疫印跡進(jìn)行測(cè)量。(圖10F)MDA-MB-231細(xì)胞的腫瘤球測(cè)定一式三份執(zhí)行。(圖10G、圖10H)在有限數(shù)目的MDA-MB-231細(xì)胞注射后5周的腫瘤發(fā)生率(圖10G)和體積(圖10H)。(圖10I)在人侵襲性乳癌(n＝154)中的MTDH和SND1的蛋白質(zhì)水平通過乳腺癌組織微陣列(BR1921a,USBiomax)的IHC染色進(jìn)行測(cè)定。腫瘤細(xì)胞中的染色強(qiáng)度評(píng)分為0(陰性)、1(弱)、2(中等)、3(強(qiáng))。(圖10J)(圖10I)的條形圖示。(圖10K)描述MTDH在腫瘤起始而不是正常腺體發(fā)育中的必要作用的圖示。在腫瘤生成期間的應(yīng)激條件下，MTDH-SND1相互作用使SND1免于應(yīng)激誘導(dǎo)的降解，并且支持基底和管腔TIC兩者的存活和活性。統(tǒng)計(jì)學(xué)：(圖10A-D、圖10F)斯氏t檢驗(yàn)。(圖10G)有限稀釋分析。(圖10H)曼懷二氏檢驗(yàn)。(圖10I、圖10J)卡方檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)代表平均值±SEM。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。圖11A-M顯示了MTDH和SND1與人乳腺癌中的蛋白質(zhì)水平正關(guān)聯(lián)，并且在預(yù)測(cè)預(yù)后不良中協(xié)作。(圖11A、圖11B)MTDH(圖11A)或SND1(圖11B)在HMLE-Neu細(xì)胞中被3種獨(dú)立shRNA擊倒，并且KD效率通過免疫印跡進(jìn)行測(cè)量。(圖11C、圖11D)MTDH(圖11C)或SND1(圖11D)在BCM-4013患者來源的異種移植的(PDX)腫瘤細(xì)胞(Zhang等人，2013)中被2種獨(dú)立shRNA擊倒，并且KO效率通過q-PCR進(jìn)行測(cè)量。數(shù)據(jù)代表平均值±SEM。(圖11E、圖11F)MTDH(圖11E)和SND1(圖11F)抗體對(duì)于免疫組織化學(xué)染色的特異性的驗(yàn)證?？贵w對(duì)人和小鼠蛋白質(zhì)兩者反應(yīng)。(圖11E)，在PyMT；Mtdh+/+和PyMT；Mtdh-/-乳房腫瘤中的MTDH的代表性免疫組織化學(xué)染色。(圖11F)，在PyMT；Mtdh+/+對(duì)照或SND1-KD腫瘤中的SND1的代表性免疫組織化學(xué)染色。比例尺：100μm。(圖11G)人乳腺腫瘤中的MTDH和SND1的蛋白質(zhì)水平通過乳腺癌組織微陣列(YTMA_201,CancerInstituteofNewJersey)的免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行測(cè)定。腫瘤細(xì)胞中的染色強(qiáng)度評(píng)分為0(陰性)、1(弱)、2(中等)、3(強(qiáng))。(圖11H)(圖11G)的條形圖示。(圖11I)在NKI295數(shù)據(jù)集中的MTDH和SND1的mRNA水平之間的關(guān)聯(lián)。(圖11J、圖11K)MTDH和SND1mRNA水平與原發(fā)性腫瘤大小(圖11J)和乳腺腫瘤的分化(圖11K)之間的關(guān)聯(lián)。(圖11L)通過MTDH和SND1的mRNA水平分層的乳腺癌患者的無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移存活(DMFS)。在圖11J-L中，使用NKI295人乳腺癌數(shù)據(jù)集(vandeVijver等人，2002)，并且樣品基于MTDH/SND1mRNA水平使用培養(yǎng)基截?cái)喾殖伤慕M。(圖11M)MTDHmRNA水平與人乳腺癌的不同亞型的預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)。在KMPlotter乳腺癌元分析數(shù)據(jù)庫中通過中值MTDH表達(dá)分層的患者的無復(fù)發(fā)存活的Kaplan-Meier圖(Gyorffy等人，2010)。統(tǒng)計(jì)學(xué)：(圖11C、圖11D)斯氏t檢驗(yàn)。(圖11G、圖11H、圖11J、圖11K)卡方檢驗(yàn)。(圖11I)皮爾森相關(guān)。(圖11L、圖11M)時(shí)序檢驗(yàn)。***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05。圖12A-D顯示了MTDH水平與人前列腺癌中的腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)。(圖12A)兩個(gè)前列腺腫瘤組織微陣列用抗MTDH抗體進(jìn)行染色。MTDH水平評(píng)分為負(fù)(0)、低(1)、中等(2)或高(3)。不同階段的前列腺組織和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的MTDH免疫染色的代表性圖像。比例尺，40μm。(圖12C)，左圖，正常組織(n＝62)以及BPN(n＝10)、PIN(n＝10)、原發(fā)性腫瘤(n＝72)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(n＝10)中的MTDH表達(dá)水平(左側(cè)柱：MTDHIHC得分0或1；右側(cè)柱：MTDHIHC得分2或3)。通過卡方檢驗(yàn)P<0.001。右圖，PIN(n＝10)和BPH(n＝10)中的MTDH水平(左側(cè)柱：MTDHIHC得分0；中間柱：MTDHIHC得分1和右側(cè)柱：MTDHIHC得分2)。通過卡方檢驗(yàn)P＝0.023。(圖12B)，MTDH水平與前列腺腫瘤格里森得分的關(guān)聯(lián)。頂部曲線代表平均MTDH得分(平均值±SEM)，并且底部曲線代表在所示組內(nèi)具有中等/高水平MTDH的樣品百分比。(圖12D)，基于其腫瘤中的MTDH表達(dá)，前列腺癌患者的無復(fù)發(fā)存活的Kaplan-Meier分析。圖13-A-D顯示了MTDH基因組增益與前列腺癌中的MTDH蛋白質(zhì)水平和臨床進(jìn)展相關(guān)。(圖13A)，前列腺腫瘤組織微陣列通過FISH就MTDH基因組拷貝數(shù)進(jìn)行分析。所顯示的是不具有(左)或具有(右)MTDH基因組增益的腫瘤的例子。SpectrumGreen(綠色)和SpectrumOrange(淡橙色)探針分別檢測(cè)染色體8著絲粒和8q22區(qū)域。比例尺，1μm。(圖13B)，MTDH基因組增益與MTDH蛋白質(zhì)水平關(guān)聯(lián)。具有MTDH增益的樣品，n＝11；不具有MTDH增益的樣品，n＝64。通過卡方檢驗(yàn)P＝0.0018。(圖13C)，在前列腺非癌性組織或腫瘤中的MTDH基因組增益的頻率。正常/良性/惡變前，n＝38；原發(fā)性腫瘤，n＝29；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，n＝8。顯示了通過卡方檢驗(yàn)的P值。(圖13D)，在其腫瘤中具有和不具有MTDH基因組增益的前列腺癌患者的無復(fù)發(fā)存活的Kaplan-Meier分析。顯示了Cox比例風(fēng)險(xiǎn)比(HR)。圖14A-F顯示了具有不同Mtdh狀態(tài)的TRAMP小鼠的代和表征。(圖14A)，在具有不同Mtdh狀態(tài)的C57BL/6背景中用于生成TRAMP小鼠的交叉方案。(圖14B)，(圖14A)中生成的小鼠的基因分型。頂部，檢測(cè)到的WT(602bp)和Mtdh的基因捕獲的突變型等位基因(472bp)。底部，檢測(cè)到的TRAMP轉(zhuǎn)基因(600bp)和內(nèi)部基因組對(duì)照(324bp)。(圖14C)，通過qPCR分析的來自具有所示基因型的小鼠的前列腺組織中的MtdhmRNA。MtdhmRNA在Mtdh-/-組織中是無法檢測(cè)的，并且與正常腺體相比較在TRAMP陽性前列腺組織中是升高的。基于曼懷二氏檢驗(yàn)**P<0.01，***P<0.001。(圖14D)，來自WT非轉(zhuǎn)基因小鼠的前列腺和來自TRAMP/Mtdh+/+小鼠的腫瘤中的Mtdh的蛋白質(zhì)印跡分析。在針對(duì)β-肌動(dòng)蛋白標(biāo)準(zhǔn)化后的Mtdh蛋白質(zhì)的任意水平顯示于底部。E-F，來自8周齡(圖14E)和28周齡(圖14F)TRAMP/Mtdh+/+和TRAMP/Mtdh-/-小鼠的前列腺中的SV40Tag癌蛋白的代表性免疫組織化學(xué)染色。比例尺，50μm。圖15A-E顯示了在小鼠中的Mtdh喪失抑制腫瘤形成，減少腫瘤負(fù)荷且增加存活率。(圖15A-B)，從TRAMP/Mtdh+/+和TRAMP/Mtdh+/-小鼠(指示為Mtdh+)或TRAMP/Mtdh-/-(指示為Mtdh-)中切除的下部泌尿生殖道的濕重(圖15A)或作為體重％的相對(duì)重量(圖15B)。數(shù)據(jù)代表平均值±SEM。基于曼懷二氏檢驗(yàn)**P<0.01。(圖15C)，從具有所示基因型的36周齡雄性小鼠中切除的下部泌尿生殖道(B，膀胱；P，前列腺；SV，精囊)的代表性圖像。比例尺，1cm。(圖15D)，腫瘤發(fā)生率通過檢查來自不同年齡具有所示Mtdh基因型的TRAMP小鼠群組的前列腺的組織切片進(jìn)行評(píng)分。在每個(gè)條形圖頂部上的數(shù)目指示具有前列腺癌的小鼠數(shù)目相對(duì)于在給定組中檢查的小鼠總數(shù)目。基于卡方檢驗(yàn)*P<0.05和**P<0.01。(圖15E)，通過一年年齡具有所示Mtdh基因型的TRAMP小鼠的死亡率?；诳ǚ綑z驗(yàn)***P<0.001。圖16A-C顯示了Mtdh的喪失抑制前列腺癌的惡性進(jìn)展。(圖16A)，從所示年齡的TRAMP/Mtdh+和TRAMP/Mtdh-小鼠解離的前列腺H&E染色的組織切片。比例尺：200μm。(圖16B)，來自具有所示基因型和年齡的小鼠的每個(gè)前列腺指定單一最高級(jí)別。‘+’和‘–’分別指示TRAMP/Mtdh+和TRAMP/Mtdh-小鼠。級(jí)別得分：1，正常；2，低級(jí)別PIN；3，高級(jí)別PIN；4，高度分化腺癌和葉狀腫瘤；5，中等分化腺癌；6，低分化腺癌和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。分級(jí)方案遵循如先前描述的標(biāo)準(zhǔn)方案(Hurwitz等人，Currentprotocolsinimmunology/由JohnEColigan[等人]編輯.2001；Chapter20:Unit205)。在每個(gè)柱底部處的數(shù)目指示在每組中評(píng)估的前列腺總數(shù)目。在T36中通過卡方檢驗(yàn)P<0.05。(圖16C)，Ki67陽性上皮細(xì)胞的定量。數(shù)據(jù)代表平均值±SEM?；谒故蟭檢驗(yàn)**P<0.01。圖17A-B顯示了Mtdh的消除減少前列腺癌的全身轉(zhuǎn)移。(圖17A)，在具有所示Mtdh基因型的一年齡TRAMP小鼠群組中的肺、肝和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率?；诳ǚ綑z驗(yàn)的P值。(圖17B)，(圖17A)的條形圖示(左側(cè)柱：Mtdh+；右側(cè)柱：Mtdh-)。圖18A-G顯示了在TRAMP-C1前列腺癌細(xì)胞中的Mtdh沉默減少體外增殖和體內(nèi)腫瘤形成。(圖18A-B)，Mtdh被兩種獨(dú)立shRNA擊倒，如通過qPCR(圖18A)和蛋白質(zhì)印跡(圖18B)定量的。(圖18C)，在48小時(shí)后的對(duì)照和Mtdh-KDTRAMP-C1癌細(xì)胞的增殖率。(圖18D)，用對(duì)照(n＝16)、Mtdh-KD1(n＝8)和Mtdh-KD2(n＝12)TRAMP-C1細(xì)胞皮下移植的雄性小鼠中的前列腺腫瘤發(fā)作的動(dòng)力學(xué)?；跁r(shí)序檢驗(yàn)的P值。(圖18E)，在(圖18D)中注射后5周的腫瘤體積。基于曼懷二氏檢驗(yàn)的***P<0.001。(圖18F)，在(圖18D)中移植后5周解離的腫瘤的圖像。G，在對(duì)照和KD組中形成的腫瘤中的MtdhmRNA水平。注意在KD組中最終生長的腫瘤表達(dá)與對(duì)照相似水平的Mtdh。(圖18A、圖18C、圖18G)數(shù)據(jù)代表平均值±SEM和基于斯氏t檢驗(yàn)的P值。**P<0.01，***P<0.001，n.s.不顯著。圖(19)顯示了SND1-MTDH相互作用及其復(fù)合物的總體結(jié)構(gòu)的映射。MTDH-SND1復(fù)合物的總體結(jié)構(gòu)。顯示了兩個(gè)垂直視圖。SND1和MTDH的SN1和SN2結(jié)構(gòu)域分別被染成青色、品紅色和黃色。SND1顯示于色帶(左)和曲面(右)中。MTDH顯示于蠕蟲(主鏈)和圓柱(側(cè)鏈)中。圖20A-B代表了SN1/2與SN3/4和SNase的結(jié)構(gòu)和序列比較。(圖20A)立體視圖中的SN1/2(品紅色，在具有MTDH的復(fù)合物中)、SN3/4(藍(lán)色，PDB代碼：3BDL)以及SNase的兩個(gè)模型(黃色，PDB代碼：2ENB)的結(jié)構(gòu)覆蓋。Lβ2-β3環(huán)中的差異通過虛線圓圈強(qiáng)調(diào)。(圖20B)SN1/2與來自SND1的SN3/4和SNase的序列比對(duì)。二級(jí)結(jié)構(gòu)元素指示在序列上方。保守殘基顏色為紅色。與MTDH相互作用的殘基通過綠色方塊鑒定。在促成核酸酶活性的SNase的活性位點(diǎn)處的殘基通過紅色圓圈指示。圖21示出了MTDH-SND1結(jié)合界面。MTDH-SND1界面的特寫立體照片。顯示了來自SN3結(jié)構(gòu)域(淺藍(lán)色)和SNase(黃色)的Lβ2-β3環(huán)，用于突出顯示MTDH結(jié)合所需的SN1Lβ2-β3環(huán)的獨(dú)特結(jié)構(gòu)。圖22A-D顯示了在結(jié)合中缺陷的MTDH和SND1突變體的鑒定。(圖22A)通過具有WT或突變體序列的加上GST標(biāo)簽的MTDH(364-582)的SND1(16-339)的體外下拉。結(jié)合GS4B的蛋白質(zhì)在SDS-PAGE上進(jìn)行檢查，并且通過考馬斯藍(lán)染色進(jìn)行顯現(xiàn)。(圖22B)通過加上GST標(biāo)簽的MTDH(364-582)的WT和突變型SND1(16-339)的體外下拉。結(jié)合的蛋白質(zhì)如(圖22A)中進(jìn)行檢查。對(duì)于(圖22A)和(圖22B)兩者，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次；顯示了代表性結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)化的結(jié)合百分比由三次實(shí)驗(yàn)求平均值；平均值±SEM顯示于數(shù)據(jù)下方。(圖22C)HEK293T細(xì)胞用具有所示單一點(diǎn)突變的人HA-SND1、WTMyc-MTDH或Myc-MTDH進(jìn)行轉(zhuǎn)染。裂解產(chǎn)物用抗Myc抗體進(jìn)行免疫沉淀，并且用所示抗體進(jìn)行免疫印跡。(圖22D)HEK293T細(xì)胞用具有所示單一點(diǎn)突變或缺失的人Myc-MTDH、WTHA-SND1或突變型HA-SND1進(jìn)行轉(zhuǎn)染。裂解產(chǎn)物用抗Myc進(jìn)行免疫沉淀，并且用所示抗體進(jìn)行免疫印跡。圖23A-E顯示了SND1結(jié)合殘基中的突變損害MTDH的腫瘤促進(jìn)功能。(圖23A)來自用載體對(duì)照、WT或突變型鼠MTDH重構(gòu)的PyMT；Mtdh-/-腫瘤細(xì)胞的裂解產(chǎn)物用抗MTDH抗體進(jìn)行免疫沉淀，并且就所示蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫印跡。注意所有氨基酸注釋均基于人MTDH。人MTDH的W394和W401分別對(duì)應(yīng)于鼠MTDH中的W391和W398。(圖23B)乳房球測(cè)定用由所示MTDH構(gòu)建體重構(gòu)的PyMT；Mtdh-/-腫瘤細(xì)胞執(zhí)行。(圖23C-E)體內(nèi)腫瘤形成(圖23C用于腫瘤發(fā)生率；圖23D、圖23E用于腫瘤體積)使用由所示W(wǎng)T或突變型MTDH重構(gòu)的PyMT；Mtdh-/-腫瘤細(xì)胞以有限數(shù)目執(zhí)行。統(tǒng)計(jì)學(xué)：(圖23B)斯氏t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)代表平均值±SEM.(圖23C)有限稀釋分析。(圖23D、圖23E)曼懷二氏檢驗(yàn)。**p<0.01，*p<0.05。圖24A-D顯示了MTDH結(jié)合袋中的突變損害SND1的腫瘤促進(jìn)功能。(圖24A)來自用載體對(duì)照、WT或突變型shRNA抗性鼠SND1重構(gòu)的SND1-KDPyMT；Mtdh+/+腫瘤細(xì)胞的裂解產(chǎn)物用抗MTDH抗體進(jìn)行免疫沉淀，并且就所示蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫印跡。(圖24B)。乳房球測(cè)定用由載體對(duì)照或所示SND1構(gòu)建體重構(gòu)的SND1-KDPyMT；Mtdh+/+腫瘤細(xì)胞執(zhí)行。(圖24C、圖24D)在用所示構(gòu)建體重構(gòu)的SND1-KDPyMT；Mtdh+/+腫瘤細(xì)胞的原位移植后的乳房腫瘤發(fā)生率(圖24C)和腫瘤生長曲線(圖24D)。統(tǒng)計(jì)學(xué)：(圖24B、圖24D)斯氏t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)代表平均值±SEM。(圖24C)卡方檢驗(yàn)。***p<0.01，*p<0.01，*p<0.05。圖25顯示了MTDH相互作用使SND1免于熱激(heatshock)應(yīng)激誘導(dǎo)的降解。HEK293T細(xì)胞用HA-SND1連同空載體對(duì)照或者所示W(wǎng)T或突變型Myc-MTDH構(gòu)建體一起進(jìn)行轉(zhuǎn)染。感染后兩天，細(xì)胞在熱激條件下進(jìn)行處理，并且裂解產(chǎn)物就所示蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫印跡。β-肌動(dòng)蛋白用作上樣對(duì)照。顯示了三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。圖26A-D顯示了野生型MTDH肽顯著阻斷MTDH-SND1相互作用。293T細(xì)胞用HA-SND1和MYC-MTDH進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。在48小時(shí)后，細(xì)胞被收集且經(jīng)歷IP測(cè)定。(圖26A、圖26B)細(xì)胞裂解產(chǎn)物與抗HA抗體或IgG一起溫育過夜，隨后為與蛋白A/G珠的2小時(shí)溫育，以下拉HA-SND1蛋白質(zhì)。珠用裂解緩沖液進(jìn)行洗滌且分成5個(gè)級(jí)分。每個(gè)級(jí)分用緩沖液或所示肽洗脫30分鐘。收集洗脫級(jí)分和珠用于WB。(圖26C、圖26D)細(xì)胞裂解產(chǎn)物分成6個(gè)級(jí)分，其中之一與IgG進(jìn)行溫育，并且剩余部分與抗HA抗體加上緩沖液或所示肽一起溫育。在24小時(shí)后，裂解產(chǎn)物與蛋白A/G珠一起溫育，隨后珠在洗滌緩沖液中進(jìn)行洗滌。圖27A-B顯示了相互作用中斷效應(yīng)通過乳腺癌細(xì)胞系的內(nèi)源免疫沉淀加以證實(shí)。乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231被收集且經(jīng)歷IP測(cè)定。(圖27A)細(xì)胞裂解產(chǎn)物與抗SND1抗體或IgG一起溫育過夜，隨后為與蛋白A/G珠的2小時(shí)溫育，以下拉內(nèi)源SND1蛋白質(zhì)。珠用裂解緩沖液進(jìn)行洗滌且分成5個(gè)級(jí)分。每個(gè)級(jí)分用緩沖液或所示肽洗脫30分鐘。收集洗脫級(jí)分和珠用于WB。(圖27B)細(xì)胞裂解產(chǎn)物分成5個(gè)級(jí)分，并且與抗SND1抗體加上緩沖液或所示肽一起溫育。在24小時(shí)后，裂解產(chǎn)物與蛋白A/G珠一起溫育，隨后珠在洗滌緩沖液中進(jìn)行洗滌。圖28顯示了荷有在SND1結(jié)合基序中的突變的MTDH突變體的鑒定，所述突變對(duì)SND1結(jié)合沒有作用或具有很少作用。通過荷有WT或突變體序列的加上GST標(biāo)簽的MTDH(SEQIDNO:1的氨基酸386-407)的SND1(SEQIDNO:2的氨基酸16-339)的體外下拉。結(jié)合GS4B的蛋白質(zhì)在SDS-PAGE上進(jìn)行檢查，并且通過考馬斯藍(lán)染色進(jìn)行顯現(xiàn)。具體實(shí)施方式本公開內(nèi)容提供了通過使用肽或其他化合物抑制MTDH-SND1復(fù)合物的活性，來減少癌癥生長和癌癥轉(zhuǎn)移的方法，所述肽或其他化合物抑制SND1與MTDH的結(jié)合。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)MTDH缺陷抑制不同的癌基因或致癌劑誘導(dǎo)的腫瘤生成。下文結(jié)果顯示MTDH是TIC選擇性需要的，并且MTDH介導(dǎo)的SND1穩(wěn)定賦予在應(yīng)激下的存活優(yōu)點(diǎn)。這是MTDH相互作用是SND1依賴性促存活基因表達(dá)所需的首個(gè)公開內(nèi)容。如本文和所附權(quán)利要求中使用的，單數(shù)形式“一個(gè)/一種”和“該/所述”包括復(fù)數(shù)指示物，除非上下文另有明確說明。因此，例如，提及“衍生物”包括多個(gè)此類衍生物，并且提及“患者”包括提及一個(gè)或多個(gè)患者等等。此外，“或”的使用意指“和/或”，除非另有說明。類似地，“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(including)”可互換且不預(yù)期是限制性的。還應(yīng)理解當(dāng)各個(gè)實(shí)施例的描述使用術(shù)語“包含”時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解在一些具體情況下，實(shí)施例可替代地可使用語言“基本上由……組成”或“由……組成”進(jìn)行描述。除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本公開內(nèi)容所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。盡管本文描述了示例性方法、裝置和材料，但與本文描述的那些相似或等價(jià)的方法和材料可用于實(shí)踐所公開的方法和產(chǎn)物。上文和正文自始至終討論的文件僅為了其在本專利申請(qǐng)的提交日之前的公開內(nèi)容而提供。本文中任何內(nèi)容不應(yīng)被解釋為承認(rèn)發(fā)明人由于在先公開內(nèi)容而無權(quán)先于這樣的公開內(nèi)容。每個(gè)文件以引用的方式全文并入，特別注意其被引用的公開內(nèi)容。下述參考文獻(xiàn)為技術(shù)人員提供了本公開內(nèi)容中使用的許多術(shù)語的一般定義：Singleton等人，DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY(第2版1994)；THECAMBRIDGEDICTIONARYOFSCIENCEANDTECHNOLOGY(Walker編輯，1988)；THEGLOSSARYOFGENETICS，第五版，R.Rieger等人(編輯)，SpringerVerlag(1991)；以及Hale和Marham，THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY(1991)。如本文使用的，“異粘蛋白(MTDH)和含葡萄球菌核酸酶結(jié)構(gòu)域1(SND1)之間的相互作用的抑制劑”或“MTDH/SND1抑制劑”指在兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)處抑制MTDH與SND1的相互作用的化合物或組合物。在一個(gè)實(shí)施例中，抑制劑抑制在MTDH(即SEQIDNO:1)的殘基393-403處的蛋白質(zhì)之間的結(jié)合。另外的抑制劑在詳述中更詳細(xì)地描述。如本文使用的，“治療有效量”或“有效量”指本文描述的肽或其他抑制劑產(chǎn)物的量，所述量足以導(dǎo)致癥狀的改善，例如有關(guān)醫(yī)學(xué)狀況的治療、治愈、預(yù)防或改善，或者此類狀況的治療、治愈、預(yù)防或改善率中的增加，從而通常提供治療的患者群體中的統(tǒng)計(jì)上顯著的改善。當(dāng)提及單獨(dú)施用的個(gè)別活性成分時(shí)，治療有效劑量指該單獨(dú)成分。當(dāng)提及組合時(shí)，治療有效劑量指無論是否組合施用(包括序貫或同時(shí))均導(dǎo)致療效的活性成分的組合量。在各個(gè)實(shí)施例中，肽或其他抑制劑產(chǎn)物的治療有效量改善與各種癌癥相關(guān)的癥狀，包括但不限于食欲缺乏、口腔疼痛、上腹痛、疲勞、腹部腫脹、持續(xù)性痛、骨痛、惡心、嘔吐、便秘、重量減輕、頭痛、直腸出血、盜汗、消化不良和尿痛。“處理”指預(yù)防性處理或治療性處理。在某些實(shí)施例中，“處理”指化合物或組合物對(duì)受試者的施用用于治療或預(yù)防目的?！爸委熜浴碧幚硎鞘┯糜陲@示出病理狀況的體征或癥狀的處理，用于縮小或消除那些體征或癥狀的目的。體征或癥狀可為生物化學(xué)、細(xì)胞、組織學(xué)、功能或物理的、主觀或客觀的?！邦A(yù)防性”處理是施用于未顯示出疾病體征或僅顯示出疾病的早期體征的處理，用于減少發(fā)展病理狀況的危險(xiǎn)的目的。本公開內(nèi)容的化合物或組合物可作為預(yù)防性處理給予，以減少發(fā)展病理狀況的危險(xiǎn)。本公開內(nèi)容的化合物或組合物可作為預(yù)防性處理給予，以減少發(fā)展病理狀況的可能性，或使病理狀況(如果發(fā)展的話)的嚴(yán)重性降到最低?！八幬锝M合物”指適合于受試者動(dòng)物包括人和哺乳動(dòng)物中的藥物用途的組合物。藥物組合物包含治療有效量的本文描述的肽或其他產(chǎn)物，任選另一種生物學(xué)活性劑，以及任選的藥學(xué)可接受的賦形劑、載體或稀釋劑。在一個(gè)實(shí)施例中，藥物組合物涵蓋這樣的組合物，所述組合物包含活性成分、和構(gòu)成載體的惰性成分，以及直接或間接起因于成分中的任何兩種或更多種的組合、復(fù)合或聚集，或者起因于成分中的一種或多種的解離，或者起因于成分中的一種或多種的其他類型的反應(yīng)或相互作用的任何產(chǎn)物。相應(yīng)地，本公開內(nèi)容的藥物組合物涵蓋通過混合本公開內(nèi)容的化合物和藥學(xué)可接受的賦形劑、載體或稀釋劑制備的任何組合物?！八帉W(xué)可接受的載體”指標(biāo)準(zhǔn)藥物載體、緩沖液等等中的任一種，例如磷酸鹽緩沖鹽水溶液、5％右旋糖水溶液、以及乳狀液(例如油/水或水/油乳狀液)。賦形劑的非限制性例子包括佐劑、粘合劑、填料、稀釋劑、崩解劑、乳化劑、濕潤劑、潤滑劑、助流劑、甜味劑、調(diào)味劑和著色劑。合適的藥物載體、賦形劑和稀釋劑在Remington'sPharmaceuticalSciences，第19版(MackPublishingCo.,Easton,1995)中描述。優(yōu)選的藥物載體取決于活性劑的預(yù)期施用模式。通常的施用模式包括腸內(nèi)(例如經(jīng)口)或胃腸外(例如皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射；或者局部、經(jīng)皮或經(jīng)粘膜施用)。如本文使用的，活性劑的“藥學(xué)可接受的”或“藥理學(xué)可接受的”鹽、酯或其他衍生物包含例如鹽、酯或其他衍生物，指并非生物學(xué)或其他方面不期望的材料，即材料可施用于個(gè)體而不引起任何不期望的生物效應(yīng)，或不以有害方式與它包含在其中的組合物的組分中的任一種或個(gè)體機(jī)體上或機(jī)體中存在的任何組分相互作用。如本文使用的，術(shù)語“單位劑型”指適合于作為用于人和動(dòng)物受試者的單元?jiǎng)┝康奈锢砩喜贿B續(xù)單位，每個(gè)單位含有以足以產(chǎn)生所需效應(yīng)的量計(jì)算的預(yù)定數(shù)量的本公開內(nèi)容的化合物，任選與藥學(xué)可接受的賦形劑、稀釋劑、載體或媒介物結(jié)合。關(guān)于本公開內(nèi)容的新型單位劑型的規(guī)格取決于采用的具體化合物和待實(shí)現(xiàn)的效應(yīng)，以及在宿主中與每種化合物相關(guān)的藥效學(xué)。如本文使用的，術(shù)語“受試者”涵蓋哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物的例子包括但不限于哺乳動(dòng)物綱的任何成員：人、非人靈長類動(dòng)物例如黑猩猩、以及其他猿和猴物種；農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物例如牛、馬、綿羊、山羊、豬；家養(yǎng)動(dòng)物例如兔、犬和貓；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物包括嚙齒類動(dòng)物，例如大鼠、小鼠和豚鼠等等。該術(shù)語不指示特定年齡或性別。在各個(gè)實(shí)施例中，受試者是人。異粘蛋白和SND1異粘蛋白：異粘蛋白(MTDH；也稱為AEG1、3D3/LYRIC)先前鑒定為位于8q22中的促轉(zhuǎn)移基因，所述8q22是與乳腺癌的弱無復(fù)發(fā)存活聯(lián)系的頻繁擴(kuò)增的基因組基因座(Hu等人，2009)。人異粘蛋白的氨基酸序列可在以引用的方式并入本文的Genbank登錄號(hào)AAH45642中發(fā)現(xiàn)，并且還在本文中作為SEQIDNO:1提供。近年來，升高水平的MTDH已在超過20個(gè)癌癥類型中報(bào)道(4)，表明該基因在人癌癥中的潛在關(guān)鍵和廣泛功能性。取決于測(cè)試的癌癥類型，主要使用細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的近期研究已牽涉許多癌癥相關(guān)過程中的MTDH，所述癌癥相關(guān)過程包括細(xì)胞增殖、應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡、侵襲、化學(xué)抗性和轉(zhuǎn)移(Emdad等人，2013；Wan和Kang，2013)MTDH的這些多效性腫瘤促進(jìn)作用可起于這種蛋白質(zhì)的復(fù)雜性質(zhì)，如通過其初始鑒定揭示的。MTDH最初報(bào)道為星形細(xì)胞中的HIV誘導(dǎo)基因(Su等人，2002)，介導(dǎo)乳房腫瘤細(xì)胞對(duì)肺內(nèi)皮的歸巢的細(xì)胞表面分子(Brown和Ruoslahti等人，2004)，與前列腺上皮細(xì)胞中的緊密連接相關(guān)的富含賴氨酸的CEACAM1共分離(LYRIC)蛋白質(zhì)(Britt等人，2004)，以及作為不同亞細(xì)胞區(qū)室中存在的新型跨膜蛋白質(zhì)(Sutherland等人，2004)。在分子水平上，人MTDH編碼具有可指示其生物功能的無法識(shí)別的結(jié)構(gòu)域的582個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，加上假定的跨膜結(jié)構(gòu)域和三個(gè)富含賴氨酸的核定位信號(hào)(Thirkettle等人，2009)。MTDH近期已報(bào)道與多重蛋白質(zhì)相互作用。在核中，MTDH顯示與PLZF(Thirkettle等人，2009)、BCCIPα(Ash等人，2008)和NFκB亞基p65(Emdad等人，2006；Sarkar等人，2008)相互作用。在細(xì)胞質(zhì)中，MTDH據(jù)報(bào)道與含葡萄球菌核酸酶結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)1(SND1)(Blanco等人，2011；Yoo等人，2011；Meng等人，2012)相互作用。MTDH還以癌細(xì)胞類型依賴性方式聯(lián)系至多重經(jīng)典癌基因信號(hào)傳導(dǎo)途徑，例如PI3K/AKT和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)(Emdad等人，2013)。然而，MTDH是否通過與其結(jié)合配偶體的相互作用發(fā)揮其功能，并且MTDH如何調(diào)節(jié)上述癌基因途徑在很大程度上仍是未知的。SND1：SND1是具有在N末端處的葡萄球菌核酸酶(SN)樣結(jié)構(gòu)域的四個(gè)串聯(lián)重復(fù)(SN1-4)，以及在C末端處的融合tudor和SN結(jié)構(gòu)域(TSN5結(jié)構(gòu)域)的多功能蛋白質(zhì)(Callebaut和Mornon，1997；Ponting,1997)。它屬于由蛋白質(zhì)組成的寡核苷酸/寡糖結(jié)合折疊(OB折疊)超家族，所述蛋白質(zhì)主要經(jīng)由OB折疊的典型β-桶參與DNA/RNA結(jié)合(Theobald等人，2003)。人SND1的氨基酸序列可在以引用的方式并入本文的Genbank登錄號(hào)NP_055205中發(fā)現(xiàn)，并且還在本文中作為SEQIDNO:2提供。一致地，SND1表明為RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)的必要組分，并且涉及miRNA介導(dǎo)的沉默(Caudy等人，2003)。它還顯示具有針對(duì)超編輯的miRNA初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的核酸酶活性(Scadden，2005)。SND1的結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)分析表明N末端SN結(jié)構(gòu)域特別是SN3/4具有RNA結(jié)合和核酸酶活性(Li等人，2008)，并且C末端TSN結(jié)構(gòu)域與甲基化的Lys/Arg配體以及核內(nèi)小核糖核蛋白(snRNP)復(fù)合物相互作用(Shaw等人，2007)。SND1在參與與不同蛋白質(zhì)的相互作用的OB折疊超家族的極少成員中。它最初鑒定為增強(qiáng)EBNA-2活化基因的轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞組分(Tong等人，1995)，并且以后顯示與涉及轉(zhuǎn)錄的廣譜蛋白質(zhì)相互作用且調(diào)節(jié)涉及轉(zhuǎn)錄的廣譜蛋白質(zhì)(Leverson,1998；Paukku等人，2003；Valineva等人，2005；Valineva等人，2006；Yang,2002)，包括致癌轉(zhuǎn)錄因子STAT5、STAT6和c-Myb。近年來，SND1鑒定為多個(gè)類型的癌癥中的MTDH的結(jié)合配偶體，并且已顯示對(duì)于在致癌或化學(xué)療法應(yīng)激下的癌細(xì)胞存活是重要的(Blanco等人，2011；Meng等人，2012；Wan等人，2014；Yoo等人，2011)。SND1是具有類似于MTDH那種的腫瘤促進(jìn)功能的MTDH的相互作用配偶體(Blanco等人，2011；Meng等人，2012；Wang等人，2012；Yoo等人，2011)。本文顯示具有妥協(xié)的SND1結(jié)合的生物化學(xué)鑒定的MTDH突變體顯示出在不同亞型的乳腺癌中的腫瘤起始細(xì)胞擴(kuò)增和存活中的減少活性(Wan等人，2014)。還沒有結(jié)構(gòu)的了解可用于理解MTDH及其結(jié)合配偶體之間的相互作用，以及這些相互作用如何影響其在癌癥中的作用。SND1在癌癥中的功能是否依賴于MTDH結(jié)合仍不清楚。鑒定的SND1相互作用蛋白的范圍表明其SN結(jié)構(gòu)域已進(jìn)化成蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域；然而，相互作用的模式在本公開內(nèi)容之前是不清楚的。異粘蛋白/SND1抑制劑如本文使用的，MTDH與SND1的相互作用在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的進(jìn)展中起重要作用。該蛋白質(zhì)相互作用的抑制劑的施用作為用于治療癌癥的有用療法。如實(shí)例4中所示，SEQIDNO:1中所示的野生型MTDH的殘基394和401是與SND1的相互作用所需的。在一些實(shí)施例中，抑制劑是包含下述的MTDH的肽：(a)共有序列XWXXXXXXWXX(SEQIDNO:3)，其中X是任何氨基酸，或(b)XWXXXXXWXX(SEQIDNO:4)，其中X是任何氨基酸。在各個(gè)實(shí)施例中，抑制劑是包含來自MTDH的殘基393-403的共有序列XWXXXXXXWXX(SEQIDNO:3)的MTDH的肽，其中X是任何氨基酸。在一些實(shí)施例中，抑制劑是包含共有序列XWXXXXXWXX(SEQIDNO:4)的MTDH的肽，其中X是任何氨基酸。在一些實(shí)施例中，MTDH/SND1抑制劑是MTDH的肽、SND1的肽、與包含SEQIDNO:1的殘基393-403的肽具有相似結(jié)構(gòu)的肽模擬物、與包含SEQIDNO:1的殘基390-403的肽具有相似結(jié)構(gòu)的肽模擬物、與包含SEQIDNO:1的殘基393-403的肽具有相似結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)部分的小分子化合物、與包含SEQIDNO:1的殘基390-403的肽具有相似結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)部分的小分子化合物、或者含有本文描述的肽或肽模擬物的納米顆粒綴合物。在各個(gè)實(shí)施例中，抑制劑是選自下述的MTDH的肽：i)在SEQIDNO:1的殘基364-582內(nèi)的肽，ii)在SEQIDNO:1的殘基364-407內(nèi)的肽，iii)包含SEQIDNO:1的殘基386-407的肽，iv)包含SEQIDNO:1的殘基393-403的肽，或v)包含SEQIDNO:1的殘基390-403的肽；或vi)在SEQIDNO:1的殘基364-582、殘基364-407、殘基386-407、殘基393-403或殘基390-403內(nèi)在殘基393-403處包含共有序列XWXXXXXXWXX(SEQIDNO:3)的肽，其中X是任何氨基酸。在一些實(shí)施例中，肽包含DWNAPAEEWGN(SEQIDNO:5)的序列或其變體，其中變體肽包含在除了W殘基之外的任何位置處的至少一個(gè)(例如2、3、4、5、6、7、8或9中任一個(gè))突變。在一些實(shí)施例中，肽長約11至約22個(gè)氨基酸(例如長約15至約22個(gè)氨基酸)。在一些實(shí)施例中，肽包含對(duì)DWNAPAEEWGN(SEQIDNO:5)的序列N末端的約1、2、3、4、5、6或7個(gè)氨基酸中的任一種或其變體。在一些實(shí)施例中，肽包含對(duì)DWNAPAEEWGN(SEQIDNO:5)的序列C末端的約1、2、3或4個(gè)氨基酸中的任一種或其變體。在一些實(shí)施例中，肽包含DWNAPEEWGN(SEQIDNO:20)的序列或其變體，其中變體肽包含在除了W殘基之外的任何位置處的至少一個(gè)(例如2、3、4、5、6、7、8或9中任一個(gè))突變。在一些實(shí)施例中，肽長約10至約21個(gè)氨基酸(例如長約14至約21個(gè)氨基酸)。在一些實(shí)施例中，肽包含對(duì)DWNAPEEWGN(SEQIDNO:20)的序列N末端的約1、2、3、4、5、6或7個(gè)氨基酸中的任一種或其變體。在一些實(shí)施例中，肽包含對(duì)DWNAPEEWGN(SEQIDNO:20)的序列C末端的約1、2、3或4個(gè)氨基酸中的任一種或其變體。在一些實(shí)施例中，肽與包含DWNAPAEEWGN(SEQIDNO:5)的序列的野生型MTDH肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合SND1(例如具有相同長度的野生型MTDH肽)。在一些實(shí)施例中，肽結(jié)合SND1的親和力為包含DWNAPAEEWGN(SEQIDNO:5)的序列的野生型MTDH肽(例如具有相同長度的野生型MTDH肽)對(duì)于SND1的結(jié)合親和力的至少約50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％中的任一種。在一些實(shí)施例中，肽包含在選自D389、A392、D393、N395、E399、E400、W404、D406和E407的MTDH中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基處的突變，其中位置對(duì)應(yīng)于野生型MTDH(即SEQIDNO:1)。在一個(gè)實(shí)施例中，肽包含在選自N395、A396、P397、A398、E399、E400和N403的一個(gè)或多個(gè)(例如2、3、4、5、6或7個(gè))氨基酸殘基處的突變，其中位置對(duì)應(yīng)于野生型MTDH(即SEQIDNO:1)。在一些實(shí)施例中，MTDH中的突變選自N395K、A396D、PAE(397-399)SQ和E400D/N403L，其中位置對(duì)應(yīng)于野生型MTDH(即SEQIDNO:1)。在各個(gè)實(shí)施例中，MTDH(SEQIDNO:1)中的突變選自D389R、D393R、E399R、E400R、W404D、D406R和E407R。在各個(gè)實(shí)施例中，抑制劑是在SND1(即SEQIDNO:2)的殘基16至339內(nèi)的SND1的肽。在一個(gè)實(shí)施例中，SND1肽包含在選自F250、R324、R255、R327、R324、P39、P43、E247、L256、H279、I284、L287、R259和N281的一個(gè)或多個(gè)殘基處的突變，其中位置對(duì)應(yīng)于野生型SND1(即SEQIDNO:2)。在各個(gè)實(shí)施例中，SND1(即SEQIDNO:2)中的突變選自F250AR324E和R255E。在一些實(shí)施例中，MTDH或SND1肽包含(例如具有)含60個(gè)氨基酸或更少、55個(gè)氨基酸或更少、40個(gè)氨基酸或更少、35個(gè)氨基酸或更少、或者30個(gè)氨基酸或更少的氨基酸序列。任選地，肽包含(例如具有)含25個(gè)氨基酸或更少、20個(gè)氨基酸或更少、15個(gè)氨基酸或更少、或者10個(gè)氨基酸或更少的氨基酸序列。在各個(gè)實(shí)施例中，肽包含(例如具有)10-35個(gè)氨基酸殘基(例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35個(gè)氨基酸殘基)。在一些方面，氨基酸從氨基酸序列內(nèi)、在N末端處和/或在C末端處從本文描述的肽中取出。此類肽片段可包含3-14個(gè)氨基酸殘基(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個(gè)氨基酸殘基)。本文描述的肽可與第二肽結(jié)構(gòu)域融合或復(fù)合，所述第二肽結(jié)構(gòu)域例如結(jié)合另一種靶或者增加肽的半衰期或穩(wěn)定性。在一個(gè)方面，肽還包含有利于肽的合成、處理或使用的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，包括但不限于在N末端和/或C末端處的一個(gè)或兩個(gè)賴氨酸，以增加肽的溶解性。合適的融合蛋白包括但不限于這樣的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)包含連接至一種或多種多肽、多肽片段或一般未識(shí)別為蛋白質(zhì)序列的部分的氨基酸的本文描述的肽。在一個(gè)方面，融合肽包含具有兩個(gè)或更多個(gè)肽的整個(gè)氨基酸序列，或可替代地包含兩種或更多種肽的一部分(片段)。在一些方面，本文描述的肽可操作地連接至例如下述中的一種或多種：標(biāo)記蛋白質(zhì)、有利于純化的肽、促進(jìn)多聚蛋白質(zhì)形成的肽序列、或前述中任一種的片段。合適的融合配偶體包括但不限于His標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽、strep標(biāo)簽和myc標(biāo)簽。任選地，本文描述的肽融合至增強(qiáng)肽的半衰期的一種或多種實(shí)體。半衰期可通過下述得到增加：例如增加肽的分子量以避免腎清除率，和/或摻入用于nFc受體介導(dǎo)的再循環(huán)途徑的配體。在一個(gè)實(shí)施例中，肽與白蛋白多肽或其片段(例如人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA))融合或化學(xué)綴合。白蛋白片段包含全長白蛋白蛋白質(zhì)的10％、25％、50％或75％。可替代地或另外，肽與白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域或脂肪酸融合或復(fù)合，所述脂肪酸當(dāng)體內(nèi)施用時(shí)結(jié)合白蛋白。白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的例子是“albu標(biāo)簽”，來源于4-(對(duì)碘苯基)-丁酸的部分(Dumelin等人，AngewChemIntEdEngl47:3196–3201(2008))。其他合適的融合配偶體包括但不限于脯氨酸-丙氨酸-絲氨酸多聚體(PAS化)和抗體或其片段(例如抗體的Fc部分)。衍生物被考慮且包括已以與氨基酸的添加、缺失或置換不同的一定方式進(jìn)行化學(xué)修飾的肽。在這點(diǎn)上，本文提供的肽與聚合物、脂質(zhì)、其他有機(jī)部分和/或無機(jī)部分化學(xué)鍵合。肽和蛋白質(zhì)修飾的例子在Hermanson,BioconjugateTechniques,AcademicPress,(1996)中給出。本文描述的肽任選包含有利于與另一部分(例如肽部分)綴合的官能團(tuán)。示例性官能團(tuán)包括但不限于異硫氰酸酯、異氰酸酯、?；B氮化物、NHS酯、磺酰氯、醛、環(huán)氧化物、環(huán)氧乙烷、碳酸酯、芳基化劑、亞氨酸酯、碳二亞胺、酸酐、鹵代烷衍生物(例如鹵代乙?；苌?、馬來酰亞胺、氮丙啶、丙烯酰衍生物、芳基化劑、硫醇-二硫化物交換試劑(例如吡啶基二硫化物或TNB硫醇)、重氮烷、羰基二咪唑、N,N'-二琥珀?；妓狨?、N-羥基琥珀酰亞胺基氯甲酸酯和肼衍生物。馬來酰亞胺例如可用于生成在體內(nèi)與白蛋白結(jié)合的蛋白S結(jié)合肽。在一個(gè)方面，本發(fā)明包括本文描述的肽，其共價(jià)修飾以包括一個(gè)或多個(gè)水溶性聚合物附著。水溶性聚合物(或其他化學(xué)部分)附著至任何氨基酸殘基，盡管與N末端或C末端的附著在一些實(shí)施例中是優(yōu)選的。有用的聚合物包括但不限于PEG(例如大小大約40kD、30kD、20kD、10kD、5kD或1kD的PEG)、聚乙二醇、聚丙二醇、單甲氧基聚乙二醇、右旋糖酐、羥乙基淀粉、纖維素、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)-聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚唾液酸(PSA)、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇、以及前述中任意種的混合物。在一個(gè)方面，本發(fā)明的肽是PEG化的肽。PEG部分可以不同形狀例如線性或分支獲得。關(guān)于水溶性聚合物附著的更多討論，參見美國專利號(hào)4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；和4,179,337?？捎糜诟纳齐陌胨テ诨蚍€(wěn)定性的其他部分在本文中描述，并且包括例如白蛋白(任選修飾以允許與本發(fā)明的肽綴合)、脂肪酸鏈(例如C12-C18脂肪酸例如C14脂肪酸，或二羧酸例如十八烷二羧酸(oddc))、抗體或其片段(例如抗體的Fc部分)和脯氨酸-丙氨酸-絲氨酸多聚體。在另一個(gè)方面，肽衍生物包括對(duì)于特定細(xì)胞類型、組織和/或器官特異性的靶向部分。可替代地，肽連接至有利于純化、檢測(cè)、多聚化、與相互作用配偶體的結(jié)合和肽活性的表征的一種或多種化學(xué)部分。示例性化學(xué)部分是生物素。適合于與本發(fā)明的肽綴合的其他部分包括但不限于光敏劑、染料、熒光染料、放射性核素、含放射性核素的復(fù)合物、酶、毒素和細(xì)胞毒性劑。光敏劑包括例如光卟啉、維速達(dá)爾、聚左旋糖、Foscan、美特維克、CysviewTM、Laserphyrin、安特林、光克洛、Photosens、Photrex、Lumacan、Cevira、Visonac、BF-200ALA和Amphinex。需要時(shí)，His標(biāo)簽、FLAG標(biāo)簽、strep標(biāo)簽或myc標(biāo)簽綴合至肽。另外，在一個(gè)方面，本發(fā)明的肽在肽的N末端氨基酸處是?；?。在另一個(gè)方面，本發(fā)明的肽在肽的C末端氨基酸處是酰胺化的。在一個(gè)再進(jìn)一步的方面，本發(fā)明的肽在肽的N末端氨基酸處是酰化的，并且在肽的C末端氨基酸處是酰胺化的。衍生物還包括包含經(jīng)修飾的或非蛋白原氨基酸或經(jīng)修飾的接頭基團(tuán)的肽(參見例如Grant,SyntheticPeptides:AUser’sGuide,OxfordUniversityPress(1992))。經(jīng)修飾的氨基酸包括例如其中氨基和/或羧基替換為另一種基團(tuán)的氨基酸。非限制性例子包括摻入硫酰胺、脲、硫脲、?；ｋ?、酯、烯烴、磺酰胺、磷酸酰胺、酮、醇、硼酸酰胺、苯二氮雜卓和其他芳香族或非芳香族雜環(huán)的經(jīng)修飾的氨基酸(參見Estiarte等人，BurgersMedicinalChemistry,第6版，第1卷，Part4,JohnWiley&Sons,NewYork(2002))。非蛋白原氨基酸包括但不限于β-丙氨酸(Bal)、正纈氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、4-氨基丁酸(γ-Abu)、2-氨基異丁酸(Aib)、6-氨基己酸(ε-Ahx)、鳥氨酸(Orn)、羥脯氨酸(Hyp)、?；撬帷⒓“彼?、瓜氨酸(Cit)、磺基丙氨酸(Coh)、環(huán)己基丙氨酸(Cha)、甲硫氨酸亞砜(Meo)、甲硫氨酸砜(Moo)、高絲氨酸甲酯(Hsm)、炔丙基甘氨酸(Eag)、5-氟色氨酸(5Fw)、6-氟色氨酸(6Fw)、3',4'-二甲氧基苯基-丙氨酸(Ear)、3',4'-二氟苯丙氨酸(Dff)、4'-氟苯基丙氨酸(Pff)、1-萘基丙氨酸(1Ni)、2-萘基丙氨酸(2Ni)、1-甲基色氨酸(1Mw)、青霉胺(Pen)、高絲氨酸(Hse)、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯甘氨酸(Phg)、苯并噻吩丙氨酸(Bta)、L-高半胱氨酸(Hcy)、N-甲基-苯丙氨酸(Nmf)、2-噻吩丙氨酸(Thi)、3,3-二苯基丙氨酸(Ebw)、L-α-叔丁基甘氨酸(Tle)、Bpa、高苯丙氨酸(Hfe)和S-芐基-L-半胱氨酸(Ece)。這些及其他非蛋白原氨基酸可作為D-或L-異構(gòu)體存在。經(jīng)修飾的接頭的例子包括但不限于柔性接頭4,7,10-三氧雜-1,13-十三烷二胺(Ttds)、甘氨酸、6-氨基己酸、β-丙氨酸(Bal)、戊炔酸(Pyn)，以及Ttds、甘氨酸、6-氨基己酸和Bal的組合。構(gòu)成本發(fā)明的肽的氨基酸的同系物可如表1中所示。在任何實(shí)施例中，本發(fā)明的肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸由表1中所示的氨基酸或構(gòu)件塊置換。表1在一些實(shí)施例中，連接本發(fā)明的肽內(nèi)的氨基酸的肽(CO-NH)鍵逆轉(zhuǎn)，以產(chǎn)生“逆向修飾的”肽，即包含與參考肽相比較以相反方向(NH-CO鍵)裝配的氨基酸殘基的肽。逆向修飾的肽包含與參考肽相同的氨基酸手性。“反轉(zhuǎn)修飾的”肽是包含與參考肽相同方向裝配的氨基酸殘基的本發(fā)明的肽，但氨基酸的手性反轉(zhuǎn)。因此，當(dāng)參考肽包含L-氨基酸時(shí)，“反轉(zhuǎn)修飾的”肽包含D-氨基酸，并且反之亦然。反轉(zhuǎn)修飾的肽包含CO-NH肽鍵?！澳嫦蚍崔D(zhuǎn)修飾的”肽指包含在相反方向裝配且具有反轉(zhuǎn)手性的氨基酸殘基的肽。逆向反轉(zhuǎn)類似物具有肽鍵(即NH-CO)的逆向末端和逆向方向，同時(shí)大致維持在參考肽中發(fā)現(xiàn)的側(cè)鏈拓?fù)鋵W(xué)。逆向反轉(zhuǎn)擬肽使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行制備，所述標(biāo)準(zhǔn)方法包括以引用的方式并入本文的Meziere等人，J.Immunol.,159,3230-3237(1997)中所述的方法。部分逆向反轉(zhuǎn)肽是其中僅氨基酸序列的部分逆轉(zhuǎn)且替換為對(duì)映體氨基酸殘基的肽。在一些實(shí)施例中，本文描述的肽抑制劑綴合至載體肽或蛋白質(zhì)，例如貨物蛋白質(zhì)或肽、轉(zhuǎn)運(yùn)肽或肽、或者細(xì)胞穿透蛋白質(zhì)或肽(CPP)，以改善藥物代謝動(dòng)力學(xué)行為。舉例說明性改善的藥物代謝動(dòng)力學(xué)行為包括但不限于更長的血清和/或循環(huán)半衰期，和/或更大的細(xì)胞滲透。在一些實(shí)施例中，本文描述的肽抑制劑與選自下述的轉(zhuǎn)運(yùn)肽或細(xì)胞穿透肽綴合：HIVTAT肽、TATm、PTD、PTR(也稱為PTD)、pVEC、SynB、R9、R9-TAT、MTS、PreS2-TLM、HTLV-IIREX、MAP、TP、PEP和PrP。在一些實(shí)施例中，本文描述的肽抑制劑與載體肽或蛋白質(zhì)例如貨物蛋白質(zhì)或肽、轉(zhuǎn)運(yùn)肽或肽、或者細(xì)胞穿透蛋白質(zhì)或肽(CPP)混合，以改善藥物代謝動(dòng)力學(xué)行為。肽抑制劑和載體肽或蛋白質(zhì)之間的合適摩爾比可為例如約1:100至約100:1，包括例如約1:50至約50:1、約1:20至約20:1、約1:10至約10:1、約1:5至約5:1、或約1:1。在一些實(shí)施例中，肽抑制劑和載體肽或蛋白質(zhì)之間的摩爾比為約1:1至約20:1、約1:1至約10:1、約1:1至約1:5:1、約1:1至約2:1、約1:1、約1:1至約1:2、約1:1至約1:5、約1:1至約1:10、或約1:1至約1:20中的任一種。用于如本文描述的癌癥預(yù)防或治療的本文所述肽的細(xì)胞內(nèi)遞送可利用“促進(jìn)劑部分”來實(shí)現(xiàn)，用于有利于肽或核酸跨越外細(xì)胞/質(zhì)膜的通過或易位進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和/或核內(nèi)，例如載體肽。如本文描述的促進(jìn)劑部分可有利于由本發(fā)明體現(xiàn)的肽、試劑或核酸以多種方式中的任一種進(jìn)入癌細(xì)胞內(nèi)，并且本發(fā)明并不限于任何特定機(jī)制(例如直接穿透到細(xì)胞內(nèi)(例如經(jīng)由增強(qiáng)的細(xì)胞膜溶解度或在細(xì)胞膜中形成瞬時(shí)孔)、內(nèi)吞作用介導(dǎo)的細(xì)胞進(jìn)入(例如，經(jīng)由與細(xì)胞表面表達(dá)受體的相互作用或巨胞飲)和經(jīng)由在細(xì)胞膜上形成瞬時(shí)結(jié)構(gòu)的細(xì)胞進(jìn)入。促進(jìn)劑部分可以是增強(qiáng)根據(jù)本發(fā)明的抗癌肽的細(xì)胞膜溶解度的脂質(zhì)部分或其他非肽部分(例如，碳水化合物部分)，用于穿過靶細(xì)胞的外細(xì)胞膜，或由此促進(jìn)肽進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。脂質(zhì)部分可例如選自甘油三酯，包括混合甘油三酯。還可使用脂肪酸且特別是C16-C20脂肪酸。通常，脂肪酸可為飽和脂肪酸且最通常為硬脂酸。在另外一個(gè)實(shí)施例中，本文描述的肽與綴合試劑綴合用于與標(biāo)記、信號(hào)傳導(dǎo)或其他分子(例如造影劑、顯像劑、生物素、鏈霉抗生物素蛋白、放射性同位素、熒光染料、化學(xué)發(fā)光劑、化學(xué)發(fā)光團(tuán)(chemiluminophore)、生物發(fā)光劑、酶或其結(jié)合片段(例如Fab和F(ab).2片段)、磁性顆粒等)形成復(fù)合物，用于肽的檢測(cè)。如應(yīng)理解的，由本發(fā)明體現(xiàn)的肽可與促進(jìn)劑部分偶聯(lián)，用于有利于肽通過進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，并且綴合試劑與標(biāo)記、信號(hào)傳導(dǎo)分子、放射性同位素等等復(fù)合，或者用于與標(biāo)記、信號(hào)傳導(dǎo)分子、放射性同位素等等復(fù)合，用于利用合適的成像技術(shù)(例如磁共振成像(MRI))檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的肽。DOTA(1,4,7,10-四氮雜環(huán)癸烷-1,4,7,10-四乙酸)是可使用且可與一系列化合物復(fù)合用于癌癥療法和診斷中的綴合試劑的例子，例如單克隆抗體、放射性同位素和金屬陽離子(例如鈣和釓)。在一些實(shí)施例中，本文描述的肽綴合至與釓復(fù)合的DOTA(SturzuA等人，2008)，所述釓作為造影劑用于靶細(xì)胞的成像。在一些實(shí)施例中，本文描述的肽配制成脂質(zhì)體、微?；蚣{米顆粒，例如用于靶向遞送和/或持續(xù)釋放。適合于肽遞送(包括靶向遞送和/或持續(xù)釋放)的脂質(zhì)體、微粒和納米顆粒是本領(lǐng)域已知的。參見例如Tan等人，RecentDevelopmentsinLiposomes,Microparticles,andNanoparticlesforproteinandpeptidedrugdelivery,Peptides,31(1),184-193,2010。還考慮了包含本文描述的肽中的一種或多種的納米顆粒綴合物。如本文使用的，術(shù)語“納米顆?！敝敢庵钙浯笮≡诩{米范圍內(nèi)(即小于1μm)測(cè)量的顆粒。在一些實(shí)施例中，納米顆粒具有在大約2-500nm，包括例如約2至約200nm、約10至約200nm、約50至約100nm的范圍內(nèi)的總直徑。納米顆粒核材料可為金屬或半導(dǎo)體，并且可由超過一個(gè)類型的原子形成。優(yōu)選地，核材料是選自Au、Fe或Cu的金屬。納米顆粒核還可由合金包括Au/Fe、Au/Cu、Au/Gd、Au/Fe/Cu、Au/Fe/Gd和Au/Fe/Cu/Gd形成，并且可用于本發(fā)明中。優(yōu)選核材料為Au和Fe，其中最優(yōu)選的材料是Au。納米顆粒的核優(yōu)選包含約100至500個(gè)原子(例如金原子)，以提供在納米范圍內(nèi)的核直徑。其他特別有用的核材料摻雜有其為NMR活性的一種或多種原子，從而允許納米顆粒在體外和體內(nèi)兩者使用NMR進(jìn)行檢測(cè)。NMR活性原子的例子包括Mn+2、Gd+3、Eu+2、Cu+2、V+2、Co+2、Ni+2、Fe+2、Fe+3和鑭系元素+3或量子點(diǎn)。包含半導(dǎo)體原子的納米顆粒核可檢測(cè)為納米規(guī)模半導(dǎo)體晶體，能夠充當(dāng)量子點(diǎn)，即它們可吸收光，由此激發(fā)材料中的電子至更高能級(jí)，隨后以材料特有的頻率釋放光的光子。半導(dǎo)體核材料的例子是硒化鎘、硫化鎘、鎘碲。還包括的是鋅化合物例如硫化鋅。在一些實(shí)施例中，納米顆粒綴合物包含可檢測(cè)標(biāo)記。標(biāo)記可為納米顆粒的核的元素或配體。標(biāo)記由于納米顆粒的該元素的固有特性或通過與可檢測(cè)的進(jìn)一步部分連接、綴合或結(jié)合而是可檢測(cè)的。標(biāo)記的優(yōu)選例子包括其為熒光基團(tuán)、放射性核素、磁性標(biāo)記或染料的標(biāo)記。熒光基團(tuán)包括熒光素、羅丹明或四甲基羅丹明、德克薩斯紅、Cy3、Cy5等，并且可通過熒光標(biāo)記的激發(fā)和使用拉曼散射光譜法檢測(cè)發(fā)出的光進(jìn)行檢測(cè)(Y.C.Cao,R.Jin,C.A.Mirkin,Science2002,297:1536-1539)。在一些實(shí)施例中，納米顆粒綴合物包含放射性核素，用于使用由放射性核素發(fā)出的放射性檢測(cè)納米顆粒，例如通過使用PET、SPECT，或用于療法，即用于殺死靶細(xì)胞?？扇菀走m合于在本發(fā)明中使用的本領(lǐng)域常用的放射性核素的例子包括以各種氧化狀態(tài)存在的99mTc，盡管最穩(wěn)定的是TcO4-；32P或33P；57Co；59Fe；通常用作Cu2+鹽的67Cu；通常用作Ga3+鹽例如檸檬酸鎵的67Ga；68Ge；82Sr；99Mo；103Pd；一般用作In3+鹽的111In；一般用作碘化鈉的125I或131I；137Cs；153Gd；153Sm；158Au；186Re；一般用作Tl+鹽例如氯化鉈的201Tl；39Y3+；71Lu3+；和24Cr2+。放射性核素作為標(biāo)記和示蹤劑的一般用途是本領(lǐng)域眾所周知的，并且可容易地由技術(shù)人員修改用于本發(fā)明的方面。放射性核素可通過摻雜納米顆粒的核或包括其作為在納米顆粒上固定的配體的部分存在的標(biāo)記而最容易地采用。另外或可替代地，納米顆粒綴合物可使用本領(lǐng)域眾所周知的許多技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，使用與如上所示的納米顆粒結(jié)合的標(biāo)記或通過采用其特性。這些檢測(cè)納米顆粒的方法范圍可從檢測(cè)當(dāng)納米顆粒結(jié)合另一個(gè)種類時(shí)產(chǎn)生的聚集，例如通過簡(jiǎn)單目視檢查或通過使用光散射(含有納米顆粒的溶液的透射率)，到使用尖端技術(shù)例如透射電子顯微鏡檢查(TEM)或原子力顯微鏡檢查(AFM)來顯現(xiàn)納米顆粒。檢測(cè)金屬顆粒的進(jìn)一步方法是采用等離子體共振，其為在金屬表面處的電子激發(fā)，通常通過光輻射引起。表面等離子體共振(SPR)的現(xiàn)象存在于金屬(例如Ag或Au)和介電材料例如空氣或水的界面處。因?yàn)镾PR中的變化由于分析物結(jié)合固定在納米顆粒表面上的配體而發(fā)生，所以改變界面的折射率。SPR的進(jìn)一步優(yōu)點(diǎn)在于它可用于監(jiān)測(cè)實(shí)時(shí)相互作用。如上所述，如果納米顆粒包括其為NMR活性的原子或摻雜有其為NMR活性的原子，則這種技術(shù)可用于在體外或體內(nèi)兩者檢測(cè)顆粒，使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)。納米顆粒還可使用基于定量信號(hào)擴(kuò)增的系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，使用納米顆粒促進(jìn)的銀(I)還原。如果納米顆粒包括配體作為熒光探針，則可使用熒光光譜法。另外，碳水化合物的同位素標(biāo)記可用于促進(jìn)其檢測(cè)。在一些實(shí)施例中，本文描述的肽綴合至金納米顆粒用于通過分支金顆粒的激光照射進(jìn)行成像或用于幫助靶細(xì)胞的細(xì)胞死亡。金納米顆粒轉(zhuǎn)移越過質(zhì)膜和核膜先前已得到報(bào)道(delaFuenteJ.M.和BerryC.C.,2005)。本文描述的肽可用于許多目的。例如，在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了破壞受試者中的MTDH和SND1之間的相互作用的方法，所述方法包括給受試者施用本文描述的肽抑制劑(或包含此類肽抑制劑的藥物組合物)中的任何一種。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了抑制受試者中的SND1依賴性促存活基因表達(dá)的方法，所述方法包括給受試者施用本文描述的肽抑制劑(或包含此類肽抑制劑的藥物組合物)中的任何一種。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了治療受試者中的癌癥的方法，所述方法包括給受試者施用本文描述的肽抑制劑(或包含此類肽抑制劑的藥物組合物)中的任何一種。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供了抑制患有癌癥的受試者中的腫瘤轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括給受試者施用本文描述的肽抑制劑(或包含此類肽抑制劑的藥物組合物)中的任何一種。癌癥預(yù)期本文所述的MTDH和/或SND1的肽以及MTDH和SND1相互作用的其他抑制劑可用于治療MTDH在其中起作用的癌癥。示例性癌癥包括但不限于腎上腺皮質(zhì)癌、AIDS相關(guān)癌癥、AIDS相關(guān)淋巴瘤、肛門癌、肛門直腸癌、肛管癌、闌尾癌、兒童小腦星形細(xì)胞瘤、兒童大腦星形細(xì)胞瘤、基底細(xì)胞癌、皮膚癌(非黑素瘤)、膽管癌、肝外膽管癌、肝內(nèi)膽管癌、膀胱癌、尿膀胱癌、骨和關(guān)節(jié)癌、骨肉瘤和惡性纖維組織細(xì)胞瘤、腦癌、腦腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、小腦星形細(xì)胞瘤、大腦星形細(xì)胞瘤/惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤、室管膜瘤、髓母細(xì)胞瘤、幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤、視通路和下丘腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、支氣管腺瘤/類癌、類癌瘤、胃腸道、神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、宮頸癌、兒童癌癥、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性髓性白血病、慢性骨髓增生性病癥、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、淋巴樣贅生物、蕈樣真菌病、Seziary綜合征、子宮內(nèi)膜癌、食管癌、顱外生殖細(xì)胞腫瘤、性腺外生殖細(xì)胞腫瘤、肝外膽管癌、眼癌、眼內(nèi)黑素瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、膽囊癌、胃部(胃)癌、胃腸道類癌瘤、胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)、生殖細(xì)胞腫瘤、卵巢生殖細(xì)胞腫瘤、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤神經(jīng)膠質(zhì)瘤、頭頸癌、肝細(xì)胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼內(nèi)黑素瘤、眼部癌、胰島細(xì)胞腫瘤(內(nèi)分泌胰腺)、卡波西肉瘤、腎癌、腎部癌、腎癌、喉癌、急性成淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓樣白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性髓性白血病、毛細(xì)胞白血病、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、AIDS相關(guān)淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥、髓母細(xì)胞瘤、黑素瘤、眼內(nèi)(眼)黑素瘤、梅克爾細(xì)胞癌、惡性間皮瘤、間皮瘤、轉(zhuǎn)移性鱗狀頸癌、口腔癌、舌癌、多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤綜合征、蕈樣霉菌病、骨髓增生異常綜合征、骨髓增生異常/骨髓增生性疾病、慢性髓性白血病、急性髓樣白血病、多發(fā)性骨髓瘤、慢性骨髓增生性病癥、鼻咽癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、口癌、口腔癌、口咽癌、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢低惡性潛能腫瘤、胰腺癌、胰島細(xì)胞胰腺癌、鼻旁竇和鼻腔癌、甲狀旁腺癌、陰莖癌、咽癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、松果體母細(xì)胞瘤和幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤、垂體瘤、漿細(xì)胞瘤/多發(fā)性骨髓瘤、胸膜肺母細(xì)胞瘤、前列腺癌、直腸癌、腎盂和輸尿管、移行細(xì)胞癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、唾液腺癌、尤因家族的肉瘤腫瘤、卡波西肉瘤、軟組織肉瘤、子宮癌、子宮肉瘤、皮膚癌(非黑素瘤)、皮膚癌(黑素瘤)、梅克爾細(xì)胞皮膚癌、小腸癌、軟組織肉瘤、鱗狀細(xì)胞癌、胃(胃部)癌、幕上原始神經(jīng)外胚層腫瘤、睪丸癌、咽喉癌、胸腺瘤、胸腺瘤和胸腺癌、甲狀腺癌、腎盂和輸尿管和其他泌尿器官的移行細(xì)胞癌、妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤、尿道癌、子宮內(nèi)膜子宮癌、子宮肉瘤、子宮體癌、陰道癌、外陰癌和腎母細(xì)胞瘤。在各個(gè)實(shí)施例中，癌癥選自乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、肺癌和前列腺癌。在一些實(shí)施例中，癌癥是前列腺癌。在一些實(shí)施例中，所述癌癥是乳腺癌。前列腺癌：前列腺癌是美國男性中最常見的癌癥類型。它占總癌癥發(fā)生率的28％和美國男性的總癌癥死亡的10％(1)。前列腺癌相關(guān)死亡率主要由晚期癌癥引起，所述晚期癌癥已擴(kuò)散并轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處器官，例如骨、肺和肝(2)。一旦癌細(xì)胞在這些重要器官中建立繼發(fā)性腫瘤，治療通常變得更復(fù)雜，伴隨更糟的結(jié)果。定義和理解驅(qū)動(dòng)前列腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的新型分子靶對(duì)于開發(fā)前列腺癌的有效治療方法是重要的。與良性增生組織和正常上皮細(xì)胞相比較，MTDH顯示在前列腺腫瘤組織和致瘤細(xì)胞系中過表達(dá)(Thirkettle等人，2009；Kikuno等人，2007)。在培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞中的MTDH擊倒增強(qiáng)細(xì)胞凋亡且抑制基質(zhì)膠侵襲。制劑本公開內(nèi)容提供了可用于癌癥治療的MTDH/SND1抑制劑(例如以抑制或壓制腫瘤的生長或轉(zhuǎn)移)。為了將抑制劑施用于患者或測(cè)試動(dòng)物，優(yōu)選在包含一種或多種藥學(xué)可接受的載體的組合物中配制產(chǎn)物。藥學(xué)或藥理學(xué)可接受的載體或媒介物指分子實(shí)體和組合物，當(dāng)如下所述使用本領(lǐng)域眾所周知的途徑施用時(shí)，所述分子實(shí)體和組合物不產(chǎn)生過敏或其他不良反應(yīng)，或者被美國食品和藥物管理局(U.S.FoodandDrugAdministration)或?qū)?yīng)國外監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)為對(duì)經(jīng)口或腸胃外施用的藥物的可接受添加劑。藥學(xué)可接受的載體包括任何和所有臨床上有用的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等。藥學(xué)載體包括藥學(xué)可接受的鹽，特別當(dāng)堿性或酸性基團(tuán)存在于化合物中時(shí)。例如，當(dāng)存在酸性取代基例如--COOH時(shí)，銨、鈉、鉀、鈣等等鹽考慮用于施用。另外，當(dāng)存在酸基團(tuán)時(shí)，化合物的藥學(xué)可接受的酯(例如甲基、叔丁基、新戊酰氧基甲基、琥珀酰基等等)考慮作為化合物的優(yōu)選形式，此類酯是本領(lǐng)域已知的，用于修飾溶解度和/或水解特征用于用作持續(xù)釋放或前體藥物制劑。當(dāng)存在堿性基團(tuán)(例如氨基或堿性雜芳基原子團(tuán)例如吡啶基)時(shí)，則酸性鹽例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、乙酸鹽、馬來酸鹽、撲酸鹽、磷酸鹽、甲磺酸鹽、對(duì)甲苯磺酸鹽等等考慮作為用于施用的形式。另外，化合物可與水或常見有機(jī)溶劑形成溶劑化物。此類溶劑化物同樣加以考慮。本文的抑制劑可經(jīng)口、胃腸外、經(jīng)眼、鼻內(nèi)、經(jīng)皮、經(jīng)粘膜、通過吸入噴霧、陰道、直腸或通過顱內(nèi)注射施用。如本文使用的，術(shù)語腸胃外包括皮下注射、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腦池內(nèi)注射或輸注技術(shù)。同樣考慮通過靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、肌內(nèi)、乳房?jī)?nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、眼球后、肺內(nèi)注射和或在特定部位的手術(shù)植入的施用。一般地，通過上述方法中任一種的施用的組合物基本上不含熱原以及對(duì)接受者可能有害的其他雜質(zhì)。此外，用于腸胃外施用的組合物是無菌的。給藥和施用MTDH/SND1抑制劑以治療有效量施用；通常，組合物采取單位劑型。所施用的抑制劑的量當(dāng)然取決于患者的年齡、體重和一般狀況，所治療的狀況的嚴(yán)重性，以及開處方醫(yī)師的判斷。合適的治療量將是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和/或在相關(guān)參考文本和文獻(xiàn)中描述。在一個(gè)方面，劑量每天施用一次或每天施用多次。MTDH/SND1抑制劑可每天施用一次、兩次、三次或四次。在一些實(shí)施例中，抑制劑的有效劑量可在0.01mg至1000mg/kg(mg/kg)體重/天的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施例中，抑制劑以范圍為下述的日劑量施用：約10mg/kg至約250mg/kg、或約100mg/kg至約250mg/kg、或約60mg/kg至約100mg/kg、或約50mg/kg至約90mg/kg、或約30mg/kg至約80mg/kg、或約20mg/kg至約60mg/kg、或約10mg/kg至約50mg/kg。此外，有效劑量可為0.5mg/kg、1mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg/25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/kg、350mg/kg、400mg/kg、450mg/kg、500mg/kg，并且可通過25mg/kg增量增加直到1000mg/kg，或可在前述值中的任何兩個(gè)之間的范圍內(nèi)。施用可繼續(xù)至少3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月、1年、2年或更久。組合療法本文描述的治療組合物可以治療有效劑量單獨(dú)或與輔助癌癥療法組合施用，所述輔助癌癥療法例如手術(shù)、化學(xué)療法、放射療法、免疫療法、溫?zé)岑煼ê图す獐煼?，并且可提供有益效?yīng)，例如減少腫瘤大小、減緩腫瘤生長速率、抑制轉(zhuǎn)移、使腫瘤對(duì)癌癥治療敏感、或以其他方式改善總體臨床狀況，而無需根除癌癥。靶向癌細(xì)胞的細(xì)胞抑制劑和細(xì)胞毒性劑特別考慮用于組合療法。同樣，靶向血管生成或淋巴管生成的試劑或者靶向檢查點(diǎn)途徑的免疫治療特別考慮用于組合療法。例如本文使用的，“化學(xué)治療劑”是可用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；瘜W(xué)治療劑的例子包括：烷基化劑，例如噻替派和環(huán)磷酰胺；烷基磺酸鹽，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如苯佐替哌、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替派(uredopa)；乙撐亞胺和甲基蜜胺包括六甲蜜胺、三乙撐蜜胺、三乙撐磷酰胺、三乙撐硫代磷酰胺和三羥甲基蜜胺；番荔枝內(nèi)酯(acetogenin)(尤其是布拉它辛和布拉它辛酮)；喜樹堿(包括合成類似物托泊替康)；苔蘚抑素；海綿他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多來新、卡折來新和比折來新合成類似物)；隱藻素(cryptophycin)(特別是隱藻素1和隱藻素8)；多拉司他?。欢嗫顾?包括合成類似物、KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉堿；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海綿抑制素；氮芥例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、異環(huán)磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥、美法侖、新氮芥、苯芥膽固醇、潑尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亞硝基脲例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司?。婚L春花生物堿；表鬼臼毒素；抗生素例如烯二炔抗生素(例如加利車霉素，尤其是加利車霉素gammall和加利車霉素omegall；L-天冬酰胺酶；蒽二酮取代的尿素；甲基肼衍生物；達(dá)內(nèi)霉素，包括達(dá)內(nèi)霉素A；二膦酸鹽例如氯屈膦酸鹽；埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色團(tuán)和相關(guān)色素蛋白烯二炔抗生素生色團(tuán))、阿克拉霉素、放射菌素、安曲霉素、重氮絲菌素、博萊霉素、放線菌素C、卡拉比星、洋紅霉素、嗜癌素、色霉素、更生霉素、柔紅霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和脫氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊達(dá)比星、麻西羅霉素、絲裂霉素例如絲裂霉素C、麥考酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三鐵阿霉素、羅多比星、鏈黑霉素、鏈脲菌素、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司他丁、佐柔比星；抗代謝物例如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物例如二甲葉酸、氨甲蝶呤、蝶羅呤、三甲曲沙；嘌呤類似物例如氟達(dá)拉濱、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物例如安西他濱、阿扎胞苷、6-阿扎尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷、脫氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷；雄激素例如卡普睪酮、丙酸屈他雄酮、環(huán)硫雄醇、美雄烷、睪內(nèi)酯；抗腎上腺藥例如氨魯米特、米托坦、曲洛司坦；葉酸補(bǔ)充劑例如亞葉酸；乙葡醛內(nèi)酯；醛磷酰胺糖苦；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；貝他布昔(bestrabucil)；比生群；依達(dá)曲沙；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；依氟鳥氨酸；依利醋銨；埃博霉素；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達(dá)明；美登素類例如美登素和安絲菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達(dá)醇；二胺硝吖啶；噴司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙肼；丙卡巴肼；多糖復(fù)合物(JHSNaturalProducts,Eugene,OR)；雷佐生；根霉素；西佐喃；鍺螺胺；細(xì)交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌；2,22"-三氯三乙胺；單端孢霉烯(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、桿孢菌素A和蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦；長春地辛；達(dá)卡巴嗪；甘露莫司?。欢甯事洞?；二溴衛(wèi)矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷("Ara-C")；環(huán)磷酰胺；噻替派；紫杉類(taxoid)例如紫杉醇(Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N.J.)、ABRAXANETMCremophor-free、白蛋白改造的紫杉醇納米顆粒制劑(AmericanPharmaceuticalPartners,Schaumberg,Illinois)和多西紫杉醇(Rorer,Antony，法國)；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；鉑配位絡(luò)合物例如順鉑、奧沙利鉑和卡鉑；長春堿；鉑；依托泊苷(VP-16)；異環(huán)磷酰胺；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞濱；諾肖林；替尼泊苷；依達(dá)曲沙；道諾霉素；氨基蝶呤；希羅達(dá)；伊班膦酸鹽；伊立替康(例如CPT-11)；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS2000；二氟甲基鳥氨酸(DFMO)；類視黃醇例如視黃酸；卡培他濱；亞葉酸(LV)；伊立替康；腎上腺皮質(zhì)抑制劑；腎上腺皮質(zhì)類固醇；孕激素；雌激素；雄激素；促性腺激素釋放激素類似物；以及上述任一種的藥學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。該定義中還包括作用于調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤的作用的抗激素劑，例如抗雌激素和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)，包括例如它莫昔芬(包括它莫西芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羥基它莫昔芬、曲沃昔芬、可莫昔芬、LY117018、奧那司酮和FARESTON-托瑞米芬；抑制芳香酶的芳香酶抑制劑，所述芳香酶調(diào)節(jié)腎上腺中的雌激素產(chǎn)生，例如4(5)-咪唑、氨魯米特、乙酸甲地孕酮、依西美坦、福美司坦、法倔唑、伏氯唑、來曲唑、和阿那曲唑；以及抗雄激素例如氟他胺、尼魯米特、比卡魯胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及曲沙他濱(1,3-二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制涉及異常細(xì)胞增殖的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的基因表達(dá)的那些，例如PKC-α、Ralf和H-Ras；核酶例如VEGF-A表達(dá)抑制劑(例如核酶)和HER2表達(dá)抑制劑；疫苗例如基因療法疫苗例如疫苗、疫苗和疫苗；rJL-2；拓?fù)洚悩?gòu)酶1抑制劑；rmRH；以及上述任一種的藥學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。在一些實(shí)施例中，本文描述的肽與任何數(shù)目的免疫檢查點(diǎn)抑制劑結(jié)合施用。免疫檢查點(diǎn)抑制劑包括與下述中的一種或多種結(jié)合且阻斷或抑制其活性的抗體或其抗原結(jié)合片段：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3和GAL9。示例性免疫檢查點(diǎn)抑制劑包括但不限于曲美木單抗(CTLA-4阻斷抗體)、抗OX40、PD-L1單克隆抗體(抗B7-H1；MEDI4736)、伊匹木單抗、MK-3475(PD-1阻斷劑)和納武單抗(抗PD1抗體)本文描述的治療方法任選包括監(jiān)測(cè)治療組合物對(duì)腫瘤的作用。例如，腫瘤大小可測(cè)定為轉(zhuǎn)移灶的存在。還考慮的是例如通過測(cè)量轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)目或通過測(cè)量與轉(zhuǎn)移相關(guān)的腹水來測(cè)量轉(zhuǎn)移程度。MTDH/SND1抑制劑及其他藥物/療法可同時(shí)在單一組合物或在分開組合物中組合施用。可替代地，施用是序貫的。同時(shí)施用通過施用包括抑制劑及其他治療劑兩者的單一組合物或藥理學(xué)蛋白質(zhì)制劑來實(shí)現(xiàn)。可替代地，其他治療劑在與抑制劑的藥理學(xué)制劑(例如片劑、注射劑或飲料)大約相同的時(shí)間分開服用。試劑盒本公開內(nèi)容還提供了用于進(jìn)行本公開內(nèi)容的方法的試劑盒。在各個(gè)實(shí)施例中，試劑盒含有例如包含液體(例如無菌可注射)制劑或固體(例如凍干)制劑的瓶、小瓶、安瓿、管、藥液筒和/或注射器。試劑盒還可含有藥學(xué)可接受的媒介物或載體(例如溶劑、溶液和/或緩沖液)，用于將固體(例如凍干)制劑重構(gòu)成溶液或懸浮液用于施用(例如通過注射)，包括但不限于在注射器中重構(gòu)凍干制劑用于注射或用于將濃縮劑稀釋至較低濃度。此外，臨時(shí)注射溶液和懸浮液可由例如包含含有如本文所述的抑制劑的組合物的無菌粉末、顆?；蚱瑒┻M(jìn)行制備。試劑盒還可包括分配裝置，例如氣溶膠或注射分配裝置、筆式注射器、自動(dòng)注射器、無針注射器、注射器和/或針。在各個(gè)實(shí)施例中，試劑盒還提供用于方法中的抑制劑的經(jīng)口劑型，例如本文所述的片劑或膠囊或其他經(jīng)口制劑。試劑盒還提供了使用說明書。雖然本公開內(nèi)容已與其具體實(shí)施例結(jié)合進(jìn)行描述，但前述描述以及下述實(shí)例預(yù)期舉例說明而不是限制本公開內(nèi)容的范圍。在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)的其他方面、優(yōu)點(diǎn)和修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。實(shí)例1-MTDH敲除小鼠的生成和在腫瘤進(jìn)展中的作用為了調(diào)查異粘蛋白對(duì)體內(nèi)乳腺癌細(xì)胞的發(fā)展、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的作用，生成異粘蛋白敲除小鼠。實(shí)驗(yàn)程序小鼠：所有涉及小鼠的實(shí)驗(yàn)方案均得到PrincetonUniversity的機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)(IACUC)批準(zhǔn)。通過將ES細(xì)胞系XB780(BayGenomics)注射到C57BL/6胚泡內(nèi)，隨后確認(rèn)種系傳遞，來生成Mtdh-KO小鼠。隨后在FVB背景中用MMTV-PyMT、MMTV-ErbB2、MMTV-Wnt轉(zhuǎn)基因小鼠(JacksonLaboratory)育種之前，將KO小鼠回交至FVB背景>6代。為了產(chǎn)生MMTV-Mtdh構(gòu)建體，將小鼠Mtdh編碼序列插入pMMTV-SV40載體內(nèi)，隨后使表達(dá)盒線性化并顯微注射到來自FVB小鼠的受精卵的原核中。對(duì)于自發(fā)性腫瘤發(fā)生研究，就乳房腫瘤每周檢查攜帶特定癌基因的雌性小鼠。當(dāng)腫瘤變得可觸及連續(xù)兩周時(shí)，腫瘤視為建立，并且通過卡鉗測(cè)量腫瘤用于計(jì)算腫瘤體積(πx長度x寬度2/6)。肺結(jié)節(jié)在固定后(MMTV-PyMT模型)或在肺切片和染色后(MMTV-ErbB2模型)直接進(jìn)行計(jì)數(shù)。Mtdh敲除等位基因的基因分型：為了測(cè)定基因捕獲盒在Mtdh基因座的第二內(nèi)含子中的精確插入位點(diǎn)，正向引物5'-CTGCAAAACAAGCACCAGAG-3'(位于Mtdh的第二外顯子中)(SEQIDNO:6)和反向引物5'-GTTTTCCCAGTCACGACGTT-3'(位于靶向載體pGT0pfs中)IDNO:7)用于擴(kuò)增覆蓋插入位點(diǎn)的片段，使用Expand20kbPUSPCRSystem(Roche)。將PCR產(chǎn)物測(cè)序，并且插入位點(diǎn)確定為在Mtdh的第二內(nèi)含子的3041bp處?；诓迦胛稽c(diǎn)，設(shè)計(jì)三種基因分型引物，以如下所示區(qū)分Mtdh+/+、Mtdh+/-和Mtdh-/-小鼠。野生型等位基因?qū)?yīng)于602bpPCR片段，而基因捕獲等位基因?qū)?yīng)于472bpPCR片段。用于基因分型野生型和基因捕獲Mtdh等位基因的PCR引物在表1中：表1MMTV-Mtdh轉(zhuǎn)基因的基因分型：DNA印跡基因分型通過Transgenic&KnockoutSharedResource在RutgersCancerInstituteofNewJersey執(zhí)行，以確認(rèn)轉(zhuǎn)基因系。對(duì)于PCR基因分型，用于鑒定MMTV-Mtdh轉(zhuǎn)基因后代的引物設(shè)計(jì)為擴(kuò)增Mtdh和SV40之間的連接區(qū)，而靶向其他基因組DNA區(qū)的引物充當(dāng)內(nèi)部對(duì)照。用于基因分型MMTV-Mtdh轉(zhuǎn)基因的PCR引物在表2中。表2乳房癌發(fā)生乳房癌發(fā)生實(shí)驗(yàn)使用先前描述的方案執(zhí)行。簡(jiǎn)言之，在通過管飼法每周接受在0.1ml棉籽油中的1mgDMBA(Sigma-AldrichChemicalCo,St.Louis,MO)共連續(xù)四周前一周，具有所示Mtdh基因型的6周齡雌性FVB/N小鼠用15mgMPA(Depo-Provera,NY,Pfizer)進(jìn)行皮下注射。就腫瘤形成每周檢查小鼠。組織學(xué)和免疫組織化學(xué)為了檢測(cè)β-半乳糖苷酶(lacZ)活性，胚胎在0.2％戊二醛中固定30分鐘，在磷酸鹽緩沖鹽水中洗滌，并且在X-gal染色液(在0.1M磷酸鈉，pH7.3中的1mg/ml4-氯-5-溴-3-吲哚基-β-半乳糖苷(X-gal)、4mMK4Fe(CN)6·3H2O、4mMK3Fe(CN)6、2mMMgCl2、0.01％脫氧膽酸鹽和0.02％NonidetP-40)中溫育過夜。在染色后，胚胎還在10％磷酸鹽緩沖的福爾馬林中固定。對(duì)于乳腺的全標(biāo)本包埋(wholemount)制備，將第4個(gè)腹股溝乳腺解剖，并在10％磷酸鹽緩沖的福爾馬林中固定過夜，隨后為水合和胭脂紅染色。隨后將染色的腺體在一系列醇浴中脫水，用histoclear試劑脫脂并固定。對(duì)于組織學(xué)，將福爾馬林固定的組織包埋在石蠟中，切片并用蘇木精和曙紅(H&E)染色。對(duì)于免疫組織化學(xué)染色，在石蠟包埋的切片上使用由檸檬酸緩沖液(pH＝6)的抗原熱恢復(fù)，并且使切片與針對(duì)PyMT(NovusBiologicals,NB100-2749,1:200)、切割的半胱天冬酶-3(CellSignaling，目錄#9664，1:200)、ERBB2(CellSignaling，目錄#2165，1:100)和p-ERBB2(CellSignaling，目錄#2243，1:200)的抗體一起溫育1小時(shí)。使生物素化的二抗溫育30分鐘，隨后與ABC試劑(Vectorlaboratories)一起溫育。根據(jù)制造商的說明書(Invitrogen)，HRP在3,3-二氨基苯胺中顯色。組織切片用蘇木精復(fù)染，脫水并固定。為了定量圖9A中切割的半胱天冬酶3-陽性細(xì)胞，在顯微鏡下獲取超過20個(gè)隨機(jī)圖像(>2000個(gè)細(xì)胞)，并且手動(dòng)計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞。組織陣列免疫染色使用兩個(gè)乳腺癌組織微陣列，并且用針對(duì)MTDH(Invitrogen，目錄#40-6500)和SND1(Sigma,HPA002632)的抗體染色。一個(gè)TMA得自Biomax(BR1921a)，并且由160個(gè)原發(fā)性腫瘤、5個(gè)正常組織和27個(gè)正常鄰近組織組成。在這192個(gè)樣品中，154個(gè)樣品就MTDH和SND1兩者成功染色。第二個(gè)TMA得自CancerInstituteofNewJersey(CINJYMTA_201)，并且由399個(gè)原發(fā)性腫瘤組成。在這399個(gè)樣品中，270個(gè)樣品就MTDH和SND1兩者成功染色。每個(gè)樣品根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分為陰性(0)、弱(1)、中等(2)或強(qiáng)(3)。免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡對(duì)于免疫沉淀(IP)實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)的細(xì)胞在冷PBS中洗滌，且在裂解緩沖液(20mMTrispH7.4、0.15MNaCl、1mMEDTA、1mMEGTA、1％Tx-100、0.0025MNa2P2O7、1mMα-甘油磷酸酯、1mMNa3VO4和1mMNaF)中裂解，所述裂解緩沖液具有無EDTA蛋白酶抑制劑混合物(RocheAppliedScience)和PMSF。細(xì)胞裂解產(chǎn)物隨后在冰上溫育10分鐘，離心并通過與蛋白A/G珠(SantaCruzBiotechnology)一起在4℃下溫育1小時(shí)得到預(yù)澄清。對(duì)于IP珠制備，使30μl蛋白A/G珠與5μg抗體一起在4℃下溫育2小時(shí)。IP在4℃下進(jìn)行過夜，并且使珠離心、洗滌且隨后在SDS蛋白質(zhì)上樣緩沖液中煮沸5分鐘，以洗脫結(jié)合蛋白質(zhì)。IP裂解產(chǎn)物經(jīng)歷用所示抗體的蛋白質(zhì)印跡。對(duì)于蛋白質(zhì)印跡，組織/腫瘤從小鼠中取出且立即在液氮中冷凍，隨后為用研缽和研棒在RIPA緩沖液加上PMSF和蛋白酶抑制劑中的勻漿化。對(duì)于培養(yǎng)的細(xì)胞，裂解產(chǎn)物通過將裂解緩沖液直接加到板上進(jìn)行收集。蛋白質(zhì)印跡凝膠制備和免疫印跡遵循標(biāo)準(zhǔn)程序執(zhí)行。針對(duì)MTDH(invitrogen，目錄#40-6500)、SND1(Santacruz，目錄#sc-271590)、ERBB2(CellSignaling，目錄#2165)、p-ERBB2(CellSignaling，目錄#2243)、EGFR(CellSignaling，目錄#4267)、抗Myc(SantaCruz，目錄#sc-40)、和抗HA(SantaCruz，目錄#sc-7392)的抗體進(jìn)行1:1000稀釋。ALDEFLUOR測(cè)定和ALDH陽性群通過FACS的分離根據(jù)制造商的說明書，ALDEFLUOR試劑盒(StemCellTechnologies,Durham,NC,USA)用于分離具有高ALDH酶促活性的群。簡(jiǎn)言之，從自發(fā)性或移植的PyMT腫瘤中新鮮解離的腫瘤細(xì)胞懸浮于含有ALDH底物的ALDEFLUOR測(cè)定緩沖液(含有1μmol/LBAAA/1x106個(gè)細(xì)胞的1ml緩沖液)中，并且在37℃下溫育45分鐘。對(duì)于每個(gè)細(xì)胞樣品，等分試樣在緊加入底物之前用50mMALDH抑制劑二乙基氨基苯甲醛(DEAB)進(jìn)行處理。使用僅由PI染色(關(guān)于活力)的細(xì)胞和用DEAB處理的ALDEFLUOR染色的細(xì)胞作為陰性對(duì)照建立分選門。人乳腺癌TMA：兩個(gè)人乳腺TMA用于研究中，以檢查MTDH和SND1蛋白質(zhì)水平的關(guān)聯(lián)。一個(gè)TMA購自USBiomax(BR1921a)，并且第二個(gè)TMA得自CancerInstituteofNewJersey(YMTA_201)。兩組TMA均使用去鑒定的腫瘤樣品，并且由PrincetonUniversity和RutgersNewJerseyMedicalSchool的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)(InstitutionalReviewBoard)視為豁免的。收獲乳腺上皮細(xì)胞和流式細(xì)胞術(shù)：如先前描述的制備乳腺或腫瘤的單細(xì)胞懸浮液(Shackleton等人，2006)。簡(jiǎn)言之，將組織切碎，剁成小片并在37℃下在培養(yǎng)基(含有5％FBS、10ng/mlEGF、500ng/ml氫化可的松、5μg/ml胰島素、20ng/ml霍亂毒素和1％Pen/Strep的1:1DMEM:Ham’sF-12培養(yǎng)基)中消化1小時(shí)，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充有300U/ml1A型膠原酶(Sigma)和100U/ml透明質(zhì)酸酶(Sigma)。在通過40μm尼龍細(xì)胞濾器過濾和抗體染色之前，類器官在37℃下進(jìn)行序貫懸浮，使用0.25％胰蛋白酶-EDTA1.5分鐘、5mg/ml分散酶(Invitrogen)和0.1mg/mlDNA酶(Sigma)5分鐘、以及0.64％氯化銨5分鐘。乳腺上皮細(xì)胞與含有CD31、CD45、TER119、CD24、CD29和CD61的抗體混合物(cocktail)一起溫育30分鐘，隨后為在FACS分析或分選之前的二抗染色20分鐘。有限稀釋測(cè)定：對(duì)于乳腺重構(gòu)測(cè)定，將來自7或8周齡雌性小鼠的乳腺的MEC的單細(xì)胞懸浮液分選，并且注射到3周齡接受者小鼠的清除乳房脂肪墊內(nèi)。生長在移植后6-8周時(shí)進(jìn)行分析。對(duì)于腫瘤發(fā)生測(cè)定，原始MEC的單細(xì)胞懸浮液移植到FVBWT接受者小鼠內(nèi)，除非另有說明。乳房球/腫瘤球測(cè)定：?jiǎn)渭?xì)胞在具有球體培養(yǎng)基(補(bǔ)充有B27(Invitrogen)、20ng/mLEGF(Novoprotein)、20ng/mLbFGF和4μg/mL肝素的1:1DMEM:Ham’s12)的超低附著板(Corning,Tewksbury,MA)中鋪平板。球體在鋪平板后4-7天進(jìn)行計(jì)數(shù)。微陣列分析：RNA在CPT(50μM)處理后從所示腫瘤細(xì)胞中提取，并且用AgilentWholeMouseGenome4x44k陣列進(jìn)行分析。RNA樣品使用AgilentLowRNAInputLinearAmplificationKit用Cy5進(jìn)行標(biāo)記，并且連同Cy3標(biāo)記的MouseUniversalReferenceRNA(Stratagene)一起進(jìn)行雜交。陣列用AgilentG2565BA掃描儀進(jìn)行掃描，并且用AgilentFeatureExtractionv9.5軟件進(jìn)行分析。Cy5/Cy3比使用特征培養(yǎng)基信號(hào)進(jìn)行計(jì)算，并且通過陣列中值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。具有>2平均倍數(shù)變化和斯氏t檢驗(yàn)p值<0.05的基因包括作為SND1調(diào)節(jié)的基因。慢病毒感染：對(duì)于擊倒研究，含有shRNA序列的pLKO質(zhì)粒購自Sigma-Aldrich(StLouis,MO,USA)，所述shRNA序列靶向鼠Mtdh(KD1,TRCN0000125816；KD2,TRCN0000125818)、鼠Snd1(TRCN0000054742)、人MTDH(KD1,TRCN0000151467；KD2,TRCN0000322872；KD3,TRCN0000322949)和人SND1(KD1,TRCN0000245140；KD2,TRCN0000245141；KD3,TRCN0000245144)。遵循標(biāo)準(zhǔn)方案，使用HEK293-T細(xì)胞作為包裝細(xì)胞系連同輔助質(zhì)粒VSVG(包膜)和p8.91(gag-pol,pCMV-dR8.91)，所有慢病毒構(gòu)建體質(zhì)粒均被包裝到病毒內(nèi)。原代細(xì)胞用補(bǔ)充有8μg/mL聚凝胺的含濃縮病毒的培養(yǎng)基在4℃下以1000g旋轉(zhuǎn)感染2小時(shí)且隨后移植，或在感染后在板中進(jìn)行培養(yǎng)且在實(shí)驗(yàn)中使用之前進(jìn)行分選。qRT-PCR分析：根據(jù)制造商的說明書，總RNA使用RNeasy試劑盒(Qiagen)進(jìn)行分離，并且用SuperscriptIII試劑盒(Invitrogen)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。定量PCR使用SYBRGreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems)與ABIPrism7900HT熱循環(huán)儀(AppliedBiosystems)執(zhí)行?；蚣细患治?GSEA)：標(biāo)準(zhǔn)化的微陣列表達(dá)數(shù)據(jù)通過使用所提供的類別比(即倍數(shù)變化)量度通過表達(dá)進(jìn)行排序。將相同基因的多個(gè)探針匹配折疊為(collapsed)一個(gè)值，其中在每種情況下使用最高的探針讀數(shù)。SND1_CPT_UP標(biāo)記含有在CPT處理后通過SND1特異性上調(diào)>2倍(p<0.05)的504種基因。SND1_CPT_UP標(biāo)記使用經(jīng)典富集統(tǒng)計(jì)學(xué)經(jīng)由GSEA就排序列表中的富集進(jìn)行測(cè)試，并且與來自基因集合的1000個(gè)隨機(jī)排列的富集結(jié)果相比較，以獲得p值。使用缺省GSEA參數(shù)將原始富集得分轉(zhuǎn)換成標(biāo)準(zhǔn)化的富集得分。富集得分定義為位于排序基因列表的運(yùn)行和峰(即富集得分)之前或之處的基因集合成員。統(tǒng)計(jì)分析：需要時(shí)所有結(jié)果均經(jīng)歷統(tǒng)計(jì)分析。如圖例中指示的，對(duì)于大多數(shù)研究使用時(shí)序檢驗(yàn)、非參數(shù)曼懷二氏檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)和不成對(duì)、雙側(cè)、獨(dú)立斯氏t檢驗(yàn)，其中具有相等方差假設(shè)。對(duì)于有限稀釋測(cè)定，MaSC或TIC的頻率和統(tǒng)計(jì)學(xué)使用L-calc軟件(StemCellTechnologies)進(jìn)行計(jì)算。p值在所有圖中指示為*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。登錄號(hào)：所有原始微陣列數(shù)據(jù)文件均在GEO數(shù)據(jù)庫(GSE55522)中可獲得。結(jié)果Mtdh敲除小鼠是存活的并且與WT小鼠肉眼無法區(qū)分為了生成Mtdh敲除(KO)小鼠，篩選BayGenomics基因捕獲數(shù)據(jù)庫，并且選擇含有進(jìn)入Mtdh的第二內(nèi)含子內(nèi)的插入片段的ESC系XB780，所述插入片段導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的過早終止(圖1A)。XB780ES細(xì)胞注射到胚泡內(nèi)生成嵌合小鼠，伴隨種系傳遞的后續(xù)確認(rèn)。Mtdh雜合(Mtdh+/-)小鼠之間的雜交以孟德爾比例產(chǎn)生子代。Mtdh純合KO(Mtdh-/-)胚胎顯示廣泛的LacZ活性(圖1B)，表明在許多胚胎器官中的遍在Mtdh表達(dá)。在成年小鼠中，MTDH也在野生型(WT,Mtdh+/+)和Mtdh+/-小鼠的各種組織中檢測(cè)到，而在Mtdh-/-小鼠中無法檢測(cè)，從而確認(rèn)基因捕獲的等位基因完全消除Mtdh表達(dá)。Mtdh-/-小鼠是存活、能育的，并且當(dāng)監(jiān)測(cè)長達(dá)兩年時(shí)，未展示明顯異常。MTDH還在正常乳腺上皮細(xì)胞(MEC)中檢測(cè)到，并且表達(dá)水平與Mtdh遺傳狀態(tài)相關(guān)(圖1C)。為了評(píng)價(jià)MTDH缺陷在出生后乳腺發(fā)育中的影響，檢查來自WT和KO處女小鼠的腹股溝乳房脂肪墊的全標(biāo)本包埋。除了與WT同窩者相比較，來自3周齡和5周齡KO小鼠的乳腺的導(dǎo)管長出中的瞬時(shí)延遲之外，在以后時(shí)間點(diǎn)或在妊娠和哺乳期間未觀察到分支形態(tài)發(fā)生中的顯著差異。在青春期時(shí)開始的WT和Mtdh-/-小鼠中在很大程度上可比較的乳腺上皮允許我們使用Mtdh-/-小鼠檢查MTDH對(duì)于乳房腫瘤形成的必要性。MtdhKO抑制管腔乳房腫瘤中的腫瘤形成和轉(zhuǎn)移：為了剖析MTDH在自身乳房腫瘤進(jìn)展中的作用，首先使用MMTV-PyMT和MMTV-ErbB2轉(zhuǎn)基因模型，這兩種模型均發(fā)展管腔腺癌，伴隨肺轉(zhuǎn)移的高發(fā)生率。在侵略性MMTV-PyMT模型中，乳房腫瘤早在42日齡時(shí)出現(xiàn)，并且到第63天時(shí)，50％的Mtdh+/+小鼠發(fā)展腫瘤(圖1D)。相比之下，第一可觸及腫瘤在第50天時(shí)在Mtdh-/-組中檢測(cè)到，并且這些小鼠中的50％僅在80天后發(fā)展腫瘤。腫瘤出現(xiàn)中的延遲還通過與WT對(duì)照相比較在Mtdh-/-小鼠中更大數(shù)目的無腫瘤乳腺得到支持(圖1E)。一致地，PyMT；Mtdh+/-和PyMT；Mtdh-/-小鼠的總腫瘤負(fù)荷分別減少為WT對(duì)照那種的54％和10％(圖1F)。此外，PyMT；Mtdh-/-小鼠具有顯著更少(圖1G)和更小的(p<0.05)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。腫瘤形成中的差異在MMTV-ErbB2模型中甚至更突出，其中腫瘤發(fā)生在長潛伏期后出現(xiàn)。雖然幾乎所有ErbB2；Mtdh+/+小鼠到300日齡時(shí)均發(fā)展腫瘤，但超過60％的ErbB2；Mtdh-/-小鼠沒有腫瘤(圖1H和1I)。即使監(jiān)測(cè)直到18個(gè)月時(shí)，30％的ErbB2；Mtdh-/-小鼠(n＝68)仍保持完全無腫瘤，而所有ErbB2；Mtdh+/+小鼠(n＝61)均死亡或達(dá)到安樂死的發(fā)病率標(biāo)準(zhǔn)(p<0.0001)。肺轉(zhuǎn)移在ErbB2；Mtdh-/-小鼠中也嚴(yán)重受損(圖1J和1K)。乳房腫瘤形成中的差異并非是由于癌基因的差異誘導(dǎo)，因?yàn)镻yMT和ErbB2的表達(dá)在WT和KO乳腺或腫瘤之間是可比較的。另外，如通過其磷酸化指示的，ErbB2的活化不受影響。此外，與年齡匹配的正常對(duì)照相比較，MTDH蛋白質(zhì)水平在PyMT和ErbB2驅(qū)動(dòng)的腫瘤中是升高的，表明高水平的MTDH可在腫瘤發(fā)生期間對(duì)MEC賦予生長優(yōu)點(diǎn)。MtdhKO遏制基底樣和混合亞型乳房腫瘤的形成：MTDH在腫瘤形成中的調(diào)查擴(kuò)展至MMTV-Wnt模型，所述MMTV-Wnt模型發(fā)展顯示出乳房干細(xì)胞(MaSC)樣基因表達(dá)譜且類似人乳腺癌的基底亞型的腫瘤(Herschkowitz等人，2007)。雖然基本上所有Wnt；Mtdh+/+小鼠在300日齡時(shí)均死于癌癥，但在35％的Wnt；Mtdh+/-和62％的Wnt；Mtdh-/-小鼠中未檢測(cè)到腫瘤(圖1L)。腫瘤的多樣性也高度依賴于Mtdh的基因劑量(圖1M)。這些表型明顯類似于我們?cè)诠芮荒[瘤模型中觀察到的那種。為了拓寬我們的分析，我們使用乙酸甲羥孕酮(MPA)和7,12-二甲基苯并蒽(DMBA)的組合處理誘導(dǎo)乳房癌發(fā)生(圖1N)，所述組合處理導(dǎo)致形成具有腺癌、腺鱗癌和腺肌上皮瘤的組織學(xué)特征的乳腺腫瘤(Yin等人，2005)。再次，Mtdh-/-雌性顯示在MPA/DMBA處理后顯著減弱的腫瘤敏感性(圖1N和1O)。MtdhKO損害癌基因誘導(dǎo)的基底和管腔TIC的擴(kuò)增和活性：Mtdh缺失對(duì)乳房腫瘤形成的顯著作用促進(jìn)了在腫瘤發(fā)生期間的早期事件調(diào)查。為此，我們檢查了在檢查的腫瘤前期時(shí)來自不同腫瘤模型的乳腺的全標(biāo)本包埋(圖2A，上圖)和蘇木精/曙紅染色切片(圖2A，下圖)。PyMT和Wnt癌基因兩者均在Mtdh+/+小鼠中誘導(dǎo)早在四周時(shí)的廣泛增生；然而，Mtdh-/-腺體顯示出與正常導(dǎo)管結(jié)構(gòu)混雜的顯著更少和更小的增生病灶。MMTV-ErbB2小鼠具有最長的腫瘤潛伏期，并且這對(duì)應(yīng)于顯著延遲和最不嚴(yán)重的增生。來自6月齡無腫瘤MMTV-ErbB2雌性的乳腺的全標(biāo)本包埋分析揭示：在Mtdh陽性小鼠中接近于100％的增生發(fā)生率，而來自ErbB2；Mtdh-/-的那些中的僅20％為輕度增生(圖3A和3B)。Mtdh-/-腺體中的這些嚴(yán)重受損的腫瘤前變化可表明在轉(zhuǎn)化的MEC的擴(kuò)增中的缺陷。為了檢查在乳腺的細(xì)胞組成中的癌基因誘導(dǎo)的變化，腫瘤前乳腺使用CD24、CD29(β1整聯(lián)蛋白)和CD61(β3整聯(lián)蛋白)進(jìn)行概況分析，這先前已用于分辨管腔和基底乳腺上皮亞群(Asselin-Labat等人，2007；Shackleton等人，2006)。與正常腺體相比較，PyMT腫瘤前組織展示Lin-CD24+CD29低管腔亞群(CD24+CD29低)的急劇擴(kuò)增(圖2B和2C)，與“管腔樣”基因表達(dá)概況的先前報(bào)道(Herschkowitz等人，2007)一致。相比之下，富含MaSC的Lin-CD24+CD29高(CD24+CD29hi)基底群的百分比在來自Wnt乳腺的腫瘤前組織中顯著增加(圖2B和2D)，如先前注明的(Shackleton等人，2006)，表明該群代表在該模型中轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵細(xì)胞靶。有趣的是，上皮層級(jí)的這些癌基因特異性擾動(dòng)受Mtdh喪失損害，如通過下述證明的：(1)在PyMT；Mtdh-/-腺體中的CD24+CD29低管腔亞群擴(kuò)增的缺乏(圖2B和2C)；(2)與WT配對(duì)物相比較，在Wnt；Mtdh-/-腺體中的CD24+CD29hi基底亞群擴(kuò)增中的顯著減少(圖2B和2D)。值得注意的是，與正常腺體相比較，Mtdh+/+小鼠中的PyMT或Wnt誘導(dǎo)的增生腺體不顯示出CD61+群的選擇性擴(kuò)增(圖3C和3D，比較橙色條)。然而，與Wnt；Mtdh+/+腺體相比較，比CD61-細(xì)胞(圖3E)更能形成乳房球的CD61+細(xì)胞的百分比在Wnt；Mtdh-/-腺體中顯著減少(圖3C和3D，比較WT相對(duì)于KO)。為了測(cè)試Mtdh-/-腫瘤前腺體是否的確含有更少的TIC，我們從Mtdh+/+和Mtdh-/-腫瘤前腺體中分離原代MEC(pMEC)，并且執(zhí)行體外乳房球形成測(cè)定。Mtdh-/-pMEC跨越多重腫瘤模型形成減少數(shù)目的球體(圖2E)。此外，當(dāng)原位移植到WT接受者小鼠中時(shí)，PyMT；Mtdh-/-pMEC在體內(nèi)含有基本上更少的腫瘤再生細(xì)胞，如當(dāng)測(cè)試一系列稀釋數(shù)目時(shí)減少的腫瘤發(fā)生率所揭示的(圖2F)。隨后分析PyMT誘導(dǎo)的TIC是否存在于擴(kuò)增的管腔群中。來自PyMT小鼠的腫瘤前腺體的分選的管腔和基底pMEC在體內(nèi)進(jìn)行移植。在接受管腔而不是基底細(xì)胞的小鼠中以高頻率檢測(cè)到腫瘤(圖2G)，表明PyMT誘導(dǎo)的腫瘤前TIC與MEC的管腔亞群共純化。重要的是，當(dāng)在體內(nèi)檢查來自PyMT；Mtdh+/+和PyMT；Mtdh-/-雌性的管腔細(xì)胞的致瘤能力時(shí)，腫瘤發(fā)生率(圖2H)和體積(圖2I)在移植有Mtdh-/-細(xì)胞的小鼠中基本上減少。這些結(jié)果表明，管腔細(xì)胞的不僅擴(kuò)增而且致瘤潛力在PyMT；Mtdh-/-小鼠中嚴(yán)重?fù)p害。根據(jù)先前的報(bào)道(Shackleton等人，2006)，與正常對(duì)照相比較，在MMTV-ErbB2腫瘤前腺體中未檢測(cè)到MEC的管腔或基底亞群的選擇性擴(kuò)增。為了鑒定哪個(gè)亞群的MEC充當(dāng)TIC，從ErbB2；Mtdh+/+增生腺體中分選出管腔和基底MEC，并且原位移植這些細(xì)胞。在接受管腔或基底MEC的100％小鼠中檢測(cè)到可觸及的腫瘤(圖3F和3G)。無論細(xì)胞來源如何，所有腫瘤在組織學(xué)中均非常類似來自MMTV-ErbB2小鼠的自發(fā)性腫瘤(圖3H)。這些結(jié)果表明MMTV-ErbB2腫瘤可源自管腔和基底區(qū)室兩者，并且基底細(xì)胞可引起管腔型腫瘤，這一發(fā)現(xiàn)得到近期報(bào)道(Zhang等人，2013a)支持。為了鑒定依賴于MTDH的細(xì)胞靶，來自ErbB2；Mtdh-/-雌性的管腔和基底亞群在體內(nèi)進(jìn)行移植。引人注目的是，當(dāng)接受ErbB2；Mtdh+/+細(xì)胞的所有小鼠均發(fā)展大腫瘤時(shí)，管腔和基底ErbB2；Mtdh-/-細(xì)胞均不引起可觸及的腫瘤(圖3F和3G)。這些結(jié)果表明MTDH對(duì)于維持ErbB2誘導(dǎo)的基底和管腔TIC是關(guān)鍵的。與其在早期腫瘤發(fā)生中調(diào)節(jié)TIC的必需作用形成對(duì)比，MTDH對(duì)于成年MaSC活性在很大程度上是可有可無的，如通過來自WT和KO小鼠的未分級(jí)的Lin-MEC(圖3J)或富集MaSC的基底細(xì)胞(圖3K和3L)的類似的體內(nèi)乳腺重構(gòu)(圖3I)效率所指示的。在促進(jìn)乳房腫瘤起始能力中的MEC固有作用：由于MTDH在小鼠中廣泛表達(dá)，全生物KO小鼠中的腫瘤發(fā)生缺陷可起因于MEC或其他細(xì)胞/組織類型中的MTDH喪失。為了區(qū)分這兩種可能性，將小鼠MTDH在體內(nèi)特異性地重新引入Mtdh-/-小鼠的MEC中，并測(cè)試這是否援救致瘤性缺陷。為此，產(chǎn)生MMTV-Mtdh轉(zhuǎn)基因小鼠系(圖4A、5A和5B)，并且在乳腺中以及在唾液腺(在較小程度上)中特異性地觀察到Mtdh轉(zhuǎn)基因的表達(dá)(圖5C)。接下來，將這些MMTV-Mtdh小鼠與PyMT；Mtdh-/-小鼠雜交，以產(chǎn)生具有或不具有外源Mtdh轉(zhuǎn)基因的PyMT；Mtdh-/-小鼠(圖4A)。值得注意的是，轉(zhuǎn)基因(Tg)援救的PyMT；Mtdh-/-腫瘤表達(dá)與PyMT；Mtdh+/+腫瘤的那種相似的MTDH水平(圖4B)。與PyMT；Mtdh-/-小鼠相比較，觀察到來自PyMT；Mtdh-/-+Tg腫瘤前腺體的管腔細(xì)胞擴(kuò)增中的幾乎兩倍增加(圖4C)。此外，在PyMT；Mtdh-/-+Tg組中，腫瘤發(fā)作加速(圖4D)并且腫瘤負(fù)荷(圖4E和4F)增加。Mtdh轉(zhuǎn)基因的存在不改變所得到的腫瘤的組織學(xué)(圖5D)。這些結(jié)果強(qiáng)烈支持MTDH在促進(jìn)靶細(xì)胞擴(kuò)增和隨后的體內(nèi)乳房腫瘤發(fā)生中的腫瘤固有作用，盡管不能排除腫瘤基質(zhì)的貢獻(xiàn)。為了補(bǔ)充我們的自發(fā)性腫瘤模型研究，接下來調(diào)查了MTDH的急性操作是否也影響腫瘤前MEC的致瘤潛能。MTDH在從PyMT；Mtdh+/+(圖4G)和ErbB2；Mtdh+/+(圖5E)雌性的腫瘤前腺體中新鮮解離的pMEC中被擊倒。在兩種模型中，MTDH擊倒(KD)細(xì)胞的球體形成能力在多個(gè)獨(dú)立樣品中顯著降低(圖4G和5E)。PyMT；Mtdh+/+pMEC的體內(nèi)腫瘤形成也被MTDHKD嚴(yán)重?fù)p害(圖4H)。相反，當(dāng)MTDH在PyMT；Mtdh-/-pMEC中經(jīng)由慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)恢復(fù)至與WT配對(duì)物可比較的水平時(shí)，體外球體和體內(nèi)腫瘤形成兩者均顯著增強(qiáng)(圖4I、4J和圖5F-5H)。接下來分析來自建立的MTDH陽性腫瘤的TIC是否依賴MTDH用于其功能性(圖4K)。當(dāng)用CD24和CD29進(jìn)行概況分析時(shí)(Vaillant等人，2008)，由PyMT、Wnt和ErbB2驅(qū)動(dòng)的腫瘤模型建立的腫瘤展示一個(gè)相對(duì)同質(zhì)的群的事實(shí)，突出顯示了需要其他標(biāo)記物來鑒定來自已建立的腫瘤的TIC。已在包括乳腺癌的多個(gè)癌癥類型中的癌癥干樣群中發(fā)現(xiàn)了增加的醛脫氫酶(ALDH)活性(Ginestier等人，2007)，但其在小鼠模型中作為TIC標(biāo)記物的用途仍然較少表征。從PyMT腫瘤中分選出ALDH+和ALDH-細(xì)胞(圖5I)，并且發(fā)現(xiàn)與ALDH-細(xì)胞相比，ALDH+細(xì)胞顯示出顯著更高的體外球體形成(圖4L)和體內(nèi)腫瘤起始活性(圖5J)。與具有TIC特征的ALDH+群體一致，由該群生成的腫瘤重現(xiàn)(recapitulate)了初始腫瘤的表型異質(zhì)性，具有ALDH+和ALDH-細(xì)胞的類似比。這指示ALDH+腫瘤細(xì)胞能夠自我更新，以及分化成ALDH-細(xì)胞。當(dāng)MTDH在來自PyMT；Mtdh+/+腫瘤的新鮮分離的ALDH+細(xì)胞中被擊倒時(shí)，球體形成活性顯著降低(圖4M)。對(duì)于MMTV-Wnt腫瘤，CD61+群已證實(shí)具有TIC特征且是高度致瘤的(Vaillant等人，2008)。一致地，CD61+腫瘤細(xì)胞能夠生成比CD61-細(xì)胞更大數(shù)目的腫瘤球體(圖4N)。重要的是，MTDHKD損害了來自MMTV-Wnt腫瘤的CD61+細(xì)胞中的球體形成活性(圖4O)。這些結(jié)果表明MTDH是MTDH陽性腫瘤中TIC的全部功能性連續(xù)需要的。MTDH的促腫瘤發(fā)生作用需要其相互作用配偶體SND1：SND1先前已被鑒定為人乳腺癌細(xì)胞中MTDH的主要結(jié)合配偶體，并且它具有類似于MTDH的轉(zhuǎn)移促進(jìn)功能(Blanco等人，2011)。在本研究中，發(fā)現(xiàn)MTDH和SND1之間的相互作用在人和鼠乳腺癌細(xì)胞中是良好保守的。為了測(cè)試SND1對(duì)MTDH在腫瘤起始中功能的必要性，SND1首先在PyMT；Mtdh-/-腫瘤細(xì)胞中被擊倒，并且顯示在這些細(xì)胞中援救小鼠MTDH的表達(dá)(圖6A)。MTDH在PyMT；Mtdh-/-腫瘤細(xì)胞中的重新引入一致地促進(jìn)體外球形成(圖4B)和體內(nèi)腫瘤形成(圖6C)；然而，MTDH的這種效應(yīng)在SND1KD后被完全消除(圖6B和6C)。如果MTDH的確需要SND1用于其促腫瘤發(fā)生功能，則預(yù)期Mtdh+/+腫瘤細(xì)胞中SND1的擊倒將表型模擬MTDH缺陷對(duì)乳房腫瘤發(fā)生的作用。事實(shí)上，Mtdh+/+腫瘤細(xì)胞中的SND1KD損害體外球體形成活性(圖6D)和體內(nèi)腫瘤起始(圖6E和6F)，類似MTDH消除對(duì)腫瘤起始活性的作用。這些結(jié)果共同指示MTDH對(duì)TIC的功能需要SND1的存在。為了進(jìn)一步測(cè)試與SND1的物理相互作用對(duì)MTDH的功能是否是關(guān)鍵的，進(jìn)行對(duì)蛋白質(zhì)的相互作用的詳細(xì)分析。SND1含有四個(gè)N末端葡萄球菌核酸酶(SN)重復(fù)和C末端Tudor-SN混合結(jié)構(gòu)域。缺少第二SN結(jié)構(gòu)域后的C末端序列的SND1構(gòu)建體(SND1ΔC，1-339)，與MTDH片段364-582而不是MTDH片段1-289化學(xué)計(jì)量結(jié)合(圖7A和7B)，類似全長SND1的結(jié)合行為(Blanco等人，2011)。這允許我們使用SND1ΔC片段用于下述體外結(jié)合研究。為了映射MTDH的最低限度SND1結(jié)合結(jié)構(gòu)域，生成在區(qū)域364-582內(nèi)的一系列MTDH片段(圖7A)，并測(cè)試其與SND1ΔC的相互作用。這導(dǎo)致鑒定足以用于SND1結(jié)合的22個(gè)氨基酸的片段(殘基386-407)(圖7A和7B)，其還通過MNDH-SND1復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)得到確認(rèn)(參見實(shí)例3)。為了測(cè)定對(duì)于相互作用必需的MTDH的關(guān)鍵殘基，設(shè)計(jì)了三種三重點(diǎn)突變體(稱為TPM)，其中每種具有在MTDH(SEQIDNO:1的氨基酸364-582)片段中的22-aa最低限度結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)的3個(gè)氨基酸突變(圖7A)。TPM1包含突變D389R、D393R和W394D。TPM2包含突變E399R、E400R和W401D。TPM3包含突變W404D、D406R和E407R。體外結(jié)合測(cè)定顯示TPM1和TPM2兩者均不能結(jié)合SND1ΔC，而TPM3與WTMTDH一樣有效地結(jié)合SND1ΔC(圖7C)。突變也在表3中闡述。表3為了檢查TPM1和TPM2是否在體內(nèi)與SND1相互作用，在HEK293T細(xì)胞中異位表達(dá)全長加上HA標(biāo)簽的SND1和加上Myc標(biāo)簽的MTDH，并且使細(xì)胞裂解產(chǎn)物經(jīng)歷抗Myc免疫沉淀。與來自體外結(jié)合測(cè)定的發(fā)現(xiàn)一致(圖7C)，HA-SND1由WT而不是TPM1或TPM2MTDH下拉(圖7D)。使用相似的策略進(jìn)一步分析所有9個(gè)個(gè)別突變，并且發(fā)現(xiàn)W394D完全消除結(jié)合并且W401D部分消除結(jié)合，而其他突變個(gè)別地不影響相互作用(圖7E)。注意到SND1結(jié)合缺陷型TPM1和TPM2MTDH仍能夠與AGO2相互作用(圖7D)，所述AGO2是另一種已知的MTDH結(jié)合配偶體(Yoo等人，2011)，表明這些突變不太可能引起MTDH中的總體構(gòu)象變化，而是選擇性地破壞與SND1的相互作用。測(cè)試這些突變是否影響MTDH在腫瘤發(fā)生中的功能。鼠形式的WTMTDH、TPM1或TPM2在PyMT；Mtdh-/-腫瘤細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)這些MTDH突變體喪失與SND1相互作用的能力(圖8A)。功能上，WTMTDH能夠增加PyMT；Mtdh-/-細(xì)胞在體外的球體形成活性和在體內(nèi)的腫瘤起始，而TPM1或TPM2突變體未能實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)(圖8B-8D)。當(dāng)測(cè)試W391D突變體(對(duì)應(yīng)于人MTDH中的W394D)時(shí)，觀察到類似的結(jié)果(圖8E-8H)。這些結(jié)果強(qiáng)烈地表明MTDH與SND1的結(jié)合殘基在人和小鼠中是高度保守的，并且與SND1的相互作用對(duì)于調(diào)節(jié)MTDH在調(diào)節(jié)TIC活性中的功能性是關(guān)鍵的。MTDH介導(dǎo)的SND1的穩(wěn)定化賦予MEC在應(yīng)激條件下的存活優(yōu)點(diǎn)：SND1已報(bào)道為在各種應(yīng)激條件下的存活因子(Gao等人，2010；Sundstrom等人，2009；Weissbach和Scadden，2012)。MTDH在腫瘤起始而不是乳腺的正常生理學(xué)中的更突出作用導(dǎo)致下述假設(shè)：MTDH通過其與SND1的相互作用賦予MEC在腫瘤發(fā)生期間的應(yīng)激條件下的優(yōu)點(diǎn)。支持這一假設(shè)，本文檢測(cè)到在腫瘤前PyMT；Mtdh-/-乳腺上皮中比在PyMT；Mtdh+/+配對(duì)物中顯著更高百分比的凋亡細(xì)胞，這在不含PyMT的腺體中未見(圖9A)。為了測(cè)試MTDH-SND1相互作用在體外應(yīng)激條件下的作用，我們用喜樹堿(CPT)處理由WT或突變型小鼠MTDH重構(gòu)的PyMT；Mtdh-/-pMEC，以誘導(dǎo)DNA復(fù)制應(yīng)激(圖9B)，這是在腫瘤發(fā)展過程中常見的應(yīng)激類型(Halazonetis等人，2008)。CPT處理以劑量依賴性方式誘導(dǎo)MEC的細(xì)胞凋亡(圖9B)。與對(duì)照相比較，存在MTDH援救組中凋亡細(xì)胞百分比的顯著減少，并且SND1結(jié)合缺陷突變消除了MTDH的這種促存活效應(yīng)(圖9B)。與SND1水平對(duì)于在應(yīng)激條件下的細(xì)胞存活是關(guān)鍵的先前觀察一致，在PyMT；Mtdh+/+MEC中的SND1沉默導(dǎo)致在CPT處理后細(xì)胞凋亡中的顯著增加(圖9C)。有趣的是，在用CPT處理的MEC中觀察到SND1蛋白質(zhì)水平的藥物劑量依賴性降低(圖9D)。這種現(xiàn)象不是這類應(yīng)激所獨(dú)有的，因?yàn)闊峒ぬ幚硪矊?dǎo)致SND1的快速減少。值得注意的是，在PyMT；Mtdh+/+pMEC中的MTDH沉默加速了SND1蛋白質(zhì)的減少(圖9D)。相反，在PyMT；Mtdh-/-MEC中的WT而不是SND1結(jié)合缺陷型MTDH的恢復(fù)穩(wěn)定了在這些應(yīng)激條件下的SND1蛋白質(zhì)(圖9E)。因此，這些數(shù)據(jù)共同表明MTDH通過與存活因子SND1相互作用且穩(wěn)定存活因子SND1促進(jìn)在應(yīng)激條件下的存活。為了提供SND1如何發(fā)揮其促存活功能的更好理解，對(duì)CPT處理后的對(duì)照相對(duì)于SND1-KDPyMT；Mtdh+/+pMEC執(zhí)行轉(zhuǎn)錄組概況分析(圖9F-9H)。Ingenuity途徑分析揭示通過SND1上調(diào)的基因(圖9F，>2倍變化，p<0.05)顯示對(duì)于分子和細(xì)胞功能包括“細(xì)胞死亡和存活”、“細(xì)胞周期”和“DNA修復(fù)”的顯著富集(圖9G)，這是與CPT誘導(dǎo)的復(fù)制應(yīng)激相關(guān)的過程。有趣的是，SND1上調(diào)基因的顯著部分牽涉“細(xì)胞死亡和存活”類別，并且這些基因的表達(dá)共同被預(yù)測(cè)顯著活化細(xì)胞存活功能(圖9H，頂部六行)，且損害細(xì)胞死亡和細(xì)胞凋亡(圖9H，底部?jī)尚?。因此，SND1全面活化促存活基因的能力可能是其在使細(xì)胞免于應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的作用的基礎(chǔ)(圖9C)。為了證實(shí)MTDH通過與SND1相互作用且穩(wěn)定SND1來調(diào)節(jié)存活的假設(shè)，用WT或SND1結(jié)合缺陷突變型小鼠MTDH(W391D)重構(gòu)的PyMT；Mtdh-/-pMEC進(jìn)行了概況分析。基因集合富集分析(GSEA)證實(shí)了SND1上調(diào)的基因標(biāo)記在用WT相對(duì)于突變型Mtdh重構(gòu)的PyMT；Mtdh-/-pMEC中顯著富集(圖9I)。MTDH和SND1對(duì)于人乳腺癌細(xì)胞的腫瘤起始活性是重要的：為了證實(shí)MTDH和SND1兩者在人乳腺癌的腫瘤起始活性中的重要作用，MTDH或SND1在多重人乳腺癌模型中被沉默，包括：(1)HER2/Neu-轉(zhuǎn)化的人乳腺上皮細(xì)胞(HMLE-N)(Mani等人，2008)(圖10A、10B、11A和11B)，(2)人原發(fā)性患者衍生的異種移植物(DeRose等人，2011；Zhang等人，2013b)(圖10C、10D、11C和11D)，和(3)MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞系(圖10E-10H)。MTDH或SND1的擊倒顯著減少所有測(cè)試模型的體外腫瘤球形成和體內(nèi)MDA-MB-231細(xì)胞的腫瘤起始。還檢查MTDH介導(dǎo)的SND1的穩(wěn)定化是否在人乳腺癌樣品中出現(xiàn)。在確認(rèn)抗體的特異性之后(圖11E和11F)，用針對(duì)MTDH和SND1的抗體對(duì)人乳腺癌組織微陣列(TMA)進(jìn)行染色(圖10I-10J)。發(fā)現(xiàn)MTDH和SND1的染色得分之間的正相關(guān)(圖10I和10J)，這使用獨(dú)立的TMA得到確認(rèn)(圖11G和11H)。值得注意的是，MTDH和SND1在mRNA水平上不相關(guān)(圖11I)。這些數(shù)據(jù)支持MTDH在乳腺癌中SND1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵作用，與我們的發(fā)現(xiàn)一致：MTDH在腫瘤發(fā)生過程中的應(yīng)激條件下與SND1相互作用且穩(wěn)定SND1。為了進(jìn)一步探索MTDH-SND1相互作用的臨床重要性，分析了NKI295人乳腺癌微陣列數(shù)據(jù)集(vandeVijver等人，2002)?；赟ND1和MTDH兩者的中值表達(dá)，將患者分成四個(gè)不同的組。具有MTDH和SND1兩者的高mRNA水平的原發(fā)性腫瘤顯著較大(圖11J)、較少分化(圖11K)并與較短的無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移存活相關(guān)(圖11L)，從而支持在腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中人乳腺癌中的MTDH和SND1之間的功能合作。與其在不同乳腺腫瘤模型中的腫瘤促進(jìn)功能一致，還發(fā)現(xiàn)更高水平的MTDH預(yù)測(cè)KM-繪圖儀數(shù)據(jù)集中跨越多重乳腺癌亞型的預(yù)后不良(圖11M)。不受理論束縛，但看起來MTDH在管腔A亞型中的表面上更強(qiáng)的預(yù)后能力很可能是由于與其他亞型相比較在該組中顯著更大的樣品大小。討論雖然腫瘤進(jìn)展的經(jīng)典克隆進(jìn)化理論假定轉(zhuǎn)移能力被在原發(fā)性腫瘤內(nèi)的罕見細(xì)胞中出現(xiàn)的隨機(jī)遺傳變化賦予，但基因組和臨床研究矛盾地證實(shí)可通過概況分析大部分原發(fā)性腫瘤來預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移的可能性(vandeVijver等人，2002)。這表明轉(zhuǎn)移潛力可由具有附加轉(zhuǎn)移促進(jìn)功能的致癌事件賦予(Bernards和Weinberg，2002)，因此這些遺傳變化可在腫瘤進(jìn)化早期出現(xiàn)并選擇(Vanharanta和Massague，2013)。支持這個(gè)概念，幾種促進(jìn)轉(zhuǎn)移的基因已顯示促進(jìn)異種移植模型中的原發(fā)性腫瘤生長(Vanharanta和Massague，2013；Wan等人，2013)。除了其報(bào)道的促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用之外，MTDH在人原發(fā)性乳腺腫瘤中的復(fù)發(fā)性擴(kuò)增/過表達(dá)因此可牽涉腫瘤發(fā)生中的MTDH。雖然使用人或鼠乳腺癌細(xì)胞系的先前研究未能揭示MTDH對(duì)異種移植模型中原發(fā)性腫瘤形成的任何作用(Brown和Ruoslahti，2004；Hu等人，2009)，但目前研究中使用的遺傳工程小鼠模型使我們能夠揭示MTDH在腫瘤發(fā)生的早期階段調(diào)節(jié)腫瘤起始細(xì)胞的擴(kuò)增和活性的作用，從而在原發(fā)性腫瘤起始與獲得轉(zhuǎn)移性狀之間建立另一種分子聯(lián)系。當(dāng)在先前的異種移植物研究中使用大量高度侵略性和晚期腫瘤細(xì)胞時(shí)，MTDH對(duì)腫瘤起始的這種作用可能被掩蓋。與該推測(cè)一致，當(dāng)大量移植晚期PyMT腫瘤細(xì)胞時(shí)，在MtdhWT和KO細(xì)胞之間的腫瘤起始中未觀察到差異。然而，來自MTDH陽性的已建立的乳房腫瘤的TIC，例如分別來自PyMT和Wnt誘導(dǎo)的腫瘤的ALDH+細(xì)胞和CD61+細(xì)胞，保持對(duì)MTDH抑制的敏感性，表明MTDH依賴性機(jī)制在已建立的腫瘤中起作用，以維持TIC的最佳功能性，并且因此阻斷MTDH及其調(diào)節(jié)途徑將有益于具有MTDH異常表達(dá)的癌癥患者。已表明起始遺傳病灶對(duì)來自人和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物兩者的乳房腫瘤的組織病理學(xué)和分子特征發(fā)揮顯著影響。例如，與PyMT和ErbB2相比較，Wnt信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)具有類似更原始祖細(xì)胞的特征的乳房腫瘤(Li等人，2003)。值得注意的是，本文發(fā)現(xiàn)MTDH是跨越這些不同腫瘤模型的TIC功能性所需的。一致地，MTDH表達(dá)與人乳腺癌的特定亞型不顯著相關(guān)(Hu等人，2009)，并且更高水平的MTDH預(yù)測(cè)跨越不同亞型的預(yù)后不良。這些結(jié)果共同確證MTDH以癌基因和譜系非依賴性方式促進(jìn)腫瘤起始的想法，與譜系特異性腫瘤促進(jìn)基因例如管腔腫瘤存活因子PDEF形成對(duì)比(Buchwalter等人，2013)。MTDH在腫瘤發(fā)生中的廣泛功能也與其在不同譜癌癥類型中的頻繁上調(diào)相一致(Emdad等人，2013；Wan和Kang，2013)。在不存在MTDH的情況下形成的腫瘤顯示出與MTDH陽性腫瘤相似的組織學(xué)特征，表明MTDH可不改變TIC的起源細(xì)胞或細(xì)胞命運(yùn)，而是影響其致瘤潛力。這連同MtdhKO對(duì)MaSC的活性具有很少作用的觀察一起確定了MTDH作為與其他細(xì)胞命運(yùn)調(diào)節(jié)劑不同的TIC的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，所述其他細(xì)胞命運(yùn)調(diào)節(jié)劑例如Wnt信號(hào)傳導(dǎo)(Lento等人，2013)、Slug/Sox9(Guo等人，2012)和GATA3(Kouros-Mehr等人，2008)，其由于其在正常和惡性背景下介導(dǎo)分化細(xì)胞和更原始的干細(xì)胞/祖細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)換的能力來調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生。本發(fā)明人和其他人已將SND1鑒定為MTDH的主要結(jié)合配偶體(Blanco等人，2011；Meng等人，2012；Yoo等人，2011)。然而，由于MTDH的兩個(gè)非重疊區(qū)，即氨基酸364-470(Blanco等人，2011)和101-205(Yoo等人，2011)各自獨(dú)立地映射為介導(dǎo)MTDH與SND1的相互作用的唯一必需結(jié)構(gòu)域，存在關(guān)于MTDH與SND1的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的差異。我們的目前研究還測(cè)定MTDH的最低限度片段(386-407)足以用于相互作用，并鑒定該片段內(nèi)的兩個(gè)關(guān)鍵殘基對(duì)于相互作用是關(guān)鍵的。這些發(fā)現(xiàn)使得與SND1的相互作用對(duì)于MTDH的功能是至關(guān)關(guān)鍵的目前證實(shí)成為可能。這些發(fā)現(xiàn)還確定SND1作為乳腺TIC的重要調(diào)節(jié)劑。重要的是，MTDH和SND1之間的相互作用以及結(jié)合殘基在人和小鼠之間是良好保守的，突出顯示了我們?cè)谛∈竽Ｐ椭械陌l(fā)現(xiàn)可能與人癌癥高度相關(guān)的可能性，如通過目前的功能和臨床分析所表明的。腫瘤發(fā)生伴隨腫瘤細(xì)胞必須克服的不同應(yīng)激，包括癌基因誘導(dǎo)的DNA復(fù)制/損害應(yīng)激。本文證實(shí)SND1是在應(yīng)激條件下在細(xì)胞中表達(dá)一群促存活基因所需的，并且SND1的沉默使轉(zhuǎn)化的MEC對(duì)復(fù)制應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感。這些結(jié)果與確定SND1作為在各種應(yīng)激條件下的促存活蛋白的先前報(bào)道(Gao等人，2010；Sundstrom等人，2009；Weissbach和Scadden，2012)一致。此外，與MTDH的物理相互作用對(duì)于使SND1免于降解且在應(yīng)激條件下支持SND1調(diào)節(jié)的基因標(biāo)記是必需的。因此，可能MTDH在腫瘤發(fā)生期間的應(yīng)激條件下由于其與SND1相互作用和穩(wěn)定SND1的能力而至少部分地使TIC免于損耗。仍然不清楚SND1如何調(diào)節(jié)下游促存活基因。SND1是多功能蛋白，據(jù)報(bào)道其涉及幾個(gè)基因調(diào)控過程，包括轉(zhuǎn)錄控制、mRNA剪接、RNA應(yīng)激顆粒形成和RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)機(jī)制(在Wan和Kang，2013中綜述)。保證未來的研究是調(diào)查SND1如何響應(yīng)應(yīng)激條件而調(diào)節(jié)基因表達(dá)，以促進(jìn)細(xì)胞存活。除了提供在腫瘤起始和轉(zhuǎn)移能力之間的分子聯(lián)系之外，我們的發(fā)現(xiàn)還提示了幾種潛在的翻譯應(yīng)用。首先，在患者衍生的腫瘤移植物中得到驗(yàn)證的MTDH和SND1在支持TIC功能中的功能重要性，可將這些蛋白質(zhì)確定為癌癥治療中的潛在治療靶。此外，關(guān)于MTDH-SND1相互作用的結(jié)果可有利于篩選或設(shè)計(jì)可破壞MTDH和SND1的相互作用的小分子抑制劑。我們的結(jié)果還突出顯示了MTDH的腫瘤特異性需求，并且表明MTDH-SND1模塊的全身靶向可被癌癥患者良好耐受，因?yàn)镸tdh的全生物敲除不導(dǎo)致小鼠的顯著缺陷。實(shí)例2-MTDH在前列腺癌中的調(diào)查為了調(diào)查MTDH在前列腺癌中的作用，將MTDH敲除小鼠與小鼠前列腺(TRAMP)小鼠的轉(zhuǎn)基因腺癌雜交，以便生成具有MTDH和TRAMP的異源表達(dá)的動(dòng)物。TRAMP模型導(dǎo)致其中SV40T抗原的表達(dá)受大鼠Probasin啟動(dòng)子控制并在小鼠的性成熟期間誘導(dǎo)的動(dòng)物，導(dǎo)致類似人前列腺癌的臨床進(jìn)展的前列腺癌發(fā)展(Greenberg等人，1995；Gingrich等人，1999)。實(shí)驗(yàn)程序小鼠。所有涉及小鼠的實(shí)驗(yàn)方案均得到PrincetonUniversity的機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)。通過將含有基因捕獲的Mtdh等位基因的ES細(xì)胞系XB780(BayGenomics)注射到C57BL/6胚泡內(nèi)，隨后通過PCR確認(rèn)種系傳遞，來生成Mtdh-/-小鼠。在用C57BL/6TRAMP轉(zhuǎn)基因小鼠(JacksonLaboratory)(Greenberg,2005)育種之前，將所有Mtdh-/-小鼠回交至C57BL/6背景>6代。使雌性TRAMP小鼠與Mtdh-/-雄性小鼠育種，以獲得雌性TRAMP/Mtdh+/-和雄性Mtdh+/-創(chuàng)立者小鼠。隨后，將這些創(chuàng)立者小鼠育種，以生成TRAMP/Mtdh+/+、TRAMP/Mtdh+/-和TRAMP/Mtdh-/-雄性小鼠。該育種策略確保所有實(shí)驗(yàn)小鼠均與SV40轉(zhuǎn)基因雜合。從尾部活組織檢查中提取DNA，并使用下述引物執(zhí)行PCR用于基因型分析：(1)共同正向引物5'-GAGAGGAGGTTTTGGGGAAG-3'(SEQIDNO:8)；(2)用于WT等位基因的反向引物5'-CCCATGTCTAAAAAGCCAATC-3'(SEQIDNO:9)；(3)用于突變型等位基因的反向引物5'-GTTCATATGGTGCCGTGCAG-3’(SEQIDNO:11)。對(duì)于腫瘤細(xì)胞注射，向無胸腺裸鼠雄性小鼠皮下注射5×105TRAMP-C1細(xì)胞，并且通過卡鉗每周兩次測(cè)量腫瘤用于計(jì)算腫瘤體積(πx長度x寬度2/6)。細(xì)胞培養(yǎng)。TRAMP-C1細(xì)胞系從ATCC獲得，并使用短串聯(lián)重復(fù)(STR)概況分析方法認(rèn)證。將細(xì)胞維持在補(bǔ)充有0.005mg/ml牛胰島素、10nM脫氫異雄甾酮、5％胎牛血清和5％；Nu-SerumIV的達(dá)爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基中。組織檢查和腫瘤分級(jí)。在安樂死時(shí)，將下泌尿生殖道取出并稱重，包括膀胱(清空的)、精囊和前列腺。取出主動(dòng)脈周淋巴結(jié)、肺和肝，并檢查可見轉(zhuǎn)移的證據(jù)。將組織固定在10％磷酸鹽緩沖的福爾馬林中，包埋在石蠟中，并以5μm厚度切片。H&E染色的背外側(cè)葉切片各自在1-6的等級(jí)上(其中‘1’代表正常前列腺，并且‘6’代表低分化的前列腺腺癌或神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤)進(jìn)行不知情評(píng)分(Gingrich,1999；Kaplan-Lefko,2003；Hurwitz,2001)。人樣品。從UniversityofMichigan的ComprehensiveCancerCenter獲得腫瘤標(biāo)本，根據(jù)UniversityofMichigan的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)，伴隨來自所有受試者的知情同意書。在我們的臨床研究中使用兩個(gè)前列腺組織微陣列，所述前列腺組織微陣列由62個(gè)正常前列腺組織、10個(gè)良性前列腺增生(BPH)、10個(gè)前列腺萎縮或前列腺炎性萎縮(PIA)、10個(gè)前列腺上皮內(nèi)瘤變(PIN)、72個(gè)前列腺腫瘤和10個(gè)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組成。在手術(shù)時(shí)，具有可用信息的患者的年齡為56至90歲(中值＝76歲，SD＝7.6歲)。所有患者均未用激素或放射療法治療。統(tǒng)計(jì)分析：需要時(shí)所有結(jié)果均經(jīng)歷統(tǒng)計(jì)分析。如圖例中指示的，對(duì)于大多數(shù)研究使用時(shí)序檢驗(yàn)、非參數(shù)曼懷二氏檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)和不成對(duì)、雙側(cè)、獨(dú)立斯氏t檢驗(yàn)，其中具有相等方差假設(shè)。對(duì)于所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。結(jié)果MTDH與人前列腺癌中的腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)：最初，調(diào)查了MTDH在人前列腺癌樣品中的臨床相關(guān)性。通過免疫組織化學(xué)分析兩個(gè)前列腺組織微陣列，所述前列腺組織微陣列由正常前列腺(NP)、良性前列腺增生(BPH)、前列腺上皮內(nèi)瘤變(PIN)、前列腺原發(fā)性腫瘤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的樣品組成，并且比較不同臨床階段的樣品之間的MTDH蛋白質(zhì)水平(圖12A)。MTDH蛋白質(zhì)在所有正常或BPH前列腺組織中無法檢測(cè)或以非常低的水平表達(dá)。MTDH的蛋白質(zhì)水平在惡變前組織(PIN)、原發(fā)性腫瘤和轉(zhuǎn)移中逐漸增加，其中表達(dá)中等或大量MTDH的樣品的百分比分別為10％、47.2％和80.0％，揭示MTDH水平與前列腺疾病的臨床進(jìn)展的緊密相關(guān)(圖12C，左圖，X2檢驗(yàn)P<0.001)。當(dāng)我們比較BPH和PIN這兩種類型的非癌性組織時(shí)(圖12C，右圖，X2檢驗(yàn)P＝0.023)，MTDH蛋白質(zhì)水平中的差異已顯而易見，指示在從良性到惡變前階段的過渡期間MTDH表達(dá)的增加。MTDH水平也與原發(fā)性腫瘤的格里森評(píng)分相關(guān)，如通過MTDH的較高平均染色強(qiáng)度(圖12B，頂部曲線)或晚期腫瘤中具有至少中等MTDH水平的更大樣品百分比(圖12B，底部曲線)所證明的。重要的是，在具有中等或高水平的MTDH的患者中基于前列腺特異性抗原(PSA)的復(fù)發(fā)率顯著高于在其前列腺腫瘤中具有低水平的MTDH的患者中的那種(圖12D)。連同前列腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移中的MTDH蛋白質(zhì)水平明顯高于原發(fā)性腫瘤中的那些的事實(shí)(圖12A和12B)，這些數(shù)據(jù)證明MTDH水平與前列腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的強(qiáng)正相關(guān)。MTDH基因組增益與前列腺癌中的MTDH過表達(dá)和臨床進(jìn)展相關(guān)。為了測(cè)試是否還存在前列腺腫瘤中MTDH的基因組拷貝數(shù)增加，使用針對(duì)MTDH基因組基因座或染色體8著絲粒區(qū)域(作為對(duì)照)的探針，通過分裂間期熒光原位雜交(FISH)分析前列腺組織微陣列。FISH分析揭示顯著部分的前列腺癌樣品具有MTDH基因的額外基因組拷貝(圖13A)。MTDHDNA增益與細(xì)胞中更高水平的蛋白質(zhì)顯著相關(guān)(圖13B)，指示DNA增益是前列腺癌中的MTDH過表達(dá)的機(jī)制。此外，MTDHDNA增益與臨床階段和預(yù)后緊密相關(guān)，使得在惡變前期(正常、BPH或PIN)、局部腫瘤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之前或之時(shí)的樣品，具有DNA增益的部分分別為0％、24％和50％(圖13C)。此外，具有增加的MTDH拷貝的患者比沒有MTDH基因組增益的患者具有更早的復(fù)發(fā)(圖13D)。這些臨床數(shù)據(jù)證實(shí)DNA和MTDH的蛋白質(zhì)狀態(tài)的預(yù)后價(jià)值，并且表明MTDH在前列腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中的潛在重要作用。Mtdh缺失的TRAMP小鼠的生成和表征：為了調(diào)查Mtdh在正常發(fā)育和癌癥中的作用，使用來自BayGenomics基因捕獲數(shù)據(jù)庫的ESC系XB780產(chǎn)生全生物Mtdh敲除(KO)小鼠(Stryke等人，2003)。突變型等位基因含有插入到Mtdh的第二內(nèi)含子內(nèi)的LacZ轉(zhuǎn)基因插入片段，所述LacZ轉(zhuǎn)基因插入片段導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄的過早終止。Mtdh-KO(Mtdh-/-)小鼠是存活和能育的，并且在尸檢時(shí)沒有看到任何器官中的明顯異常。具體地，包括前列腺和精囊兩者的下泌尿生殖道的總體形態(tài)和相對(duì)重量在野生型(WT,Mtdh+/+)、雜合(Mtdh+/-)和Mtdh-/-雄性小鼠之間是可比較的。當(dāng)在微觀水平下檢查時(shí)，不存在Mtdh-/-小鼠的前列腺上皮中的形態(tài)異常。為了檢查Mtdh消除在前列腺腫瘤形成中的后果，使用小鼠前列腺轉(zhuǎn)基因腺瘤(TRAMP)模型。如“材料與方法”中所述，生成C57BL/6背景中的TRAMP/Mtdh+/+、TRAMP/Mtdh+/-和TRAMP/Mtdh-/-小鼠(圖14A)，并且通過PCR確認(rèn)基因型(圖14B)。作為評(píng)價(jià)Mtdh在前列腺腫瘤發(fā)生中的作用的初始步驟，我們從正常和TRAMP小鼠中分離前列腺組織，并檢查Mtdh的mRNA(圖14C)和蛋白質(zhì)(圖14D)水平。如預(yù)期的，在Mtdh-/-前列腺組織中未檢測(cè)到MtdhmRNA(圖14C)，確認(rèn)基因捕獲的方法完全消除了Mtdh表達(dá)。與不表達(dá)SV40T抗原的匹配對(duì)照小鼠相比較，在來自TRAMP/Mtdh+/+和TRAMP/Mtdh+/-小鼠的前列腺組織中觀察到更豐富的MtdhmRNA(圖14C)。一致地，與正常對(duì)照相比較，在TRAMP/Mtdh+/+前列腺中檢測(cè)到Mtdh的蛋白質(zhì)水平中的顯著增加(圖14D)。這些數(shù)據(jù)指示Mtdh在小鼠中的前列腺腫瘤發(fā)生期間被上調(diào)，并且表明更高水平的Mtdh可賦予腫瘤細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。為了測(cè)試Mtdh喪失是否影響PB-Tag轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，SV40T抗原在來自TRAMP小鼠的前列腺中進(jìn)行免疫染色。T抗原早在8周齡時(shí)在前列腺上皮細(xì)胞中檢測(cè)到(圖14E)，并且在晚期階段時(shí)在前列腺上皮和腫瘤細(xì)胞中連續(xù)表達(dá)(圖14F)。在癌癥進(jìn)展的早期或晚期時(shí)，在TRAMP/Mtdh+/+和TRAMP/Mtdh-/-小鼠之間的個(gè)體前列腺上皮細(xì)胞中的T抗原免疫反應(yīng)性中不存在顯著差異。SV40t和TmRNA表達(dá)在具有不同Mtdh狀態(tài)的TRAMP小鼠中是可比較的。如對(duì)于陰性對(duì)照預(yù)期的，SV40抗原在來自正常小鼠的前列腺中是無法檢測(cè)的。這些結(jié)果證實(shí)Mtdh缺失不影響前列腺上皮細(xì)胞中的PB-Tag轉(zhuǎn)基因表達(dá)。Mtdh的喪失壓制前列腺腫瘤形成并增加存活率：為了調(diào)查Mtdh對(duì)癌基因誘導(dǎo)的前列腺腫瘤發(fā)生的總體效應(yīng)，就其前列腺腫瘤發(fā)展和癌癥相關(guān)死亡率研究具有不同Mtdh狀態(tài)的TRAMP小鼠群組(n>100)。首先，因?yàn)槊谀蛏称髦亓渴荰RAMP小鼠中的腫瘤負(fù)荷的可靠指標(biāo)(Kaplan-Lefko等人，2003)，所以將來自不同年齡的TRAMP小鼠的泌尿生殖器進(jìn)行解剖并測(cè)量，以在總體水平下監(jiān)測(cè)腫瘤形成。因?yàn)镸tdh表達(dá)在Mtdh+/+和Mtdh+/-前列腺組織之間是可比較的(圖14C)，所以這些小鼠被分組為Mtdh陽性組(Mtdh+)相對(duì)于Mtdh陰性組(Mtdh-)。SV40T抗原根據(jù)年齡誘導(dǎo)TRAMP/Mtdh+小鼠中泌尿生殖器質(zhì)量的急劇擴(kuò)大(圖15A，菱形)，使得這些小鼠中的許多在36周齡時(shí)展示嚴(yán)重?cái)U(kuò)大的腹部。相比之下，在TRAMP/Mtdh-/-小鼠中的泌尿生殖器濕重保持相對(duì)恒定或僅以慢得多的速率增加(圖15A，正方形)。當(dāng)比較相對(duì)泌尿生殖器重量(作為體重的％)時(shí)，獲得相似的結(jié)果(圖15B)。一致地，幾乎所有從36周齡TRAMP/Mtdh+小鼠中解剖的泌尿生殖器復(fù)合物均顯示出腫瘤形成的肉眼可見體征(圖15C，頂圖)，而TRAMP/Mtdh-/-小鼠的那些保持類似于正常對(duì)照(圖15C，底圖)。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)在組織學(xué)水平下的前列腺癌出現(xiàn)，將來自TRAMP小鼠的前列腺組織切片，并進(jìn)行蘇木精和曙紅染色。大約50％的23或28周齡的TRAMP/Mtdh+小鼠發(fā)展前列腺癌病變，并且到36周齡時(shí)，該組中的幾乎所有小鼠均發(fā)展多灶性前列腺腫瘤(圖15D)。相比之下，在28周齡TRAMP/Mtdh-/-小鼠中未檢測(cè)到前列腺癌，并且在前列腺上皮的非常有限區(qū)域中，僅在50％的36周齡TRAMP/Mtdh-/-小鼠中檢測(cè)到前列腺癌病變。這些組織病理學(xué)結(jié)果與形態(tài)學(xué)觀察一致，顯示大多數(shù)TRAMP/Mtdh-/-小鼠到36周齡時(shí)不展示前列腺腫瘤形成的可見體征(圖15C)。值得注意的是，在TRAMP小鼠中形成的腫瘤顯示出不同的組織學(xué)特征，所述組織學(xué)特征是腺癌、葉狀腫瘤和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的特征，并且已表明這些形態(tài)上不同的腫瘤可源自前列腺內(nèi)的不同細(xì)胞譜系，或由共同早期祖先獨(dú)立發(fā)展(Chiaverotti等人，2008)。有趣的是，TRAMP/Mtdh-/-小鼠顯示所有這些不同腫瘤亞型的出現(xiàn)中的延遲通常在28或36周左右出現(xiàn)，表明Mtdh在前列腺癌中的可能譜系不依賴性作用。由于惡性前列腺癌發(fā)展，顯著百分比(～50％)的TRAMP/Mtdh+在達(dá)到一歲之前死亡。相比之下，檢查的14個(gè)TRAMP/Mtdh-/-中僅1個(gè)死于癌癥相關(guān)疾病(圖15E，P<0.001)。這些數(shù)據(jù)共同證實(shí)小鼠中的Mtdh缺失抑制癌基因驅(qū)動(dòng)的前列腺癌形成，并延長TRAMP小鼠的壽命。Mtdh的失活阻礙前列腺癌進(jìn)展：前列腺癌進(jìn)展由從惡變前病變例如PIN開始到高度分化癌、中度分化癌和低分化癌的多個(gè)階段組成。為了調(diào)查Mtdh喪失如何影響前列腺癌的起始和進(jìn)展，對(duì)每個(gè)前列腺的背側(cè)和外側(cè)葉執(zhí)行組織學(xué)檢查，所述前列腺是TRAMP小鼠中經(jīng)歷腫瘤發(fā)生的最頻繁和嚴(yán)重的部位(21)(圖16A)?；趯?duì)于TRAMP腫瘤的先前描述的分級(jí)系統(tǒng)(21,22)，每個(gè)前列腺被分配范圍從正常前列腺的得分1到包括神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的低分化癌的得分6的最高得分。在8至12周齡的TRAMP/Mtdh+和TRAMP/Mtdh-前列腺兩者中均容易檢測(cè)到PIN病變(圖16B，第一圖)，如由上皮增生和完整基底細(xì)胞層的存在所證明的(圖16A，T8和T12)。這與來自10周齡TRAMP/Mtdh+和TRAMP/Mtdh-小鼠的前列腺上皮中的可比較的增殖和細(xì)胞凋亡指數(shù)一致。在23周和28周時(shí)，相當(dāng)大部分的TRAMP/Mtdh+小鼠分別發(fā)展具有侵襲性病變的高度或中度分化的腺癌，并且到36周時(shí)，84％的TRAMP/Mtdh+小鼠展示腫瘤細(xì)胞的間變片的中度分化至低分化腺癌特征。相比之下，大多數(shù)TRAMP/Mtdh-小鼠僅到36周時(shí)才發(fā)展PIN或早期、高度分化的腺癌或葉狀腫瘤。一致地，E-鈣粘蛋白的表達(dá)逐漸減少甚至變得不存在，因?yàn)榍傲邢倌[瘤在TRAMP/Mtdh+小鼠中進(jìn)展至較少分化的階段，而跨越檢查的不同年齡在TRAMP/Mtdh-/-小鼠中的前列腺組織中檢測(cè)到豐富的E-鈣粘蛋白。此外，Mtdh+腫瘤的惡性進(jìn)展伴隨顯著更高百分比的增殖細(xì)胞(圖16C，P<0.01)，而凋亡細(xì)胞的百分比在該階段的Mtdh+和Mtdh-腫瘤中相似。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明Mtdh的失活在腫瘤發(fā)生的早期階段阻止前列腺癌進(jìn)展，并且預(yù)防惡變前病變擴(kuò)張并進(jìn)展到晚期。Mtdh的消除減少前列腺腫瘤細(xì)胞的全身轉(zhuǎn)移：在大約50周齡時(shí)(大多數(shù)TRAMP/Mtdh-/-小鼠已發(fā)展前列腺癌病變的時(shí)間點(diǎn))，檢查TRAMP小鼠群組中的轉(zhuǎn)移性疾病。解剖肝、肺和主動(dòng)脈周淋巴結(jié)，在TRAMP模型中頻繁的轉(zhuǎn)移部位(Gingrich等人，1996)，并在宏觀和組織學(xué)水平兩者下檢查轉(zhuǎn)移病灶的出現(xiàn)(圖17A-B)。在來自34％的TRAMP/Mtdh+小鼠的肝中觀察到多個(gè)大轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)，導(dǎo)致顯著增加的肝尺寸。相反，檢查的TRAMP/Mtdh-/-小鼠無一在肝中發(fā)展可見的轉(zhuǎn)移灶。類似地，在39％的TRAMP/Mtdh+小鼠中發(fā)現(xiàn)肺中的多個(gè)轉(zhuǎn)移性沉積物，但17只TRAMP/Mtdh-/-小鼠中僅2只在其肺中檢測(cè)到一個(gè)或兩個(gè)轉(zhuǎn)移病灶。在TRAMP/Mtdh+小鼠(9/20)中頻繁鑒定淋巴結(jié)的擴(kuò)大，并且該發(fā)生率在TRAMP/Mtdh-/-小鼠中降低至30％。為了證實(shí)轉(zhuǎn)移細(xì)胞是前列腺來源的，對(duì)肝、肺和淋巴結(jié)的連續(xù)切片執(zhí)行免疫組織化學(xué)分析，以檢測(cè)T抗原癌蛋白。觀察到T抗原癌蛋白的均勻表達(dá)局限于轉(zhuǎn)移性沉積物而不是圍繞正常細(xì)胞，與PB指導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)的組織特異性模式相一致(Gingrich等人，1996)。這些數(shù)據(jù)共同清楚地顯示小鼠中的Mtdh缺失顯著減少TRAMP模型中的全身轉(zhuǎn)移。值得注意的是，由于接近于50％的TRAMP/Mtdh+小鼠在達(dá)到一歲之前死于大型原發(fā)性腫瘤和可能的轉(zhuǎn)移性腫瘤的事實(shí)，所以觀察到的Mtdh+和Mtdh-組之間的轉(zhuǎn)移差異非?？赡鼙坏凸?。前列腺癌細(xì)胞中的Mtdh擊倒減少體外增殖和體內(nèi)腫瘤形成：由于Mtdh在小鼠中廣泛表達(dá)，全生物Mtdh-KO小鼠中的腫瘤發(fā)生缺陷可起因于前列腺上皮細(xì)胞或其他細(xì)胞/組織類型中的Mtdh喪失。為了區(qū)分這兩種可能性，檢查了Mtdh在TRAMP-C1細(xì)胞系的致瘤能力中的必要性，這是TRAMP模型中的晚期前列腺腫瘤的特征(Foster，1997)。Mtdh被擊倒(KD)(圖15A和9B)，并且發(fā)現(xiàn)Mtdh-KD降低TRAMP-C1細(xì)胞的體外增殖(圖15C)。為了檢查Mtdh-KD在體內(nèi)腫瘤形成中的后果，我們將對(duì)照和Mtdh-KD細(xì)胞注射到接受者小鼠的側(cè)腹中，并監(jiān)測(cè)隨著時(shí)間過去的腫瘤出現(xiàn)?？捎|及的腫瘤的出現(xiàn)在KD組中顯著延遲(圖18D)，并且從KD組切除的腫瘤遠(yuǎn)小于來自對(duì)照組的腫瘤(圖18E和18F)。在另外兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)中獲得類似的結(jié)果。有趣的是，最終在Mtdh-KD組中形成的腫瘤表達(dá)與對(duì)照組中的腫瘤相似的Mtdh水平(圖18G)，其可起因于沒有Mtdh抑制的細(xì)胞克隆擴(kuò)增或Mtdh在Mtdh-KD細(xì)胞中的重新表達(dá)。討論人前列腺癌的特征在于猖獗的復(fù)發(fā)性擴(kuò)增和缺失，表明連同一些眾所周知的遺傳損傷，例如腫瘤抑制基因PTEN和p53的喪失，仍然存在許多未表征的基因控制這種惡性腫瘤的生成和進(jìn)展(Taylor,2010)。在目前研究中，證實(shí)MTDH在人前列腺癌中頻繁過表達(dá)和擴(kuò)增，并且其表達(dá)水平與疾病進(jìn)展和弱存活后果強(qiáng)相關(guān)。此外，利用Mtdh-KO小鼠的遺傳研究提供了第一個(gè)體內(nèi)證據(jù)：Mtdh在自發(fā)前列腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，而不影響正常發(fā)育。TRAMP模型緊密類似人前列腺癌，因?yàn)槠渥园l(fā)地發(fā)展可轉(zhuǎn)移到多個(gè)不同器官的進(jìn)行性前列腺癌。重要的是，此處顯示與正常前列腺組織相比較，Mtdh水平在人和SV40驅(qū)動(dòng)的鼠前列腺腫瘤兩者中均升高。有趣的是，近期發(fā)現(xiàn)Mtdh通過基因組擴(kuò)增在p53/Pten缺陷型轉(zhuǎn)移性前列腺癌小鼠模型中過表達(dá)，在所述小鼠模型中端粒酶活性在端粒功能障礙后被重新激活(Ding,2012)，表明Mtdh可通過類似于我們?cè)谌饲傲邢侔┲邪l(fā)現(xiàn)的基因組擴(kuò)增機(jī)制在小鼠中被活化。未來的研究需要調(diào)查Mtdh過表達(dá)在SV40轉(zhuǎn)化腫瘤中的分子基礎(chǔ)。顯示TRAMP小鼠中的Mtdh敲除顯著損害腫瘤形成并降低癌癥相關(guān)死亡率。在TRAMP-C1癌細(xì)胞中的Mtdh沉默延長無腫瘤存活并減少體內(nèi)腫瘤生長的發(fā)現(xiàn)還支持在前列腺癌中Mtdh的前列腺腫瘤細(xì)胞固有作用。值得注意的是，由推測(cè)攜帶Mtdh靶向shRNA的TRAMP-C1癌細(xì)胞最終形成的腫瘤重新獲得Mtdh的表達(dá)，加強(qiáng)了Mtdh對(duì)于體內(nèi)前列腺癌形成是必需的概念。在TRAMP/Mtdh-/-小鼠中的良性或高度分化階段觀察到前列腺癌進(jìn)展的阻斷，這一概念還通過TRAMP/Mtdh-/-前列腺組織中組成型高水平的上皮標(biāo)記物E-鈣粘蛋白得到支持。一致地，盡管TRAMP/Mtdh+小鼠展示擴(kuò)大的前列腺和阻塞的精囊，這一現(xiàn)象通常起因于進(jìn)入尿道和精囊內(nèi)的前列腺腫瘤細(xì)胞的侵襲和惡性生長，來自TRAMP/Mtdh-/-小鼠的泌尿生殖道在很大程度上看起來正常。與來自小鼠模型的發(fā)現(xiàn)一致，MTDH在人前列腺癌中顯示出進(jìn)展相關(guān)的表達(dá)模式。這些結(jié)果可表明MTDH作為前列腺癌進(jìn)展的生物標(biāo)記物的潛在用途和停止人前列腺癌的惡性進(jìn)展的可能治療靶。小百分比的TRAMP/Mtdh-/-小鼠在長潛伏期后仍展示侵襲性前列腺癌并死于疾病的事實(shí)(14只中的1只)表明，一些TRAMP/Mtdh-/-腫瘤已克服Mtdh的缺陷并利用Mtdh非依賴性途徑來支持其惡性生長和進(jìn)展。事實(shí)上，SV40癌基因的誘導(dǎo)早在青春期時(shí)在前列腺上皮細(xì)胞中均勻出現(xiàn)；然而，侵襲性前列腺癌和轉(zhuǎn)移的發(fā)展出現(xiàn)要晚得多，并且看起來是高度異質(zhì)的，表明個(gè)別腫瘤可獲得不同的遺傳和表觀遺傳改變，以完全轉(zhuǎn)化SV40抗原陽性細(xì)胞。盡管如在大多數(shù)TRAMP/Mtdh-/-小鼠中觀察到的，Mtdh的失活抑制Mtdh依賴性信號(hào)傳導(dǎo)和前列腺癌進(jìn)展，但它不阻斷由Mtdh非依賴性機(jī)制支持的腫瘤生長。這也與MTDH在大百分比但不是所有人前列腺癌中高度表達(dá)的觀察一致。然而，依賴于高水平的MTDH進(jìn)展到惡性階段的癌細(xì)胞對(duì)于MTDH靶向治療劑是敏感的，如通過Mtdh陽性TRAMP-C1細(xì)胞中的Mtdh抑制顯著損害這些細(xì)胞的致瘤潛力的發(fā)現(xiàn)所支持的。轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官負(fù)責(zé)患有實(shí)體癌的患者中癌癥相關(guān)死亡的大多數(shù)(Wan,2013)。先前證實(shí)MTDH在具有較高轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的人乳腺癌中被擴(kuò)增和/或過表達(dá)(Hu等人，2009)。在目前研究中，發(fā)現(xiàn)人前列腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的大部分顯示出高水平的MTDH，并且具有8q22基因組基因座的擴(kuò)增。在功能上，Mtdh消除顯著降低了TRAMP模型中的遠(yuǎn)處器官中的轉(zhuǎn)移發(fā)生率和負(fù)荷。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，近期研究顯示在由Pten和p53喪失驅(qū)動(dòng)的前列腺癌傾向的小鼠模型中的端粒功能障礙后的端粒酶再活化有利于在癌癥相關(guān)基因座處的拷貝數(shù)改變的選擇，并且發(fā)現(xiàn)Mtdh位于選擇性基因列表的頂部，所述基因的遺傳擴(kuò)增在這個(gè)小鼠模型中與癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移強(qiáng)烈相關(guān)(Ding等人，2012)。這表明除了SV40癌基因之外，Mtdh在由遺傳事件驅(qū)動(dòng)的前列腺癌中的可能重要作用。最后，應(yīng)當(dāng)注意MTDH的轉(zhuǎn)移促進(jìn)功能很可能存在于除乳腺癌和前列腺癌之外的其他癌癥類型中。幾項(xiàng)近期研究的確顯示異常MTDH表達(dá)與另外的癌癥類型中的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和更差的預(yù)后相關(guān)，所述另外的癌癥類型包括喉鱗狀細(xì)胞癌(Liu等人，2013)、頭與頸鱗狀細(xì)胞癌(Yu等人，2014)、以及肝細(xì)胞癌(Zhu等人，2011)，并且MTDH的過表達(dá)增加肝細(xì)胞癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)移(Yoo等人，2009)?？傊?，本文的研究報(bào)道MTDH在小鼠和人前列腺癌兩者中均過表達(dá)，并且這種升高的MTDH水平對(duì)于自發(fā)性前列腺癌進(jìn)展和體內(nèi)轉(zhuǎn)移是關(guān)鍵的。鑒于MTDH在不同癌癥類型中的廣泛過表達(dá)，MTDH的腫瘤促進(jìn)作用可能不限于本研究中使用的模型。事實(shí)上，正在進(jìn)行的研究還已發(fā)現(xiàn)Mtdh的缺失顯著抑制自發(fā)性乳房腫瘤形成和轉(zhuǎn)移。未來的研究需要了解負(fù)責(zé)MTDH的腫瘤促進(jìn)功能的根本機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)途徑，并且有利于開發(fā)MTDH靶向治療劑以控制人癌癥。實(shí)例3-異粘蛋白和SND1之間的相互作用的分析異粘蛋白(MTDH)和含葡萄球菌核酸酶結(jié)構(gòu)域1(SND1)在不同癌癥類型中過表達(dá)且相互作用。MTDH和SND1兩者均與不同細(xì)胞機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用，并且牽涉多重癌癥相關(guān)細(xì)胞過程和信號(hào)傳導(dǎo)途徑，可能Mtdh和SND1通過經(jīng)由其多重相互作用結(jié)構(gòu)域/基序協(xié)調(diào)腫瘤促進(jìn)信號(hào)傳導(dǎo)活性來增強(qiáng)惡性特征。然而，結(jié)構(gòu)信息的完全缺乏極大妨礙了MTDH/SND1蛋白質(zhì)復(fù)合物的功能的機(jī)制性理解，盡管兩種蛋白質(zhì)在許多類型的癌癥中有顯著的臨床相關(guān)性。闡明MTDH-SND1相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)對(duì)于開發(fā)靶向MTDH或SND1的新方法作為新型癌癥治療策略也是重要的。為了分析兩種蛋白質(zhì)之間的相互作用，如下所述測(cè)定MTDH-SND1復(fù)合物的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)，其揭示11個(gè)殘基的MTDH肽基序占據(jù)在兩個(gè)SN結(jié)構(gòu)域(SN1/2)之間延伸的蛋白質(zhì)凹槽，其中兩個(gè)MTDH色氨酸殘基嵌套在SND1中的兩個(gè)明確限定的口袋內(nèi)。實(shí)驗(yàn)程序蛋白質(zhì)制備：使用標(biāo)準(zhǔn)的基于PCR的克隆策略生成所有構(gòu)建體和點(diǎn)突變。簡(jiǎn)言之，將具有不同邊界和突變型的SND1和MTDH克隆到pQlink載體(Addgene)中，所述pQlink載體分別具有N端His8標(biāo)簽和GST標(biāo)簽，具有在親和標(biāo)簽后的TEV切割位點(diǎn)。蛋白質(zhì)在大腸桿菌(E.coli)菌株DH5α中在23℃下過表達(dá)。SND1和SND1(16-339)-L21-MTDH(386-407)的表達(dá)和純化遵循由先前出版物(Li等人，2008)修改的程序。對(duì)于SND1蛋白質(zhì)，使用含有2mMβ-ME、0.5MNaCl、5mM咪唑和25mMTrisPH8的裂解緩沖液，在Ni-NTA樹脂(Qiagen)上純化裂解產(chǎn)物的可溶級(jí)分。通過含有0.2MNaCl、250mM咪唑和不含β-ME的25mMTrisPH8的緩沖液洗脫His-SND1蛋白質(zhì)。在通過肝素緩沖液A(25mMHEPES、PH7、10mMEDTA、10％甘油、2mMβ-ME)稀釋4倍后，將蛋白質(zhì)裝載到肝素柱(GEHealthcare)，并且通過100ml0-0.6MNaCl梯度洗脫。加上GST標(biāo)簽的MTDH蛋白質(zhì)在GS4B樹脂(GEHealthcare)上進(jìn)行純化，并且還通過陰離子交換色譜(Source15Q,GEHealthcare)進(jìn)行分級(jí)。為了有利于SND1和MTDH復(fù)合物的結(jié)晶，經(jīng)由具有21個(gè)殘基的柔性接頭(L21)，使SND1(16-339)融合至MTDH肽(386-407)。對(duì)于SeMet蛋白質(zhì)，12LHis-SND1(16-339)-L21-MTDH(386-407)融合蛋白在pQlink載體中在23℃下在大腸桿菌菌株(BL21,DE3)中在OD600＝1時(shí)過表達(dá)22小時(shí)，使用0.25mMIPTG。在10mMDTT的存在下通過TEV蛋白酶切割之前，如上所述通過Ni-NTA和肝素柱純化蛋白質(zhì)。在通過疏水相互作用色譜(HiTrapPhenylHP,GEHealthcare)進(jìn)一步純化以去除雜質(zhì)(包括TEV和在以后峰處的融合蛋白二聚體)前，將樣品調(diào)整至1.4M(NH4)2SO4并旋轉(zhuǎn)以去除團(tuán)塊。隨后在最終步驟中通過凝膠過濾色譜(Superdex200,GEHealthcare)純化融合蛋白的單體，以將緩沖液更換為10mMTrisPH8、150mMNaCl和10mMDTT。將樣品濃縮至15mg/ml用于結(jié)晶。結(jié)晶和數(shù)據(jù)收集：通過混合250nl15mg/mlSeMet-SND1(16-339)-L21-MTDH(386-407)與250nl孔緩沖液(21.6％pEG3350、0.1M檸檬酸鈉,PH8.0、0.1MCsCl)，加上50nl微小種子，使SND1和MTDH融合蛋白的晶體通過坐滴式蒸汽擴(kuò)散法在23℃下生長。單晶在4天內(nèi)生長且在7天后成熟。在液氮中快速冷凍之前，將晶體逐漸更換為具有0至25％甘油的孔緩沖液。為了減少對(duì)晶體的輻射損害，在相同位置上用25％束能量，0.6秒/幀在波長處連續(xù)收集SND1(16-339)-L21-MTDH(386-407)的兩個(gè)SAD數(shù)據(jù)集。在APSLS-CAT(ID-D)處收集數(shù)據(jù)，并且使用HKL2000(Otwinowski,1997)將這兩個(gè)數(shù)據(jù)集組合并加工至通過phenix.xtriage在0.0833的處測(cè)量反常散射信號(hào)的最佳截?cái)?Adams等人，2010)。通過將暴露時(shí)間增加到1.5S來收集第二個(gè)SAD數(shù)據(jù)集，其被加工為結(jié)構(gòu)測(cè)定：使用在下的組合SAD數(shù)據(jù)集，通過phenix.autosol(Adams等人，2010)測(cè)定SND1(16-339)-L21-MTDH(386-407)的初始結(jié)構(gòu)。在具有Rfree/Rwork＝0.35/0.30的初始模型中發(fā)現(xiàn)24個(gè)硒原子和5個(gè)不對(duì)稱單元。該模型通過phenix.refine(Adams等人，2010)以反?；鶊F(tuán)(Se)進(jìn)行精制，并且使用在CCP4包(Winn等，2011)中的Phaser(McCoy等人，2007)，通過分子替換充當(dāng)數(shù)據(jù)集的起始模型。改進(jìn)的模型使用Coot(Emsley和Cowtan，2004)手動(dòng)構(gòu)建，并使用具有TLS和異?；鶊F(tuán)(Se)的phenix.refine約束進(jìn)行精制(Adams等人，2010)。最終結(jié)構(gòu)精制為(表S1)。GST-介導(dǎo)的下拉測(cè)定：經(jīng)由GST標(biāo)簽使～20μgGST-MTDH(不同的截短形式和位點(diǎn)突變型)結(jié)合到10μl谷胱甘肽樹脂。樹脂用200μl測(cè)定緩沖液(25mMTris,PH8.0,150mMNaCl,3mMDTT)洗滌三次，以去除過量的未結(jié)合蛋白。將15μgHis-SND1(16-339)以在具有2mg/mlBSA的測(cè)定緩沖液中懸浮的100μl體積加入樹脂中。在通過SDS-PAGE檢查之前，混合物用200μl測(cè)定緩沖液洗滌兩次，并通過考馬斯藍(lán)染色顯現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并通過ImageJ分析與GST-MTDH相關(guān)的SND1比。免疫沉淀和蛋白質(zhì)印跡：對(duì)于體內(nèi)免疫沉淀(IP)實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)的細(xì)胞在冷PBS中進(jìn)行洗滌，并且在裂解緩沖液(20mMTrispH7.4、0.15MNaCl、1mMEDTA、1mMEGTA、1％Tx-100、0.0025MNa2P2O7、1mMβ-甘油磷酸酯、1mMNa3VO4和1mMNaF)進(jìn)行裂解，所述裂解緩沖液具有無EDTA的蛋白酶抑制劑混合物(RocheAppliedScience)和PMSF。隨后使細(xì)胞裂解產(chǎn)物在冰上溫育10分鐘，離心，并通過與蛋白A/G珠(SantaCruzBiotechnology)在4℃下溫育1小時(shí)進(jìn)行預(yù)清除。對(duì)于IP珠制備，使30μl蛋白A/G珠與5μg抗體在4℃下溫育2小時(shí)。IP在4℃下進(jìn)行過夜，并將珠離心，洗滌，隨后在SDS蛋白質(zhì)上樣緩沖液中煮沸5分鐘，以洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。使IP裂解產(chǎn)物經(jīng)歷用所示抗體的蛋白質(zhì)印跡。對(duì)于蛋白質(zhì)印跡，通過在板上直接加入裂解緩沖液來收集來自培養(yǎng)的細(xì)胞的裂解產(chǎn)物。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序執(zhí)行蛋白質(zhì)印跡凝膠制備和免疫印跡。針對(duì)MTDH(Invitrogen，目錄#40-6500)、SND1(Santacruz，目錄#sc-271590)、抗Myc(SantaCruz，目錄#sc-40)和抗HA(SantaCruz，目錄#sc-7392)的抗體進(jìn)行1:1000稀釋。腫瘤球測(cè)定：?jiǎn)渭?xì)胞在具有球體培養(yǎng)基(補(bǔ)充有B27(Invitrogen)、20ng/mLEGF、20ng/mLbFGF和4μg/mL肝素的1:1DMEM:Ham’s12)的超低附著板(Corning,Tewksbury,MA)中鋪平板。球體在鋪平板后4-7天進(jìn)行計(jì)數(shù)。腫瘤發(fā)生測(cè)定：所有涉及小鼠的程序和所有實(shí)驗(yàn)方案均得到PrincetonUniversity的機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)。對(duì)于腫瘤發(fā)生測(cè)定，將所示數(shù)目的PyMT腫瘤細(xì)胞移植到FVB接受者小鼠的乳房脂肪內(nèi)，并且每周兩次監(jiān)測(cè)腫瘤形成。當(dāng)腫瘤變得可觸及連續(xù)兩周時(shí)，腫瘤視為建立，并且通過卡鉗測(cè)量腫瘤大小用于計(jì)算腫瘤體積(πx長度x寬度2/6)。FRET測(cè)定：對(duì)于FRET測(cè)定，將與(TC)SND1(16-339)融合的CFP-MTDH融合蛋白和四半胱氨酸肽克隆到pQlink載體(Addgene)內(nèi)，所述pQlink載體具有N末端GST標(biāo)簽與親和標(biāo)簽后的TEV切割位點(diǎn)。蛋白質(zhì)在23℃下在大腸桿菌菌株DH5α中過表達(dá)。大腸桿菌細(xì)胞裂解產(chǎn)物的可溶級(jí)分在GS4B樹脂(Qiagen)上進(jìn)行純化，隨后通過TEV切割來去除GST標(biāo)簽。未加上標(biāo)簽的蛋白質(zhì)還通過陰離子交換色譜(Source15Q,GEHealthcare)和凝膠過濾色譜(Superdex200,GEHealthcare)進(jìn)行分級(jí)。將FlAsH-EDC2化合物(Invitrogen)以1:1.1摩爾比加入TC-SND1(16-339)中，以產(chǎn)生在FRET測(cè)定中充當(dāng)CFP受體的高度熒光的TC-FLASH-SND1。使用VictorX5MultilabelPlateReader(PerkinElmer)，伴隨在450nm處的激發(fā)和在490nm處的發(fā)射，在濃度漸增的TC-FLASH-SND1(0.25、0.5、1、2、4、8μM)的存在和不存在下，測(cè)量0.2μMCFP-MTDH的CFP的供體熒光信號(hào)?；诠w熒光的喪失，使用下述方程計(jì)算能量轉(zhuǎn)移速率：E＝1-(FDA/FD)，其中FDA和FD分別是在TC-FLASH-SND1的存在和不存在下的CFP熒光。TC-FLASH-SND1濃度依賴性FRET效率在GraphPadPrism(GraphPadSoftware,Inc.)中進(jìn)行擬合，用于估計(jì)MTDH肽和SND1之間的平衡解離常數(shù)(KD)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次；顯示了代表性結(jié)果。生物層干涉測(cè)量法(BLI)：通過與150nMGST-MTDH(386-407)溫育，隨后與1mg/mlBSA溫育，并通過含有25mMTrispH8.0、100mMNaCl和3mMDTT的結(jié)合緩沖液洗滌，來活化通過抗GST抗體固定的BLI傳感器，其中每個(gè)步驟3分鐘。將由GST-MTDH活化的7個(gè)傳感器同時(shí)浸入7個(gè)孔內(nèi)，所述7個(gè)孔含有結(jié)合緩沖液對(duì)照和濃度漸增的His8-SND1(16-339)(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2μM)，以測(cè)量SND1結(jié)合的結(jié)合速率。在結(jié)合三分鐘后，將傳感器浸入結(jié)合緩沖液內(nèi)，以測(cè)量解離速率。使用ForteBioOctetRED96(PallLifeScience)執(zhí)行數(shù)據(jù)收集和分析。統(tǒng)計(jì)分析：需要時(shí)所有結(jié)果均經(jīng)歷統(tǒng)計(jì)分析。如圖例中指示的，對(duì)于大多數(shù)研究使用時(shí)序檢驗(yàn)、非參數(shù)曼懷二氏檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)和不成對(duì)、雙側(cè)、獨(dú)立斯氏t檢驗(yàn)，其中具有相等方差假設(shè)。對(duì)于有限稀釋測(cè)定，TIC的頻率和統(tǒng)計(jì)學(xué)使用L-calc軟件(StemCellTechnologies)進(jìn)行計(jì)算。P值在所有圖中指示為*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。登錄號(hào)：MTDH-SND1復(fù)合物的原子坐標(biāo)以登錄號(hào)4QMG保藏于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中。結(jié)果其相互作用所需的MTDH和SND1的最低限度區(qū)域的映射：最初進(jìn)行的MTDH(殘基1-582)的一級(jí)序列分析表明MTDH在其整個(gè)序列中大部分是非結(jié)構(gòu)化的，除了接近N末端的跨膜結(jié)構(gòu)域之外。因此，MTDH可充當(dāng)支架蛋白質(zhì)，并且經(jīng)由其在其序列自始至終的肽基序召募不同的信號(hào)傳導(dǎo)分子?；贛TDH片段(SEQIDNO:1的氨基酸364-470)具有與SND1相互作用所需的基本區(qū)域的先前觀察(Blanco等人，2011)，MTDH的最低限度片段(SEQIDNO:1的氨基酸386-407)最近映射在賦予SND1結(jié)合的該區(qū)域內(nèi)(參見上文)。SND1結(jié)構(gòu)域無一已映射用于與蛋白質(zhì)分子的特異性相互作用。為了填補(bǔ)這個(gè)缺口，制備一些SND1構(gòu)建體，并且兩個(gè)給出了分別具有N末端SN1/2和C末端SN3/4-TSN5結(jié)構(gòu)域的高度可溶性重組蛋白質(zhì)。通過使用具有SND1結(jié)合基序的加上GST標(biāo)簽的MTDH(SEQIDNO:1的氨基酸364-582)片段執(zhí)行下拉實(shí)驗(yàn)，我們顯示SND1的SN1/2結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:2的氨基酸16-339)與MTDH化學(xué)計(jì)量結(jié)合，而SN3/4-TSN5結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:2的氨基酸340-885)幾乎不與MTDH相互作用。使用生物層干涉測(cè)量法的這種相互作用的進(jìn)一步分析顯示這種相互作用是容易可逆的。MTDH和SND1之間的結(jié)合親和力為約0.9μM，如通過FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)測(cè)定所指示的。MTDH-SND1復(fù)合物的總體結(jié)構(gòu)：在廣泛的努力之后，SND1SN1/2結(jié)構(gòu)域和具有SEQIDNO:1的MTDH殘基386-407的合成肽的共結(jié)晶未能獲得蛋白質(zhì)晶體，可能是由于兩種蛋白質(zhì)之間相對(duì)弱的相互作用。為了穩(wěn)定復(fù)合物并促進(jìn)結(jié)晶，經(jīng)由長度范圍為12-37個(gè)殘基的柔性接頭，使SND1SN1/2結(jié)構(gòu)域融合至MTDH(SEQIDNO:1的氨基酸386-407)。具有21個(gè)殘基的接頭的構(gòu)建體最終獲得衍射晶體。雖然SN1/2結(jié)構(gòu)域與SN3/4結(jié)構(gòu)域緊密相關(guān)，但使用SN3/4(PDB代碼：3BDL)結(jié)構(gòu)通過分子替換的結(jié)構(gòu)測(cè)定是不成功的，可能是由于從OB折疊發(fā)出的擴(kuò)展環(huán)的大多樣性。最后，通過SeleniumSAD(單波長異常色散)定相測(cè)定結(jié)構(gòu)，并精制至在幾乎相同的每個(gè)不對(duì)稱單位中發(fā)現(xiàn)MTDH-SND1融合蛋白的五個(gè)拷貝，其中均方根偏差在290個(gè)殘基內(nèi)不超過具有限定的電子密度的MTDH殘基數(shù)目在不同拷貝中略有不同。盡管如此，MTDH的殘基393-403在所有拷貝中均可見，在與SND1的界面處具有明確限定的電子密度圖。SN1和SN2兩者均顯示出葡萄球菌核酸酶(SNase)的典型OB折疊，并且以類似于SN3/4(圖17A)的中心對(duì)稱相關(guān)方式排列(圖16)。每個(gè)SN結(jié)構(gòu)域含有由三螺旋束(α1-α2-α3)和短β-發(fā)夾(β4-β8)封端的β-桶(β1-β2-β3-β7-β5)(圖16)。MTDH肽(SEQIDNO:1的D393WNAPAEEWGN403)占據(jù)SN1和SN2結(jié)構(gòu)域之間的淺凹槽，其中SEQIDNO:1的兩個(gè)色氨酸殘基W394和W401與SND1中兩個(gè)明確限定的疏水口袋形成廣泛的疏水性接觸。值得注意的是，在MTDH-SND1界面的相對(duì)側(cè)，SND1具有三個(gè)延長的突出結(jié)構(gòu)元件(SN1中的β6-β7發(fā)夾以及SN1和SN2兩者中延長的Lβ4-α1環(huán))，導(dǎo)致能夠具有不同結(jié)合模式的尖銳表面。SN1/2結(jié)構(gòu)域先前表明參與DNA/RNA結(jié)合，并且促成SND1的核酸酶活性(Li等人，2008)。有待確定與MTDH-SND1界面相對(duì)的SND1的丘陵表面是否可能參與結(jié)合DNA/RNA或其他蛋白質(zhì)，并且促成由SND1介導(dǎo)的核酸酶活性或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。SN1/2與SN3/4和SNase的結(jié)構(gòu)比較：SN1/2、SN3/4(PDB代碼：3BDL)和SNase(PDB代碼：2ENB)的兩個(gè)拷貝的結(jié)構(gòu)疊加揭示了β片層和α螺旋中的相似結(jié)構(gòu)(圖19)，其中均方根偏差在SN1/2和SN3/4之間的268個(gè)殘基上為在SN1和SNase之間的123個(gè)殘基上為并且在SN2和SNase之間的116個(gè)殘基上為然而，幾個(gè)環(huán)區(qū)域明顯不同，具有不同的長度和氨基酸序列(圖20A和20B)。這些可能是由OB折疊進(jìn)化的新特征，以賦予新功能性。例如，如以后詳細(xì)顯示的，SN1中細(xì)長的Lβ2-β3環(huán)對(duì)于介導(dǎo)MTDH結(jié)合是關(guān)鍵的。SN1和SN3中的Lβ4-α1環(huán)顯著長于SNase中的那種，并且它們采用明顯不同的構(gòu)象，所述構(gòu)象可能對(duì)兩個(gè)SN結(jié)構(gòu)域限定不同的特異性。在SNase活性位點(diǎn)處的六個(gè)殘基中的兩個(gè)保留在SN3中，這些殘基中的僅一個(gè)在SN1和SN4中保持相同或相似，但其中無一保留在SN2中(圖20B)。這與先前觀察一致：SN3/4顯示出低核酸酶活性，而SN1/2增加核酸酶活性(Li等人，2008)，推測(cè)是通過增強(qiáng)底物結(jié)合。這些觀察表明對(duì)于SND1中的SN結(jié)構(gòu)域已進(jìn)化出新功能，但這些SN折疊中的核酸酶活性在進(jìn)化過程中降低(在SN3/4中)或縮小(在SN1/2中)。MTDH-SND1相互作用界面：MTDH在SND1的丘陵表面背面上占據(jù)SN1和SN2之間的延長凹槽的事實(shí)與MTDH可充當(dāng)支架信號(hào)傳導(dǎo)蛋白質(zhì)的概念一致。該體系結(jié)構(gòu)可允許MTDH橋接SND1和其他MTDH相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物，而不干擾SND1的主要結(jié)合表面。MTDH-SND1界面因此為理解不同的下游信號(hào)傳導(dǎo)及其在癌癥中的功能提供了重要的基礎(chǔ)。界面由MTDH中的W394和W401與SND1中的兩個(gè)分離的明確限定的疏水口袋的疏水性范德華接觸支配，其由在口袋的外圍處的氫鍵(H-鍵)和鹽橋相互作用支撐(圖21)。W394的疏水口袋由SN1Lβ2-β3環(huán)中的殘基P39、P43和P44以及SN2α1螺旋上的E247和F250的側(cè)鏈形成。W401的口袋遠(yuǎn)離約并位于來自SN2的α1和α2螺旋之間，并且由疏水殘基L256、H279、I284和L287以及殘基R255、R259和N281的碳鏈區(qū)形成輪廓。在接近界面一端的疏水口袋的外周處，SND1中的R327和R324與MTDH中的D393和N395，及其在不對(duì)稱單元的五個(gè)復(fù)合物中的兩個(gè)的392處的主鏈羰基基團(tuán)形成幾個(gè)H鍵和鹽橋相互作用；在中間，SND1中的R255與在395處的MTDH主鏈形成H鍵相互作用；并且在另一端處，幾個(gè)H鍵和鹽橋相互作用由來自SN1α1螺旋和SN2β5鏈的殘基和主鏈原子與MTDH殘基E400和N403形成。SND1中的MTDH界面是高度獨(dú)特的，并且僅存在于SN1/2中。用于W394和W401的明確限定的疏水口袋由具有靜電勢(shì)的SN1/2的表面輪廓清楚地顯示，但在SN3/4中不存在。SN1/2中的兩個(gè)疏水口袋之間的表面是堿性的，其部分有利于與E400的靜電相互作用，但對(duì)于與W394和W401之間的非極性殘基(A396PA398)的相互作用并不理想。這可能解釋了SND1和MTDH之間相對(duì)弱的相互作用以及這種相互作用的快速解離速率。與SN1/2不同，SN3和SN4之間的蛋白質(zhì)凹槽大部分是堿性的，是不利于MTDH結(jié)合的SN3/4的另一個(gè)結(jié)構(gòu)特征的基礎(chǔ)。此外，SN1Lβ2-β3環(huán)中對(duì)于襯里W394的口袋必需的脯氨酸殘基在SN3或SNase中均不存在(圖20B、圖21)，進(jìn)一步限定SN1/2與MTDH的結(jié)合特異性。結(jié)合缺陷的MTDH和SND1突變體的鑒定：為了獲得上文表征的界面如何促成MTDH-SND1相互作用的了解，執(zhí)行結(jié)構(gòu)指導(dǎo)的誘變研究。MTDH-SND1結(jié)構(gòu)表明由MTDHW394和W401作出的范德華疏水接觸可在SND1結(jié)合中起主要作用。與該概念一致，將兩個(gè)色氨酸殘基中任一突變?yōu)樾〉枚嗟臍埢彼?W394A、W401A)或帶負(fù)電荷的殘基天冬氨酸(W394D、W401D)，消除或顯著降低在體外在SND1(16-339)和MTDH(364-582)之間的相互作用(圖22A)。W→A突變體顯示出比W→D突變體更強(qiáng)的缺陷，并且關(guān)于W394的突變導(dǎo)致比關(guān)于W401的突變更嚴(yán)重的缺陷，表明MTDH-SND1相互作用在很大程度上由范德華接觸決定，并且W394對(duì)SND1結(jié)合作出比W401更大的貢獻(xiàn)。預(yù)期破壞H鍵或鹽橋相互作用的在外周界面處的MTDH突變(N395A、E400A、E400R、N403A)幾乎沒有任何效應(yīng)，類似靶向在界面外的D389的突變(D389R)(圖22A)。這可能是個(gè)別H鍵對(duì)MTDH-SND1相互作用作出較小貢獻(xiàn)。這些結(jié)果與結(jié)構(gòu)觀察一致，并支持MTDH和SND1之間的相互作用由MTDH色氨酸殘基和SND1中的疏水口袋之間的范德華接觸支配的概念。還鑒定了破壞MTDH結(jié)合的在界面處的幾個(gè)SND1突變。對(duì)SND1疏水口袋作出的變化(包括R255E、F250A和SN1Lβ2-β3環(huán)中的缺失(Δ39-43))幾乎完全消除了MTDH結(jié)合(圖22B)。除了擾亂與W401的范德華接觸之外，R255E也可能影響其與MTDH主鏈的H鍵相互作用(圖21)。Δ39-43的作用還支持了在SN1Lβ2-β3環(huán)中獨(dú)特發(fā)現(xiàn)的這些殘基(圖20A、20B和21)對(duì)于MTDH-結(jié)合的作用。R324E突變顯著削弱了MTDH結(jié)合，可能通過引入與MTDH中的D393的排斥性電荷-電荷接觸。預(yù)期擾動(dòng)其H鍵相互作用的對(duì)該殘基的不同突變R324A幾乎不影響MTDH結(jié)合，類似于陰性對(duì)照，R316E，位于界面外部的SND1突變。還檢查在該界面處鑒定的MTDH和SND1突變?nèi)绾斡绊懖溉閯?dòng)物細(xì)胞中的全長蛋白質(zhì)的相互作用。全長加上HA標(biāo)簽的SND1與全長加上Myc標(biāo)簽的野生型(WT)或突變型MTDH一起在HEK293T細(xì)胞中共表達(dá)，并且使細(xì)胞裂解產(chǎn)物經(jīng)歷抗HA免疫沉淀用于SND1下拉。與體外觀察(圖22A)一致，WTMTDH而不是突變體W394A、W394D或W401A連同HA-SND1一起被下拉(圖22C，以紅色表示)。MTDH突變W401D顯著降低了結(jié)合(圖22C，以藍(lán)色表示)，而其他突變，包括陰性對(duì)照D389R，位于MTDH-SND1界面外部的突變，不影響相互作用(圖22C)。同樣地，在體外影響MTDH結(jié)合的SND1突變也影響體內(nèi)的全長蛋白質(zhì)結(jié)合至相似的水平。WTHA-SND1和陰性對(duì)照突變體HA-SND1R316E兩者均容易地與Myc-MTDH結(jié)合，而其他突變?chǔ)?9-43、F250A或R255E幾乎完全消除MTDH結(jié)合，并且R324E顯著降低結(jié)合(圖22D)。對(duì)MTDH-SND1相互作用的體外和體內(nèi)研究的相似結(jié)果強(qiáng)烈表明上文表征的MTDH-SND1界面決定了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的全長MTDH和SND1的相互作用。這允許進(jìn)一步定義該界面在控制MTDH和SND1在癌癥促進(jìn)中的功能中的作用。SND1結(jié)合缺陷的MTDH突變體具有減少的促腫瘤發(fā)生活性：如上文證實(shí)的，MTDH在調(diào)節(jié)乳房腫瘤發(fā)生中起作用。特別地，小鼠中Mtdh的遺傳缺失損害由不同癌基因(PyMT、Wnt、ErbB2)或致癌劑刺激轉(zhuǎn)化的乳腺上皮細(xì)胞的腫瘤起始潛能，并且這種缺陷可通過經(jīng)由慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)將MTDH重新引入Mtdh敲除(Mtdh-/-)腫瘤細(xì)胞內(nèi)容易地援救。為了測(cè)試與SND1相互作用對(duì)于MTDH的腫瘤起始效應(yīng)是否重要，鼠形式的WT或突變型MTDH(W394A或W401A，小鼠中的相應(yīng)突變是W391A、W398A)在來自PyMT；Mtdh-/-小鼠的乳房腫瘤細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。MTDH突變體W394A或W401A完全喪失與SND1相互作用的能力(圖23A)，表明MTDH的SND1相互作用殘基在小鼠和人之間是良好保守的。在功能上，體外乳房球形成測(cè)定顯示，與用WTMTDH重構(gòu)的那些相比較，用突變型MTDH重構(gòu)的PyMT；Mtdh-/-腫瘤細(xì)胞形成顯著更低數(shù)量的球體(圖23B)。為了檢查MTDH突變?nèi)绾斡绊戵w內(nèi)腫瘤形成，將PyMT；Mtdh-/-腫瘤細(xì)胞原位移植到WT接受者小鼠的乳房脂肪墊內(nèi)。發(fā)現(xiàn)用突變型MTDH重構(gòu)的PyMT；Mtdh-/-腫瘤細(xì)胞含有基本上更少的腫瘤起始細(xì)胞，如通過當(dāng)注射有限數(shù)量的細(xì)胞時(shí)減少的腫瘤發(fā)生率揭示的(圖23C)。此外，由用突變型MTDH重構(gòu)的PyMT；Mtdh-/-腫瘤細(xì)胞形成的腫瘤大小比用WTMTDH的那種小得多(圖23D-E)。這些結(jié)果證實(shí)MTDH和SND1之間的相互作用對(duì)于MTDH的促腫瘤產(chǎn)生活性是必需的。MTDH結(jié)合缺陷的SND1突變體在腫瘤促進(jìn)中無活性：用于MTDH-結(jié)合的SND1中明確限定的口袋和這種相互作用在腫瘤起始中的作用表明SND1中的蛋白質(zhì)口袋代表了新型癌癥治療靶。如上文證實(shí)的，SND1的擊倒(KD)損害PyMT/Mtdh+/+腫瘤細(xì)胞的腫瘤起始活性，從而支持SND1的腫瘤促進(jìn)作用(Wan等人，2014)。在目前研究中，WT或突變型SND1(F250A或R255E)的shRNA抗性構(gòu)建體在SND1-KDPyMT/Mtdh+/+腫瘤細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，并且在體外和體內(nèi)測(cè)試其對(duì)腫瘤起始活性的作用。SND1突變幾乎完全消除了與MTDH的相互作用(圖24A)。SND1突變體幾乎不導(dǎo)致在體外乳房球測(cè)定中形成的球體數(shù)目中的任何增加，而WTSND1與對(duì)照相比使球體數(shù)目增加超過2倍(圖24B)。在將細(xì)胞移植到接受者小鼠的乳房脂肪墊內(nèi)之后，如通過腫瘤發(fā)生率和總腫瘤負(fù)荷反映的，WTSND1顯著提高了腫瘤起始和腫瘤生長，而SND1突變體顯示出非常小的作用(圖24D)。這些結(jié)果還支持我們的結(jié)論：MTDH和SND1之間的相互作用對(duì)于腫瘤促進(jìn)是重要的，并且SND1中的兩個(gè)MTDH結(jié)合口袋對(duì)于該活性均為關(guān)鍵的。SND1結(jié)合缺陷的MTDH突變體未能在應(yīng)激下穩(wěn)定SND1：這些近期研究表明MTDH在應(yīng)激條件下增強(qiáng)SND1蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性中起關(guān)鍵作用，這可能促成SND1在癌細(xì)胞中在致癌或其他應(yīng)激下的促存活作用(Gao等人，2010；Sundstrom等人，2009；Weissbach和Scadden，2012)。為了證實(shí)這一概念，檢查了MTDH突變對(duì)SND1在熱激下的細(xì)胞穩(wěn)定性的作用，所述熱激是在其下SND1已被證實(shí)對(duì)于細(xì)胞存活是重要的條件(Gao等人，2010；Weissbach和Scadden，2012)。當(dāng)單獨(dú)過表達(dá)時(shí)，HA-SND1的細(xì)胞水平在45℃下迅速降低，具有約30分鐘的半衰期(圖25)。與WTMyc-MTDH的共表達(dá)增強(qiáng)了HA-SND1在45℃下的細(xì)胞穩(wěn)定性，其中半衰期延長超過3小時(shí)，而任一MTDH突變體W394A和W401A的共表達(dá)未能在熱激下穩(wěn)定HA-SND1。該結(jié)果支持MTDH-SND1相互作用在促進(jìn)SND1的細(xì)胞穩(wěn)定性中的作用，與我們的MTDH和SND1的蛋白質(zhì)水平在人乳腺癌中正相關(guān)的近期觀察一致(參見上文)。討論近年來，MTDH由于其在不同癌癥類型中的廣泛牽涉而獲得越來越多的關(guān)注，并且SND1已證實(shí)為具有類似于MTDH的腫瘤促進(jìn)功能的MTDH結(jié)合蛋白(Emdad等人，2013；Wan和Kang，2013)。然而，相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和功能意義仍不清楚。我們的研究在此處映射MTDH和SND1的最低限度相互作用基序/結(jié)構(gòu)域，并測(cè)定其復(fù)合物的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)分析和結(jié)構(gòu)指導(dǎo)的功能研究顯示MTDH-SND1界面是MTDH和SND1在乳房腫瘤起始中的活性所必需的，并且具有希望作為新型癌癥治療靶的結(jié)構(gòu)特征。此外，MTDH-SND1復(fù)合物的結(jié)構(gòu)為未來理解由這種相互作用橋接的癌細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)提供了重要的平臺(tái)。本研究中表征的MTDH-SND1界面提供了關(guān)于其相互作用的分子基礎(chǔ)的關(guān)鍵了解。先前將必需的SND1結(jié)合基序映射至MTDH的兩個(gè)不同區(qū)域：SEQIDNO:1的殘基364-470(Blanco等人，2011)和SEQIDNO:1的殘基101-205(Yoo等人，2011)。在此處的研究將MTDH的短的11個(gè)殘基的肽基序(SEQIDNO:1的殘基393-403)限定為主要SND1結(jié)合基序，其位于由Blanco等人(Blanco等人，2011)鑒定的片段內(nèi)。在該界面處的MTDH或SND1中的突變消除了HEK293T細(xì)胞和乳腺腫瘤細(xì)胞兩者中的全長蛋白質(zhì)的相互作用，從而支持該界面是MTDH和SND1之間的主要結(jié)合位點(diǎn)的概念。MTDH-SND1界面在癌癥促進(jìn)中的突出功能表明靶向該界面可能是用于癌癥治療的有用策略。此外，我們的結(jié)果表明靶向該界面的重要方式。MTDH和SND1之間的相互作用由MTDH中的W395和W401以及SND1中的兩個(gè)明確限定的疏水口袋之間的范德華接觸所支配，所述范德華接觸吸引小分子抑制劑的結(jié)合。重要的是，在任一結(jié)合口袋處的MTDH或SND1中的突變消除了其促進(jìn)乳房腫瘤起始的活性，從而使同時(shí)靶向兩個(gè)SND1口袋成為有吸引力的治療方法。用于靶向的該界面的其他吸引人的特征包括MTDH和SND1之間的容易可逆的結(jié)合，表明這種相互作用可被特異性抑制劑逆轉(zhuǎn)。此外，MTDH結(jié)合口袋是在SN1/2結(jié)構(gòu)域中獨(dú)特進(jìn)化的，但不存在于其他OB折疊超家族蛋白質(zhì)或SND1中的其他SN結(jié)構(gòu)域中，是開發(fā)對(duì)于阻斷MTDH結(jié)合高度特異性的化合物的潛在希望。MTDH-SND1界面的結(jié)構(gòu)為理解由該相互作用協(xié)調(diào)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)提供了重要的平臺(tái)。盡管SN1/2和SN3/4結(jié)構(gòu)域之間具有結(jié)構(gòu)相似性，SN3/4不具有MTDH結(jié)合所需的獨(dú)特口袋和表面特征。此外，在SN1/2和SN3/4中具有突出結(jié)構(gòu)的丘陵表面是明顯不同的，并且預(yù)期賦予不同的結(jié)合特異性。含有SN3/4-TSN5結(jié)構(gòu)域的SND1片段中的結(jié)構(gòu)域顯示以新月形的線性取向排列(Li等人，2008)。FRET分析指示全長SND1的末端之間的距離比SN3/4-TSN5片段的距離更遠(yuǎn)，表明多個(gè)SND1結(jié)構(gòu)域以線性方式排列。該體系結(jié)構(gòu)可能允許不同的結(jié)合配偶體以相關(guān)定向進(jìn)行協(xié)調(diào)，用于下游信號(hào)傳導(dǎo)。令人驚訝的是，MTDH經(jīng)由短肽與SND1的表面結(jié)合，所述SND1的表面相當(dāng)平坦并且明顯不同于位于相對(duì)側(cè)的丘陵表面。這種簡(jiǎn)單的結(jié)合模式與該界面在癌癥促進(jìn)中的強(qiáng)大功能形成鮮明對(duì)比，表明由該界面介導(dǎo)的下游信號(hào)傳導(dǎo)可促成MTDH和SND1在癌癥中的多方面作用。重要的是注意到，除單個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域之外，具有幾乎五百個(gè)殘基的MTDH的整個(gè)序列大部分是無序的，表明MTDH可與許多信號(hào)傳導(dǎo)蛋白相互作用的可能性。這些特征類似信號(hào)傳導(dǎo)支架蛋白質(zhì)例如AKAP(激酶錨定蛋白(Gelman，2012)的那種，表明MTDH可充當(dāng)信號(hào)傳導(dǎo)支架蛋白質(zhì)。連同SND1一起，MTDH可經(jīng)由不同的信號(hào)傳導(dǎo)分子介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，所述不同信號(hào)傳導(dǎo)分子通過SND1和MTDH的多個(gè)相互作用結(jié)構(gòu)域/基序協(xié)調(diào)。在應(yīng)激下SND1穩(wěn)定性對(duì)MTDH結(jié)合的依賴提供了MTDH-SND1相互作用在癌癥中的作用的另一種解釋。該結(jié)果也與MTDH和SND1在腫瘤組織中同時(shí)升高的觀察一致(參見上文和Wang等人，2012)。然而，MTDH-SND1相互作用如何促成在應(yīng)激下的SND1穩(wěn)定性仍有待確定。目前的體外研究證實(shí)MTDH結(jié)合對(duì)SN1/2結(jié)構(gòu)域的熱穩(wěn)定性或其對(duì)蛋白酶切割的敏感性具有最低限度影響，表明MTDH結(jié)合可能不直接穩(wěn)定SND1。需要進(jìn)一步的研究來解開SND1的細(xì)胞穩(wěn)定性是否依賴于其他生物分子的召募的疑團(tuán)。實(shí)例4–野生型MTDH肽顯著阻斷MTDH-SND1相互作用。293T細(xì)胞用HA-SND1和MYC-MTDH共轉(zhuǎn)染。48小時(shí)后，收集細(xì)胞并實(shí)施免疫沉淀測(cè)定。參見圖26A和圖26B。將細(xì)胞裂解產(chǎn)物與抗HA抗體或IgG溫育過夜，隨后為與蛋白A/G珠的兩小時(shí)溫育，以下拉HA-SND1蛋白質(zhì)。將珠用裂解緩沖液洗滌并分成五個(gè)級(jí)分。每個(gè)級(jí)分用緩沖液或指示的肽(即肽-wt(PNSDWNAPAEEWGNW，SEQIDNO:16)；肽-394A(PNSDANAPAEEWGNW，SEQIDNO:17)；肽-401A(PNSDWNAPAEEAGNW，SEQIDNO:18)和肽-MT(PNSDANAPAEEAGNW，SEQIDNO:19)洗脫30分鐘。收集洗脫級(jí)分和珠用于蛋白質(zhì)印跡。(圖26C和26D)將細(xì)胞裂解產(chǎn)物分成6個(gè)級(jí)分。級(jí)分之一與IgG一起溫育，并且剩余部分與抗HA抗體加上緩沖液或指示的肽一起溫育。在24小時(shí)后，將裂解產(chǎn)物與蛋白A/G珠一起溫育，隨后通過洗滌緩沖液洗滌珠。在所有測(cè)定中均使用50uM肽。通過乳腺癌細(xì)胞系的內(nèi)源性免疫沉淀(IP)確認(rèn)相互作用中斷效應(yīng)。簡(jiǎn)言之，收集來自乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231的細(xì)胞裂解產(chǎn)物并實(shí)施IP測(cè)定。結(jié)果在圖27A和圖27B中提供。圖27A-細(xì)胞裂解產(chǎn)物與抗SND1抗體或IgG溫育過夜，隨后為與蛋白A/G珠的2小時(shí)溫育，以下拉內(nèi)源性SND1蛋白質(zhì)。將珠用裂解緩沖液洗滌并分成5個(gè)級(jí)分。每個(gè)級(jí)分用緩沖液或指示的肽洗脫30分鐘。收集洗脫級(jí)分和珠用于WB。圖27B-將細(xì)胞裂解產(chǎn)物分成5個(gè)級(jí)分，并與抗SND1抗體加上緩沖液或指示的肽一起溫育。在24小時(shí)后，將裂解產(chǎn)物與蛋白A/G珠一起溫育，隨后洗滌珠，隨后為蛋白質(zhì)印跡。上文結(jié)果指示野生型MTDH肽可有效阻斷MTDH-SND1相互作用。包含單一點(diǎn)突變W401A的肽使野生型肽的效力降低一半。還觀察到插入單一點(diǎn)突變W394A或雙重點(diǎn)突變對(duì)中斷MTDH與SND1的相互作用沒有作用。實(shí)例5–保留MTDH-SND1相互作用的序列變化MTDH-SND1復(fù)合物的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)揭示了異粘蛋白(MTDH)的11個(gè)殘基的肽基序用于結(jié)合含葡萄球菌核酸酶結(jié)構(gòu)域1(SND1)的延長蛋白質(zhì)凹槽。在該界面處結(jié)合缺陷的MTDH和SND1突變體具有降低的癌癥促進(jìn)活性，這確定了該界面作為開發(fā)癌癥治療劑的新型靶的意義。在該界面處的肽基序及其衍生物是阻斷這種相互作用的潛在抑制劑。為了探究保留SND1結(jié)合的在與SND1的界面處的MTDH肽的序列變化，對(duì)除W394和W401外的殘基執(zhí)行結(jié)構(gòu)指導(dǎo)的突變分析，所述W394和W401是結(jié)合SND1中的兩個(gè)明確限定的口袋的兩個(gè)殘基。突變無一對(duì)MTDH-SND1結(jié)合具有明顯作用。這提供了在設(shè)計(jì)肽和肽模擬抑制劑方面很大的靈活性，并且允許在制備這種抑制劑中的靈活化學(xué)。實(shí)驗(yàn)程序蛋白質(zhì)制備：使用標(biāo)準(zhǔn)的基于PCR的克隆策略生成所有構(gòu)建體和點(diǎn)突變。簡(jiǎn)言之，將具有不同邊界和突變型的SND1和MTDH克隆到pQlink載體(Addgene)中，所述pQlink載體分別具有N端His8標(biāo)簽和GST標(biāo)簽，在親和標(biāo)簽后具有TEV切割位點(diǎn)。蛋白質(zhì)在大腸桿菌菌株DH5α中在23℃下過表達(dá)。SND1和SND1(16-339)-L21-MTDH(386-407)的表達(dá)和純化遵循由先前出版物(Li等人，2008)修改的程序。GST-介導(dǎo)的滴定下拉測(cè)定：經(jīng)由GST標(biāo)簽將～20μgGST-MTDH(386-407，野生型和不同突變體)結(jié)合到10μl的谷胱甘肽樹脂上。樹脂用200μl測(cè)定緩沖液(25mMTris,PH8.0、150mMNaCl、3mMDTT)洗滌三次，以去除過量的未結(jié)合蛋白。將具有滴定濃度(10、3、1、0.5、0.25、0.12μM)的15μgHis-SND1(16-339)以在具有2mg/mlBSA的測(cè)定緩沖液中懸浮的500μl體積加入樹脂中。在通過SDS-PAGE檢查之前，混合物用500μl測(cè)定緩沖液洗滌兩次，并通過考馬斯藍(lán)染色顯現(xiàn)。結(jié)果保留SND1結(jié)合的MTDH的氨基酸序列變化：肽基序中的序列變化程度代表了在開發(fā)肽模擬抑制劑的化學(xué)中的靈活性水平。為了探索這種可能性，基于由MTDH-SND1復(fù)合物的高分辨率結(jié)構(gòu)揭示的MTDH-SND1相互作用模式，執(zhí)行對(duì)在與SND1的界面處或附近的MTDH殘基的進(jìn)一步突變分析。制備了對(duì)七個(gè)殘基的新型突變，并且通過滴定下拉測(cè)定測(cè)量其與具有SN1/2結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:2的氨基酸16-339)的His6-SND1的結(jié)合親和力(圖28)。所有MTDH突變體均獲得在野生型MTDH那種的0.7-1.3倍內(nèi)的結(jié)合親和力。W394和W401不包括在該突變列表中，因?yàn)閷?duì)這兩個(gè)殘基的突變較早顯示對(duì)與SND1的相互作用具有強(qiáng)烈的影響。預(yù)期對(duì)W394和W401的有限突變，例如替換為Tyr和Phe，保留對(duì)SND1的結(jié)合親和力的小部分。對(duì)于保留SND1結(jié)合的這兩個(gè)殘基的突變存在很少的耐受。在此處和早期的突變研究收集的結(jié)果支持對(duì)MTDH的其他位點(diǎn)的突變保留SND1結(jié)合的一般很大的耐受。這在設(shè)計(jì)肽抑制劑和肽模擬抑制劑中提供了顯著的靈活性。參考文獻(xiàn)Asselin-Labat,M.L.,Sutherland,K.D.,Barker,H.,Thomas,R.,Shackleton,M.,Forrest,N.C.,Hartley,L.,Robb,L.,Grosveld,F.G.,vanderWees,J.,等人.(2007).Gata-3isanessentialregulatorofmammary-glandmorphogenesisandluminal-celldifferentiation.Naturecellbiology9,201-209.Bernards,R.,和Weinberg,R.A.(2002).Aprogressionpuzzle.Nature418,823.Blanco,M.A.,Aleckovic,M.,Hua,Y.,Li,T.,Wei,Y.,Xu,Z.,Cristea,I.M.,和Kang,Y.(2011).Identificationofstaphylococcalnucleasedomain-containing1(SND1)asaMetadherin-interactingproteinwithmetastasis-promotingfunctions.JBiolChem286,19982-19992.Brown,D.M.,和Ruoslahti,E.(2004).Metadherin,acellsurfaceproteininbreasttumorsthatmediateslungmetastasis.CancerCell5,365-374.Buchwalter,G.,Hickey,M.M.,Cromer,A.,Selfors,L.M.,Gunawardane,R.N.,Frishman,J.,Jeselsohn,R.,Lim,E.,Chi,D.,Fu,X.,等人.(2013).PDEFpromotesluminaldifferentiationandactsasasurvivalfactorforER-positivebreastcancercells.CancerCell23,753-767.DeRose,Y.S.,Wang,G.,Lin,Y.C.,Bernard,P.S.,Buys,S.S.,Ebbert,M.T.,Factor,R.,Matsen,C.,Milash,B.A.,Nelson,E.,等人.(2011).Tumorgraftsderivedfromwomenwithbreastcancerauthenticallyreflecttumorpathology,growth,metastasisanddiseaseoutcomes.Naturemedicine17,1514-1520.Emdad,L.,Das,S.K.,Dasgupta,S.,Hu,B.,Sarkar,D.,和Fisher,P.B.(2013).AEG-1/MTDH/LYRIC:signalingpathways,downstreamgenes,interactingproteins,andregulationoftumorangiogenesis.Advancesincancerresearch120,75-111.Gao,X.,Ge,L.,Shao,J.,Su,C.,Zhao,H.,Saarikettu,J.,Yao,X.,Yao,Z.,Silvennoinen,O.,和Yang,J.(2010).Tudor-SNinteractswithandco-localizeswithG3BPinstressgranulesunderstressconditions.FEBSLett584,3525-3532.Ginestier,C.,Hur,M.H.,Charafe-Jauffret,E.,Monville,F.,Dutcher,J.,Brown,M.,Jacquemier,J.,Viens,P.,Kleer,C.G.,Liu,S.,等人.(2007).ALDH1isamarkerofnormalandmalignanthumanmammarystemcellsandapredictorofpoorclinicaloutcome.CellStemCell1,555-567.Guo,W.,Keckesova,Z.,Donaher,J.L.,Shibue,T.,Tischler,V.,Reinhardt,F.,Itzkovitz,S.,Noske,A.,Zurrer-Hardi,U.,Bell,G.,等人.(2012).SlugandSox9cooperativelydeterminethemammarystemcellstate.Cell148,1015-1028.Halazonetis,T.D.,Gorgoulis,V.G.,和Bartek,J.(2008).Anoncogene-inducedDNAdamagemodelforcancerdevelopment.Science319,1352-1355.Herschkowitz,J.I.,Simin,K.,Weigman,V.J.,Mikaelian,I.,Usary,J.,Hu,Z.,Rasmussen,K.E.,Jones,L.P.,Assefnia,S.,Chandrasekharan,S.,等人.(2007).Identificationofconservedgeneexpressionfeaturesbetweenmurinemammarycarcinomamodelsandhumanbreasttumors.GenomeBiol8,R76.Hu,G.,Chong,R.A.,Yang,Q.,Wei,Y.,Blanco,M.A.,Li,F.,Reiss,M.,Au,J.L.,Haffty,B.G.,和Kang,Y.(2009).MTDHactivationby8q22genomicgainpromoteschemoresistanceandmetastasisofpoor-prognosisbreastcancer.CancerCell15,9-20.Kouros-Mehr,H.,Bechis,S.K.,Slorach,E.M.,Littlepage,L.E.,Egeblad,M.,Ewald,A.J.,Pai,S.Y.,Ho,I.C.,和Werb,Z.(2008).GATA-3linkstumordifferentiationanddisseminationinaluminalbreastcancermodel.CancerCell13,141-152.Lento,W.,Congdon,K.,Voermans,C.,Kritzik,M.,和Reya,T.(2013).Wntsignalinginnormalandmalignanthematopoiesis.ColdSpringHarborperspectivesinbiology5.Li,Y.,Welm,B.,Podsypanina,K.,Huang,S.,Chamorro,M.,Zhang,X.,Rowlands,T.,Egeblad,M.,Cowin,P.,Werb,Z.,等人.(2003).EvidencethattransgenesencodingcomponentsoftheWntsignalingpathwaypreferentiallyinducemammarycancersfromprogenitorcells.ProcNatlAcadSciUSA100,15853-15858.Mani,S.A.,Guo,W.,Liao,M.J.,Eaton,E.N.,Ayyanan,A.,Zhou,A.Y.,Brooks,M.,Reinhard,F.,Zhang,C.C.,Shipitsin,M.,等人.(2008).Theepithelial-mesenchymaltransitiongeneratescellswithpropertiesofstemcells.Cell133,704-715.Meng,X.,Zhu,D.,Yang,S.,Wang,X.,Xiong,Z.,Zhang,Y.,Brachova,P.,和Leslie,K.K.(2012).CytoplasmicMetadherin(MTDH)providessurvivaladvantageunderconditionsofstressbyactingasRNA-bindingprotein.JBiolChem287,4485-4491.Perou,C.M.,Sorlie,T.,Eisen,M.B.,vandeRijn,M.,Jeffrey,S.S.,Rees,C.A.,Pollack,J.R.,Ross,D.T.,Johnsen,H.,Akslen,L.A.,等人.(2000).Molecularportraitsofhumanbreasttumours.Nature406,747-752.Shackleton,M.,Vaillant,F.,Simpson,K.J.,Stingl,J.,Smyth,G.K.,Asselin-Labat,M.L.,Wu,L.,Lindeman,G.J.,和Visvader,J.E.(2006).Generationofafunctionalmammaryglandfromasinglestemcell.Nature439,84-88.Sundstrom,J.F.,Vaculova,A.,Smertenko,A.P.,Savenkov,E.I.,Golovko,A.,Minina,E.,Tiwari,B.S.,Rodriguez-Nieto,S.,Zamyatnin,A.A.,Jr.,Valineva,T.,等人.(2009).Tudorstaphylococcalnucleaseisanevolutionarilyconservedcomponentoftheprogrammedcelldeathdegradome.Naturecellbiology11,1347-1354.Vaillant,F.,Asselin-Labat,M.L.,Shackleton,M.,Forrest,N.C.,Lindeman,G.J.,和Visvader,J.E.(2008).ThemammaryprogenitormarkerCD61/beta3integrinidentifiescancerstemcellsinmousemodelsofmammarytumorigenesis.Cancerresearch68,7711-7717.vandeVijver,M.J.,He,Y.D.,van'tVeer,L.J.,Dai,H.,Hart,A.A.,Voskuil,D.W.,Schreiber,G.J.,Peterse,J.L.,Roberts,C.,Marton,M.J.,等人.(2002).Agene-expressionsignatureasapredictorofsurvivalinbreastcancer.TheNewEnglandjournalofmedicine347,1999-2009.Vanharanta,S.,和Massague,J.(2013).Originsofmetastatictraits.CancerCell24,410-421.Wan,L.,和Kang,Y.(2013).PleiotropicrolesofAEG-1/MTDH/LYRICinbreastcancer.Advancesincancerresearch120,113-134.Wan,L.,Pantel,K.,和Kang,Y.(2013).Tumormetastasis:movingnewbiologicalinsightsintotheclinic.Naturemedicine19,1450-1464.Weissbach,R.,和Scadden,A.D.(2012).Tudor-SNandADAR1arecomponentsofcytoplasmicstressgranules.Rna18,462-471.Yin,Y.,Bai,R.,Russell,R.G.,Beildeck,M.E.,Xie,Z.,Kopelovich,L.,和Glazer,R.I.(2005).CharacterizationofmedroxyprogesteroneandDMBA-inducedmultilineagemammarytumorsbygeneexpressionprofiling.Molecularcarcinogenesis44,42-50.Yoo,B.K.,Santhekadur,P.K.,Gredler,R.,Chen,D.,Emdad,L.,Bhutia,S.,Pannell,L.,Fisher,P.B.,和Sarkar,D.(2011).IncreasedRNA-inducedsilencingcomplex(RISC)activitycontributestohepatocellularcarcinoma.Hepatology53,1538-1548.Zhang,W.,Tan,W.,Wu,X.,Poustovoitov,M.,Strasner,A.,Li,W.,Borcherding,N.,Ghassemian,M.,和Karin,M.(2013a).ANIK-IKKalphamoduleexpandsErbB2-inducedtumor-initiatingcellsbystimulatingnuclearexportofp27/Kip1.CancerCell23,647-659.Zhang,X.,Claerhout,S.,Prat,A.,Dobrolecki,L.E.,Petrovic,I.,Lai,Q.,Landis,M.D.,Wiechmann,L.,Schiff,R.,Giuliano,M.,等人.(2013b).Arenewabletissueresourceofphenotypicallystable,biologicallyandethnicallydiverse,patient-derivedhumanbreastcancerxenograftmodels.Cancerresearch73,4885-4897.GreenbergNM,DeMayoF,FinegoldMJ,MedinaD,TilleyWD,AspinallJO,等人.Prostatecancerinatransgenicmouse.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica.1995；92:3439-43.GingrichJR,BarriosRJ,FosterBA,GreenbergNM.PathologicprogressionofautochthonousprostatecancerintheTRAMPmodel.Prostatecancerandprostaticdiseases.1999；2:70-5.Kaplan-LefkoPJ,ChenTM,IttmannMM,BarriosRJ,AyalaGE,HussWJ,等人.Pathobiologyofautochthonousprostatecancerinapre-clinicaltransgenicmousemodel.TheProstate.2003；55:219-37.HurwitzAA,FosterBA,AllisonJP,GreenbergNM,KwonED.TheTRAMPmouseasamodelforprostatecancer.Currentprotocolsinimmunology/editedbyJohnEColigan[等人].2001；Chapter20:Unit205.ChiaverottiT,CoutoSS,DonjacourA,MaoJH,NagaseH,CardiffRD,等人.Dissociationofepithelialandneuroendocrinecarcinomalineagesinthetransgenicadenocarcinomaofmouseprostatemodelofprostatecancer.AmJPathol.2008；172:236-46.GingrichJR,BarriosRJ,MortonRA,BoyceBF,DeMayoFJ,FinegoldMJ,等人.Metastaticprostatecancerinatransgenicmouse.Cancerresearch.1996；56:4096-102.FosterBA,GingrichJR,KwonED,MadiasC,GreenbergNM.Characterizationofprostaticepithelialcelllinesderivedfromtransgenicadenocarcinomaofthemouseprostate(TRAMP)model.Cancerresearch.1997；57:3325-30.TaylorBS,SchultzN,HieronymusH,GopalanA,XiaoY,CarverBS,等人.Integrativegenomicprofilingofhumanprostatecancer.Cancercell.2010；18:11-22.DingZH,WuCJ,JaskelioffM,IvanovaE,Kost-AlimovaM,ProtopopovA,等人.TelomeraseReactivationfollowingTelomereDysfunctionYieldsMurineProstateTumorswithBoneMetastases.Cell.2012；148:896-907.LiuY,SuZW,LiG,YuCY,RenSL,HuangDH,等人.Increasedexpressionofmetadherinproteinpredictsworsedisease-freeandoverallsurvivalinlaryngealsquamouscellcarcinoma.IntJCancer.2013；133:671-9.YuC,LiuY,TanH,LiG,SuZ,RenS,等人.MetadherinregulatesmetastasisofsquamouscellcarcinomaoftheheadandneckviaAKTsignallingpathway-mediatedepithelial-mesenchymaltransition.Cancerletters.2014；343:258-67.ZhuK,DaiZ,PanQ,WangZ,YangGH,YuL,等人.MetadherinPromotesHepatocellularCarcinomaMetastasisthroughInductionofEpithelial-MesenchymalTransition.ClinicalCancerResearch.2011；17:7294-302.YooBK,EmdadL,SuZZ,VillanuevaA,ChiangDY,MukhopadhyayND,等人.Astrocyteelevatedgene-1regulateshepatocellularcarcinomadevelopmentandprogression.JClinInvest.2009；119:465-77.Otwinowski,Z.,Minor,W.(1997).ProcessingofX-raydiffractiondatacollectedinoscillationmode.MethodsEnzymol276,307-326.Adams,P.D.,Afonine,P.V.,Bunkoczi,G.,Chen,V.B.,Davis,I.W.,Echols,N.,Headd,J.J.,Hung,L.W.,Kapral,G.J.,Grosse-Kunstleve,R.W.,等人.(2010).PHENIX:acomprehensivePython-basedsystemformacromolecularstructuresolution.ActaCrystallogrDBiolCrystallogr66,213-221.McCoy,A.J.,Grosse-Kunstleve,R.W.,Adams,P.D.,Winn,M.D.,Storoni,L.C.,和Read,R.J.(2007).Phasercrystallographicsoftware.JApplCrystallogr40,658-674.Winn,M.D.,Ballard,C.C.,Cowtan,K.D.,Dodson,E.J.,Emsley,P.,Evans,P.R.,Keegan,R.M.,Krissinel,E.B.,Leslie,A.G.,McCoy,A.,等人.(2011).OverviewoftheCCP4suiteandcurrentdevelopments.ActaCrystallogrDBiolCrystallogr67,235-242.Emsley,P.,和Cowtan,K.(2004).Coot:model-buildingtoolsformoleculargraphics.ActaCrystallogrDBiolCrystallogr60,2126-2132.Weissbach,R.,和Scadden,A.D.(2012).Tudor-SNandADAR1arecomponentsofcytoplasmicstressgranules.Rna18,462-471.Gao,X.,Ge,L.,Shao,J.,Su,C.,Zhao,H.,Saarikettu,J.,Yao,X.,Yao,Z.,Silvennoinen,O.,和Yang,J.(2010).Tudor-SNinteractswithandco-localizeswithG3BPinstressgranulesunderstressconditions.FEBSLett584,3525-3532.Emdad,L.,Das,S.K.,Dasgupta,S.,Hu,B.,Sarkar,D.,和Fisher,P.B.(2013).AEG-1/MTDH/LYRIC:signalingpathways,downstreamgenes,interactingproteins,andregulationoftumorangiogenesis.Advancesincancerresearch120,75-111.Li,C.L.,Yang,W.Z.,Chen,Y.P.,和Yuan,H.S.(2008).StructuralandfunctionalinsightsintohumanTudor-SN,akeycomponentlinkingRNAinterferenceandediting.Nucleicacidsresearch36,3579-3589.Gelman,I.H.(2012).SuppressionoftumorandmetastasisprogressionthroughthescaffoldingfunctionsofSSeCKS/Gravin/AKAP12.Cancermetastasisreviews31,493-500.ThirkettleHJ,GirlingJ,WarrenAY,MillsIG,SahadevanK,LeungH,等人.LYRIC/AEG-1istargetedtodifferentsubcellularcompartmentsbyubiquitinylationandintrinsicnuclearlocalizationsignals.ClinCancerRes.2009；15:3003-13.KikunoN,ShiinaH,UrakamiS,KawamotoK,HirataH,TanakaY,等人.Knockdownofastrocyte-elevatedgene-1inhibitsprostatecancerprogressionthroughupregulationofFOXO3aactivity.Oncogene.2007；26:7647-55.StrykeD,KawamotoM,HuangCC,JohnsSJ,KingLA,HarperCA,等人.BayGenomics:aresourceofinsertionalmutationsinmouseembryonicstemcells.NucleicAcidsRes.2003；31:278-81.SuZZ,KangDC,ChenY,PekarskayaO,ChaoW,VolskyDJ,等人.IdentificationandcloningofhumanastrocytegenesdisplayingelevatedexpressionafterinfectionwithHIV-1orexposuretoHIV-1envelopeglycoproteinbyrapidsubtractionhybridization,RaSH.Oncogene.2002；21:3592-602.BrittDE,YangDF,YangDQ,FlanaganD,CallananH,LimYP,等人.Identificationofanovelprotein,LYRIC,localizedtotightjunctionsofpolarizedepithelialcells.Experimentalcellresearch.2004；300:134-48.SutherlandHG,LamYW,BriersS,LamondAI,BickmoreWA.3D3/lyric:anoveltransmembraneproteinoftheendoplasmicreticulumandnuclearenvelope,whichisalsopresentinthenucleolus.Experimentalcellresearch.2004；294:94-105.AshSC,YangDQ,BrittDE.LYRIC/AEG-1overexpressionmodulatesBCCIPalphaproteinlevelsinprostatetumorcells.BiochemBiophysResCommun.2008；371:333-8.EmdadL,SarkarD,SuZZ,RandolphA,BoukercheH,ValerieK,等人.ActivationofthenuclearfactorkappaBpathwaybyastrocyteelevatedgene-1:implicationsfortumorprogressionandmetastasis.Cancerresearch.2006；66:1509-16.SarkarD,ParkES,EmdadL,LeeSG,SuZZ,FisherPB.Molecularbasisofnuclearfactor-kappaBactivationbyastrocyteelevatedgene-1.Cancerresearch.2008；68:1478-84.序列表<110>普林斯頓大學(xué)理事會(huì)威斯康星舊生研究基金會(huì)<120>阻斷異粘蛋白-SND1相互作用的肽作為癌癥治療的用途<130>31256/48166PC<150>US62/016914<151>2014-06-25<160>20<170>PatentInversion3.5<210>1<211>582<212>PRT<213>Homosapiens<400>1MetAlaAlaArgSerTrpGlnAspGluLeuAlaGlnGlnAlaGluGlu151015GlySerAlaArgLeuArgGluMetLeuSerValGlyLeuGlyPheLeu202530ArgThrGluLeuGlyLeuAspLeuGlyLeuGluProLysArgTyrPro354045GlyTrpValIleLeuValGlyThrGlyAlaLeuGlyLeuLeuLeuLeu505560PheLeuLeuGlyTyrGlyTrpAlaAlaAlaCysAlaGlySerArgLys65707580LysArgArgSerProProArgLysArgGluGluAlaAlaAlaValPro859095AlaAlaAlaProAspAspLeuAlaLeuLeuLysAsnLeuArgSerGlu100105110GluGlnLysLysLysAsnArgLysLysLeuSerGluLysProLysPro115120125AsnGlyArgThrValGluValAlaGluGlyGluAlaValArgThrPro130135140GlnSerValThrAlaLysGlnProProGluIleAspLysLysAsnGlu145150155160LysSerLysLysAsnLysLysLysSerLysSerAspAlaLysAlaVal165170175GlnAsnSerSerArgHisAspGlyLysGluValAspGluGlyAlaTrp180185190GluThrLysIleSerHisArgGluLysArgGlnGlnArgLysArgAsp195200205LysValLeuThrAspSerGlySerLeuAspSerThrIleProGlyIle210215220GluAsnThrIleThrValThrThrGluGlnLeuThrThrAlaSerPhe225230235240ProValGlySerLysLysAsnLysGlyAspSerHisLeuAsnValGln245250255ValSerAsnPheLysSerGlyLysGlyAspSerThrLeuGlnValSer260265270SerGlyLeuAsnGluAsnLeuThrValAsnGlyGlyGlyTrpAsnGlu275280285LysSerValLysLeuSerSerGlnIleSerAlaGlyGluGluLysTrp290295300AsnSerValSerProAlaSerAlaGlyLysArgLysAlaGluProSer305310315320AlaTrpSerGlnAspThrGlyAspAlaAsnThrAsnGlyLysAspTrp325330335GlyArgSerTrpSerAspArgSerIlePheSerGlyIleGlySerThr340345350AlaGluProValSerGlnSerThrThrSerAspTyrGlnTrpAspVal355360365SerArgAsnGlnProTyrIleAspAspGluTrpSerGlyLeuAsnGly370375380LeuSerSerAlaAspProAsnSerAspTrpAsnAlaProAlaGluGlu385390395400TrpGlyAsnTrpValAspGluGluArgAlaSerLeuLeuLysSerGln405410415GluProIleProAspAspGlnLysValSerAspAspAspLysGluLys420425430GlyGluGlyAlaLeuProThrGlyLysSerLysLysLysLysLysLys435440445LysLysLysGlnGlyGluAspAsnSerThrAlaGlnAspThrGluGlu450455460LeuGluLysGluIleArgGluAspLeuProValAsnThrSerLysThr465470475480ArgProLysGlnGluLysAlaPheSerLeuLysThrIleSerThrSer485490495AspProAlaGluValLeuValLysAsnSerGlnProIleLysThrLeu500505510ProProAlaThrSerThrGluProSerValIleLeuSerLysSerAsp515520525SerAspLysSerSerSerGlnValProProIleLeuGlnGluThrAsp530535540LysSerLysSerAsnThrLysGlnAsnSerValProProSerGlnThr545550555560LysSerGluThrSerTrpGluSerProLysGlnIleLysLysLysLys565570575LysAlaArgArgGluThr580<210>2<211>910<212>PRT<213>Homosapiens<400>2MetAlaSerSerAlaGlnSerGlyGlySerSerGlyGlyProAlaVal151015ProThrValGlnArgGlyIleIleLysMetValLeuSerGlyCysAla202530IleIleValArgGlyGlnProArgGlyGlyProProProGluArgGln354045IleAsnLeuSerAsnIleArgAlaGlyAsnLeuAlaArgArgAlaAla505560AlaThrGlnProAspAlaLysAspThrProAspGluProTrpAlaPhe65707580ProAlaArgGluPheLeuArgLysLysLeuIleGlyLysGluValCys859095PheThrIleGluAsnLysThrProGlnGlyArgGluTyrGlyMetIle100105110TyrLeuGlyLysAspThrAsnGlyGluAsnIleAlaGluSerLeuVal115120125AlaGluGlyLeuAlaThrArgArgGluGlyMetArgAlaAsnAsnPro130135140GluGlnAsnArgLeuSerGluCysGluGluGlnAlaLysAlaAlaLys145150155160LysGlyMetTrpSerGluGlyAsnGlySerHisThrIleArgAspLeu165170175LysTyrThrIleGluAsnProArgHisPheValAspSerHisHisGln180185190LysProValAsnAlaIleIleGluHisValArgAspGlySerValVal195200205ArgAlaLeuLeuLeuProAspTyrTyrLeuValThrValMetLeuSer210215220GlyIleLysCysProThrPheArgArgGluAlaAspGlySerGluThr225230235240ProGluProPheAlaAlaGluAlaLysPhePheThrGluSerArgLeu245250255LeuGlnArgAspValGlnIleIleLeuGluSerCysHisAsnGlnAsn260265270IleLeuGlyThrIleLeuHisProAsnGlyAsnIleThrGluLeuLeu275280285LeuLysGluGlyPheAlaArgCysValAspTrpSerIleAlaValTyr290295300ThrArgGlyAlaGluLysLeuArgAlaAlaGluArgPheAlaLysGlu305310315320ArgArgLeuArgIleTrpArgAspTyrValAlaProThrAlaAsnLeu325330335AspGlnLysAspLysGlnPheValAlaLysValMetGlnValLeuAsn340345350AlaAspAlaIleValValLysLeuAsnSerGlyAspTyrLysThrIle355360365HisLeuSerSerIleArgProProArgLeuGluGlyGluAsnThrGln370375380AspLysAsnLysLysLeuArgProLeuTyrAspIleProTyrMetPhe385390395400GluAlaArgGluPheLeuArgLysLysLeuIleGlyLysLysValAsn405410415ValThrValAspTyrIleArgProAlaSerProAlaThrGluThrVal420425430ProAlaPheSerGluArgThrCysAlaThrValThrIleGlyGlyIle435440445AsnIleAlaGluAlaLeuValSerLysGlyLeuAlaThrValIleArg450455460TyrArgGlnAspAspAspGlnArgSerSerHisTyrAspGluLeuLeu465470475480AlaAlaGluAlaArgAlaIleLysAsnGlyLysGlyLeuHisSerLys485490495LysGluValProIleHisArgValAlaAspIleSerGlyAspThrGln500505510LysAlaLysGlnPheLeuProPheLeuGlnArgAlaGlyArgSerGlu515520525AlaValValGluTyrValPheSerGlySerArgLeuLysLeuTyrLeu530535540ProLysGluThrCysLeuIleThrPheLeuLeuAlaGlyIleGluCys545550555560ProArgGlyAlaArgAsnLeuProGlyLeuValGlnGluGlyGluPro565570575PheSerGluGluAlaThrLeuPheThrLysGluLeuValLeuGlnArg580585590GluValGluValGluValGluSerMetAspLysAlaGlyAsnPheIle595600605GlyTrpLeuHisIleAspGlyAlaAsnLeuSerValLeuLeuValGlu610615620HisAlaLeuSerLysValHisPheThrAlaGluArgSerSerTyrTyr625630635640LysSerLeuLeuSerAlaGluGluAlaAlaLysGlnLysLysGluLys645650655ValTrpAlaHisTyrGluGluGlnProValGluGluValMetProVal660665670LeuGluGluLysGluArgSerAlaSerTyrLysProValPheValThr675680685G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