醫(yī)用純化豬真皮及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)用純化豬真皮及其制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)材料的制備領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]膠原廣泛地存在于哺乳動(dòng)物的骨、腱、軟骨和皮膚及其它結(jié)締組織中，約占哺乳動(dòng)物蛋白總量的1/3，是構(gòu)成人體重要的細(xì)胞外基質(zhì)成分。膠原具有優(yōu)良的生物相容性，較弱的抗原性，能促進(jìn)細(xì)胞的粘附和增殖，良好的止血性能，良好的可降解性，以及較好的親水性等。因此，長(zhǎng)期以來，人們利用膠原的性能特點(diǎn)，研究開發(fā)系列膠原基生物醫(yī)學(xué)材料，如生物敷料、人工皮膚、生物醫(yī)用膜、止血海綿、脫細(xì)胞真皮基質(zhì)材料、可注射膠原溶液、膠原基復(fù)合醫(yī)用纖維以及組織工程支架材料等等，部分膠原基生物醫(yī)學(xué)材料已應(yīng)用于臨床，并被證明具有一定的療效(但衛(wèi)華，王坤余，曾睿，等.膠原的醫(yī)學(xué)應(yīng)用及其發(fā)展前景.生物醫(yī)學(xué)工程與臨床.2004，8 (1):45— 48)。
[0003]膠原是世界上資源存量最大的可再生動(dòng)物生物質(zhì)資源，來源廣泛、價(jià)廉易得，具有很高的醫(yī)學(xué)利用價(jià)值。膠原的利用方式主要有兩種:(1)提取膠原:從含有膠原的組織(如牛腱、鼠尾腱)中提取膠原(蛋白)，用得到的膠原制備各種醫(yī)用材料；(2)本體利用:直接處理含膠原的組織(豬皮、羊皮、牛皮、心包等)，除去非膠原成分，然后應(yīng)用(但年華，但衛(wèi)華，曾睿，等.動(dòng)物皮的利用方式及其發(fā)展前景.中國(guó)皮革，2007，36 (1):38— 40)。
[0004]令人遺憾的是，膠原在醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面，由于膠原基生物醫(yī)學(xué)材料的生物相容性在制造過程中難于控制，導(dǎo)致材料在使用過程中常常出現(xiàn)可靠性和安全性的問題。出現(xiàn)這些問題的根本原因就是由于所使用的膠原的純度達(dá)不到要求。根據(jù)我們的研究，解決膠原基生物醫(yī)學(xué)材料的生物相容性的關(guān)鍵是:提高膠原組織的純度，最大限度地清除原料中的非膠原成分、小分子物質(zhì)，同時(shí)保持膠原的三股螺旋結(jié)構(gòu)；在膠原的純化提取的過程中，既要確保膠原的生物活性，又要清除抗原物質(zhì)，消除其免疫原性。實(shí)際上，無論是第一種利用方式，還是第二種利用方式，都涉及純化這個(gè)關(guān)鍵問題(但年華，但衛(wèi)華，林海，等.京尼平交聯(lián)脫細(xì)胞豬真皮基質(zhì)材料的研究.功能材料.2012，21 (43):2966— 2969 ;吳霞，但衛(wèi)華，肖世維.不同條件下提取豬皮膠原的研究.中國(guó)皮革.2011,41 (3):33— 36;劉新華，路翠娟，但年華，等.從脫細(xì)胞豬真皮基質(zhì)材料的邊角料中提取I型膠原.中國(guó)皮革，2013，42 (13): 22—27 ;但年華，劉新華，但衛(wèi)華，等.豬源I型膠原/殼聚糖復(fù)合海綿的制備.皮革科學(xué)與工程.2014，24 (3):17— 22)。如果膠原純化不到位，本體應(yīng)用的安全性難以保障，提取的膠原也難免含有雜質(zhì)而影響其性能。
[0005]我國(guó)是生豬養(yǎng)殖大國(guó)，擁有豐富的豬皮資源，豬皮價(jià)廉易得。豬皮在組織學(xué)上與人體皮膚具有一定的同源性，是理想的天然膠原原料。豬皮中除含有膠原外，還含有較多的非膠原成分，如表皮、毛被、油脂、細(xì)胞等。
[0006]現(xiàn)有的膠原提取技術(shù)中，有的使用氯化鈉除去原料中的非膠原成分，再進(jìn)行提純(傅燕鳳，沈月新，楊承剛，等.淡水魚魚皮膠原蛋白的提取.上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào).2004，13
(6):146—150;張艷，李國(guó)英，繆煜清，等.草魚皮膠原的提取及性能的初步研究.水產(chǎn)科學(xué)，2006,25 (3):136-139);有的技術(shù)則是進(jìn)行一些簡(jiǎn)單的預(yù)處理就進(jìn)行提取(李開雄，趙志遠(yuǎn)，劉霞.豬皮中膠原蛋白的提取及應(yīng)用.肉類研究.1996，4:43—48 ;楊波，李國(guó)英.牛蛙皮中未變性I型膠原蛋白的提取及性能表征.皮革科學(xué)與工程，2012，22 (5):5— 8，19)。這些簡(jiǎn)單的方法無法除去豬皮中的多種非膠原成分，難以滿足豬皮純化的需要。
[0007]在脫細(xì)胞真皮的制備中，常采用的方法有(宋冰.脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的研究現(xiàn)狀.濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào).2007，30(1):53-54):
(I)DispaseII一Triton法:利用從中性蛋白酶DispaseII,使表皮層與真皮層分離，然后利用非離子型表面活性劑Triton X —100，處理剩余真皮組織，破壞真皮細(xì)胞細(xì)胞膜，進(jìn)而使真皮細(xì)胞及其細(xì)胞器溶解，充分漂洗后獲得。
[0008](2)高滲鹽一SDS法:該法首先將皮膚標(biāo)本浸泡于lmol/L NaCl溶液中，37°C下作用24 h，分離表皮與真皮，再用0.5%的破膜劑十二烷基硫酸鈉(SDS)室溫下
孵育Ih脫除真皮中的細(xì)胞成分而制得。
[0009](3)高滲鹽一酶消化法:在lmol/L的溶液中，37°C浸泡24— 48h，除去表皮后用
0.25%胰蛋白酶加0.P/oEDTA螯合劑37°C恒溫下孵育90min，去除真皮中細(xì)胞成分而得到。
[0010](4) NaOH消蝕法:在lmol/L的溶液中，37°C浸泡24h除去表皮，然后用4% NaOH溶液消蝕，B型超聲清洗儀間斷振蕩清洗，每隔4 h更換消蝕液一次，消蝕16 — 18 h。處理后的皮片在蒸餾水中浸洗24 h以上。最后將皮片浸于生理鹽水(滴加青霉素和慶大霉素溶液)中，4°C儲(chǔ)存。
[0011]目前比較常用的處理方法，如江蘇啟東生物材料研究所制備的脫細(xì)胞異種(豬)真皮基質(zhì)的制備方法，具體過程如下:用50kg左右無皮膚疾患的健康小白豬，活殺后剃毛，取下大張皮膚，用電動(dòng)劈皮機(jī)制成0.3-0.5mm的斷層皮片，用洗必泰溶液消毒后，用無菌高滲鹽水(30g/L)浸泡24小時(shí)，脫去表皮，經(jīng)戊二醛(2g/L浸泡10分鐘)交聯(lián)后，以含有胰蛋白酶為主要原料的脫細(xì)胞液進(jìn)行處理，生理鹽水沖洗，再制成網(wǎng)狀包裝保存(李開通，劉達(dá)恩.脫細(xì)胞異種(豬)真皮基質(zhì)臨床應(yīng)用與研究進(jìn)展.中國(guó)社區(qū)醫(yī)師?醫(yī)學(xué)專業(yè)，2012，14 (6):13-14.)。
[0012]這些方法將重點(diǎn)放在了除去表皮和細(xì)胞上，且方法難以有效地完全除去組織中的細(xì)胞，未涉及或較少涉及皮中的其它成分的除去。在有些制備方法中，采用剃毛的方法，除去毛被，但毛根仍殘留在皮中。有些方法采用Na2S溶解毛，會(huì)使產(chǎn)品中殘留有毒性較大的S2—，對(duì)生物相容性產(chǎn)生十分不利的影響，且在廢水中含有S2—，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。
[0013]綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)存在以下不足:
1.以資源相對(duì)有限的牛腱、鼠尾腱為原料提取膠原，忽略了原料的選擇及其純化對(duì)于制備醫(yī)用膠原的極端重要性，制備成本高，難以滿足普通消費(fèi)者的需要；
2.以牛組織為原料提取膠原，存在攜帶瘋牛病病毒的風(fēng)險(xiǎn)。而豬皮組織同源性好，來源廣泛，價(jià)廉易得。
[0014]以往的方法將重點(diǎn)放在除去表皮和細(xì)胞上，且方法難以有效地完全除去組織中的細(xì)胞。對(duì)油脂、毛被等也未能有效除去，難以滿足除去豬皮中多種非膠原成分的需要，所得到的產(chǎn)物純度難以滿足醫(yī)學(xué)要求，更無法滿足醫(yī)用植入材料的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015]醫(yī)用純化豬真皮具有以下性能(含量以絕干基計(jì)):
(O外觀:白色或接近白色；
(2)蛋白質(zhì)含量:彡95%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))；
(3)抗張強(qiáng)度:彡4.0Mpa ；
(4)斷裂伸長(zhǎng)率S15% ；
(5)酸堿度袖值5.5—8.0;
(6)重金屬含量:<10 μ g/ml ；
(7)二氯甲烷萃取物2% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))；
(8)灰分2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))；
(9)羥脯氨酸含量:應(yīng)不小于氨基酸總含量的5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))；
(10)組織學(xué)檢查:組織切片后HE染色法染色，光學(xué)顯微鏡檢查，無殘留細(xì)胞；
(11)體外細(xì)胞毒性:細(xì)胞毒性反應(yīng)不大于I級(jí)；
(12)致敏試驗(yàn):應(yīng)無遲發(fā)型超敏反應(yīng)；
(13)皮內(nèi)刺激:原發(fā)性刺激PII應(yīng)小于0.4 ；
(14)熱原:無熱源。
[0016]2.權(quán)利要求1所述的醫(yī)用純化豬真皮及其制備方法，包括以下步驟:
(O原料皮準(zhǔn)備:從可溯源性、健康的豬上剝?nèi)〉男迈r豬皮；立即采用去肉機(jī)進(jìn)行去肉，用刀修去頭尾、腹肷、四肢等部位，保留豬皮正身部位，每張皮采用500— 2000克食鹽腌制后冷凍保存；從剝?nèi)⊥戤叺嚼鋬霰４?，離體時(shí)間不超過4h ；
(2)稱重:稱取100重量份的冷凍豬皮；
(3)第一次清洗:加水調(diào)節(jié)液比2.0—4.0，浸泡30—60min，至完全解凍后，再轉(zhuǎn)動(dòng)30—120min，控干廢液，加水調(diào)節(jié)液比2.0—4.0，純堿0.5—1.2%轉(zhuǎn)動(dòng)30— 120min，控干廢液；
(4)第二次清洗:加水調(diào)節(jié)液比2.0—4.