本申請(qǐng)要求于2014年8月1日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第62/035,916號(hào)的優(yōu)先權(quán)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及瘦素相關(guān)肽以及，更具體地，涉及肉豆蔻?；?myristoylated)瘦素相關(guān)肽。

背景技術(shù)：

肥胖——被定義為相對(duì)于瘦體重的過(guò)量的體脂肪——與許多重要的臨床和心理疾病有關(guān)，例如高血壓、升高的血脂、和II型或非胰島素依賴(lài)性糖尿病(NIDDM)、及縮短的預(yù)期壽命。在美國(guó)有大約600-1000萬(wàn)人患有NIDDM，包括65歲以上的總?cè)丝诘?8％。此外，約45％患有NIDDM的男性和70％患有NIDDM的女性是肥胖的，并且他們的糖尿病通過(guò)減輕體重而得到實(shí)質(zhì)改善或甚至消除。

已證明瘦素相關(guān)肽及類(lèi)似物在治療人類(lèi)肥胖癥及其相關(guān)功能障礙方面具有巨大的潛力。在瘦素相關(guān)的合成肽激動(dòng)劑和拮抗劑的開(kāi)發(fā)、涉及以及臨床前應(yīng)用方面所進(jìn)行的努力表明，為滿(mǎn)足大多數(shù)肥胖人類(lèi)的治療需求，瘦素在臨床上的貌似失敗已經(jīng)加速了開(kāi)發(fā)新的肽療法的努力，所述肽療法旨在降低這種疾病及其相關(guān)代謝功能障礙的流行比例。在這方面，小分子肽療法具有克服重組瘦素的局限性的潛力，因?yàn)橹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)(CNS)對(duì)它們的吸收并不依賴(lài)于穿過(guò)血腦屏障(BBB)的可飽和轉(zhuǎn)運(yùn)。在大多數(shù)人類(lèi)肥胖病例中，進(jìn)入CNS的缺陷轉(zhuǎn)運(yùn)被鑒定為瘦素抗性的起因。

例如，在瘦素缺陷的ob/ob和瘦素抗性db/db小鼠模型中，具有瘦素樣活性的合成肽(如小鼠[D-Leu-4]-OB3及其類(lèi)似物)顯著地影響體重增加、食物和水?dāng)z入、血糖、胰島素敏感性、以及血清骨鈣素、骨轉(zhuǎn)換的敏感性和特異性標(biāo)記物。然而，作為人類(lèi)候選藥物的[D-Leu-4]-OB3及其類(lèi)似物的藥代動(dòng)力學(xué)并不如治療用途所需要的那樣是最佳的。尤其是，[D-Leu-4]-OB3及其類(lèi)似物具有短的血清半衰期和高的血漿清除率，導(dǎo)致[D-Leu-4]-OB3及其類(lèi)似物的生物利用度降低，從而需要更高的劑量。

因此，需要開(kāi)發(fā)具有改善的藥代動(dòng)力學(xué)的經(jīng)修飾的瘦素相關(guān)肽及類(lèi)似物，以提供用于治療人類(lèi)肥胖癥及其相關(guān)功能障礙的有效療法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明包括肉豆蔻酸與瘦素相關(guān)肽的多肽綴合物，其相對(duì)于未綴合肉豆蔻酸的瘦素相關(guān)肽具有改善的藥理作用。優(yōu)選地，肉豆蔻酸綴合至瘦素相關(guān)肽的N末端。本文的多肽綴合物可通過(guò)在給藥后減少體重增加、食物攝入、水消耗、和/或血糖水平來(lái)調(diào)節(jié)體重。本文中多肽綴合物也可增加骨形成。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述瘦素相關(guān)肽包括[D-Leu-4]-OB3，一種具有序列SCSLPQT(SEQ ID NO：1)的具有瘦素樣活性的合成肽酰胺，并且所述瘦素相關(guān)肽與肉豆蔻酸綴合以形成化合物MA-[D-Leu-4]-OB3。

本文所述的藥物組合物可以以比未肉豆蔻?；氖菟叵嚓P(guān)肽的劑量低至少4倍、甚至10倍的劑量給藥。通過(guò)給予受試者治療有效的量，綴合了肉豆蔻酸的瘦素相關(guān)肽可用于在需要其的受試者中治療與體重的動(dòng)態(tài)平衡相關(guān)的病癥。例如，所治療的病癥可為肥胖癥、高血糖癥、高胰島素血癥、攝食過(guò)度、甲狀腺功能障礙、不育或糖尿病。綴合了肉豆蔻酸的瘦素相關(guān)肽也可用于增加骨形成。例如，綴合了肉豆蔻酸的瘦素相關(guān)肽可用于治療患有選自以下病癥的受試者：營(yíng)養(yǎng)不良、饑餓、神經(jīng)性厭食癥、骨質(zhì)疏松癥、癌癥、糖尿病、結(jié)核病、慢性腹瀉、AIDS和腸系膜上動(dòng)脈綜合征。綴合了肉豆蔻酸的瘦素相關(guān)肽可以經(jīng)由皮下、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、口服或鼻內(nèi)給藥來(lái)給予。

附圖說(shuō)明

通過(guò)結(jié)合附圖閱讀以下的詳細(xì)描述將更全面地理解和領(lǐng)會(huì)本發(fā)明，其中：

圖1為本發(fā)明的綴合了肉豆蔻酸的瘦素相關(guān)肽的示意圖。

圖2為示出治療前(時(shí)間0)以及向雄性Swiss Webster小鼠皮下遞送0.1mg肽之后1、2、4、6、18和24小時(shí)的MA-[D-Leu-4]-OB3血清濃度的圖(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n＝3只小鼠)。各數(shù)值表示平均值±SEM。誤差棒包含于點(diǎn)中，并且誤差棒范圍為0.01至0.12ng/ml；

圖3為示出治療前(時(shí)間0)以及向雄性Swiss Webster小鼠腹膜內(nèi)遞送0.1mg肽之后1、2、4、6、18和24小時(shí)的MA-[D-Leu-4]-OB3血清濃度的圖(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n＝3只小鼠)。各數(shù)值表示平均值±SEM。誤差棒包含于點(diǎn)中，并且誤差棒范圍為0.01至0.12ng/ml；

圖4為示出治療前(時(shí)間0)以及向雄性Swiss Webster小鼠肌肉內(nèi)遞送0.1mg肽之后1、2、4、6、18和24小時(shí)的MA-[D-Leu-4]-OB3血清濃度的圖(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n＝3只小鼠)。各數(shù)值表示平均值±SEM。誤差棒包含于點(diǎn)中，并且誤差棒范圍為0.01至0.12ng/ml；

圖5為示出治療前(時(shí)間0)以及向雄性Swiss Webster小鼠口服遞送(管飼法)0.1mg肽之后1、2、4、6、18和24小時(shí)的MA-[D-Leu-4]-OB3血清濃度的圖(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n＝3只小鼠)。各數(shù)值表示平均值±SEM。誤差棒包含于點(diǎn)中，并且誤差棒范圍為0.01至0.12ng/ml；

圖6為示出治療前(時(shí)間0)以及向雄性Swiss Webster小鼠鼻內(nèi)滴注0.1mg肽之后1、2、4、6、18和24小時(shí)的MA-[D-Leu-4]-OB3血清濃度的圖(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n＝3只小鼠)。各數(shù)值表示平均值±SEM。誤差棒包含于點(diǎn)中，并且誤差棒范圍為0.01至0.12ng/ml；

圖7為示出在db/db小鼠中，在于0.3％十二烷基麥芽苷中口服遞送之后綴合了肉豆蔻酸的[D-Leu-4]-OB3對(duì)空腹血糖的作用的圖；

圖8為示出在db/db小鼠中，在于PBS中口服遞送之后綴合了肉豆蔻酸的[D-Leu-4]-OB3對(duì)空腹血糖作用的圖；

圖9為示出在STZ誘發(fā)高血糖癥的雄性Swiss Webster小鼠中，在缺乏或存在MA-[D-Leu-4]-OB3或二甲雙胍的情況下，地特(detemir)胰島素對(duì)體重增加的作用的圖。各點(diǎn)表示平均值±SEM體重，其表達(dá)為起始體重的百分比(每組n＝6只小鼠)；以及

圖10為示出在STZ誘發(fā)高血糖癥的雄性Swiss Webster小鼠中，在缺乏或存在MA-[D-Leu-4]-OB3或二甲雙胍的情況下，地特胰島素對(duì)空腹血糖水平的作用的圖。每根棒和垂直線表示平均值±SEM的空腹血糖(每組n＝6只小鼠)。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)在參考附圖，其中相同的附圖標(biāo)記始終表示相同的部分，由圖1可見(jiàn)肉豆蔻酸與瘦素相關(guān)肽的綴合物，該綴合物導(dǎo)致優(yōu)于單獨(dú)的瘦素相關(guān)肽的顯著改善的藥代動(dòng)力學(xué)特征。優(yōu)選地，所述瘦素相關(guān)肽為對(duì)應(yīng)于瘦素殘基116-122的被稱(chēng)作OB3的合成肽，其中小鼠OB3具有序列SCSLPQT(SEQ ID NO：1)，人OB3具有序列SCHLPWA(SEQ ID NO：16)。

所述瘦素相關(guān)肽也可包括與對(duì)應(yīng)于SCSLPQT(SEQ ID NO：1)和SCHLPWA(SEQ ID NO：16)的區(qū)域鄰近或重疊的其他區(qū)域瘦素。例如，可以使用以下方案評(píng)價(jià)AVPIQKVQDDTKTLI(SEQ ID NO：2)、TKTLIKTIVTRINDI(SEQ ID NO：3)、RINDISHTQSVSAKQ(SEQ ID NO：4)、VSAKQRVTGLDFIPG(SEQ ID NO：5)、DFIPGLHPILSLSKM(SEQ ID NO：6)、SLSKMDQTLAVYQQV(SEQ ID NO：7)、VYQQVLTSLPSQNVL(SEQ ID NO：8)、SQNVLQIANDLENLR(SEQ ID NO：9)、DLLHLLAFSKSCSLP(SEQ ID NO：10)、SCSLPQTSGLQKPES(SEQ ID NO：11)、QKPESLDGVLEASLY(SEQ ID NO：12)、EASLYSTEVVALSRL(SEQ ID NO：13)、ALSRLQGSLQDILQQ(SEQ ID NO：14)或DILQQLDVSPEC(SEQ ID NO：15)。

優(yōu)選地，所述瘦素相關(guān)肽包含至少一個(gè)D-取代的氨基酸。例如，對(duì)于SEQ ID NO.1，D-異構(gòu)體(isoform)氨基酸可選自[D-Ser-1]、[D-Cys-2]、[D-Ser-3]、[D-Leu-4]、[D-Pro-5]、[D-Gln-6]和[D-Thr-7]；對(duì)于SEQ ID NO.16，D-異構(gòu)體氨基酸可選自[D-Ser-1]、[D-Cys-2]、[D-His-3]、[D-Leu-4]、[D-Pr0-5]、[D-Trp-6]和[D-Ala-7]。

如圖1所示，肉豆蔻酸與瘦素相關(guān)肽的殘基的游離氨基共價(jià)連接?；蛘?，肉豆蔻酸可與所述肽的殘基的任何游離氨基綴合。例如，在人OB3肽(SEQ ID NO：16)的3位的組氨酸(H)殘基除了α氨基以外，還提供額外的游離氨基。以下脂類(lèi)也可用于代替肉豆蔻酸并且根據(jù)以下方案進(jìn)行測(cè)試：環(huán)己基戊?；?、酰基谷氨?；?、月桂?；?、2-琥珀酰氨基肉豆蔻酸、2-琥珀酰氨基乙氧基棕櫚酸、肉豆蔻?；?α-谷氨?；?、肉豆蔻酰基-α-谷氨?；?甘氨?；?、膽酰基(choloyl)、7-脫氧膽酰基、石膽?；?lithocholoyl)、石膽?；?谷氨?；?、4-苯甲?；?苯丙氨酸、L-甲狀腺素基(thyroxyl)、辛二?；?D-甲狀腺素、3，3′，5，5′-四碘甲狀腺乙?；?tetraiodothyroacetyl)、環(huán)己基戊?；?。

所要求保護(hù)的發(fā)明的合成基于已知的乙?；椒?，其中脂肪酸與蛋白質(zhì)共價(jià)連接。為了選擇性地?；?例如肉豆蔻酰化)ε-氨基，在偶聯(lián)過(guò)程中可使用多種保護(hù)基團(tuán)以封閉α-氨基。合適的保護(hù)基團(tuán)的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，它們包括p-甲氧基苯甲酰氧基-羰基(pmZ)。優(yōu)選地，將ε-氨基在一步合成中?；?例如肉豆蔻酰化)而不使用氨基保護(hù)基團(tuán)。通過(guò)在堿性條件下于極性溶劑中，使活化的脂肪酸酯與蛋白質(zhì)的ε-氨基反應(yīng)來(lái)進(jìn)行酰化(例如肉豆蔻酰化)。所述反應(yīng)的堿性必須足以使瘦素類(lèi)似物的所有游離氨基去質(zhì)子化。在弱堿條件下，所有的游離氨基均不被去質(zhì)子化，導(dǎo)致N-末端或α-氨基的優(yōu)先酰化(例如肉豆蔻?；?。在?；?例如內(nèi)豆蔻酰化)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法如反相疏水色譜法來(lái)純化產(chǎn)物。此后，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法如凍干或通過(guò)結(jié)晶回收產(chǎn)物。

例如，在Rainin Symphony合成儀中，使用Fmoc/叔丁基策略在Rink Amide樹(shù)脂上合成肽的樣品。采用HCTU/DIPEA溶液使氨基酸偶聯(lián)，并采用20％哌啶/DMF溶液除去Fmoc。在自動(dòng)合成完成后，將肉豆蔻酸酐手動(dòng)添加到肽的N-末端。使用TFA裂解混合物從樹(shù)脂上切割肽。使用Maldi-Tof質(zhì)譜法來(lái)核對(duì)所存在的目標(biāo)質(zhì)量。使用反相HPLC和C-18Waters Sunfire柱純化所述肽。

肉豆蔻?；碾牡乃幋鷦?dòng)力學(xué)可以根據(jù)本領(lǐng)域的已知方法確定。例如，肉豆蔻?；氖菟叵嚓P(guān)肽的藥代動(dòng)力學(xué)可通過(guò)分析總吸收、血清半衰期和血漿清除率來(lái)確定。用于確定總吸收、血清半衰期和血漿清除率的測(cè)定是本領(lǐng)域已知的，并且用于以下實(shí)施例中。通過(guò)使半衰期從小于1小時(shí)延長(zhǎng)至長(zhǎng)達(dá)28小時(shí)(這取決于遞送途徑)、增加吸收、降低血漿清除速率以及使最小有效劑量減少4倍或更多，肉豆蔻酸與[D-Leu-4]-OB3的綴合顯著改善了藥代動(dòng)力學(xué)特征。因此，本發(fā)明的肉豆蔻?；碾奶峁┝藘?yōu)于非肉豆蔻酰化的瘦素肽的顯著優(yōu)勢(shì)，例如，它們可以以較低劑量和較低的給藥頻率進(jìn)行給藥。盡管本發(fā)明使用SEQ ID NO：1進(jìn)行測(cè)試，但是本發(fā)明方法可應(yīng)用于其他瘦素相關(guān)的蛋白質(zhì)，然后如下所述測(cè)試其功效。

實(shí)施例1

肉豆蔻酸與[D-Leu-4]-OB3的綴合——一種具有生物活性的瘦素相關(guān)的合成肽酰胺——顯著改善了其藥代動(dòng)力學(xué)特征。

材料和方法

動(dòng)物的圈養(yǎng)

從Charles River Laboratories(Troy，NY，USA)獲得3至4周齡、重量為12至15g的雄性Swiss Webster小鼠。將動(dòng)物每籠3只圈養(yǎng)于配有不銹鋼絲蓋和空氣過(guò)濾器的聚碳酸酯籠中，并維持在Albany醫(yī)學(xué)院動(dòng)物資源設(shè)施的通風(fēng)架(Thoren Caging Systems，Hazelton，PA，USA)上。將小鼠保持于恒溫(24℃)、從07：00至19：00照明的條件下，并且允許自由進(jìn)食和飲水，直至用于吸收研究。

肽的給藥

MA-[D-Leu-4]-OB3作為C-末端酰胺由NeoBioLab(Cambridge，MA，USA)商業(yè)化地制備。對(duì)于SC、IP和IM遞送，將肽以0.1mg/200μl的濃度溶解于無(wú)菌磷酸鹽緩沖鹽水中(PBS，pH 7.2)，該濃度比之前所示的在兩種遺傳肥胖小鼠模型中對(duì)于調(diào)節(jié)能量消耗、葡萄糖水平和胰島素敏感性而言最佳的[D-Leu-4]-OB3濃度低10倍。對(duì)于口服和鼻內(nèi)遞送，將MA-[D-Leu-4]-OB3分別以0.1mg/100μl和0.1mg/10μl的濃度溶解于在無(wú)菌去離子水中復(fù)原的0.3％(Aegis Therapeutics，San Diego，CA，USA)中。在零時(shí)刻(0)，每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)向三只小鼠中的每一只通過(guò)SC、IM或IP注射給予單次200μl MA-[D-Leu-4]-OB3。通過(guò)采用異氟烷(1-4％)輕微麻醉小鼠，并使用P-20移液器將10μl MA-[D-Leu-4]-OB3遞送到鼻孔中來(lái)實(shí)現(xiàn)鼻內(nèi)遞送。在給予肽之后，將小鼠轉(zhuǎn)移到分開(kāi)的籠中以度過(guò)指定的時(shí)間段。

血液的收集和血清的制備

在肽遞送之后1、2、4、6、18和24小時(shí)，采用異氟烷(5％)麻醉小鼠并通過(guò)心臟穿刺放血。將血液收集在無(wú)菌未肝素化的塑料離心管中，并使其在室溫下靜置1小時(shí)。采用無(wú)菌木制涂藥棒將凝結(jié)的血從管壁刮下。通過(guò)在Eppendorf 5702R、A-4-38轉(zhuǎn)子(Eppendorf North America，Westbury，NY，USA)中以2600×g離心30分鐘而制備單個(gè)血清樣品，按時(shí)間點(diǎn)合并，并將該樣品冷凍儲(chǔ)存直至用于測(cè)定MA-[D-Leu-4]-OB3含量。這些動(dòng)物操作由Albany醫(yī)學(xué)院動(dòng)物管理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)，并且根據(jù)相關(guān)準(zhǔn)則和規(guī)定進(jìn)行。

血清MA-[D-Leu-4]-OB3的測(cè)量

使用本發(fā)明人開(kāi)發(fā)且驗(yàn)證的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA來(lái)測(cè)量混合血清樣品中的MA-[D-Leu-4]-OB3濃度，所述競(jìng)爭(zhēng)性ELISA具有以下改良：將MA-[D-Leu-4]-OB3用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。MA-[D-Leu-4]-OB3與用于ELISA中的[D-Leu-4]-OB3的多克隆抗體的交叉反應(yīng)性為100％。將每份血清樣品一式兩份地進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)內(nèi)和試驗(yàn)間的變異系數(shù)分別為0.03％和0.2％。

藥代動(dòng)力學(xué)分析：總吸收(AUC)

使用圖形程序SigmaPlot 8.0(SPSS Science，Chicago，IL，USA)繪制在SC、IP、IM、口服或鼻內(nèi)遞送后MA-[D-Leu-4]-OB3的血清濃度與時(shí)間的關(guān)系圖。使用該程序的函數(shù)計(jì)算每條曲線下的面積(AUC)，并表示為ng/ml/min。

藥代動(dòng)力學(xué)分析：血清半衰期(t_1/2)

使用以下公式，計(jì)算MA-[D-Leu-4]OB3的血清濃度降低至IP、SC、IM、口服和鼻內(nèi)給藥后所達(dá)到的最大濃度的恰好一半時(shí)所需要的時(shí)間：

t_1/2＝0.693/k_elim

其中k_elim表示消除常數(shù)，其通過(guò)繪制吸收曲線的β相中的每個(gè)濃度點(diǎn)的自然對(duì)數(shù)隨時(shí)間的曲線而確定。這些圖中的每一個(gè)的線性回歸分析產(chǎn)生一條直線，其斜率代表每種遞送方法的k_elim。

藥代動(dòng)力學(xué)分析：血漿清除率(CL)

使用以下方程式由AUC計(jì)算IP、SC、IM、口服和鼻內(nèi)遞送后，血漿中的MA-[D-Leu-4]-OB3的清除率：

CL＝劑量/AUC

藥代動(dòng)力學(xué)：表觀分布容積(V_d)

由于藥物的半衰期與其血漿清除率負(fù)相關(guān)，并直接與其分布容積成正比，因此在ip、sc、im和鼻內(nèi)遞送后，MA-[D-Leu-4]-OB3的表觀分布容積使用以下方程式由其半衰期和清除率而計(jì)算：

t_1/2＝0.693×V_d/CL

結(jié)果

[D-Leu-4]-OB3的半衰期通常在1小時(shí)以?xún)?nèi)，并且生理學(xué)上有效的劑量為毫克級(jí)?？紤]到[D-Leu-4]-OB3在治療人類(lèi)肥胖癥和/或糖尿病方面的應(yīng)用，重要的是改善[D-Leu-4]-OB3的藥代動(dòng)力學(xué)特征，主要是延長(zhǎng)血清半衰期和/或降低最佳有效劑量。本文所呈現(xiàn)的結(jié)果表明，肉豆蔻酸與[D-Leu-4]-OB3的綴合通過(guò)以下方式顯著改善了其藥代動(dòng)力學(xué)特征：(a)將其半衰期從小于1小時(shí)延長(zhǎng)至長(zhǎng)達(dá)28小時(shí)，這取決于遞送途徑；(b)增加其吸收；(c)降低將其從血漿中清除的速率；以及(d)使最小有效劑量降低4倍。

吸收曲線

在SC、IP、IM、口服和鼻內(nèi)遞送之后，MA-[D-Leu-4]OB3的吸收曲線分別示于圖2-6中。在SC、IP和IM給予0.1mg肽之后，在2小時(shí)時(shí)(t_max)出現(xiàn)MA-[D-Leu-4]-OB3的最大吸收(C_max)，然后隨時(shí)間快速降低。在18小時(shí)后，血清中MA-[D-Leu-4]-OB3的濃度降低至接近基線的水平(圖2-4)。在口服和鼻內(nèi)給藥之后，吸收曲線與SC、IP、和IM遞送后所觀察到的吸收曲線明顯不同?？诜捅莾?nèi)給藥之后，分別在4小時(shí)和6小時(shí)時(shí)達(dá)到MA-[D-Leu-4]-OB3的C_max。然而，在口服和鼻內(nèi)給藥24小時(shí)之后，C_max分別降低31％和80％。

總攝入

MA-[D-Leu-4]-OB3的總吸收通過(guò)測(cè)量每種遞送方法的吸收曲線下的面積(AUC)來(lái)確定。該數(shù)值代表吸收進(jìn)入體循環(huán)中的肽的總吸收量或程度，或其給藥后的總吸收量。在SC、IP、IM、口服和鼻內(nèi)遞送之后，AUC值分別為1,829,225ng/ml/min、1,212,330ng/ml/min、842,374ng/ml/min、278,460ng/ml和158,426ng/ml。由這些值計(jì)算鼻內(nèi)、口服、IM、IP和SC的相對(duì)生物利用度分別為1.0、1.8、5.3、7.7和11.7。

消除常數(shù)(k_elim)和血清半衰期(t_1/2)

如材料和方法部分所描述的，計(jì)算在SC、IP、IM、口服和鼻內(nèi)遞送之后，MA-[D-Leu-4]-OB3的消除常數(shù)，它們被分別確定為-0.350、-0.155、-0.117、-0.024和-0.085。在SC、IP、IM、口服和鼻內(nèi)遞送之后，MA-[D-Leu-4]-OB3的血清半衰期分別為2.0、4.1、5.5、28.9和8.2小時(shí)。

血漿清除率(CL)和表觀分布容積(V_d)

在SC、IP、IM、口服和鼻內(nèi)給藥之后，MA-[D-Leu-4]-OB3的血漿清除率分別為0.05、0.08、0.12、0.36和0.63ml/min。在SC、IP、IM、口服和鼻內(nèi)遞送之后，MA-[D-Leu-4]OB3的表觀分布容積分別為8.6、30.9、61.3、900.8和447.0ml。這些藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)以及先前描述的[D-Leu-4]-OB3的那些藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)均歸納于下表1。

表1

在SC、IP、IM、口服和鼻內(nèi)遞送之后，[D-Leu-4]-OB3(1mg)¹和MA-[D-Leu-4]-OB3(0.1mg)的藥代動(dòng)力學(xué)特征

¹獲自先前研究的數(shù)據(jù)

²于PBS中遞送

³于0.3％DDM中遞送

在先前采用[D-Leu-4]-OB3的研究中，盡管該研究反復(fù)地論證了其對(duì)于能量平衡和葡萄糖體內(nèi)動(dòng)態(tài)平衡具有瘦素樣作用，但是不論遞送途徑如何，對(duì)于持續(xù)性反應(yīng)均需要高的濃度(毫克級(jí))和每日多次劑量。因此，改善[D-Leu-4]-OB3在人類(lèi)應(yīng)用中的藥代動(dòng)力學(xué)對(duì)本發(fā)明而言是必要的。具體地，尋求增加[D-Leu-4]-OB3的生物利用度、延長(zhǎng)其半衰期以及降低其從體循環(huán)中清除的速率。這種改善可降低所遞送的[D-Leu-4]-OB3劑量的大小和頻率，同時(shí)維持或改善其功效。

本發(fā)明的肉豆蔻酸與[D-Leu-4]-OB3的綴合為改進(jìn)[D-Leu-4]-OB3的藥代動(dòng)力學(xué)特征提供了一種有效方法。當(dāng)通過(guò)IP、SC、或IM注射遞送，或以管飼法口服遞送時(shí)，MA-[D-Leu-4]-OB3的最大吸收(C_max)明顯高于[D-Leu-4]-OB3的最大吸收(C_max)，即使是在低于[D-Leu-4]-OB3的10倍劑量時(shí)。然而，在鼻內(nèi)滴注后所觀察到的[D-Leu-4]-OB3的雙相吸收，在鼻內(nèi)遞送MA-[D-Leu-4]-OB3之后并未觀察到，這種現(xiàn)象可能與較低的給藥劑量有關(guān)。在鼻內(nèi)滴注之后，MA-[D-Leu-4]-OB3的這種吸收曲線的變化表明，達(dá)到肽最大濃度的單一吸收位點(diǎn)與[D-Leu-4]-OB3的吸收曲線中所觀察到的兩個(gè)峰相比時(shí)要晚得多，T_max分別為6h對(duì)比10和60min。

如數(shù)據(jù)表明，與[D-Leu-4]-OB3的5至60分鐘的吸收期相比，取決于給藥途徑，MA-[D-Leu-4]-OB3的吸收在2至6小時(shí)期間內(nèi)緩慢發(fā)生。這些發(fā)現(xiàn)表明與[D-Leu-4]-OB3相比，肉豆蔻酸綴合有利于更高濃度的MA-[D-Leu-4]-OB3的吸收，但吸收速率較慢。盡管這種吸收模式似乎并不能在所使用的所有遞送方法中提高M(jìn)A[D-Leu-4]-OB3的總吸收(AUC)，但是其的確延長(zhǎng)了在體循環(huán)中存在升高的肽水平的時(shí)間。

值得特別注意并且與延長(zhǎng)MA-[D-Leu-4]-OB3的生物活性直接有關(guān)的是，與[D-Leu-4]-OB3相比，其更長(zhǎng)的半衰期和更慢的血漿清除率，這在本研究中所使用的每一種遞送方法之后均可觀察到。當(dāng)與在血清中快速升高并迅速清除的[D-Leu-4]-OB3相比，這種模式可在更長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)維持MA-[D-Leu-4]-OB3的生物活性。在db/db小鼠中的口服功效研究的結(jié)果表明情況就是這樣，在所述研究中遞送了與先前所使用的[D-Leu-4]-OB3相比更低劑量的MA-[D-Leu-4]-OB3。

因此本發(fā)明的[D-Leu-4]-OB3的肉豆蔻酸綴合顯著改善了其藥代動(dòng)力學(xué)特征。所述數(shù)據(jù)也表明MA-[D-Leu-4]-OB3可用作治療人類(lèi)肥胖癥和/或糖尿病的一種口服、非侵入性的且安全的治療方法。

實(shí)施例2

研究對(duì)比了在6至7周齡雄性BKS.Cg-Dock7^m+/+Lepr^db/J糖尿病db/db小鼠中，口服遞送于PBS或0.3％十二烷基麥芽苷(DDM，)中的綴合了肉豆蔻酸的[D-Leu-4]-OB3對(duì)空腹血糖的作用。

在連續(xù)14天，每天一次通過(guò)管飼法，在晚上向雄性db/db小鼠口服給予濃度增加的于PBS或DDM中的MA-[D-Leu-4]-OB3。使用Accu-Chek Nano葡萄糖計(jì)(Roche，Indianapolis，IN)每隔一天測(cè)量空腹(8小時(shí))血糖水平。在治療14天后，接受于PBS中的MA-[D-Leu-4]-OB3(250或500mcg/天)的小鼠中的血糖水平與僅接受PBS的對(duì)照小鼠的相同。然而，在采用250mcg/天治療的小鼠中的14天治療期結(jié)束時(shí)，在以100或250mcg/天接受于0.3％DDM中的MA-[D-Leu-4]-OB3的小鼠中的血糖水平明顯降低到非糖尿病BKS小鼠中所觀察到的水平。

這些結(jié)果表明，在DDM中口服遞送濃度比我們先前采用[D-Leu-4]-OB3的研究中所使用的濃度低四倍的MA-[D-Leu-4]-OB3時(shí)，其在降低血糖方面是有效的。這些結(jié)果與藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)一致，其表明與在DDM中的[D-Leu-4]-OB3相比，于DDM中的MA-[D-Leu-4]-OB3具有增加的吸收、更慢的清除率和更長(zhǎng)的半衰期。

實(shí)施例3

一項(xiàng)證明在胰島素不足的糖尿小鼠模型中，綴合了肉豆蔻酸的[D-Leu-4]-OB3(MA-[D-Leu-4]-OB3)對(duì)體重增加和血糖控制的功效的研究。

目標(biāo)

在這些研究中，使用鏈脲霉素(STZ)-誘發(fā)的Swiss Webster小鼠，以檢查在胰島素不足的糖尿病小鼠模型中MA-[D-Leu-4]-OB3對(duì)體重增加和胰島素敏感性的作用。使用這種模型，將MA-[D-Leu-4]-OB3的胰島素致敏作用與另一種已經(jīng)充分表征的胰島素致敏藥物——二甲雙胍的作用進(jìn)行比較。

材料和方法

采用單次腹膜內(nèi)(ip)劑量的150mg/kg STZ使七周齡雄性Swiss Webster小鼠患有高血糖。在STZ處理之前，測(cè)量空腹血糖水平以確立正常(非糖尿病)葡萄糖水平，此后每天評(píng)估高血糖。在STZ治療后4-5天，空腹血糖水平通常比正常的高3至4倍。

使用地特胰島素(Novo Nordisk，Malov，Denmark)遞送筆來(lái)分配0.025U/100μl磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，并且通過(guò)每日兩次(8：00至9:00a.m.以及4:00至5:00p.m.)皮下(sc)注射遞送14天。將MA-[D-Leu-4]-OB3(NeoBiolab，Cambridge，MA)和二甲雙胍(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)分別溶解于用無(wú)菌去離子水復(fù)原的0.3％十二烷基麥芽苷(DDM，Aegis Therapeutics，San Diego，CA)中，并且通過(guò)口服管飼法、每日兩次(8：00h至9：00h以及16：00h至17：00h)分別以5mg/kg/100μl或100mg/kg/100μl的濃度遞送14天。

在第0天及之后的每一天，測(cè)量食物和水?dāng)z入量，并且在早晨8:00h至9：00h稱(chēng)量小鼠的重量。為了確保測(cè)量血糖這些天的空腹(8小時(shí))葡萄糖水平，將食物在8:00h至9:00h從籠中移出，并且在測(cè)量之后立即放回。

結(jié)果

在STZ誘發(fā)高血糖癥的雄性SW小鼠中，單獨(dú)的胰島素、或與MA-[D-Leu-4]-OB3組合、或與二甲雙胍組合對(duì)體重增加的作用示于圖9和下表2中：

表2

在STZ誘發(fā)高血糖癥的雄性Swiss Webster小鼠中，單獨(dú)的地特胰島素、或與MA-[D-Leu-4]-OB3組合、或與二甲雙胍組合對(duì)體重增加、食物和水?dāng)z入量、以及血糖水平的作用

在14天測(cè)試期結(jié)束時(shí)，單獨(dú)給予DDM的小鼠增重11.9％，而每天接受0.05U胰島素的小鼠增重16.1％。接受單獨(dú)的MA-[D-Leu-4]-OB3的小鼠只增重8.1％。當(dāng)MA-[D-Leu-4]-OB3與胰島素聯(lián)合給藥時(shí)，胰島素誘發(fā)的體重增加降低至未治療的小鼠中所觀察到的體重增加(11.9％)。當(dāng)二甲雙胍與胰島素聯(lián)合給藥時(shí)，體重增加只增加10.0％。

在STZ誘發(fā)高血糖癥的小鼠中，在缺乏或存在MA-[D-Leu-4]-OB3或二甲雙胍的情況下，胰島素對(duì)空腹血糖的作用示于圖10和表2。在14天研究期間，正常SW小鼠中的空腹血糖水平保持穩(wěn)定(150-170mg/dl)，而在STZ處理的小鼠中，接受單獨(dú)的DDM的小鼠的空腹血糖水平在500至600mg/dl范圍內(nèi)。0.05U地特胰島素使血糖水平降低64.0％，但并未降低至正常范圍。單獨(dú)的MA-[D-Leu-4]-OB3對(duì)空腹血糖水平的作用非常小。當(dāng)?shù)靥匾葝u素與MA-[D-Leu-4]-OB3或二甲雙胍聯(lián)合給藥時(shí)，0.05U地特胰島素的抗高血糖作用被放大。在兩天內(nèi)，在聯(lián)合給予MA-[D-Leu-4]-OB3與胰島素的小鼠中，空腹血糖水平幾乎達(dá)到正常，并且在整個(gè)研究過(guò)程中保持如此。未發(fā)現(xiàn)低血糖事件。當(dāng)聯(lián)合給予二甲雙胍與胰島素時(shí)，觀察到類(lèi)似的結(jié)果。然而，在6天或治療后，接受二甲雙胍的小鼠的低血糖日益嚴(yán)重。

總結(jié)

該研究的結(jié)果表明當(dāng)口服給予MA-[D-Leu-4]-OB3與皮下給予胰島素聯(lián)合時(shí)，MA-[D-Leu-4]-OB3防止與胰島素藥物療法相關(guān)的體重增加。結(jié)果還表明，在這種胰島素不足的糖尿病小鼠模型中，MA-[D-Leu-4]-OB3在防止由外源性胰島素誘發(fā)的體重增加以及提高組織對(duì)胰島素的敏感性方面，與二甲雙胍一樣好或優(yōu)于二甲雙胍。

MA-[D-Leu-4]-OB3的胰島素致敏作用進(jìn)一步得到了在該胰島素不足的小鼠模型中的觀察結(jié)果的支持，但與先前在高胰島素血癥ob/ob和db/db小鼠中采用[D-Leu-4]-OB3、以及在db/db小鼠中采用MA-[D-Leu-4]-OB3所觀察到的結(jié)果相反，單獨(dú)的MA-[D-Leu-4]-OB3不能顯著地降低空腹血糖水平。這些水平——在14天測(cè)試期結(jié)束時(shí)比在研究開(kāi)始時(shí)僅降低1.2％——證實(shí)STZ處理使內(nèi)源性胰島素的產(chǎn)生嚴(yán)重受損。

該數(shù)據(jù)反映了為了使MA-[D-Leu-4]-OB3發(fā)揮其對(duì)血糖水平的影響，其完全依賴(lài)于胰島素的存在。該結(jié)論進(jìn)一步由以下觀察結(jié)果支持：當(dāng)將MA-[D-Leu-4]-OB3(0.25mg/kg/天)與外源性胰島素聯(lián)合給藥時(shí)，MA-[D-Leu-4]-OB3能夠在該研究的前兩天內(nèi)使血糖水平正?；?。

關(guān)于該小鼠模型中MA-[D-Leu-4]-OB3對(duì)葡萄糖體內(nèi)動(dòng)態(tài)平衡的功效，值得特別注意的事實(shí)是，雖然MA-[D-Leu-4]-OB3和二甲雙胍在與外源性胰島素聯(lián)合用藥時(shí)，都能使血糖降低至正常水平以?xún)?nèi)，但是MA-[D-Leu-4]-OB3的劑量比二甲雙胍的劑量低20倍(分別為10mg/kg/天和200mg/kg/天)。該數(shù)據(jù)表明，在這種胰島素不足的小鼠模型中，以質(zhì)量計(jì)，MA-[D-Leu-4]-OB3在改善胰島素敏感性方面的有效性可能是二甲雙胍的20倍，以摩爾計(jì)，其有效性可能是二甲雙胍的6.1倍。

在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明可為藥物化合物，其包含與瘦素相關(guān)肽綴合的下述任一種化合物：環(huán)己基戊?；Ⅴ；劝滨；?、月桂酰基、2-琥珀酰氨基肉豆蔻酸、2-琥珀酰氨基乙氧基棕櫚酸、肉豆蔻酰基-α-谷氨?；?、肉豆蔻酰基-α-谷氨?；?甘氨酰基、膽?；?、7-脫氧膽?；?、石膽?；?、石膽?；?谷氨?；?-苯甲?；?苯丙氨酸、L-甲狀腺素基、辛二?；?D-甲狀腺素、3，3′，5，5′-四碘甲狀腺乙?；?、環(huán)己基戊?；Ｋ鍪菟叵嚓P(guān)肽可為下述中的一種：AVPIQKVQDDTKTLI(SEQ ID NO：2)、TKTLIKTIVTRINDI(SEQ ID NO：3)、RINDISHTQSVSAKQ(SEQ ID NO：4)、VSAKQRVTGLDFIPG(SEQ ID NO：5)、DFIPGLHPILSLSKM(SEQ ID NO：6)、SLSKMDQTLAVYQQV(SEQ ID NO：7)、VYQQVLTSLPSQNVL(SEQ ID NO：8)、SQNVLQIANDLENLR(SEQ ID NO：9)、DLLHLLAFSKSCSLP(SEQ ID NO：10)、SCSLPQTSGLQKPES(SEQ ID NO：11)、QKPESLDGVLEASLY(SEQ ID NO：12)、EASLYSTEVVALSRL(SEQ ID NO：13)、ALSRLQGSLQDILQQ(SEQ ID NO：14)或DILQQLDVSPEC(SEQ ID NO：15)。

序列表

<110> 奧爾巴尼醫(yī)學(xué)院

<120> 肉豆蔻?；氖菟叵嚓P(guān)肽及其用途

<130> 232P007A

<150> 62/035,916

<151> 2014-08-11

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 對(duì)應(yīng)于瘦素OB3區(qū)域的合成肽

<400> 1

Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr

1 5

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 對(duì)應(yīng)于瘦素OB3區(qū)域的合成肽

<400> 2

Ala Val Pro Ile Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu Ile

1 5 10 15

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 對(duì)應(yīng)于瘦素OB3區(qū)域的合成肽

<400> 3

Thr Lys Thr Leu Ile Lys Thr Ile Val Thr Arg Ile Asn Asp Ile

1 5 10 15

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 對(duì)應(yīng)于瘦素OB3區(qū)域的合成肽

<400> 4

Arg Ile Asn Asp Ile Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ala Lys Gln

1 5 10 15

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 對(duì)應(yīng)于瘦素OB3區(qū)域的合成肽

<400> 5

Val Ser Ala Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe Ile Pro Gly

1 5 10 15

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 對(duì)應(yīng)于瘦素OB3區(qū)域的合成肽

<400> 6

Asp Phe Ile Pro Gly Leu His Pro Ile Leu Ser Leu Ser Lys Met

1 5 10 15

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 對(duì)應(yīng)于瘦素OB3區(qū)域的合成肽

<400> 7

Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln Val

1 5 10 15

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 對(duì)應(yīng)于瘦素OB3區(qū)域的合成肽

<400> 8

Val Tyr Gln Gln Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu

1 5 10 15

<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 對(duì)應(yīng)于瘦素的OB3區(qū)域的合成肽

<400> 9

Ser Gln Asn Val Leu Gln Ile Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg

1 5 10 15

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 對(duì)應(yīng)于瘦素OB3區(qū)域的合成肽

<400> 10

Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro

1 5 10 15

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 對(duì)應(yīng)于瘦素OB3區(qū)域的合成肽

<400> 11

Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro Glu Ser

1 5 10 15

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 對(duì)應(yīng)于瘦素的OB3區(qū)域的合成肽

<400> 12

Gln Lys Pro Glu Ser Leu Asp Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr

1 5 10 15

<210> 13

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 對(duì)應(yīng)于瘦素OB3區(qū)域的合成肽

<400> 13

Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg Leu

1 5 10 15

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 對(duì)應(yīng)于瘦素OB3區(qū)域的合成肽

<400> 14

Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Ile Leu Gln Gln

1 5 10 15

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 對(duì)應(yīng)于瘦素OB3區(qū)域的合成肽

<400> 15

Asp Ile Leu Gln Gln Leu Asp Val Ser Pro Glu Cys

1 5 10

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 對(duì)應(yīng)于瘦素OB3區(qū)域的合成肽

<400> 16

Ser Cys His Leu Pro Trp Ala

1 5