本發(fā)明提供使用放射療法和重組減毒李斯特菌(Listeria)菌株疫苗的組合來誘導(dǎo)人和犬科動物受試者中對Her-2/neu抗原表達性腫瘤的免疫應(yīng)答以及治療該腫瘤和接種該腫瘤的疫苗的方法。
背景技術(shù)：
：Her-2/neu(下文稱為“Her-2”)是185kDa的糖蛋白，它是酪氨酸激酶的表皮生長因子受體(EGFR)家族的成員，并在所有乳腺癌的25至40％中過表達，并且也在很多骨(骨肉瘤–OSA)、卵巢、肺、胰腺、腦和胃腸道癌中過表達。過表達Her-2的癌癥患者表現(xiàn)出耐受性，即使存在可檢測的直接對Her-2的體液、CD8+T細胞和CD4+T細胞應(yīng)答。大型養(yǎng)殖狗自發(fā)發(fā)展成OSA，再現(xiàn)了人類小兒OSA的多個方面，包括組織學(xué)異質(zhì)性、侵襲性局部疾病和早期轉(zhuǎn)移。在診斷中，95％的狗患有微轉(zhuǎn)移性疾病，并且盡管進行了截肢和化療，但中值存活時間也只有10個月，大部分狗由于進行性轉(zhuǎn)移性疾病而被實施安樂死?；加修D(zhuǎn)移性骨肉瘤的人類患者的總體存活率在10-50％的范圍內(nèi)，具體取決于轉(zhuǎn)移灶的位置和數(shù)量。用于破壞腫瘤細胞或改變腫瘤/間質(zhì)結(jié)構(gòu)的放射療法(RT)是許多癌癥類型的治療方法的組成部分。然而，由于OSA對標(biāo)準(zhǔn)劑量的放療而言是耐放射的，因此其不用于治療OSA。近來，已有證據(jù)表明RT可與靶向免疫療法發(fā)揮協(xié)同作用。例如，RT引起免疫原性細胞死亡，其中腫瘤細胞隨著時間的推移因細胞凋亡、壞死和/或有絲分裂障礙而緩慢死亡，從而導(dǎo)致瀕死細胞被免疫系統(tǒng)清除。這繼而充當(dāng)腫瘤抗原的潛在來源以用于免疫療法。RT還調(diào)節(jié)細胞死亡受體、腫瘤相關(guān)抗原和粘附分子的腫瘤細胞表面表達，這使得腫瘤細胞更易受到免疫介導(dǎo)的殺傷的影響。本發(fā)明通過以下令人驚訝的發(fā)現(xiàn)滿足了患有OSA的受試者的需求：放射療法在與使用LmddA疫苗載體生成的重組李斯特菌-Her-2/neu疫苗(ADXS31-164)聯(lián)合時對骨肉瘤和肺轉(zhuǎn)移尤其有效，所述載體具有明確的減毒機制且不含抗生素選擇標(biāo)記。技術(shù)實現(xiàn)要素：在一個實施例中，本發(fā)明提供治療受試者中Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因，并且其中施用所述放射療法包括施用所述放射療法至少兩次。在另一個實施例中，本發(fā)明提供引起對受試者中Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥增強的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因，并且其中施用所述放射療法包括施用所述放射療法至少兩次。在另一個實施例中，本發(fā)明提供延長患有Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的受試者的存活期的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因，并且其中施用所述放射療法包括施用所述放射療法至少兩次。在另一個實施例中，本發(fā)明提供延遲患有Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的受試者的轉(zhuǎn)移性疾病的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因，并且其中施用所述放射療法包括施用所述放射療法至少兩次。在另一個實施例中，本發(fā)明提供破壞患有Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的受試者對Her-2/neu的耐受性的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的佐劑的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因，并且其中施用所述放射療法包括施用所述放射療法至少兩次。在一個實施例中，受試者是人。在一個實施例中，人受試者是兒童。在另一個實施例中，人受試者是成人。在另一個實施例中，受試者是犬科動物。在另一個實施例中，將所述融合多肽施用于所述受試者防止所述腫瘤內(nèi)的逃逸突變。在另一個實施例中，所述Her-2/neu嵌合抗原包含至少5、9、13、14或17個標(biāo)繪的人MHCI類表位。在另一個實施例中，所述Her-2/neu嵌合抗原包含至少5、9、13、14或17個犬科動物MHCI類表位。在一個實施例中，核酸分子整合進李斯特菌基因組。在另一個實施例中，核酸分子在所述重組李斯特菌疫苗株的質(zhì)粒中，并且質(zhì)粒在不存在抗生素選擇的情況下穩(wěn)定維持在重組李斯特菌疫苗株中。在一個實施例中，重組李斯特菌缺乏actA毒力基因。在一個實施例中，另外的多肽選自：a)非溶血LLO蛋白或N-末端片段、b)PEST序列或c)ActA片段。在一個實施例中，由所述第二開放閱讀框編碼的代謝酶是丙氨酸消旋酶或D-氨基酸轉(zhuǎn)移酶。在本發(fā)明的一些實施例中，重組減毒李斯特菌菌株為ADXS31-164。在一個實施例中，重組減毒李斯特菌菌株與獨立的佐劑一起施用，該佐劑在一個實施例中包括粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、編碼GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂草苷QS21、單磷酰脂質(zhì)A或未經(jīng)甲基化的含CpG寡核苷酸。在一個實施例中，癌癥是骨肉瘤(OSA)。在另一個實施例中，癌癥或腫瘤是肺轉(zhuǎn)移性疾病。在一個實施例中，施用包括施用所述重組減毒李斯特菌菌株至少兩次。在一個實施例中，施用所述放射療法包括施用所述放射療法至少兩次。在一個實施例中，本文提供包括放射療法和施用本文所提供的ADXS31-164的聯(lián)合療法。在一個實施例中，放射療法在施用重組減毒李斯特菌菌株之前施用。在另一個實施例中，受試者在施用所述放射療法和所述重組減毒李斯特菌菌株前未進行截肢。在另一個實施例中，該方法還包括在所述受試者中出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移后施用所述放射療法和所述重組減毒李斯特菌菌株，所述轉(zhuǎn)移在一個實施例中為肺轉(zhuǎn)移性疾病。在一個實施例中，該方法導(dǎo)致所述受試者的總體存活期延長。在另一個實施例中，該方法導(dǎo)致受試者中轉(zhuǎn)移性疾病延遲。在另一個實施例中，該方法導(dǎo)致Her-2/neu特異性T細胞應(yīng)答增強。在另一個實施例中，所述引起增強的免疫應(yīng)答導(dǎo)致所述受試者的總體存活期延長。在另一個實施例中，所述引起增強的免疫應(yīng)答導(dǎo)致受試者中轉(zhuǎn)移性疾病延遲。在一個實施例中，轉(zhuǎn)移性疾病為肺轉(zhuǎn)移性疾病。在另一個實施例中，所述引起增強的免疫應(yīng)答導(dǎo)致Her-2/neu特異性T細胞應(yīng)答增強。附圖說明被視為本發(fā)明的主題在說明書的結(jié)論部分特別指出并明確要求進行保護。然而，在結(jié)合附圖閱讀時，通過參考以下具體實施方式，可以最好地理解本發(fā)明(對組織和操作方法來說皆是如此)及其目的、特征和優(yōu)點，在附圖中：圖1.ADXS31-164的構(gòu)建。(A)pAdv164的質(zhì)粒圖譜，其具有在組成型李斯特菌p60啟動子控制下的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)dal基因，用于互補LmddA菌株的染色體dal-dat缺失。它還包含截短的LLO(1-441)與嵌合人HER2/neu基因的融合體，該融合體通過3個HER2/neu片段：EC1(aa40-170)、EC2(aa359-518)和ICI(aa679-808)的直接融合而構(gòu)建。右側(cè)的載體示意圖詳細示出，pAdv164表達由融合至截短的LLO的人HER2/neu的2個胞外域和一個胞內(nèi)域組成的嵌合HER2/neu融合蛋白。質(zhì)粒借助于dal基因的營養(yǎng)缺陷型互補而維持在重組dal/dat/actA-李斯特菌菌株(LmddA)內(nèi)(參見實例)。(B)通過對用抗LLO抗體印跡的TCA沉淀細胞培養(yǎng)上清液進行的Western印跡分析檢測了Lm-LLO-ChHer2(Lm-LLO-138)和LmddA-LLO-ChHer2(ADXS31-164)中tLLO-ChHer2的表達和分泌?！?04KD的差異條帶對應(yīng)于tLLO-ChHer2。檢測到內(nèi)源性LLO為58KD條帶。李斯特菌對照缺乏ChHer2表達。圖2.ADXS31-164的免疫原性(A)基于HER2/neu李斯特菌的疫苗在免疫小鼠的脾細胞中引起的細胞毒性T細胞應(yīng)答使用NT-2細胞作為刺激因子、3T3/neu細胞作為靶標(biāo)進行測試。Lm-對照基于在各個方面相同但表達不相關(guān)抗原(HPV16-E7)的LmddA背景。(B)免疫FVB/N小鼠的脾細胞分泌進細胞培養(yǎng)基中的IFN-在使用絲裂霉素C處理的NT-2細胞體外刺激24小時后通過ELISA測定。(C)嵌合疫苗免疫的HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細胞響應(yīng)于來自蛋白不同區(qū)域的肽的體外溫育而分泌IFN-。重組ChHer2蛋白用作陽性對照，不相關(guān)肽或無肽組構(gòu)成陰性對照，如圖例中所列出。使用72小時共溫育后收集的細胞培養(yǎng)上清液進行ELISA分析，以測定IFN-γ分泌。每個數(shù)據(jù)點為一式三份數(shù)據(jù)的平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)誤差。*P值<0.001。圖3.李斯特菌-ChHER2/neu疫苗的腫瘤預(yù)防研究使用每種重組李斯特菌-ChHer2或?qū)φ绽钏固鼐呙缱⑸銱ER2/neu轉(zhuǎn)基因小鼠六次。免疫在6周齡開始，每三周一次延續(xù)直到第21周。每周監(jiān)測腫瘤的外觀并以無腫瘤小鼠的百分比表示。*p<0.05，N＝9只每組。圖4.ADXS31-164免疫對脾臟中％Treg的作用。給FVB/N小鼠皮下接種1×106個NT-2細胞，并且使用每種疫苗以一周為間隔免疫三次。在第二次免疫后7天收集脾臟。在分離免疫細胞后，對其進行染色，以通過抗CD3、CD4、CD25和FoxP3抗體檢測Treg。來自代表性實驗的Treg的點圖示出CD25+/FoxP3+T細胞的頻率，以不同治療組之間總CD3+或CD3+CD4+T細胞的百分比表示。圖5.ADXS31-164免疫對NT-2腫瘤中％腫瘤浸潤Treg的作用。給FVB/N小鼠皮下接種1×106個NT-2細胞，并且使用每種疫苗以一周為間隔免疫三次。在第二次免疫后7天收集腫瘤。在分離免疫細胞后，對其進行染色，以通過抗CD3、CD4、CD25和FoxP3抗體檢測Treg。(A).來自代表性實驗的Treg的點圖。(B).CD25+/FoxP3+T細胞的頻率，以不同治療組之間總CD3+或CD3+CD4+T細胞的百分比(左插圖)和腫瘤內(nèi)CD8/Treg比率(右插圖)表示。數(shù)據(jù)以2個獨立實驗獲得的平均值±SEM表示。圖6.ADXS31-164疫苗接種可延緩腦中乳腺癌細胞系的生長。Balb/c小鼠使用ADXS31-164或?qū)φ绽钏固鼐呙缑庖呷?。給麻醉小鼠顱內(nèi)注射EMT6-Luc細胞(5,000個)。(A)小鼠的離體成像使用XenogenX-100CCD照相機在指定的天數(shù)進行。(B)像素強度以光子數(shù)/秒/cm2表面積繪圖；這以平均發(fā)光度表示。(C)EMT6-Luc細胞、4T1-Luc和NT-2細胞系的HER2/neu表達通過使用抗HER2/neu抗體的Western印跡檢測。鼠科動物巨噬細胞樣細胞系J774.A2細胞用作陰性對照。圖7.示出在截肢和化療后ADXS31-164接種的前18個犬科動物骨肉瘤患者。圖8.示出ADXS31-164施用不會導(dǎo)致A)擴張型心肌病的早期跡象。B)在研究過程中評估的連續(xù)心臟肌鈣蛋白I水平表明該水平對于大部分狗而言在整個研究期間保持在正常范圍內(nèi)。應(yīng)當(dāng)注意的是，心臟肌鈣蛋白I水平暫時性升高的一只狗在這些值輕度升高時具有不明顯的超聲心動圖(另見圖26D)。圖9.示出A)體溫和B)收縮壓的ADXS31-164相關(guān)變化。在基線和ADXS31-164施用后每2小時記錄體溫和收縮壓。示出每只狗每次疫苗接種時的參數(shù)。水平條表示每個劑量組、每個時間點所有狗的中值。★p<0.05，★★p<0.005圖10.示出聯(lián)合ADXS31-164和姑息性放射療法(RT)在未接受截肢和化療的原發(fā)性肢體骨肉瘤的背景下的治療計劃表。圖11.上部插圖：放射顯影照片顯示出存在與骨肉瘤相關(guān)的肱骨近端骨折，并且那些照片在使用兩塊骨板和一顆髓內(nèi)釘進行骨折固定術(shù)后獲取。下部插圖：胸部的CT掃描未顯示出入選時轉(zhuǎn)移性疾病的跡象。也在基線時和8次ADXS31-164施用后獲取放射顯影照片。這些放射顯影照片顯示無肺轉(zhuǎn)移性疾病的跡象，且存在圍繞骨折部位的骨痂，表明盡管存在骨肉瘤但骨折已愈合。圖12.前期I期臨床試驗的時間線，其評估重組表達ADXS31-164的單核細胞增多性李斯特菌(L.monocytogenes)引起患有肢體骨肉瘤的進行了截肢和后續(xù)化療的狗的治療有效性抗腫瘤免疫的安全性和功效。圖13A-B.ADXS-31-164施用后的治療相關(guān)不良事件和存活期曲線。圖13A示出治療相關(guān)不良事件。圖13B示出在試驗入選時所有狗均無轉(zhuǎn)移性疾病。對照組的狗接受了截肢，然后單獨施用卡鉑或卡鉑加上阿霉素。審查疫苗組的2只狗，因為它們死于不相關(guān)的原因(1只狗死于吸入性肺炎，另一只死于腎胚細胞瘤)。疫苗接種組：紅線；對照組：黑線。圖14.人(A)和犬科動物(B)患者的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性骨肉瘤(OSA)的放射圖像。在兩個物種中，原發(fā)性病灶的特征在于骨干骺端(A中箭頭)的增生和溶解區(qū)域。圖15.I期3+3臨床試驗的示意圖，其在患有HER2+骨肉瘤(OSA)的狗中評估ADXS31-164的安全性和功效?；加凶园l(fā)性HER2+肢體OSA的私有狗接受了護理標(biāo)準(zhǔn)截肢和隨訪卡鉑化療。在最終卡鉑劑量三周后，給狗靜脈內(nèi)接種2×108、5×108、1×109或3.3×109個CFU的ADXS31-164(相隔三周進行三次疫苗接種)。每2個月給狗進行再分期直到死亡，以確定疫苗預(yù)防轉(zhuǎn)移性疾病的功效。圖16.犬科動物原發(fā)性骨肉瘤中的HER2/neu表達。(A)狗原發(fā)性O(shè)SA的H&E染色示出惡性成骨細胞的巢和類骨質(zhì)沉積。(B)犬科動物原發(fā)性O(shè)SA的免疫組織化學(xué)評估示出HER2/neu在惡性成骨細胞中的表達。(C)5只私有狗的原發(fā)性O(shè)SA樣品的Western印跡示出HER2/neu表達是可變的。陽性對照為：MCF-7人乳腺癌細胞系和CAMAC2犬科動物乳腺癌細胞系。圖17.基線(前)和ADXS31-164施用后24小時(后)的血液指標(biāo)值。對每個劑量組內(nèi)所有狗每次疫苗接種時的前值和后值取平均值。★p<0.05，★★p<0.005。示出在ADXS31-164施用后24小時，白細胞和中性粒細胞計數(shù)(A-B)的瞬時、但統(tǒng)計學(xué)上顯著的增加，并且伴有血小板和淋巴細胞(C-D)瞬時減少。圖18.ADXS31-164誘導(dǎo)的白細胞(WBC)、中性粒細胞和單核細胞計數(shù)增加與存活期相關(guān)。WBC、中性粒細胞和單核細胞計數(shù)在基線和疫苗接種后24小時測定。在每次疫苗接種后計算增加的百分比，并且對每只狗取平均值。(A)結(jié)果根據(jù)存活(死亡或活著)顯示。(B)結(jié)果根據(jù)所接受的ADXS31-164劑量顯示。水平條表示該組的中值。圖19.示出ADXS31-164誘導(dǎo)的Her-2特異性T細胞應(yīng)答的IFN-γELISpot評估結(jié)果。圖20.示出重復(fù)“加強”疫苗接種刺激了Her-2特異性免疫。(A)示出患者289-003的結(jié)果。(B)示出患者289-004的結(jié)果。EC1、EC2和IC1表示HER2/neu多肽的肽片段。圖21.(A)轉(zhuǎn)移時間(TTM)和(B)OSA特異性存活期的KaplanMeier估計。圖22.示出ADXS31-164預(yù)防轉(zhuǎn)移性疾病的發(fā)展。(A和B)在卡鉑治療后3周(A)和第三次ADXS31-164疫苗接種后3周(B)采集的胸部放射顯影照片示出右顱側(cè)肺葉預(yù)先存在的轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)大小增加，但在其余的肺葉中轉(zhuǎn)移性疾病不會進一步發(fā)展。(C和D)在ICG施用后，肺結(jié)節(jié)的胸腔鏡檢查發(fā)現(xiàn)在近紅外光下發(fā)熒光(C)。在轉(zhuǎn)移灶切除時移除的外觀總體正常的肺組織示出在近紅外光下的熒光(插圖)(D)。(E和F)(E)肺結(jié)節(jié)和(F)發(fā)熒光正常肺組織的H&E染色組織病理學(xué)示出包裹性肺結(jié)節(jié)(E)和外觀總體正常的肺組織炎癥的局灶性區(qū)域(F)的顯著出血和壞死。(G和H)在低倍(G)和高倍(H)放大率下肺結(jié)節(jié)的免疫組織化學(xué)示出圍繞肺結(jié)節(jié)的CD3+T細胞以及腫瘤組織內(nèi)的微量CD3+T細胞。(I和J)在低倍(I)和高倍(J)放大率下外觀正常的肺組織的免疫組織化學(xué)顯示CD3+T細胞的局灶性積聚。(K)局灶性肺炎的高倍放大率H&E染色示出大異常細胞，其中有絲分裂象被淋巴細胞圍繞。(L)肺炎區(qū)域的波形蛋白染色示出大波形蛋白陽性細胞，其中突出的有絲分裂象被單核細胞圍繞。圖23.ADXS31‐164延緩/預(yù)防轉(zhuǎn)移性疾病并且延長患有自發(fā)性HER2+骨肉瘤的狗的總體存活期。示出疫苗接種狗與歷史對照組相比的Kaplan‐Meier存活期曲線。對照組由患有HER2+肢體OSA的狗、截肢處理的狗和隨訪化療但未接受ADXS31-164的狗組成。P<0.0001。疫苗接種組：紅線；對照組：黑線。圖24.示出ADXS31‐164破壞了對HER2/neu的耐受性。在基線、第3次疫苗接種后3周(9周)和2個月后(17周)收集PBMC，并通過IFN-γELISpot分析對HER2/neu的高度保守IC1域的應(yīng)答。所示的結(jié)果將狗分為早期應(yīng)答者、晚期應(yīng)答者和表觀無應(yīng)答者。NA表示這些狗的17周樣品未經(jīng)評估。圖25A-D.示出ADXS31-164未對心臟功能造成不利影響。評估每只狗的基線、疫苗接種時和其后每2個月的心臟參數(shù)LVID(舒張期)(圖25A)、LVID(收縮期)(圖25B)和縮短分數(shù)(圖25C)。在相同的時間點評估心臟肌鈣蛋白I水平(圖25D)。圖26.示出ADXS31-164破壞了對HER2/neu的高度保守胞內(nèi)域的免疫耐受性。圖27A-D.示出與ADXS31-164療法結(jié)合的放射療法在受試者386-002(圖27A)、受試者385-005(圖27B)、受試者386-003(圖27C)和受試者386-007(圖27D)中延遲原發(fā)性骨肉瘤(OSA)的進展。圖28A-C.示出在具有干擾一般活動的疼痛的受試者中(圖28A)、在具有干擾行走能力的疼痛的受試者中(圖28B)以及在具有干擾生活幸福的疼痛的受試者中(圖28C)的疼痛問卷結(jié)果。圖29A-D.示出與ADXS31-164療法結(jié)合的姑息性放射療法減少溶解、促進腫瘤合并并延長受試者存活期(圖29A-D)。在16Gy的放射(從2014年9月13日開始連續(xù)2天給予8Gy)和3劑ADXS31-164(2014年11月25日)后，遠端脛骨骨肉瘤病變的橫向(圖29A)和AP(圖29C)放射線視圖展示出明顯的皮質(zhì)骨重建和溶解減少。用16Gy的放射(從2014年7月16日開始連續(xù)2天給予8Gy)和3劑ADXS31-164(2014年10月13日)治療的遠端橈骨骨肉瘤病變的橫向(圖29B)和AP(圖29D)放射線視圖。注意，在橈骨的遠端部分中的腫脹和骨溶解明顯減少(在圖29B中將2014年10月13日的放射顯影照片與2014年7月16日的放射顯影照片進行比較)。在遠端脛骨的內(nèi)側(cè)面上骨密度增加(在圖29D中將2014年10月13日的放射顯影照片與2014年7月16日的放射顯影照片進行比較)。在圖29D中2014年10月13日的放射顯影照片上見到遠端撓骨的內(nèi)側(cè)面的骨折有微小的移置。圖30A-B.示出與ADXS31-164結(jié)合的放射療法延長了患有骨肉瘤(OSA)的狗的存活期。應(yīng)當(dāng)理解，為了闡述的簡潔和清楚，顯示在圖中的要素未必是按比率繪制的。例如，為了清楚，一些要素的尺寸可以是相對其他要素而放大的。另外，在認為適合時，附圖標(biāo)記可以在附圖之間重復(fù)，以指出對應(yīng)的或類似的要素。具體實施方式在以下具體實施方式中，陳述了多個具體細節(jié)，以提供對本發(fā)明的透徹理解。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解可在不具有這些具體細節(jié)的情況下實施本發(fā)明。在其他情況中，為避免使本發(fā)明復(fù)雜化，未對熟知的方法、工序和組分進行詳細描述。在一個實施例中，本發(fā)明提供治療受試者中的腫瘤生長或癌癥的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的腫瘤特異性抗原。在一個實施例中，本發(fā)明提供預(yù)防受試者中的腫瘤生長或癌癥的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的腫瘤特異性抗原。在一個實施例中，本發(fā)明提供引起受試者中針對腫瘤生長或癌癥增強的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的腫瘤特異性抗原。在一個實施例中，本發(fā)明提供延長患有腫瘤生長或癌癥的受試者的存活期的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的腫瘤特異性抗原。在一個實施例中，本發(fā)明提供延遲患有腫瘤生長或癌癥的受試者的轉(zhuǎn)移性疾病的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的腫瘤特異性抗原。在一個實施例中，本發(fā)明提供破壞患有腫瘤生長或癌癥的受試者對腫瘤特異性抗原的耐受性的方法，該腫瘤生長或癌癥表達所述腫瘤特異性抗原，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的腫瘤特異性抗原。在一個實施例中，腫瘤特異性抗原為Her-2/neu。在一個實施例中，本發(fā)明提供治療受試者中的Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原。在一個實施例中，本發(fā)明提供預(yù)防受試者中的Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原。在另一個實施例中，本發(fā)明提供引起受試者中針對Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥增強的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原。在另一個實施例中，本發(fā)明提供延長患有Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的受試者的存活期的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原。在另一個實施例中，本發(fā)明提供延遲患有Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的受試者中的轉(zhuǎn)移性疾病的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原。在另一個實施例中，本發(fā)明提供破壞患有Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的受試者對Her-2/neu的耐受性的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的佐劑的Her-2/neu嵌合抗原。在一個實施例中，重組減毒李斯特菌菌株還包含編碼代謝酶的第二開放閱讀框，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因。在一個實施例中，本發(fā)明提供治療受試者中Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因。在一個實施例中，本發(fā)明提供預(yù)防受試者中Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因。在另一個實施例中，本發(fā)明提供引起受試者中針對Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥增強的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因。在另一個實施例中，本發(fā)明提供延長患有Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的受試者的存活期的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因。在另一個實施例中，本發(fā)明提供延遲患有Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的受試者中的轉(zhuǎn)移性疾病的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因。在另一個實施例中，本發(fā)明提供破壞患有Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的受試者對Her-2/neu的耐受性的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的佐劑的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因。在一個實施例中，施用所述放射療法包括施用所述放射療法至少兩次。在一個實施例中，本發(fā)明提供治療受試者中Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因，并且其中施用所述放射療法包括施用所述放射療法至少兩次。在另一個實施例中，本發(fā)明提供引起對受試者中Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥增強的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因，并且其中施用所述放射療法包括施用所述放射療法至少兩次。在另一個實施例中，本發(fā)明提供延長患有Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的受試者的存活期的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因，并且其中施用所述放射療法包括施用所述放射療法至少兩次。在另一個實施例中，本發(fā)明提供延遲患有Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的受試者的轉(zhuǎn)移性疾病的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因，并且其中施用所述放射療法包括施用所述放射療法至少兩次。在另一個實施例中，本發(fā)明提供破壞患有Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的受試者對Her-2/neu的耐受性的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的佐劑的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因，并且其中施用所述放射療法包括施用所述放射療法至少兩次。在一個實施例中，受試者是人。在一個實施例中，人受試者是兒童。在另一個實施例中，人受試者是成人。在一個實施例中，本發(fā)明提供治療人類受試者中Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因。在一個實施例中，本發(fā)明提供預(yù)防人類受試者中Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因。在另一個實施例中，本發(fā)明提供引起人類受試者中針對Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥增強的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因。在另一個實施例中，本發(fā)明提供延長患有Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的人類受試者的存活期的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因。在另一個實施例中，本發(fā)明提供延遲患有Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的人類受試者中的轉(zhuǎn)移性疾病的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因。在另一個實施例中，本發(fā)明提供破壞患有Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的人類受試者對Her-2/neu的耐受性的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的佐劑的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因。在另一個實施例中，受試者是犬科動物。在一個實施例中，犬科動物是狗。在一個實施例中，本發(fā)明提供治療犬科動物受試者中Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因。在一個實施例中，本發(fā)明提供預(yù)防犬科動物受試者中Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因。在另一個實施例中，本發(fā)明提供引起犬科動物受試者中針對Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥增強的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因。在另一個實施例中，本發(fā)明提供延長患有Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的犬科動物受試者的存活期的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因。在另一個實施例中，本發(fā)明提供延遲患有Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的犬科動物受試者中的轉(zhuǎn)移性疾病的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因。在另一個實施例中，本發(fā)明提供破壞患有Her-2/neu表達性腫瘤生長或癌癥的犬科動物受試者對Her-2/neu的耐受性的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框和第二開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的佐劑的Her-2/neu嵌合抗原，該第二開放閱讀框編碼代謝酶，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因。在一個實施例中，本發(fā)明提供延遲受試者中的轉(zhuǎn)移性疾病或治療受試者中的轉(zhuǎn)移性疾病的方法。在一個實施例中，轉(zhuǎn)移性疾病為肺轉(zhuǎn)移性疾病。因此，在一個實施例中，本發(fā)明提供延遲患有腫瘤生長或癌癥的受試者中的肺轉(zhuǎn)移性疾病的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的腫瘤特異性抗原。在另一個實施例中，本發(fā)明提供治療患有腫瘤生長或癌癥的受試者中的肺轉(zhuǎn)移性疾病的方法，該方法包括施用放射療法和重組減毒李斯特菌菌株的組合的步驟，該重組減毒李斯特菌菌株包含含有第一開放閱讀框的核酸，該第一開放閱讀框編碼融合多肽，該融合多肽包含融合至另外的多肽的腫瘤特異性抗原。在一個實施例中，本文提供用于預(yù)防、治療、延長存活期、延遲轉(zhuǎn)移性疾病、破壞對Her-2/neu的耐受性、針對Her2-neu抗原表達性腫瘤進行疫苗接種、誘導(dǎo)免疫應(yīng)答、引起針對Her2-neu抗原的次優(yōu)勢表位增強的免疫應(yīng)答，同時繞開突變回避的方法。在另一個實施例中，將本發(fā)明的融合多肽施用于受試者防止所述腫瘤內(nèi)的逃逸突變。在另一個實施例中，繞開突變回避是由于表位擴展。在又一個實施例中，突變回避是由于抗原的嵌合性質(zhì)所致。在另一個實施例中，本文提供用于受權(quán)利要求書保護的方法的免疫原性組合物，該組合物包含融合多肽，其中所述融合多肽包含融合至另外的多肽的Her-2/neu嵌合抗原，并且其中將融合蛋白施用于患有Her-2/neu表達性腫瘤的受試者防止所述腫瘤內(nèi)的逃逸突變。在另一個實施例中，本文提供用于受權(quán)利要求書保護的方法的重組李斯特菌疫苗株，該疫苗株包含免疫原性組合物。在一個實施例中，重組減毒李斯特菌菌株是疫苗株。在一個實施例中，本文提及的核酸是核酸分子。在一個實施例中，用于本發(fā)明方法的重組減毒李斯特菌菌株還包含含有編碼代謝酶的第三開放閱讀框的核酸分子，并且其中該代謝酶互補在重組李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因。在另一個實施例中，本文提供包含核酸分子的重組減毒李斯特菌菌株，其中該核酸分子包含編碼多肽的第一開放閱讀框，其中該多肽包含Her-2/neu嵌合抗原，其中該核酸分子還包含第二和第三開放閱讀框，第二和第三開放閱讀框各編碼代謝酶，并且其中該代謝酶互補在所述重組李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因。在一個實施例中，核酸分子整合進李斯特菌基因組。在另一個實施例中，核酸分子在重組李斯特菌疫苗株的質(zhì)粒中。在又一個實施例中，質(zhì)粒在不存在抗生素選擇的情況下穩(wěn)定維持在重組李斯特菌疫苗株中。在另一個實施例中，該質(zhì)粒不賦予重組李斯特菌抗生素抗性。在另一個實施例中，重組李斯特菌菌株是減毒的。在另一個實施例中，重組李斯特菌是減毒營養(yǎng)缺陷型菌株。在另一個實施例中，外源抗原表達對細菌諸如本發(fā)明的一種細菌施加的高代謝負擔(dān)也是減毒的重要機制。在一個實施例中，減毒菌株是LmddA。在另一個實施例中，該菌株發(fā)揮強烈的佐劑效應(yīng)，這是基于李斯特菌的疫苗的固有特性。該佐劑效應(yīng)的一個表現(xiàn)是表達除人嵌合Her-2/neu之外的抗原的李斯特菌或ADXS-31-164(表達人嵌合Her-2/neu)疫苗導(dǎo)致的腫瘤內(nèi)Treg數(shù)量下降5倍(參見本文的圖5)。在另一個實施例中，表達不同抗原(HPV16E7)的LmddA載體還與腫瘤中Treg的頻率顯著下降相關(guān)，很可能是由于先天免疫應(yīng)答的結(jié)果。在另一個實施例中，LmddA載體表達前列腺特異性抗原(PSA)、人乳頭瘤病毒(HPV)抗原(E6、E7)。在另一個實施例中，HPV菌株為HPV16、HPV18或本領(lǐng)域已知的任何菌株。在一個實施例中，減毒營養(yǎng)缺陷型李斯特菌疫苗株是ADXS-31-164菌株。ADXADXS-31-164基于李斯特菌疫苗載體，該載體由于毒力基因actA的缺失而減毒，并且由于dal基因的互補而維持用于Her-2/neu的體內(nèi)和體外表達的質(zhì)粒。在一個實施例中，ADXS31-164表達和分泌融合至李斯特菌溶血素O(LLO)的前441個氨基酸的嵌合Her-2/neu蛋白。在另一個實施例中，ADXS31-164發(fā)揮強烈的和抗原特異性的抗腫瘤應(yīng)答，在轉(zhuǎn)基因動物中能夠破壞對Her-2/neu的耐受性(參見實例)。在另一個實施例中，ADXS31-164菌株是高度減毒的，并且具有比前代李斯特菌疫苗更高的安全譜，因為它能更迅速地從免疫小鼠的脾臟清除。在另一個實施例中，ADXS31-164使轉(zhuǎn)基因動物中的腫瘤發(fā)病延緩期比Lm-LLO-ChHer2(該疫苗的抗生素抗性和毒性更強的形式)更長(參見圖3)。在一個實施例中，Lm-LLO-ChHer2菌株為Lm-LLO-138。在另一個實施例中，ADXS31-164菌株具有高度免疫原性，能夠破壞對Her-2/neu自體抗原的耐受性，并且防止Her-2/neu轉(zhuǎn)基因動物中的腫瘤形成。在另一個實施例中，ADXS31-164使腫瘤內(nèi)調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)顯著減少。在另一個實施例中，LmddA疫苗處理的腫瘤中Treg頻率的下降使腫瘤內(nèi)CD8/Treg比率升高，暗示在LmddA疫苗免疫后可獲得更有利的腫瘤微環(huán)境。在另一個實施例中，該嵌合抗原的使用不產(chǎn)生逃逸突變，表明腫瘤的突變不會遠離對使用該新型抗原進行治療的治療有效應(yīng)答(參見實例6)。在另一個實施例中，ADXS31-164的外周免疫延緩了腦中轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞系的生長(參見實例7)。在另一個實施例中，與未接受ADXS31-164疫苗接種的對照受試者相比，將包括截肢、化療和ADXS31-164疫苗接種的治療提供給患有骨肉瘤犬科動物受試者延長了存活期(參見實例9和10)。在另一個實施例中，與未接受ADXS31-164疫苗接種的對照受試者相比，將包括截肢、化療和ADXS31-164疫苗接種的治療提供給患有骨肉瘤的犬科動物受試者顯示出轉(zhuǎn)移減少(參見實例10)。在另一個實施例中，與未接受ADXS31-164疫苗接種的對照受試者相比，將包括截肢、化療和ADXS31-164疫苗接種的治療提供給患有骨肉瘤的犬科動物受試者顯示出所誘導(dǎo)的特異性T細胞應(yīng)答增強(參見實例10)。在另一個實施例中，與僅接受放射療法或僅接受ADXS31-164疫苗接種的對照受試者相比，患有骨肉瘤并接受放射療法然后用ADXS31-164進行疫苗接種的犬科動物受試者延長了存活期(參見實例11)。在另一個實施例中，與僅接受放射療法或僅接受ADXS31-164疫苗接種的對照受試者相比，患有骨肉瘤并接受放射療法然后用ADXS31-164進行疫苗接種的犬科動物受試者顯示出轉(zhuǎn)移減少(參見實例11)。在另一個實施例中，術(shù)語“ADXS31-164”、“Lm-人嵌合Her-2/neu”、“Lm-huHer2-neu”和“Lm-hucHer-2/neu”在本文可互換使用。在一個實施例中，骨肉瘤細胞不易被放射殺死，因此放射療法很少用于治療骨肉瘤。在一個實施例中，將重組減毒的表達嵌合抗原的無抗生素李斯特菌用于預(yù)防和治療癌癥或?qū)嶓w腫瘤，如本文所舉例說明。在另一個實施例中，腫瘤是Her-2/neu陽性腫瘤。在另一個實施例中，癌癥是Her-2/neu表達性癌癥。在另一個實施例中，癌癥是乳腺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)癌癥、頭頸癌、骨肉瘤(OSA)、犬科動物OSA、尤因氏肉瘤(ES)或本領(lǐng)域已知的任何Her-2/neu表達性癌癥。在另一個實施例中，犬科動物骨肉瘤是肢體骨肉瘤。在另一個實施例中，腫瘤是骨肉瘤、乳腺腫瘤、頭頸部腫瘤或本領(lǐng)域已知的任何其他抗原表達性腫瘤。在另一個實施例中，所述癌癥或?qū)嶓w腫瘤是復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性疾病的結(jié)果。在一個實施例中，轉(zhuǎn)移性疾病為肺轉(zhuǎn)移性疾病。在一個實施例中，本發(fā)明提供治療、預(yù)防或延遲轉(zhuǎn)移的方法。在一個實施例中，本發(fā)明提供治療、預(yù)防或延遲OSA轉(zhuǎn)移的方法。在一個實施例中，轉(zhuǎn)移在肺中。在另一個實施例中，轉(zhuǎn)移在另一組織中。在另一個實施例中，轉(zhuǎn)移在骨中，在一個實施例中該轉(zhuǎn)移在初始OSA部位的近側(cè)，在另一個實施例中該轉(zhuǎn)移在初始OSA部位的遠側(cè)。在另一個實施例中，轉(zhuǎn)移在腎中。在另一個實施例中，轉(zhuǎn)移在心臟中。在另一個實施例中，轉(zhuǎn)移為孤立的。在另一個實施例中，轉(zhuǎn)移為孤立的局部復(fù)發(fā)。在另一個實施例中，轉(zhuǎn)移為多部位轉(zhuǎn)移。在另一個實施例中，表達嵌合Her-2/neu的重組李斯特菌可用作治療Her-2/neu過表達實體腫瘤的治療性疫苗。在另一個實施例中，本文提供的Her-2/neu嵌合抗原可用于治療Her-2/neu表達性腫瘤和防止該腫瘤的逃逸突變。在另一個實施例中，術(shù)語“逃逸突變”是指遠離對治療的治療有效應(yīng)答的腫瘤突變。在一個實施例中，本文提供了包含編碼本文提供的重組多肽的第一開放閱讀框的核酸分子，其中核酸分子駐留在重組李斯特菌疫苗株內(nèi)。在另一個實施例中，將本文提供的核酸分子用于轉(zhuǎn)化李斯特菌，以獲得重組李斯特菌。在另一個實施例中，本文提供的核酸缺乏毒力基因。在另一個實施例中，整合進李斯特菌基因組的核酸分子攜帶無功能的毒力基因。在另一個實施例中，毒力基因在重組李斯特菌的基因組中是突變的。在又一個實施例中，該核酸分子用于使李斯特菌基因組中存在的內(nèi)源性基因失活。在又一個實施例中，毒力基因是actA基因。在另一個實施例中，毒力基因是prfA基因。在另一個實施例中，毒力基因是inlB基因。技術(shù)人員將會理解，毒力基因可以是本領(lǐng)域已知的與重組李斯特菌中的毒性相關(guān)的任何基因。在一個實施例中，代謝基因、毒力基因或兩者在李斯特菌菌株的染色體中缺乏。在另一個實施例中，代謝基因、毒力基因或兩者在李斯特菌菌株的染色體以及任何游離型遺傳元件中缺乏。技術(shù)人員將會理解，術(shù)語“游離體”、“游離體的”等是指不整合進本文提供的李斯特菌的染色體中的質(zhì)粒載體或其用途。在另一個實施例中，該術(shù)語是指整合進本文提供的李斯特菌的染色體中的質(zhì)粒載體。在另一個實施例中，代謝基因、毒力基因或兩者在李斯特菌菌株的基因組中缺乏。在一個實施例中，代謝基因、毒力基因或兩者在染色體中突變。在一個實施例中，代謝基因、毒力基因或兩者從染色體中缺失。在一個實施例中，代謝基因、毒力基因或兩者在染色體中失活。在另一個實施例中，本文提供的核酸和質(zhì)粒不賦予重組李斯特菌抗生素抗性?！昂怂岱肿印痹谝粋€實施例中是指質(zhì)粒。在另一個實施例中，該術(shù)語是指整合載體。在另一個實施例中，該術(shù)語是指非整合載體。在另一個實施例中，該術(shù)語是指包含整合載體的質(zhì)粒。在另一個實施例中，整合載體是位點特異性整合載體。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法和組合物的核酸分子由本領(lǐng)域已知的任何類型的核苷酸構(gòu)成。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例?！按x酶”在另一個實施例中是指參與宿主細菌所需的營養(yǎng)物的合成的酶。在另一個實施例中，該術(shù)語是指宿主細菌所需的營養(yǎng)物的合成所需的酶。在另一個實施例中，該術(shù)語是指參與宿主細菌所利用的營養(yǎng)物的合成的酶。在另一個實施例中，該術(shù)語是指參與宿主細菌持續(xù)生長所需的營養(yǎng)物的合成的酶。在另一個實施例中，該酶為營養(yǎng)物的合成所需。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，“穩(wěn)定保持”指核酸分子或質(zhì)粒在沒有選擇(例如抗生素選擇)的情況下保持10代，而沒有可檢測的損失。在另一個實施例中，該周期為15代。在另一個實施例中，該周期為20代。在另一個實施例中，該周期為25代。在另一個實施例中，該周期為30代。在另一個實施例中，該周期為40代。在另一個實施例中，該周期為50代。在另一個實施例中，該周期為60代。在另一個實施例中，該周期為80代。在另一個實施例中，該周期為100代。在另一個實施例中，該周期為150代。在另一個實施例中，該周期為200代。在另一個實施例中，該周期為300代。在另一個實施例中，該周期為500代。在另一個實施例中，該周期為500代以上。在另一個實施例中，該核酸分子或質(zhì)粒在體外(例如培養(yǎng)物中)穩(wěn)定保持。在另一個實施例中，該核酸分子或質(zhì)粒在體內(nèi)穩(wěn)定保持。在另一個實施例中，該核酸分子或質(zhì)粒在體外和體內(nèi)都穩(wěn)定保持。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在一個實施例中，本發(fā)明提供表達該抗原的重組李斯特菌菌株。本發(fā)明還提供包含融合至Her-2嵌合蛋白或其片段的李斯特菌溶血素(LLO)蛋白片段的重組多肽，包含該重組多肽的疫苗和免疫原性組合物，以及誘導(dǎo)抗Her-2免疫應(yīng)答和治療Her-2表達性腫瘤及接種包含該重組多肽的疫苗的方法。在另一個實施例中，本發(fā)明的重組李斯特菌菌株已在動物宿主中傳代。在另一個實施例中，該傳代讓該菌株作為疫苗載體的效能最佳化。在另一個實施例中，該傳代穩(wěn)定李斯特菌菌株的免疫原性。在另一個實施例中，該傳代穩(wěn)定李斯特菌菌株的毒力。在另一個實施例中，該傳代增強李斯特菌菌株的免疫原性。在另一個實施例中，該傳代增強李斯特菌菌株的毒力。在另一個實施例中，該傳代除去李斯特菌菌株的不穩(wěn)定亞株。在另一個實施例中，該傳代降低李斯特菌菌株的不穩(wěn)定亞株的普遍性。在另一個實施例中，李斯特菌菌株包含編碼含抗原重組肽的基因的基因組插入。在另一個實施例中，李斯特菌菌株攜帶包含編碼含抗原重組肽的基因的質(zhì)粒。在另一個實施例中，該傳代通過本領(lǐng)域已知的任何其他方法進行。在一個實施例中，本文提供的多肽為融合蛋白，該融合蛋白包含另外的多肽，該另外的多肽選自：a)非溶血LLO蛋白或N-末端片段、b)PEST序列或c)ActA片段，另外其中所述另外的多肽融合至Her-2/neu嵌合抗原。在另一個實施例中，另外的多肽是有功能的。在另一個實施例中，另外的多肽的片段具有免疫原性。在另一個實施例中，另外的多肽具有免疫原性。在另一個實施例中，本文提供的多肽為融合蛋白，該融合蛋白包含融合至Her-2/neu嵌合抗原的非溶血LLO蛋白或N-末端片段。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法和組合物的融合蛋白包含來自李斯特菌生物體的ActA序列。在一個實施例中，ActA蛋白及其片段以類似于LLO的方式增強抗原呈遞和免疫。在本發(fā)明的方法和組合物的一個實施例中，融合蛋白包含Her-2/neu抗原和另外的多肽。在另一個實施例中，融合至Her-2/neu抗原的該另外的多肽稱為另外的佐劑多肽。在一個實施例中，另外的多肽是非溶血LLO蛋白或其片段(本文的實例)。在另一個實施例中，另外的多肽是PEST序列。在另一個實施例中，另外的多肽是ActA蛋白或其片段。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法和組合物的另外的多肽是李斯特菌溶血素(LLO)肽。在另一個實施例中，另外的多肽是ActA肽。在另一個實施例中，另外的多肽是PEST序列肽。在另一個實施例中，另外的多肽是能夠增強抗原肽的免疫原性的任何其他肽。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。包含Her-2/neu嵌合抗原的融合蛋白可通過任何合適的方法制備，包括例如克隆和適當(dāng)序列的限制或通過下文討論的方法直接化學(xué)合成?；蛘?，可克隆子序列并使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖懈钸m當(dāng)?shù)淖有蛄?。然后可連接片段以制備所需的DNA序列。在一個實施例中，編碼所述抗原的DNA可使用DNA擴增法例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)制備。首先，在天然DNA片段的新末端的任一側(cè)單獨擴增。一個擴增的序列的5'末端編碼肽接頭，而另一個擴增的序列的3'末端也編碼肽接頭。由于第一片段的5'末端與第二片段的3'末端互補，兩個片段(在部分純化后，如在LMP瓊脂糖上)可在第三PCR反應(yīng)中用作重疊模板。擴增的序列將包含密碼子、開口位點羧基側(cè)上的片段(現(xiàn)在形成氨基序列)、接頭和開口位點氨基側(cè)上的序列(現(xiàn)在形成羧基序列)。將抗原連接至質(zhì)粒。每種方法代表了本發(fā)明的獨立實施例。本發(fā)明的結(jié)果表明，本發(fā)明的組合物的施用可用于誘導(dǎo)識別和殺死腫瘤細胞的抗原特異性T細胞(如，細胞毒性T細胞)的形成(本文的實例)。在一個實施例中，本發(fā)明提供包含融合至Her-2嵌合蛋白或融合至其片段的LLO蛋白的N-末端片段的重組多肽。在一個實施例中，本發(fā)明提供由融合至Her-2嵌合蛋白或融合至其片段的LLO蛋白的N-末端片段組成的重組多肽。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法和組合物的Her-2嵌合蛋白是人Her-2嵌合蛋白。在另一個實施例中，Her-2嵌合蛋白是小鼠Her-2嵌合蛋白。在另一個實施例中，Her-2嵌合蛋白是大鼠Her-2嵌合蛋白。在另一個實施例中，Her-2嵌合蛋白是靈長類Her-2嵌合蛋白。在另一個實施例中，Her-2嵌合蛋白是犬科動物Her-2嵌合蛋白。在另一個實施例中，Her-2蛋白是本領(lǐng)域已知的人或任何其他動物物種的Her-2嵌合蛋白或它們的組合。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，Her-2蛋白是稱為“Her-2/neu”、“Erbb2”、“v-erb-b2”、“c-erb-b2”、“neu”或“cNeu”的蛋白。在另一個實施例中，術(shù)語Her2/neu或其語法等同形式在本文也稱為“Her-2”、“Her-2蛋白”、“HER2蛋白”或“HER2”。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在一個實施例中，Her2-neu嵌合蛋白具有Her-2/neu抗原的兩個胞外片段和一個胞內(nèi)片段，該抗原示出癌基因的MHCI類表位簇，而在另一個實施例中，嵌合蛋白具有3個H2Dq和至少17個Her-2/neu抗原的標(biāo)繪的人MHCI類表位(片段EC1、EC2和IC1)(參見圖1A)。在另一個實施例中，嵌合蛋白具有至少13個標(biāo)繪的人MHCI類表位(片段EC2和IC1)。在另一個實施例中，嵌合蛋白具有至少14個標(biāo)繪的人MHCI類表位(片段EC1和IC1)。在另一個實施例中，嵌合蛋白具有至少9個標(biāo)繪的人MHCI類表位(片段EC1和IC2)。在另一個實施例中，Her2-neu嵌合蛋白融合至非溶血李斯特菌溶血素O(LLO)。在另一個實施例中，Her2-neu嵌合蛋白融合至截短的李斯特菌溶血素O(tLLO)。在另一個實施例中，Her2-neu嵌合蛋白融合至單核細胞增多性李斯特菌李斯特菌溶血素O(LLO)蛋白的前441個氨基酸，并且由單核細胞增多性李斯特菌減毒營養(yǎng)缺陷型菌株LmddA表達和分泌。在另一個實施例中，來自本文提供的減毒營養(yǎng)缺陷型菌株(表達嵌合Her-2/neu抗原/LLO融合蛋白)的融合蛋白tLLO-ChHer2的表達和分泌與體外生長8小時后TCA沉淀細胞培養(yǎng)上清液中Lm-LLO-ChHer2的表達和分泌相當(dāng)(參見圖1B)。在一個實施例中，在未暴露的動物(animal)或不相關(guān)李斯特菌疫苗注射的小鼠中未檢測到CTL活性(參見圖2A)。而在另一個實施例中，本文提供的減毒營養(yǎng)缺陷型菌株(ADXS31-164)能夠通過野生型FVB/N小鼠的脾細胞刺激IFN-γ的分泌(圖2B)。在另一個實施例中，本文提供的方法和組合物的代謝酶是氨基酸代謝酶，而在另一個實施例中，代謝酶是丙氨酸消旋酶。在另一個實施例中，代謝酶是D-氨基酸轉(zhuǎn)移酶。在另一個實施例中，代謝酶催化用于重組李斯特菌菌株中的細胞壁合成的氨基酸的形成，而在另一個實施例中，代謝酶是丙氨酸消旋酶。在另一個實施例中，編碼該代謝酶的基因在李斯特菌p60啟動子的控制下表達。在另一個實施例中，使用inlA(編碼內(nèi)化素)啟動子。在另一個實施例中，使用hly啟動子。在另一個實施例中，使用ActA啟動子。在另一個實施例中，整合酶基因在任何其他革蘭氏陽性啟動子的控制下表達。在另一個實施例中，編碼代謝酶的基因在李斯特菌中發(fā)揮功能的任何其他啟動子的控制下表達。技術(shù)人員將會知道，其他啟動子或多順反子表達盒可用于驅(qū)動基因的表達。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，Her-2嵌合蛋白由以下SEQIDNO:1示出的核酸序列編碼gagacccacctggacatgctccgccacctctaccagggctgccaggtggtgcagggaaacctggaactcacctacctgcccaccaatgccagcctgtccttcctgcaggatatccaggaggtgcagggctacgtgctcatcgctcacaaccaagtgaggcaggtcccactgcagaggctgcggattgtgcgaggcacccagctctttgaggacaactatgccctggccgtgctagacaatggagacccgctgaacaataccacccctgtcacaggggcctccccaggaggcctgcgggagctgcagcttcgaagcctcacagagatcttgaaaggaggggtcttgatccagcggaacccccagctctgctaccaggacacgattttgtggaagaatatccaggagtttgctggctgcaagaagatctttgggagcctggcatttctgccggagagctttgatggggacccagcctccaacactgccccgctccagccagagcagctccaagtgtttgagactctggaagagatcacaggttacctatacatctcagcatggccggacagcctgcctgacctcagcgtcttccagaacctgcaagtaatccggggacgaattctgcacaatggcgcctactcgctgaccctgcaagggctgggcatcagctggctggggctgcgctcactgagggaactgggcagtggactggccctcatccaccataacacccacctctgcttcgtgcacacggtgccctgggaccagctctttcggaacccgcaccaagctctgctccacactgccaaccggccagaggacgagtgtgtgggcgagggcctggcctgccaccagctgtgcgcccgagggcagcagaagatccggaagtacacgatgcggagactgctgcaggaaacggagctggtggagccgctgacacctagcggagcgatgcccaaccaggcgcagatgcggatcctgaaagagacggagctgaggaaggtgaaggtgcttggatctggcgcttttggcacagtctacaagggcatctggatccctgatggggagaatgtgaaaattccagtggccatcaaagtgttgagggaaaacacatcccccaaagccaacaaagaaatcttagacgaagcatacgtgatggctggtgtgggctccccatatgtctcccgccttctgggcatctgcctgacatccacggtgcagctggtgacacagcttatgccctatggctgcctcttagactaa(SEQIDNO:1)。在另一個實施例中，Her-2嵌合蛋白具有以下序列：ETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKNIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGQQKIRKYTMRRLLQETELVEPLTPSGAMPNQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLD(SEQIDNO:2)。下表1分別示出人和犬科動物Her-2EC和IC片段的氨基酸序列之間的百分比(％)同一性。表1在另一個實施例中，編碼人Her-2/neuEC1片段的氨基酸序列在(SEQIDNO:69)：SLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCK(SEQIDNO:69)中示出。在另一個實施例中，編碼犬科動物Her-2/neuEC1片段的氨基酸序列在(SEQIDNO:70)：SLSFLQDIQEVQGYVLIAHSQVRQIPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLEGGIPAPGAAPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRSPQLCHQDTILWKDVFHKNNQLALTLIDTNRSRACPPCSPACK(SEQIDNO:70)中示出。在另一個實施例中，編碼人Her-2/neuEC2片段的氨基酸序列在(SEQIDNO:71)：TAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGS(SEQIDNO:71)中示出。在另一個實施例中，編碼犬科動物Her-2/neuEC2片段的氨基酸序列在(SEQIDNO:72)：TAPLQPEQLRVFEALEEITGYLYISAWPDSLPNLSVFQNLRVIRGRVLHDGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGS(SEQIDNO:72)中示出。在另一個實施例中，編碼人Her-2/neuIC1片段的氨基酸序列在(SEQIDNO:73)：NQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYLED(SEQIDNO:73)中示出。在另一個實施例中，編碼犬科動物Her-2/neuIC1片段的氨基酸序列在(SEQIDNO:74)：NQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYLED(SEQIDNO:74)中示出。在一個實施例中，Her-2EC1片段(SEQIDNO:69)的人氨基酸序列具有與犬科動物Her-2EC1片段(SEQIDNO:70)89％的同一性。在另一個實施例中，Her-2EC2片段(SEQIDNO:71)的人氨基酸序列具有與犬科動物Her-2EC2片段(SEQIDNO:72)93％的同一性。在另一個實施例中，Her-2IC1片段(SEQIDNO:73)的人氨基酸序列具有與犬科動物Her-2IC1片段(SEQIDNO:74)98％的同一性。在一個實施例中，本文提供的方法和組合物的Her2嵌合蛋白或其片段不包括其信號序列。在另一個實施例中，由于信號序列的高疏水性，信號序列的省去使Her2片段能夠在李斯特菌中成功表達。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法和組合物的Her2嵌合蛋白的片段不包括其跨膜域(TM)。在一個實施例中，由于TM的高疏水性，TM的省去使Her2片段能夠在李斯特菌中成功表達。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在一個實施例中，大鼠Her-2/neu基因的核酸序列為CCGGAATCGCGGGCACCCAAGTGTGTACCGGCACAGACATGAAGTTGCGGCTCCCTGCCAGTCCTGAGACCCACCTGGACATGCTCCGCCACCTGTACCAGGGCTGTCAGGTAGTGCAGGGCAACTTGGAGCTTACCTACGTGCCTGCCAATGCCAGCCTCTCATTCCTGCAGGACATCCAGGAAGTTCAGGGTTACATGCTCATCGCTCACAACCAGGTGAAGCGCGTCCCACTGCAAAGGCTGCGCATCGTGAGAGGGACCCAGCTCTTTGAGGACAAGTATGCCCTGGCTGTGCTAGACAACCGAGATCCTCAGGACAATGTCGCCGCCTCCACCCCAGGCAGAACCCCAGAGGGGCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGTCTCACAGAGATCCTGAAGGGAGGAGTTTTGATCCGTGGGAACCCTCAGCTCTGCTACCAGGACATGGTTTTGTGGAAGGACGTCTTCCGCAAGAATAACCAACTGGCTCCTGTCGATATAGACACCAATCGTTCCCGGGCCTGTCCACCTTGTGCCCCCGCCTGCAAAGACAATCACTGTTGGGGTGAGAGTCCGGAAGACTGTCAGATCTTGACTGGCACCATCTGTACCAGTGGTTGTGCCCGGTGCAAGGGCCGGCTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCCGCAGGCTGCACGGGCCCCAAGCATTCTGACTGCCTGGCCTGCCTCCACTTCAATCATAGTGGTATCTGTGAGCTGCACTGCCCAGCCCTCGTCACCTACAACACAGACACCTTTGAGTCCATGCACAACCCTGAGGGTCGCTACACCTTTGGTGCCAGCTGCGTGACCACCTGCCCCTACAACTACCTGTCTACGGAAGTGGGATCCTGCACTCTGGTGTGTCCCCCGAATAACCAAGAGGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCTCGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGACAATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAGAGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTGTTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCTCCGTGACCTCAGTGTCTTCCAGAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGCGCGTACTCATTGACACTGCAAGGCCTGGGGATCCACTCGCTGGGGCTGCGCTCACTGCGGGAGCTGGGCAGTGGATTGGCTCTGATTCACCGCAACGCCCATCTCTGCTTTGTACACACTGTACCTTGGGACCAGCTCTTCCGGAACCCACATCAGGCCCTGCTCCACAGTGGGAACCGGCCGGAAGAGGATTGTGGTCTCGAGGGCTTGGTCTGTAACTCACTGTGTGCCCACGGGCACTGCTGGGGGCCAGGGCCCACCCAGTGTGTCAACTGCAGTCATTTCCTTCGGGGCCAGGAGTGTGTGGAGGAGTGCCGAGTATGGAAGGGGCTCCCCCGGGAGTATGTGAGTGACAAGCGCTGTCTGCCGTGTCACCCCGAGTGTCAGCCTCAAAACAGCTCAGAGACCTGCTTTGGATCGGAGGCTGATCAGTGTGCAGCCTGCGCCCACTACAAGGACTCGTCCTCCTGTGTGGCTCGCTGCCCCAGTGGTGTGAAACCGGACCTCTCCTACATGCCCATCTGGAAGTACCCGGATGAGGAGGGCATATGCCAGCCGTGCCCCATCAACTGCACCCACTCCTGTGTGGATCTGGATGAACGAGGCTGCCCAGCAGAGCAGAGAGCCAGCCCGGTGACATTCATCATTGCAACTGTAGTGGGCGTCCTGCTGTTCCTGATCTTAGTGGTGGTCGTTGGAATCCTAATCAAACGAAGGAGACAGAAGATCCGGAAGTATACGATGCGTAGGCTGCTGCAGGAAACTGAGTTAGTGGAGCCGCTGACGCCCAGCGGAGCAATGCCCAACCAGGCTCAGATGCGGATCCTAAAAGAGACGGAGCTAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGATCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACATCTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTCCGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCCAGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGCGGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCAAGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAGATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCACCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGGCCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAACGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTTGGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTTCACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTTGGGCCCATCCAGCCCCATGGACAGTACCTTCTACCGTTCACTGCTGGAAGATGATGACATGGGTGACCTGGTAGACGCTGAAGAGTATCTGGTGCCCCAGCAGGGATTCTTCTCCCCGGACCCTACCCCAGGCACTGGGAGCACAGCCCATAGAAGGCACCGCAGCTCGTCCACCAGGAGTGGAGGTGGTGAGCTGACACTGGGCCTGGAGCCCTCGGAAGAAGGGCCCCCCAGATCTCCACTGGCTCCCTCGGAAGGGGCTGGCTCCGATGTGTTTGATGGTGACCTGGCAATGGGGGTAACCAAAGGGCTGCAGAGCCTCTCTCCACATGACCTCAGCCCTCTACAGCGGTACAGCGAGGACCCCACATTACCTCTGCCCCCCGAGACTGATGGCTATGTTGCTCCCCTGGCCTGCAGCCCCCAGCCCGAGTATGTGAACCAATCAGAGGTTCAGCCTCAGCCTCCTTTAACCCCAGAGGGTCCTCTGCCTCCTGTCCGGCCTGCTGGTGCTACTCTAGAAAGACCCAAGACTCTCTCTCCTGGGAAGAATGGGGTTGTCAAAGACGTTTTTGCCTTCGGGGGTGCTGTGGAGAACCCTGAATACTTAGTACCGAGAGAAGGCACTGCCTCTCCGCCCCACCCTTCTCCTGCCTTCAGCCCAGCCTTTGACAACCTCTATTACTGGGACCAGAACTCATCGGAGCAGGGGCCTCCACCAAGTAACTTTGAAGGGACCCCCACTGCAGAGAACCCTGAGTACCTAGGCCTGGATGTACCTGTA(SEQIDNO:45)。在一個實施例中，編碼大鼠Her-2/neuEC1片段的核酸序列為CCCAGGCAGAACCCCAGAGGGGCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGTCTCACAGAGATCCTGAAGGGAGGAGTTTTGATCCGTGGGAACCCTCAGCTCTGCTACCAGGACATGGTTTTGTGGAAGGACGTCTTCCGCAAGAATAACCAACTGGCTCCTGTCGATATAGACACCAATCGTTCCCGGGCCTGTCCACCTTGTGCCCCCGCCTGCAAAGACAATCACTGTTGGGGTGAGAGTCCGGAAGACTGTCAGATCTTGACTGGCACCATCTGTACCAGTGGTTGTGCCCGGTGCAAGGGCCGGCTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCCGCAGGCTGCACGGGCCCCAAGCA(SEQIDNO:46)。在另一個實施例中，編碼大鼠Her-2/neuEC2片段的核酸序列為：GGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCTCGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGACAATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAGAGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTGTTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCTCCGTGACCTCAGTGTCTTCCAGAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGCGCGTACTCATTGACACTGCAAGGCCTGGGGATCCACTCGCTGGGGCTGCGCTCACTGCGGGAGCTGGGCAGTGGATTGGCTCTGATTCACCGCAACGCCCATCTCTGCTTTGTACACACTGTACCTTGGGACCAGCTCTTCCGGAACCCACATCAGGCCCTGCTCCACAGTGGGAACCGGCCGGAAGAGGATTGTGGTCTCGAGGGCTTGGTCTGTAACTCACTGTGTGCCCACGGGCACTGCTGGGGGCCAGGGCCCACCCA(SEQIDNO:47)。在另一個實施例中，編碼大鼠Her-2/neuIC1片段的核酸序列為：CGCCCAGCGGAGCAATGCCCAACCAGGCTCAGATGCGGATCCTAAAAGAGACGGAGCTAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGATCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACATCTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTCCGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCCAGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGCGGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCAAGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAGATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCACCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGGCCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAACGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTTGGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTTCACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTTGGGCCCATCCAGCCCCATGGACAGTACCTTCTACCGTTCACTGCTGGAA(SEQIDNO:48)。在一個實施例中，人Her-2/neu基因的核酸序列為：ATGGAGCTGGCGGCCTTGTGCCGCTGGGGGCTCCTCCTCGCCCTCTTGCCCCCCGGAGCCGCGAGCACCCAAGTGTGCACCGGCACAGACATGAAGCTGCGGCTCCCTGCCAGTCCCGAGACCCACCTGGACATGCTCCGCCACCTCTACCAGGGCTGCCAGGTGGTGCAGGGAAACCTGGAACTCACCTACCTGCCCACCAATGCCAGCCTGTCCTTCCTGCAGGATATCCAGGAGGTGCAGGGCTACGTGCTCATCGCTCACAACCAAGTGAGGCAGGTCCCACTGCAGAGGCTGCGGATTGTGCGAGGCACCCAGCTCTTTGAGGACAACTATGCCCTGGCCGTGCTAGACAATGGAGACCCGCTGAACAATACCACCCCTGTCACAGGGGCCTCCCCAGGAGGCCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGCCTCACAGAGATCTTGAAAGGAGGGGTCTTGATCCAGCGGAACCCCCAGCTCTGCTACCAGGACACGATTTTGTGGAAGGACATCTTCCACAAGAACAACCAGCTGGCTCTCACACTGATAGACACCAACCGCTCTCGGGCCTGCCACCCCTGTTCTCCGATGTGTAAGGGCTCCCGCTGCTGGGGAGAGAGTTCTGAGGATTGTCAGAGCCTGACGCGCACTGTCTGTGCCGGTGGCTGTGCCCGCTGCAAGGGGCCACTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCTGCCGGCTGCACGGGCCCCAAGCACTCTGACTGCCTGGCCTGCCTCCACTTCAACCACAGTGGCATCTGTGAGCTGCACTGCCCAGCCCTGGTCACCTACAACACAGACACGTTTGAGTCCATGCCCAATCCCGAGGGCCGGTATACATTCGGCGCCAGCTGTGTGACTGCCTGTCCCTACAACTACCTTTCTACGGACGTGGGATCCTGCACCCTCGTCTGCCCCCTGCACAACCAAGAGGTGACAGCAGAGGATGGAACACAGCGGTGTGAGAAGTGCAGCAAGCCCTGTGCCCGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACTTGCGAGAGGTGAGGGCAGTTACCAGTGCCAATATCCAGGAGTTTGCTGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTCTGCCGGAGAGCTTTGATGGGGACCCAGCCTCCAACACTGCCCCGCTCCAGCCAGAGCAGCTCCAAGTGTTTGAGACTCTGGAAGAGATCACAGGTTACCTATACATCTCAGCATGGCCGGACAGCCTGCCTGACCTCAGCGTCTTCCAGAACCTGCAAGTAATCCGGGGACGAATTCTGCACAATGGCGCCTACTCGCTGACCCTGCAAGGGCTGGGCATCAGCTGGCTGGGGCTGCGCTCACTGAGGGAACTGGGCAGTGGACTGGCCCTCATCCACCATAACACCCACCTCTGCTTCGTGCACACGGTGCCCTGGGACCAGCTCTTTCGGAACCCGCACCAAGCTCTGCTCCACACTGCCAACCGGCCAGAGGACGAGTGTGTGGGCGAGGGCCTGGCCTGCCACCAGCTGTGCGCCCGAGGGCACTGCTGGGGTCCAGGGCCCACCCAGTGTGTCAACTGCAGCCAGTTCCTTCGGGGCCAGGAGTGCGTGGAGGAATGCCGAGTACTGCAGGGGCTCCCCAGGGAGTATGTGAATGCCAGGCACTGTTTGCCGTGCCACCCTGAGTGTCAGCCCCAGAATGGCTCAGTGACCTGTTTTGGACCGGAGGCTGACCAGTGTGTGGCCTGTGCCCACTATAAGGACCCTCCCTTCTGCGTGGCCCGCTGCCCCAGCGGTGTGAAACCTGACCTCTCCTACATGCCCATCTGGAAGTTTCCAGATGAGGAGGGCGCATGCCAGCCTTGCCCCATCAACTGCACCCACTCCTGTGTGGACCTGGATGACAAGGGCTGCCCCGCCGAGCAGAGAGCCAGCCCTCTGACGTCCATCGTCTCTGCGGTGGTTGGCATTCTGCTGGTCGTGGTCTTGGGGGTGGTCTTTGGGATCCTCATCAAGCGACGGCAGCAGAAGATCCGGAAGTACACGATGCGGAGACTGCTGCAGGAAACGGAGCTGGTGGAGCCGCTGACACCTAGCGGAGCGATGCCCAACCAGGCGCAGATGCGGATCCTGAAAGAGACGGAGCTGAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCTGGCGCTTTTGGCACAGTCTACAAGGGCATCTGGATCCCTGATGGGGAGAATGTGAAAATTCCAGTGGCCATCAAAGTGTTGAGGGAAAACACATCCCCCAAAGCCAACAAAGAAATCTTAGACGAAGCATACGTGATGGCTGGTGTGGGCTCCCCATATGTCTCCCGCCTTCTGGGCATCTGCCTGACATCCACGGTGCAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTATGGCTGCCTCTTAGACCATGTCCGGGAAAACCGCGGACGCCTGGGCTCCCAGGACCTGCTGAACTGGTGTATGCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGATGTGCGGCTCGTACACAGGGACTTGGCCGCTCGGAACGTGCTGGTCAAGAGTCCCAACCATGTCAAAATTACAGACTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGACGAGACAGAGTACCATGCAGATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAGTGGATGGCGCTGGAGTCCATTCTCCGCCGGCGGTTCACCCACCAGAGTGATGTGTGGAGTTATGGTGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGGCCAAACCTTACGATGGGATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGACCTGCTGGAAAAGGGGGAGCGGCTGCCCCAGCCCCCCATCTGCACCATTGATGTCTACATGATCATGGTCAAATGTTGGATGATTGACTCTGAATGTCGGCCAAGATTCCGGGAGTTGGTGTCTGAATTCTCCCGCATGGCCAGGGACCCCCAGCGCTTTGTGGTCATCCAGAATGAGGACTTGGGCCCAGCCAGTCCCTTGGACAGCACCTTCTACCGCTCACTGCTGGAGGACGATGACATGGGGGACCTGGTGGATGCTGAGGAGTATCTGGTACCCCAGCAGGGCTTCTTCTGTCCAGACCCTGCCCCGGGCGCTGGGGGCATGGTCCACCACAGGCACCGCAGCTCATCTACCAGGAGTGGCGGTGGGGACCTGACACTAGGGCTGGAGCCCTCTGAAGAGGAGGCCCCCAGGTCTCCACTGGCACCCTCCGAAGGGGCTGGCTCCGATGTATTTGATGGTGACCTGGGAATGGGGGCAGCCAAGGGGCTGCAAAGCCTCCCCACACATGACCCCAGCCCTCTACAGCGGTACAGTGAGGACCCCACAGTACCCCTGCCCTCTGAGACTGATGGCTACGTTGCCCCCCTGACCTGCAGCCCCCAGCCTGAATATGTGAACCAGCCAGATGTTCGGCCCCAGCCCCCTTCGCCCCGAGAGGGCCCTCTGCCTGCTGCCCGACCTGCTGGTGCCACTCTGGAAAGGGCCAAGACTCTCTCCCCAGGGAAGAATGGGGTCGTCAAAGACGTTTTTGCCTTTGGGGGTGCCGTGGAGAACCCCGAGTACTTGACACCCCAGGGAGGAGCTGCCCCTCAGCCCCACCCTCCTCCTGCCTTCAGCCCAGCCTTCGACAACCTCTATTACTGGGACCAGGACCCACCAGAGCGGGGGGCTCCACCCAGCACCTTCAAAGGGACACCTACGGCAGAGAACCCAGAGTACCTGGGTCTGGACGTGCCAGTGTGAACCAGAAGGCCAAGTCCGCAGAAGCCCTGA(SEQIDNO:49)。在另一個實施例中，以嵌合體實施的編碼人Her-2/neuEC1片段的核酸序列跨越人EC1區(qū)域的120-510bp，并在(SEQIDNO:50)中示出。GAGACCCACCTGGACATGCTCCGCCACCTCTACCAGGGCTGCCAGGTGGTGCAGGGAAACCTGGAACTCACCTACCTGCCCACCAATGCCAGCCTGTCCTTCCTGCAGGATATCCAGGAGGTGCAGGGCTACGTGCTCATCGCTCACAACCAAGTGAGGCAGGTCCCACTGCAGAGGCTGCGGATTGTGCGAGGCACCCAGCTCTTTGAGGACAACTATGCCCTGGCCGTGCTAGACAATGGAGACCCGCTGAACAATACCACCCCTGTCACAGGGGCCTCCCCAGGAGGCCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGCCTCACAGAGATCTTGAAAGGAGGGGTCTTGATCCAGCGGAACCCCCAGCTCTGCTACCAGGACACGATTTTGTGGAAG(SEQIDNO:50)。在一個實施例中，完整的EC1人Her-2/neu片段跨越人Her-2/neu基因的58-979bp，并在(SEQIDNO:54)中示出。GCCGCGAGCACCCAAGTGTGCACCGGCACAGACATGAAGCTGCGGCTCCCTGCCAGTCCCGAGACCCACCTGGACATGCTCCGCCACCTCTACCAGGGCTGCCAGGTGGTGCAGGGAAACCTGGAACTCACCTACCTGCCCACCAATGCCAGCCTGTCCTTCCTGCAGGATATCCAGGAGGTGCAGGGCTACGTGCTCATCGCTCACAACCAAGTGAGGCAGGTCCCACTGCAGAGGCTGCGGATTGTGCGAGGCACCCAGCTCTTTGAGGACAACTATGCCCTGGCCGTGCTAGACAATGGAGACCCGCTGAACAATACCACCCCTGTCACAGGGGCCTCCCCAGGAGGCCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGCCTCACAGAGATCTTGAAAGGAGGGGTCTTGATCCAGCGGAACCCCCAGCTCTGCTACCAGGACACGATTTTGTGGAAGGACATCTTCCACAAGAACAACCAGCTGGCTCTCACACTGATAGACACCAACCGCTCTCGGGCCTGCCACCCCTGTTCTCCGATGTGTAAGGGCTCCCGCTGCTGGGGAGAGAGTTCTGAGGATTGTCAGAGCCTGACGCGCACTGTCTGTGCCGGTGGCTGTGCCCGCTGCAAGGGGCCACTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCTGCCGGCTGCACGGGCCCCAAGCACTCTGACTGCCTGGCCTGCCTCCACTTCAACCACAGTGGCATCTGTGAGCTGCACTGCCCAGCCCTGGTCACCTACAACACAGACACGTTTGAGTCCATGCCCAATCCCGAGGGCCGGTATACATTCGGCGCCAGCTGTGTGACTGCCTGTCCCTACAACTACCTTTCTACGGACGTGGGATCCTGCACCCTCGTCTGCCCCCTGCACAACCAAGAGGTGACAGCAGAGGAT(SEQIDNO:54)。在另一個實施例中，以嵌合體實施的編碼人Her-2EC2片段的核酸序列跨越人Her-2/neuEC2片段的1077-1554bp，并且包括50bp延伸，且在(SEQIDNO:51)中示出。AATATCCAGGAGTTTGCTGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTCTGCCGGAGAGCTTTGATGGGGACCCAGCCTCCAACACTGCCCCGCTCCAGCCAGAGCAGCTCCAAGTGTTTGAGACTCTGGAAGAGATCACAGGTTACCTATACATCTCAGCATGGCCGGACAGCCTGCCTGACCTCAGCGTCTTCCAGAACCTGCAAGTAATCCGGGGACGAATTCTGCACAATGGCGCCTACTCGCTGACCCTGCAAGGGCTGGGCATCAGCTGGCTGGGGCTGCGCTCACTGAGGGAACTGGGCAGTGGACTGGCCCTCATCCACCATAACACCCACCTCTGCTTCGTGCACACGGTGCCCTGGGACCAGCTCTTTCGGAACCCGCACCAAGCTCTGCTCCACACTGCCAACCGGCCAGAGGACGAGTGTGTGGGCGAGGGCCTGGCCTGCCACCAGCTGTGCGCCCGAGGG(SEQIDNO:51)。在一個實施例中，完整的EC2人Her-2/neu片段跨越人Her-2/neu基因的907-1504bp，并在(SEQIDNO:55)中示出。TACCTTTCTACGGACGTGGGATCCTGCACCCTCGTCTGCCCCCTGCACAACCAAGAGGTGACAGCAGAGGATGGAACACAGCGGTGTGAGAAGTGCAGCAAGCCCTGTGCCCGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACTTGCGAGAGGTGAGGGCAGTTACCAGTGCCAATATCCAGGAGTTTGCTGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTCTGCCGGAGAGCTTTGATGGGGACCCAGCCTCCAACACTGCCCCGCTCCAGCCAGAGCAGCTCCAAGTGTTTGAGACTCTGGAAGAGATCACAGGTTACCTATACATCTCAGCATGGCCGGACAGCCTGCCTGACCTCAGCGTCTTCCAGAACCTGCAAGTAATCCGGGGACGAATTCTGCACAATGGCGCCTACTCGCTGACCCTGCAAGGGCTGGGCATCAGCTGGCTGGGGCTGCGCTCACTGAGGGAACTGGGCAGTGGACTGGCCCTCATCCACCATAACACCCACCTCTGCTTCGTGCACACGGTGCCCTGGGACCAGCTCTTTCGGAACCCGCACCAAGCTCTGCTCCACACTGCCAACCGGCCAGAG(SEQIDNO:55)。在另一個實施例中，以嵌合體實施的編碼人Her-2/neuIC1片段的核酸序列以(SEQIDNO:52)示出。CAGCAGAAGATCCGGAAGTACACGATGCGGAGACTGCTGCAGGAAACGGAGCTGGTGGAGCCGCTGACACCTAGCGGAGCGATGCCCAACCAGGCGCAGATGCGGATCCTGAAAGAGACGGAGCTGAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCTGGCGCTTTTGGCACAGTCTACAAGGGCATCTGGATCCCTGATGGGGAGAATGTGAAAATTCCAGTGGCCATCAAAGTGTTGAGGGAAAACACATCCCCCAAAGCCAACAAAGAAATCTTAGACGAAGCATACGTGATGGCTGGTGTGGGCTCCCCATATGTCTCCCGCCTTCTGGGCATCTGCCTGACATCCACGGTGCAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTATGGCTGCCTCTTAGACT(SEQIDNO:52)。在另一個實施例中，編碼完整的人Her-2/neuIC1片段的核酸序列跨越人Her-2/neu基因的2034-3243，并在(SEQIDNO:56)中示出。CAGCAGAAGATCCGGAAGTACACGATGCGGAGACTGCTGCAGGAAACGGAGCTGGTGGAGCCGCTGACACCTAGCGGAGCGATGCCCAACCAGGCGCAGATGCGGATCCTGAAAGAGACGGAGCTGAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCTGGCGCTTTTGGCACAGTCTACAAGGGCATCTGGATCCCTGATGGGGAGAATGTGAAAATTCCAGTGGCCATCAAAGTGTTGAGGGAAAACACATCCCCCAAAGCCAACAAAGAAATCTTAGACGAAGCATACGTGATGGCTGGTGTGGGCTCCCCATATGTCTCCCGCCTTCTGGGCATCTGCCTGACATCCACGGTGCAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTATGGCTGCCTCTTAGACCATGTCCGGGAAAACCGCGGACGCCTGGGCTCCCAGGACCTGCTGAACTGGTGTATGCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGATGTGCGGCTCGTACACAGGGACTTGGCCGCTCGGAACGTGCTGGTCAAGAGTCCCAACCATGTCAAAATTACAGACTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGACGAGACAGAGTACCATGCAGATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAGTGGATGGCGCTGGAGTCCATTCTCCGCCGGCGGTTCACCCACCAGAGTGATGTGTGGAGTTATGGTGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGGCCAAACCTTACGATGGGATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGACCTGCTGGAAAAGGGGGAGCGGCTGCCCCAGCCCCCCATCTGCACCATTGATGTCTACATGATCATGGTCAAATGTTGGATGATTGACTCTGAATGTCGGCCAAGATTCCGGGAGTTGGTGTCTGAATTCTCCCGCATGGCCAGGGACCCCCAGCGCTTTGTGGTCATCCAGAATGAGGACTTGGGCCCAGCCAGTCCCTTGGACAGCACCTTCTACCGCTCACTGCTGGAGGACGATGACATGGGGGACCTGGTGGATGCTGAGGAGTATCTGGTACCCCAGCAGGGCTTCTTCTGTCCAGACCCTGCCCCGGGCGCTGGGGGCATGGTCCACCACAGGCACCGCAGCTCATCTACCAGGAGTGGCGGTGGGGACCTGACACTAGGGCTGGAGCCCTCTGAAGAGGAGGCCCCCAGGTCTCCACTGGCACCCTCCGAAGGGGCT(SEQIDNO:56)。在一個實施例中，用于本文提供的方法和組合物的LLO是李斯特菌LLO。在一個實施例中，LLO來自的李斯特菌是單核細胞增多性李斯特菌(LM)。在另一個實施例中，李斯特菌是伊萬諾夫李斯特菌(Listeriaivanovii)。在另一個實施例中，李斯特菌是威耳遜李斯特菌。在另一個實施例中，李斯特菌是西爾李斯特菌。在另一個實施例中，LLO蛋白是非李斯特菌LLO蛋白。在另一個實施例中，LLO蛋白是合成LLO蛋白。在另一個實施例中，它是重組LLO蛋白。在一個實施例中，LLO蛋白由以下(SEQIDNO:3)示出的核酸序列編碼atgaaaaaaataatgctagtttttattacacttatattagttagtctaccaattgcgcaacaaactgaagcaaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccatggcaccaccagcatctccgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacggagatgcagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgttgtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgcaatttcgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaatcaaccagatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggtatgactaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgccactaaatcaaacgttaacaacgcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttatccaaatgtaagtgcaaaaattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttggtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagtgaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgttaatgaacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaagcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgtcaagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgatgctgccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaattcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccaggagttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattatgat(SEQIDNO:3)。在另一個實施例中，LLO蛋白包含序列SEQIDNO:4MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDKYIQGLDYNKNNVLVYHGDAVTNVPPRKGYKDGNEYIVVEKKKKSINQNNADIQVVNAISSLTYPGALVKANSELVENQPDVLPVKRDSLTLSIDLPGMTNQDNKIVVKNATKSNVNNAVNTLVERWNEKYAQAYPNVSAKIDYDDEMAYSESQLIAKFGTAFKAVNNSLNVNFGAISEGKMQEEVISFKQIYYNVNVNEPTRPSRFFGKAVTKEQLQALGVNAENPPAYISSVAYGRQVYLKLSTNSHSTKVKAAFDAAVSGKSVSGDVELTNIIKNSSFKAVIYGGSAKDEVQIIDGNLGDLRDILKKGATFNRETPGVPIAYTTNFLKDNELAVIKNNSEYIETTSKAYTDGKINIDHSGGYVAQFNISWDEVNYD(SEQIDNO:4)對應(yīng)于該序列的前蛋白的前25個氨基酸為信號序列，并且在細菌分泌時從LLO切割。因此，在本實施例中，全長的活性LLO蛋白為504個殘基長。在另一個實施例中，LLO蛋白具有GenBank登錄號DQ054588、DQ054589、AY878649、U25452或U25452示出的序列。在另一個實施例中，LLO蛋白是LLO蛋白的變體。在另一個實施例中，LLO蛋白是LLO蛋白的同源物。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，“截短的LLO”或“tLLO”是指包含PEST域的LLO片段。在另一個實施例中，該術(shù)語是指不包含氨基末端的活化域并且不包含胱氨酸484的LLO片段。在另一個實施例中，LLO片段由PEST序列組成。在另一個實施例中，LLO片段包含PEST序列。在另一個實施例中，LLO片段由529個氨基酸全長LLO蛋白的約前400至441個氨基酸組成。在另一個實施例中，該LLO片段為LLO蛋白的非溶血形式。在本發(fā)明的方法和組合物的另一個實施例中，由本發(fā)明的方法和組合物的核酸序列編碼的多肽是包含嵌合Her-2/neu抗原和另外的多肽的融合蛋白，其中在另一個實施例中，該融合蛋白尤其包含單核細胞增多性李斯特菌非溶血LLO蛋白(本文的實例)。在一個實施例中，LLO片段由大約殘基1-25組成。在另一個實施例中，該LLO片段由大約殘基1-50構(gòu)成。在另一個實施例中，該LLO片段由大約殘基1-75構(gòu)成。在另一個實施例中，該LLO片段由大約殘基1-100構(gòu)成。在另一個實施例中，該LLO片段由大約殘基1-125構(gòu)成。在另一個實施例中，該LLO片段由大約殘基1-150構(gòu)成。在另一個實施例中，該LLO片段由大約殘基1-175構(gòu)成。在另一個實施例中，該LLO片段由大約殘基1-200構(gòu)成。在另一個實施例中，該LLO片段由大約殘基1-225構(gòu)成。在另一個實施例中，該LLO片段由大約殘基1-250構(gòu)成。在另一個實施例中，該LLO片段由大約殘基1-275構(gòu)成。在另一個實施例中，該LLO片段由大約殘基1-300構(gòu)成。在另一個實施例中，該LLO片段由大約殘基1-325構(gòu)成。在另一個實施例中，該LLO片段由大約殘基1-350構(gòu)成。在另一個實施例中，該LLO片段由大約殘基1-375構(gòu)成。在另一個實施例中，該LLO片段由大約殘基1-400構(gòu)成。在另一個實施例中，該LLO片段由大約殘基1-425構(gòu)成。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法和組合物的融合蛋白包含來自LLO蛋白或來自另一種生物體如原核生物體的PEST序列。PEST氨基酸序列在另一個實施例中具有選自SEQIDNO:5-9的序列。在另一個實施例中，PEST序列是單核細胞增多性李斯特菌ActA蛋白的PEST序列。在另一個實施例中，PEST序列為KTEEQPSEVNTGPR(SEQIDNO:5)、KASVTDTSEGDLDSSMQSADESTPQPLK(SEQIDNO:6)、KNEEVNASDFPPPPTDEELR(SEQIDNO:7)或RGGIPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR(SEQIDNO:8)。在另一個實施例中，PEST序列來自鏈球菌屬(Streptococcussp)的鏈球菌溶血素O蛋白。在另一個實施例中，PEST序列來自釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的鏈球菌溶血素O，例如氨基酸35-51處的KQNTASTETTTTNEQPK(SEQIDNO:9).在另一個實施例中，PEST序列來自類馬鏈球菌(Streptococcusequisimilis)的鏈球菌溶血素O，例如氨基酸38-54處的KQNTANTETTTTNEQPK(SEQIDNO:10)。在另一個實施例中，PEST序列為源自原核生物體的另一PEST氨基酸序列。在另一個實施例中，PEST序列是本領(lǐng)域已知的任何其他PEST序列。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在一個實施例中，抗原融合至單核細胞增多性李斯特菌的PEST序列增強了抗原的細胞介導(dǎo)免疫和抗腫瘤免疫。因此，抗原融合至來源于其他原核生物體的其他PEST序列也將增強抗原的免疫原性?？筛鶕?jù)諸如由例如Rechsteiner和Rogers(1996,TrendsBiochem.Sci.21:267-271)針對單核細胞增多性李斯特菌所述的方法來鑒定其他原核生物體的PEST序列?；蛘?，來自其他原核生物體的PEST氨基酸序列也可基于這種方法來鑒定。可預(yù)期其中PEST氨基酸序列的其他原核生物體包括但不限于其他的李斯特菌菌種。在另一個實施例中，PEST序列嵌入抗原蛋白內(nèi)。因此，在另一個實施例中，“融合”是指既包含抗原也包含連接至抗原的一端或嵌入抗原內(nèi)的PEST氨基酸序列的抗原蛋白。在另一個實施例中，本文提供了包含本發(fā)明的重組多肽的疫苗。在另一個實施例中，本文提供了由本發(fā)明的重組多肽組成的疫苗。在另一個實施例中，本文提供了編碼本發(fā)明的重組多肽的核苷酸分子。在另一個實施例中，本文提供了包含核苷酸分子的疫苗。在另一個實施例中，本文提供了編碼本發(fā)明的重組多肽的核苷酸分子。在另一個實施例中，本文提供了本發(fā)明的核苷酸分子編碼的重組多肽。在另一個實施例中，本文提供了包含本發(fā)明的核苷酸分子或重組多肽的疫苗。在另一個實施例中，本文提供了包含本發(fā)明的核苷酸分子或重組多肽的免疫原性組合物。在另一個實施例中，本文提供了包含本發(fā)明的核苷酸分子或重組多肽的載體。在另一個實施例中，本文提供了包含本發(fā)明的核苷酸分子的李斯特菌的重組形式。在另一個實施例中，本文提供了包含本發(fā)明的李斯特菌的重組形式的疫苗。在另一個實施例中，本文提供了本發(fā)明的李斯特菌的重組形式的培養(yǎng)物。在一個實施例中，用于本發(fā)明的方法的疫苗或組合物包含本文所述的任何形式或?qū)嵤├闹亟M單核細胞增多性李斯特菌。在一個實施例中，用于本發(fā)明的疫苗或組合物由本文所述的任何形式或?qū)嵤├谋景l(fā)明的重組單核細胞增多性李斯特菌組成。在另一個實施例中，用于本發(fā)明的方法的疫苗或組合物基本上由本文所述的任何形式或?qū)嵤├谋景l(fā)明的重組單核細胞增多性李斯特菌組成。在一個實施例中，術(shù)語“包含”是指疫苗或組合物中包含重組單核細胞增多性李斯特菌，以及包括可為本領(lǐng)域已知的其他疫苗、組合物或處理。在另一個實施例中，術(shù)語“基本上由...組成”是指功能組分為重組單核細胞增多性李斯特菌的疫苗，然而可包括不直接涉及疫苗的治療效果的其他疫苗組分，并且可以例如指有利于重組單核細胞增多性李斯特菌的效果(如，穩(wěn)定、維持等)的組分。在另一個實施例中，術(shù)語“組成”是指包含重組單核細胞增多性李斯特菌的疫苗。在另一個實施例中，本文提供了阻礙或延緩來源于受試者的HER2表達性腫瘤的轉(zhuǎn)移性疾病的方法，其中并且在另一個實施例中，該方法包括將包含本文所述的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者的步驟。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法包括施用本文所述的任何形式或?qū)嵤├闹亟M單核細胞增多性李斯特菌的步驟。在一個實施例中，本發(fā)明的方法由施用本文所述的任何形式或?qū)嵤├谋景l(fā)明的重組單核細胞增多性李斯特菌的步驟組成。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法基本上由施用本文所述的任何形式或?qū)嵤├谋景l(fā)明的重組單核細胞增多性李斯特菌的步驟組成。在一個實施例中，術(shù)語“包括”是指方法包括施用重組單核細胞增多性李斯特菌的步驟，以及包括可為本領(lǐng)域已知的其他方法或處理。在另一個實施例中，術(shù)語“基本上由...組成”是指功能組成部分為施用重組單核細胞增多性李斯特菌的方法，然而可包括不直接涉及方法的治療效果的其他方法步驟，并且可以例如指有利于重組單核細胞增多性李斯特菌的施用效果的步驟。在一個實施例中，術(shù)語“組成”是指無另外的步驟的施用重組單核細胞增多性李斯特菌的方法。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法和組合物的李斯特菌是單核細胞增多性李斯特菌。在另一個實施例中，李斯特菌是伊萬諾夫李斯特菌(Listeriaivanovii)。在另一個實施例中，李斯特菌是威耳遜李斯特菌。在另一個實施例中，李斯特菌是西爾李斯特菌。每種類型的李斯特菌表示本發(fā)明的單獨實施例。在一個實施例中，本發(fā)明的方法和組合物的李斯特菌菌株是ADXS31-164菌株。在另一個實施例中，ADXS31-164刺激野生型FVB/N小鼠的脾細胞分泌IFN-γ。另外，本文提供的數(shù)據(jù)顯示，ADXS31-164能夠引起對位于靶抗原的不同域的人表位的抗Her-2/neu特異性免疫應(yīng)答。在另一個實施例中，本發(fā)明提供包含編碼Her-2嵌合蛋白或其片段的核苷酸分子的李斯特菌的重組形式。在一個實施例中，融合蛋白的兩個分子(LLO、ActA片段或PEST序列和抗原)直接連接。在另一個實施例中，兩個分子通過由一個或多個氨基酸組成的短間隔肽連接。在一個實施例中，間隔肽除連接蛋白或維持一定的最小距離或它們之間的其他空間關(guān)系之外無特定生物學(xué)活性。在另一個實施例中，選擇間隔肽的組成氨基酸以影響分子的一些性質(zhì)，諸如折疊、凈電荷或疏水性。在另一個實施例中，兩個蛋白分子(LLO片段和抗原)是單獨合成的或不融合的。在另一個實施例中，兩個蛋白分子從相同的核酸單獨合成。在又一個實施例中，兩個分子從單獨的核酸各自合成。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在一個實施例中，編碼本文提供的重組多肽的核酸還編碼信號肽或序列。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法和組合物的融合蛋白包含來自LLO的LLO信號序列。在一個實施例中，異源抗原可通過使用信號序列諸如李斯特菌信號序列例如溶血素信號序列或actA信號序列表達?；蛘?，例如，外源基因可在單核細胞增多性李斯特菌啟動子下游表達，而不形成融合蛋白。在另一個實施例中，信號肽是細菌的(李斯特菌的或非李斯特菌的)。在一個實施例中，信號肽是細菌天然的。在另一個實施例中，信號肽是細菌外源的。在另一個實施例中，信號肽是單核細胞增多性李斯特菌的信號肽，諸如secA1信號肽。在另一個實施例中，信號肽是乳乳球菌(Lactococcuslactis)的Usp45信號肽或炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)的保護抗原信號肽。在另一個實施例中，信號肽是secA2信號肽，例如單核細胞增多性李斯特菌的p60信號肽。此外，重組核酸分子任選地包含編碼p60或其片段的第三多核苷酸序列。在另一個實施例中，信號肽是Tat信號肽，諸如枯草芽孢桿菌Tat信號肽(如，PhoD)。在一個實施例中，信號肽在編碼重組多肽的相同翻譯閱讀框中。在另一個實施例中，本文提供了誘導(dǎo)受試者的抗Her-2免疫應(yīng)答的方法，該方法包括將編碼包含融合至Her-2嵌合蛋白或融合至其片段的LLO蛋白的N-末端片段的重組多肽的重組核苷酸施用于受試者，從而誘導(dǎo)受試者的抗Her-2免疫應(yīng)答。在一個實施例中，本文提供了引起受試者的對Her-2/neu表達性腫瘤的增強免疫應(yīng)答的方法，而在另一個實施例中，該方法包括將包含本文提供的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者。在另一個實施例中，對Her-2表達性腫瘤的免疫應(yīng)答包括對Her-2蛋白的次優(yōu)勢表位的免疫應(yīng)答。在另一個實施例中，對Her-2表達性腫瘤的免疫應(yīng)答包括對Her-2蛋白的多個次優(yōu)勢表位的免疫應(yīng)答。在另一個實施例中，對Her-2表達性腫瘤的免疫應(yīng)答包括對Her-2蛋白的至少1-5個次優(yōu)勢表位的免疫應(yīng)答。在另一個實施例中，對Her-2表達性腫瘤的免疫應(yīng)答包括對Her-2蛋白的至少1-10個次優(yōu)勢表位的免疫應(yīng)答。在另一個實施例中，對Her-2表達性腫瘤的免疫應(yīng)答包括對Her-2蛋白的至少1-17個次優(yōu)勢表位的免疫應(yīng)答。在另一個實施例中，對Her-2表達性腫瘤的免疫應(yīng)答包括對Her-2蛋白的至少17個次優(yōu)勢表位的免疫應(yīng)答。據(jù)報告，當(dāng)基于小片段李斯特菌的疫苗或曲妥單抗(針對位于Her-2/neu抗原的胞外域的表位的單克隆抗體)靶向這些腫瘤時，致癌蛋白Her-2/neu的點突變或氨基酸缺失介導(dǎo)了耐藥腫瘤細胞的治療。本文描述了基于嵌合Her-2/neu的組合物，該組合物具有Her-2/neu抗原的兩個胞外片段和一個胞內(nèi)片段，該抗原示出癌基因的MHCI類表位簇。該嵌合蛋白具有3個H2Dq和至少17個Her-2/neu抗原的標(biāo)繪的人MHCI類表位，并且融合至單核細胞增多性李斯特菌李斯特菌溶血素O蛋白的前441個氨基酸，由單核細胞增多性李斯特菌減毒菌株LmddA表達和分泌。前述報告示出，當(dāng)使用分別表達和分泌Her-2/neu抗原的小片段的基于李斯特菌的疫苗(每種疫苗僅具有Her-2/neu癌基因的一個H2Dq表位)免疫Her-2/neu轉(zhuǎn)基因小鼠時，由于每種疫苗靶向的Her-2/neu抗原的那些表位的突變，Her-2/neu過表達性腫瘤可逃逸(參見SinghR,PatersonY.Immunoeditingsculptstumorepitopesduringimmunotherapy.CancerRes2007；67:1887-92)。本文示出了出乎意料的結(jié)果，當(dāng)Her-2/neu蛋白的三個或更多個表位并入嵌合疫苗時，可通過逃逸突變消除這些腫瘤的選擇和逃逸。使用新型Her-2/neu嵌合李斯特菌疫苗免疫不會導(dǎo)致可能與Her-2/neu抗原的點突變或氨基酸缺失相關(guān)的任何逃逸突變(參見本文的實例4)。在一個實施例中，本文提供了將李斯特菌疫苗株工程化為表達Her-2嵌合蛋白或表達嵌合蛋白的重組多肽的方法，該方法包括用核酸分子轉(zhuǎn)化李斯特菌菌株。在另一個實施例中，核酸分子包含編碼多肽的第一開放閱讀框，其中該多肽包含Her-2/neu嵌合抗原。在另一個實施例中，核酸分子還包含編碼代謝酶的第二開放閱讀框，并且其中所述代謝酶互補在重組李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因，從而將李斯特菌疫苗株工程化為表達Her-2嵌合蛋白。在一個實施例中，本文提供的方法和組合物還包含佐劑，佐劑在一個實施例中為獨立的佐劑，其中在另一個實施例中，佐劑或獨立的佐劑包括粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、編碼GM-CSF蛋白的核苷酸分子、皂草苷QS21、單磷酰脂質(zhì)A或未經(jīng)甲基化的含CpG寡核苷酸。在另一個實施例中，佐劑是鋁佐劑、弗氏佐劑、MPL、乳液、SBAS2、編碼免疫刺激細胞因子的核苷酸分子、細菌有絲分裂原或細菌毒素。在一個實施例中，“佐劑”是加強對抗原的免疫應(yīng)答和/或調(diào)節(jié)其傾向所需的免疫應(yīng)答的組分。在一個實施例中，佐劑是免疫原性佐劑，其在一個實施例中是在與特定的疫苗抗原結(jié)合使用時起到加速、延長或增強抗原特異性免疫應(yīng)答的作用的物質(zhì)。在一個實施例中，“獨立的”佐劑是獨立的，在一個實施例中與存在于融合多肽中的本發(fā)明的“另外的佐劑多肽”不同的佐劑，所述融合多肽具有腫瘤特異性抗原，其在一個實施例中為Her-2/neu。在一個實施例中，將減毒李斯特菌菌株諸如單核細胞增多性李斯特菌δ-actA突變體(Brundageetal,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,90:11890-11894)、單核細胞增多性李斯特菌δ-plcA(Camillietal,1991,J.Exp.Med.,173:751-754)或δ-ActA、δINL-b(Brockstedtet5al,2004,PNAS,101:13832–13837)用于本發(fā)明。在另一個實施例中，減毒李斯特菌菌株通過引入一個或多個減毒突變構(gòu)建，如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員了解本文的公開內(nèi)容時所理解。此類菌株的例子包括但不限于芳族氨基酸營養(yǎng)缺陷型李斯特菌菌株(Alexanderetal,1993,InfectionandImmunity1061:2245-2248)和形成脂磷壁酸的突變體(Abachinetal,2002,Mol.Microbiol.43:1-14)以及因缺乏毒力基因而減毒的那些(參見本文的實例)。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法和組合物的核酸分子可操作地連接至啟動子/調(diào)控序列。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法和組合物的第一開放閱讀框可操作地連接至啟動子/調(diào)控序列。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法和組合物的第二開放閱讀框可操作地連接至啟動子/調(diào)控序列。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法和組合物的第三開放閱讀框可操作地連接至啟動子/調(diào)控序列。在另一個實施例中，每個開放閱讀框可操作地連接至啟動子/調(diào)控序列。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。技術(shù)人員在了解本文提供的本公開內(nèi)容和方法時，將易于理解不同的轉(zhuǎn)錄啟動子、終止子、載體或特定基因序列(如，市售的克隆載體中的那些)可成功地用于本發(fā)明的方法和組合物。如本發(fā)明所設(shè)想，這些功能在例如稱為pUC系列的市售載體中提供。在另一個實施例中，移除非必需DNA序列(如，抗生素抗性基因)。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，本發(fā)明使用市售的質(zhì)粒。此類質(zhì)?？蓮亩鄠€來源獲得，例如Invitrogen(LaJolla,CA)、Stratagene(LaJolla,CA)、Clontech(PaloAlto,CA)，或可使用本領(lǐng)域熟知的方法構(gòu)建。在另一個實施例中，將諸如pCR2.1(Invitrogen,LaJolla,CA)的質(zhì)粒用于有利于在原核生物體中表達本發(fā)明的多肽，pCR2.1是具有原核復(fù)制起點和啟動子/調(diào)控元件的原核表達載體。在另一個實施例中，移除外源性核苷酸序列以減小質(zhì)粒的大小并增加可置于其中的盒的大小。此類方法是本領(lǐng)域熟知的，并且在例如Sambrooketal.(1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork)andAusubeietal.(1997,CurrentProtocolsinMolecularBiology,Green&Wiley,NewYork)中有所描述。將抗生素抗性基因用于分子生物學(xué)和疫苗制備通常使用的常規(guī)選擇和克隆工藝。本發(fā)明設(shè)想的抗生素抗性基因包括但不限于賦予氨芐青霉素、青霉素、甲氧西林、鏈霉素、紅霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素(CAT)、新霉素、潮霉素、慶大霉素以及本領(lǐng)域熟知的其他抗生素抗性的基因產(chǎn)物。每個基因表示本發(fā)明的單獨實施例。用于轉(zhuǎn)化細菌的方法是本領(lǐng)域熟知的，并包括基于氯化鈣感受態(tài)細胞的方法、電穿孔方法、噬菌體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)、化學(xué)和物理轉(zhuǎn)化技術(shù)(deBoeretal,1989,Cell56:641-649；Milleretal,1995,FASEBJ.,9:190-199；Sambrooketal.1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork；Ausubeletal.,1997,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork；Gerhardtetal.,eds.,1994,MethodsforGeneralandMolecularBacteriology,AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,DC；Miller,1992,AShortCourseinBacterialGenetics,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.)。在另一個實施例中，本發(fā)明的李斯特菌疫苗株通過電穿孔轉(zhuǎn)化。每種方法代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，將接合用于將遺傳物質(zhì)和/或質(zhì)粒引入細菌。接合的方法是本領(lǐng)域熟知的，并且例如在NikodinovicJetal.(Asecondgenerationsnp-derivedEscherichiacoli-Streptomycesshuttleexpressionvectorthatisgenerallytransferablebyconjugation.Plasmid.2006Nov；56(3):223-7)和AuchtungJMetal(RegulationofaBacillussubtilismobilegeneticelementbyintercellularsignalingandtheglobalDNAdamageresponse.ProcNatlAcadSciUSA.2005Aug30；102(35):12554-9)中有所描述。每種方法代表了本發(fā)明的獨立實施例。在一個實施例中，“轉(zhuǎn)化”與術(shù)語“轉(zhuǎn)染”等同使用，是指將細菌細胞工程化為吸收質(zhì)粒或其他異源性DNA分子。在另一個實施例中，“轉(zhuǎn)化”是指將細菌細胞工程化為表達質(zhì)粒的基因或其他異源性DNA分子。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。本發(fā)明可用的質(zhì)粒和其他表達載體在本文別處有所描述，并且可包括例如啟動子/調(diào)控序列、革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的復(fù)制起點、編碼融合蛋白的分離的核酸以及編碼氨基酸代謝基因的分離的核酸等特征。另外，編碼融合蛋白和氨基酸代謝基因的分離的核酸將具有適用于驅(qū)動此類分離的核酸的表達的啟動子。用于驅(qū)動在細菌系統(tǒng)中表達的啟動子是本領(lǐng)域熟知的，并且包括噬菌體λ、pBR322的β-內(nèi)酰胺酶基因的bla啟動子和pBR325的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的CAT啟動子。原核啟動子的另外例子包括：噬菌體λ的主要右和左啟動子(PL和PR)，大腸桿菌的trp、recA、lacZ、lad和gal啟動子，枯草芽孢桿菌的α-淀粉酶(Ulmanenetal,1985.J.Bacteriol.162:176-182)和S28特異性啟動子(Gilmanetal,1984Gene32:11-20)，芽孢桿菌屬的噬菌體的啟動子(Gryczan,1982,In:TheMolecularBiologyoftheBacilli,AcademicPress,Inc.,NewYork)以及鏈霉菌屬啟動子(Wardetal,1986,Mol.Gen.Genet.203:468-478)。在本發(fā)明中考慮的另外的原核啟動子例如在Glick(1987,J.Ind.Microbiol.1:277-282)、Cenatiempo(1986,Biochimie,68:505-516)和Gottesman(1984,Ann.Rev.Genet.18:415-442)中進行了綜述。在本發(fā)明中考慮的啟動子/調(diào)控元件的另外例子包括但不限于：李斯特菌prfA啟動子、李斯特菌hly啟動子、李斯特菌p60啟動子和李斯特菌ActA啟動子(GenBank登錄號NC_003210)或其片段。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法和組合物的質(zhì)粒包含編碼融合蛋白的基因。在另一個實施例中，克隆子序列，并使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖懈钸m當(dāng)?shù)淖有蛄小Ｔ诹硪粋€實施例中，然后連接片段生成所需的DNA序列。在另一個實施例中，編碼抗原的DNA使用DNA擴增法例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)制備。首先，在天然DNA片段的新末端的任一側(cè)單獨擴增。一個擴增的序列的5'末端編碼肽接頭，而另一個擴增的序列的3'末端也編碼肽接頭。由于第一片段的5'末端與第二片段的3'末端互補，兩個片段(在部分純化后，如在LMP瓊脂糖上)可在第三PCR反應(yīng)中用作重疊模板。擴增的序列將包含密碼子、開口位點羧基側(cè)上的片段(現(xiàn)在形成氨基序列)、接頭和開口位點氨基側(cè)上的序列(現(xiàn)在形成羧基序列)。將抗原連接至質(zhì)粒。每種方法代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，本發(fā)明還包括用于臨床應(yīng)用的基于噬菌體的染色體整合系統(tǒng)。使用必需酶(包括但不限于D-丙氨酸消旋酶)營養(yǎng)缺陷型宿主菌株，例如Lmdal(-)dat(-)。在另一個實施例中，為避免“噬菌體治愈步驟”(phagecuringstep)，使用基于PSA的噬菌體整合系統(tǒng)(Lauer,etal.,2002JBacteriol,184:4177-4186)。這在另一個實施例中需要通過抗生素持續(xù)選擇以維持整合基因。因此，在另一個實施例中，本發(fā)明使得能建立基于噬菌體的染色體整合系統(tǒng)，該系統(tǒng)不需要以抗生素選擇。相反，營養(yǎng)缺陷型宿主菌株將是互補的。在另一個實施例中，使用重組DNA方法合成本發(fā)明的重組蛋白。在一個實施例中，這涉及形成編碼融合蛋白的DNA序列，將DNA置于具體啟動子/調(diào)控元件的控制下的表達盒(諸如本發(fā)明的質(zhì)粒)中，以及表達蛋白。在另一個實施例中，通過任何合適的方法，包括例如適當(dāng)序列的克隆和限制或通過諸如Narangetal.(1979,Meth.Enzymol.68:90-99)的磷酸三酯法、Brownetal.(1979,Meth.Enzymol68:109-151)的磷酸二酯法、Beaucageetal.(1981,Tetra.Lett.,22:151859-1862)的二乙基亞磷酰胺法和美國專利No.4,458,066的固相載體法的方法直接化學(xué)合成來制備編碼本發(fā)明的融合蛋白(如，非溶血LLO/抗原)的DNA。在另一個實施例中，使用化學(xué)合成制備單鏈寡核苷酸。在各種實施例中，該單鏈寡核苷酸通過與互補序列雜交或使用單鏈作為模板通過DNA聚合酶聚合轉(zhuǎn)換為雙鏈DNA。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到，雖然DNA的化學(xué)合成僅限于約100個堿基的序列，但較長的序列可通過較短的序列的連接獲得。在另一個實施例中，克隆子序列，并使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖懈钸m當(dāng)?shù)淖有蛄?。然后連接片段以制備所需的DNA序列。在另一個實施例中，使用DNA擴增法諸如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)克隆編碼本發(fā)明的融合蛋白或重組蛋白的DNA。因此，使用包含合適的限制性位點的正義引物和包含另一個限制性位點(如，不相同的限制性位點以有利于克隆)的反義引物PCR擴增非溶血LLO的基因。重復(fù)相同的步驟擴增編碼抗原的分離的核酸。連接非溶血LLO和抗原序列并插入質(zhì)?；蜉d體，以生成編碼連接至抗原末端的非溶血LLO的載體。兩個分子直接或通過限制性位點引入的短間隔肽連接。在另一個實施例中，分子通過由一個或多個氨基酸組成的間隔肽隔離，通常間隔肽除連接蛋白或維持一定的最小距離或它們之間的其他空間關(guān)系之外無特定生物學(xué)活性。在另一個實施例中，選擇間隔肽的組成氨基酸以影響分子的一些性質(zhì)，諸如折疊、凈電荷或疏水性。在另一個實施例中，將編碼融合或重組蛋白的核酸序列轉(zhuǎn)化至多種宿主細胞，包括大腸桿菌、其他細菌宿主諸如李斯特菌、酵母和各種高等真核細胞諸如COS、CHO和HeLa細胞系以及骨髓瘤細胞系。重組融合蛋白基因?qū)⒖刹僮鞯剡B接至每個宿主的適當(dāng)表達控制序列。啟動子/調(diào)控序列在本文別處詳細描述。在另一個實施例中，質(zhì)粒還包含另外的啟動子調(diào)控元件，以及核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止信號。對于真核細胞，調(diào)控序列將包括啟動子和來源于如免疫球蛋白基因、SV40、細胞巨化病毒等的增強子，以及聚腺苷酸化序列。在另一個實施例中，序列包括剪接供體和受體序列。在一個實施例中，術(shù)語“可操作地連接”是指其中這樣描述的組成部分處于允許其以預(yù)期方式發(fā)揮功能的關(guān)系的并置。“可操作地連接”至編碼序列的控制序列的連接方式使得編碼序列的表達在與控制序列相容的條件下實現(xiàn)。在另一個實施例中，為了選擇包含質(zhì)粒的營養(yǎng)缺陷型細菌，使轉(zhuǎn)化的營養(yǎng)缺陷型細菌在將選擇氨基酸代謝基因表達的培養(yǎng)基上生長。在另一個實施例中，用包含用于D-谷氨酸合成的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化D-谷氨酸合成缺陷型細菌，并且該營養(yǎng)缺陷型細菌將在不存在D-谷氨酸的情況下生長，而未被該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化或者不表達編碼用于D-谷氨酸合成的蛋白的質(zhì)粒的營養(yǎng)缺陷型細菌將不會生長。在另一個實施例中，如果本發(fā)明的質(zhì)粒包含編碼用于D-丙氨酸合成的氨基酸代謝酶的分離的核酸，D-丙氨酸合成營養(yǎng)缺陷型的細菌當(dāng)被轉(zhuǎn)化且表達所述質(zhì)粒時，將在不存在D-丙氨酸的情況下生長。這樣的用于制備適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基(其包含或缺少必需生長因子、補充劑、氨基酸、維生素、抗生素等)的方法是本領(lǐng)域熟知的，且可商購獲得(Becton-Dickinson,FranklinLakes,NJ)。每種方法代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，一旦在適當(dāng)培養(yǎng)基上選擇了包含本發(fā)明的質(zhì)粒的營養(yǎng)缺陷型細菌，細菌即可在存在選擇壓力的情況下繁殖。這樣的繁殖包括使細菌在無營養(yǎng)缺陷因子的培養(yǎng)基中生長。表達氨基酸代謝酶的質(zhì)粒在營養(yǎng)缺陷型細菌中的存在將確保，該質(zhì)粒將與該細菌一起復(fù)制，從而連續(xù)地選擇攜帶該質(zhì)粒的細菌。技術(shù)人員在獲知本文的公開內(nèi)容和方法后將能夠容易地通過調(diào)整培養(yǎng)基(包含質(zhì)粒的營養(yǎng)缺陷型細菌在其中生長)的體積來放大李斯特菌疫苗載體的生產(chǎn)。技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在另一個實施例中，其他營養(yǎng)缺陷型菌株和互補系統(tǒng)適合與本發(fā)明一起使用。在一個實施例中，本文提供了阻礙受試者的Her-2表達性腫瘤生長的方法，其中并且在另一個實施例中，該方法包括將包含本文所述的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者的步驟。在另一個實施例中，本文提供了引起受試者的對Her-2/neu表達性腫瘤的增強免疫應(yīng)答的方法，其中并且在另一個實施例中，該方法包括將包含本文所述的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者的步驟。在又一個實施例中，對Her-2/neu表達性腫瘤的免疫應(yīng)答包括對Her-2/neu蛋白的至少一個次優(yōu)勢表位的免疫應(yīng)答。在一個實施例中，本文提供了防止Her-2/neu表達性腫瘤治療中的逃逸突變的方法，其中并且在另一個實施例中，該方法包括將包含本文提供的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于所述受試者的步驟。在另一個實施例中，本文提供了預(yù)防受試者的Her-2/neu抗原表達性腫瘤發(fā)病的方法，其中并且在另一個實施例中，該方法包括將包含本文提供的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者的步驟。在一個實施例中，本文提供了降低腫瘤內(nèi)調(diào)節(jié)性T細胞的頻率的方法，其中并且在另一個實施例中，該方法包括將包含本文提供的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者的步驟。在一個實施例中，本文提供了降低腫瘤內(nèi)骨髓來源的抑制性細胞的頻率的方法，其中并且在另一個實施例中，該方法包括將包含本文提供的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者的步驟。在另一個實施例中，本文提供了降低骨髓來源的抑制性細胞的頻率的方法，其中并且在另一個實施例中，該方法包括將包含本文提供的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者的步驟。在一個實施例中，本文提供了防止受試者中Her-2/neu表達性腫瘤的發(fā)展的方法，其中并且在另一個實施例中，該方法包括將包含本文提供的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者的步驟。在另一個實施例中，本文提供了防止受試者中形成來自于Her-2/neu表達性腫瘤的轉(zhuǎn)移性疾病的方法，其中并且在另一個實施例中，該方法包括將包含本文提供的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者的步驟。在另一個實施例中，本文提供了治療受試者的來自于Her-2/neu表達性腫瘤的轉(zhuǎn)移性疾病的方法，其中并且在另一個實施例中，該方法包括將包含本文提供的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者的步驟。在一個實施例中，本文提供了施用本發(fā)明的組合物的方法。在另一個實施例中，本文提供了施用本發(fā)明的疫苗的方法。在另一個實施例中，本文提供了施用本發(fā)明的重組多肽或重組核苷酸的方法。在另一個實施例中，施用本發(fā)明的組合物、疫苗、重組多肽或重組核苷酸的步驟通過各自本身為分立的實施例的李斯特菌的減毒重組形式進行，該李斯特菌包括組合物、疫苗、重組核苷酸或表達重組多肽。在另一個實施例中，施用通過不同的減毒細菌載體進行。在另一個實施例中，施用通過DNA疫苗(如，裸DNA疫苗)進行。在另一個實施例中，本發(fā)明的重組多肽的施用通過重組生成蛋白，然后將重組蛋白施用于受試者來進行。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法和組合物引起的免疫應(yīng)答包括CD8+T細胞介導(dǎo)的應(yīng)答。在另一個實施例中，免疫應(yīng)答主要由CD8+T細胞介導(dǎo)的應(yīng)答組成。在另一個實施例中，免疫應(yīng)答的僅有可檢測組成部分是CD8+T細胞介導(dǎo)的應(yīng)答。在另一個實施例中，本文提供的方法和組合物引起的免疫應(yīng)答包括CD4+T細胞介導(dǎo)的應(yīng)答。在另一個實施例中，免疫應(yīng)答主要由CD4+T細胞介導(dǎo)的應(yīng)答組成。在另一個實施例中，免疫應(yīng)答的僅有可檢測組成部分是CD4+T細胞介導(dǎo)的應(yīng)答。在另一個實施例中，CD4+T細胞介導(dǎo)的應(yīng)答伴有對抗原的可測定抗體應(yīng)答。在另一個實施例中，CD4+T細胞介導(dǎo)的應(yīng)答不伴有對抗原的可測定抗體應(yīng)答。在另一個實施例中，本發(fā)明提供誘導(dǎo)受試者的對抗原的次優(yōu)勢CD8+T細胞表位的CD8+T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的方法，該方法包括以下步驟：(a)使編碼Her2-neu嵌合抗原或其片段的核苷酸分子融合至編碼LLO蛋白的N-末端片段的核苷酸分子，從而形成編碼LLO-抗原融合蛋白的重組核苷酸；以及(b)將重組核苷酸或LLO-抗原融合體施用于受試者；從而誘導(dǎo)對抗原的次優(yōu)勢CD8+T細胞表位的CD8+T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。在一個實施例中，本文提供了提高腫瘤內(nèi)CD8+/調(diào)節(jié)性T細胞比率的方法，其中并且在另一個實施例中，該方法包括將包含本發(fā)明的重組多肽、重組李斯特菌或重組載體的組合物施用于受試者的步驟。在另一個實施例中，本文提供了降低腫瘤內(nèi)調(diào)節(jié)性T細胞的頻率的方法，其中并且在另一個實施例中，該方法包括將包含本文提供的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者的步驟。在另一個實施例中，本文提供的方法和組合物引起的免疫應(yīng)答包括對抗原的至少一個次優(yōu)勢表位的免疫應(yīng)答。在另一個實施例中，免疫應(yīng)答不包括對次優(yōu)勢表位的免疫應(yīng)答。在另一個實施例中，免疫應(yīng)答主要由對至少一個次優(yōu)勢表位的免疫應(yīng)答組成。在另一個實施例中，免疫應(yīng)答的僅有可測定組成部分是對至少一個次優(yōu)勢表位的免疫應(yīng)答。每種類型的免疫應(yīng)答表示本發(fā)明的單獨實施例。在一個實施例中，本發(fā)明的方法破壞了受試者對Her-2/neu表達性腫瘤或所述受試者的癌癥的耐受性，其中并且在另一個實施例中，該方法包括將包含本文提供的重組李斯特菌疫苗株的組合物施用于受試者的步驟。測定免疫應(yīng)答的方法是本領(lǐng)域熟知的，并且包括如測定腫瘤生長的抑制、流式細胞術(shù)、靶細胞裂解分析(如，鉻釋放分析)、四聚物的使用等等。每種方法代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，本發(fā)明提供阻礙受試者中Her-2表達性腫瘤的生長的方法，其中并且在另一個實施例中，該方法包括向受試者施用以下組合：放射療法，和包含融合至Her-2嵌合蛋白或其片段的LLO蛋白的N-末端片段的重組多肽或編碼該重組多肽的重組核苷酸，其中該受試者產(chǎn)生對Her-2表達性腫瘤的免疫應(yīng)答，從而阻礙Her-2表達性腫瘤在受試者中生長。在另一個實施例中，本發(fā)明提供延緩或抑制受試者的來源于Her-2表達性腫瘤的轉(zhuǎn)移性疾病的方法，其中并且在另一個實施例中，該方法包括向受試者施用以下組合：放射療法，和包含融合至Her-2嵌合蛋白或其片段的LLO蛋白的N-末端片段的重組多肽或編碼該重組多肽的重組核苷酸，其中該受試者產(chǎn)生對Her-2表達性腫瘤的免疫應(yīng)答，從而延緩或抑制受試者的來源于Her-2表達性腫瘤的轉(zhuǎn)移性疾病。在另一個實施例中，本發(fā)明提供改善Her-2嵌合蛋白的抗原性的方法，其中并且在另一個實施例中，該方法包括使編碼LLO蛋白的N-末端片段的核苷酸融合至編碼Her-2蛋白或其片段的核苷酸，以形成重組核苷酸的步驟，從而改善Her-2嵌合蛋白的抗原性。在另一個實施例中，本文提供了改善Her-2嵌合蛋白的抗原性的方法，其中并且在另一個實施例中，該方法包括將李斯特菌菌株工程化為表達重組核苷酸。在另一個實施例中，使用不同的細菌載體表達重組核苷酸。在另一個實施例中，細菌載體是減毒的。在另一個實施例中，使用DNA疫苗(如，裸DNA疫苗)表達重組核苷酸。在另一個實施例中，核苷酸編碼的LLO-Her-2嵌合體融合肽的施用通過重組生成蛋白，然后將重組蛋白施用于受試者來進行。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在一個實施例中，本發(fā)明提供誘導(dǎo)腫瘤的“表位擴展”的方法。在另一個實施例中，使用本文提供的組合物和方法的免疫誘導(dǎo)具有除本發(fā)明的疫苗攜帶的抗原之外的抗原的其他腫瘤上的表位擴展。在另一個實施例中，優(yōu)勢表位或次優(yōu)勢表位在進行治療的受試者中分別是優(yōu)勢的或次優(yōu)勢的。在另一個實施例中，優(yōu)勢表位或次優(yōu)勢表位在進行治療的群體中是優(yōu)勢的或次優(yōu)勢的。在一個實施例中，本文提供了通過表位擴展來預(yù)防、治療、阻遏、抑制受試者中的癌癥或腫瘤生長、誘導(dǎo)對受試者中癌癥或腫瘤生長的免疫應(yīng)答、或引起對次優(yōu)勢表位增強的免疫應(yīng)答的方法，其中并且在另一個實施例中，所述癌癥與本發(fā)明的組合物中包含的抗原或其片段的表達相關(guān)。在另一個實施例中，方法包括將包含本發(fā)明的重組多肽、重組李斯特菌或重組載體的組合物施用于所述受試者。在又一個實施例中，受試者產(chǎn)生對抗原表達性癌癥或抗原表達性腫瘤的免疫應(yīng)答，從而治療、阻遏或抑制受試者的癌癥或腫瘤生長。在一個實施例中，“優(yōu)勢CD8+T細胞表位”是指蛋白或包含蛋白的病原體或癌細胞的疫苗接種、感染或惡性生長引起的超過30％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指由此引起的超過35％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指超過40％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指超過45％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指超過50％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指超過55％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指超過60％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指超過65％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指超過70％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指超過75％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指超過80％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指超過85％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指超過90％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指超過95％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指超過96％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指超過97％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指超過98％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在一個實施例中，“次優(yōu)勢CD8+T細胞表位”是指蛋白或包含蛋白的病原體或癌細胞的疫苗接種、感染或惡性生長引起的少于30％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指少于28％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指超過26％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指少于24％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指超過22％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指少于20％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指超過18％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指少于16％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指超過14％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指超過12％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指少于10％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指超過8％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指少于6％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指少于5％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指超過4％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指少于3％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指少于2％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指少于1％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。在另一個實施例中，該術(shù)語是指少于0.5％的抗原特異性CD8+T細胞識別的表位。每種類型的優(yōu)勢表位和次優(yōu)勢表位表示本發(fā)明的單獨實施例。在一個實施例中，本發(fā)明的方法和組合物中的抗原以可檢測水平在受試者非腫瘤細胞上表達。在另一個實施例中，抗原以可檢測水平在至少某一百分比(如，0.01％、0.03％、0.1％、0.3％、1％、2％、3％或5％)的受試者非腫瘤細胞上表達。在一個實施例中，“非腫瘤細胞”是指腫瘤體外的細胞。在另一個實施例中，“非腫瘤細胞”是指非惡性細胞。在另一個實施例中，“非腫瘤細胞”是指未轉(zhuǎn)化的細胞。在另一個實施例中，非腫瘤細胞是體細胞。在另一個實施例中，非腫瘤細胞是生殖細胞。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在一個實施例中，“可檢測水平”是指可使用標(biāo)準(zhǔn)分析檢測的水平。在一個實施例中，分析是免疫分析。在一個實施例中，分析是酶聯(lián)免疫分析(ELISA)。在另一個實施例中，分析是Western印跡。在另一個實施例中，分析是FACS。技術(shù)人員將會知道，本文提供的方法可使用本領(lǐng)域可用的任何其他分析。在另一個實施例中，可檢測水平相對于具體分析的背景水平確定。用于執(zhí)行每種這些技術(shù)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，并且每種技術(shù)表示本發(fā)明的單獨實施例。在一個實施例中，使用重組抗原表達性單核細胞增多性李斯特菌進行疫苗接種誘導(dǎo)了表位擴展。在另一個實施例中，即使在Her2的范圍外，使用LLO-抗原融合體的疫苗接種也誘導(dǎo)了表位擴展。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，本發(fā)明提供阻礙受試者中Her-2表達性腫瘤的生長的方法，該方法包括將包含融合至Her-2嵌合抗原的LLO蛋白的N-末端片段的重組多肽施用于受試者，其中抗原具有一個或多個次優(yōu)勢CD8+T細胞表位，其中受試者產(chǎn)生對抗原表達性腫瘤的免疫應(yīng)答，從而阻礙受試者中Her-2表達性腫瘤的生長。在另一個實施例中，抗原不包含任何優(yōu)勢CD8+T細胞表位。在另一個實施例中，本文提供了阻礙受試者中Her-2表達性腫瘤生長的方法，該方法包括將包含編碼本文提供的重組多肽的重組核苷酸的李斯特菌的重組形式施用于受試者。在另一個實施例中，本發(fā)明提供誘導(dǎo)在患有癌癥的宿主中形成細胞毒性T細胞的方法，該方法包括將本發(fā)明的組合物施用于宿主，從而誘導(dǎo)在患有癌癥的宿主中形成細胞毒性T細胞。在另一個實施例中，本發(fā)明提供減少癌癥發(fā)生的方法，該方法包括施用本發(fā)明的組合物。在另一個實施例中，本發(fā)明提供改善癌癥的方法，該方法包括施用本發(fā)明的組合物。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在一個實施例中，將組合物離體施用于受試者的細胞；在另一個實施例中，將組合物離體施用于供體的細胞；在另一個實施例中，將組合物體內(nèi)施用于供體的細胞，然后轉(zhuǎn)移到受試者。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在一個實施例中，本發(fā)明的方法治療的癌癥為乳腺癌。在另一個實施例中，癌癥為含Her2癌癥。在另一個實施例中，癌癥為黑素瘤。在另一個實施例中，癌癥為胰腺癌。在另一個實施例中，癌癥為卵巢癌。在另一個實施例中，癌癥為胃癌。在另一個實施例中，癌癥為胰腺的癌性病變。在另一個實施例中，癌癥為肺腺癌。在另一個實施例中，癌癥為結(jié)直腸腺癌。在另一個實施例中，癌癥為肺鱗癌。在另一個實施例中，癌癥為胃腺癌。在另一個實施例中，癌癥為卵巢表面上皮腫瘤(例如其良性的、增生性的或惡性的種類)。在另一個實施例中，癌癥為口腔鱗狀細胞癌。在另一個實施例中，癌癥為非小細胞肺癌。在另一個實施例中，癌癥為CNS癌癥。在另一個實施例中，癌癥為子宮內(nèi)膜癌。在另一個實施例中，癌癥為膀胱癌。在另一個實施例中，癌癥為間皮瘤。在另一個實施例中，癌癥為惡性間皮瘤(MM)。在另一個實施例中，癌癥為頭頸癌。在另一個實施例中，癌癥為前列腺癌。在一個實施例中，癌癥為骨肉瘤，其在一個實施例中為惡性骨腫瘤。在一個實施例中，骨肉瘤是以下亞型中的任一種：成骨細胞、成軟骨細胞、成纖維細胞OSA、毛細血管擴張型OSA、小細胞OSA、低級中央OSA、骨膜OSA、骨旁O(shè)SA、繼發(fā)性O(shè)SA、高級骨膜OSA或骨外OSA。在另一個實施例中，癌癥為Her-2/neu表達性骨肉瘤。在另一個實施例中，骨肉瘤為犬科動物骨肉瘤。在另一個實施例中，骨肉瘤為局部骨肉瘤。在另一個實施例中，骨肉瘤為轉(zhuǎn)移性骨肉瘤。在另一個實施例中，骨肉瘤為高度骨肉瘤。在另一個實施例中，骨肉瘤為犬科動物肢體骨肉瘤。在另一個實施例中，癌癥為肺轉(zhuǎn)移性疾病。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在本發(fā)明的方法的另一個實施例中，受試者產(chǎn)生對抗原表達性腫瘤或靶抗原的免疫應(yīng)答，從而介導(dǎo)抗腫瘤效應(yīng)。在另一個實施例中，本發(fā)明提供用于治療癌癥的免疫原性組合物，該組合物包含截短的LLO與Her-2嵌合蛋白的融合體。在另一個實施例中，免疫原性組合物還包含表達該融合體的李斯特菌菌株。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，本發(fā)明提供用于治療癌癥的免疫原性組合物，該組合物包含表達Her-2嵌合蛋白的李斯特菌菌株。在另一個實施例中，本文提供了包含本發(fā)明的李斯特菌的重組形式的免疫原性組合物。在一個實施例中，本發(fā)明的處理方案為治療性的。在另一個實施例中，該方案為預(yù)防性的。在另一個實施例中，將本發(fā)明的疫苗用于保護人們免于諸如乳腺癌的癌癥或其他類型的含Her-2腫瘤的風(fēng)險，因為家族性遺傳或其他情況使得它們易于患有這些類型的疾病，如技術(shù)人員將理解的那樣。在另一個實施例中，疫苗在通過手術(shù)、常規(guī)化療或放療摧毀腫瘤生長后用作癌癥免疫療法。在另一個實施例中，疫苗與放射治療和手術(shù)、常規(guī)化療或兩者聯(lián)合。在此類治療后，本發(fā)明的疫苗的施用使得對疫苗的腫瘤抗原的CTL應(yīng)答破壞了其余的轉(zhuǎn)移并且延長了癌癥的緩解。在另一個實施例中，疫苗與手術(shù)、常規(guī)化療、放射治療或它們的任何組合聯(lián)合用作放療癌癥免疫療法。在另一個實施例中，此類聯(lián)合治療用于不能經(jīng)受截肢的受試者。在另一個實施例中，此類聯(lián)合治療用于患有原發(fā)性骨肉瘤的不能經(jīng)受截肢的受試者。在另一個實施例中，將本發(fā)明的疫苗用于影響之前建立的腫瘤的生長并殺死現(xiàn)有的腫瘤細胞。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，上述任何方法所用的疫苗和免疫原性組合物具有本發(fā)明的疫苗和免疫原性組合物的任何特性。每種特性表示本發(fā)明的單獨實施例。應(yīng)當(dāng)理解的是，在本發(fā)明的組合物和用途的背景下描述的組合物可被稱為免疫原性組合物，反之亦然。本發(fā)明設(shè)想了劑量范圍的各種實施例。在一個實施例中，就疫苗載體而言，劑量在0.4LD50/劑的范圍內(nèi)。在另一個實施例中，劑量為約0.4-4.9LD50/劑。在另一個實施例中，劑量為約0.5-0.59LD50/劑。在另一個實施例中，劑量為約0.6-0.69LD50/劑。在另一個實施例中，劑量為約0.7-0.79LD50/劑。在另一個實施例中，劑量為約0.8LD50/劑。在另一個實施例中，劑量為0.4LD50/劑至0.8LD50/劑。在另一個實施例中，劑量為107個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為1.5×107個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為2×107個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為3×107個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為4×107個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為6×107個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為8×107個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為1×108個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為1.5×108個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為2×108個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為3×108個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為4×108個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為6×108個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為8×108個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為1×109個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為1.5×109個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為2×109個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為3×109個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為5×109個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為6×109個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為8×109個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為1×1010個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為1.5×1010個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為2×1010個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為3×1010個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為5×1010個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為6×1010個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為8×1010個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為8×109個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為1×1011個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為1.5×1011個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為2×1011個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為3×1011個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為5×1011個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為6×1011個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為8×1011個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為5.0×108個細菌/劑。在另一個實施例中，劑量為3.3×109個細菌/劑。在另一個實施例中，用于本文提供的方法的組合物包含3.3×109個李斯特菌/劑。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在一個實施例中，將本發(fā)明的疫苗或免疫原性組合物單獨施用于受試者。在另一個實施例中，疫苗或免疫原性組合物與另一種癌癥療法(其在一個實施例中為放射療法)一起施用。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在一個實施例中，本發(fā)明的方法和組合物的重組李斯特菌與編碼Her-2嵌合抗原或LLO-Her-2嵌合抗原融合體的構(gòu)建體一起穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。在一個實施例中，構(gòu)建體包含多接頭以有利于另外的亞克隆。制備重組李斯特菌的多種技術(shù)是已知的。在一個實施例中，使用同源重組將構(gòu)建體或核酸分子整合進李斯特菌染色體。用于同源重組的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，并且例如在BalogluS,BoyleSM,etal.(ImmuneresponsesofmicetovacciniavirusrecombinantsexpressingeitherListeriamonocytogenespartiallisteriolysinorBrucellaabortusribosomalL7/L12protein.VetMicrobiol2005,109(1-2):11-7)和JiangLL,SongHH,etal.,(CharacterizationofamutantListeriamonocytogenesstrainexpressinggreenfluorescentprotein.ActaBiochimBiophysSin(Shanghai)2005,37(1):19-24)中有所描述。在另一個實施例中，如美國專利No.6,855,320所述進行同源重組。在這種情況下，通過hly啟動子控制下的E7基因的染色體整合，制備表達E7的重組單核細胞增多性李斯特菌菌株，并且包含hly信號序列以確保基因產(chǎn)物的分泌，從而產(chǎn)生稱作Lm-AZ/E7的重組體。在另一個實施例中，將溫敏質(zhì)粒用于選擇重組體。每種技術(shù)代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，該構(gòu)建體或核酸分子采用轉(zhuǎn)座子插入整合進李斯特菌染色體。用于轉(zhuǎn)座子插入的技術(shù)在本領(lǐng)域是熟知的，尤其是Sunetal.(InfectionandImmunity1990,58:3770-3778)在DP-L967的構(gòu)建中所描述的。在另一個實施例中，轉(zhuǎn)座子誘變具有可形成穩(wěn)定的基因組插入突變體的優(yōu)點，但缺點是外源基因在基因組中的插入位置是未知的。在另一個實施例中，使用噬菌體整合位點將該構(gòu)建體或核酸分子整合進李斯特菌染色體(LauerP,ChowMYetal,Construction,characterization,anduseoftwoListeriamonocytogenessite-specificphageintegrationvectors.JBacteriol2002；184(15):4177-86)。在該方法的某些實施例中，使用噬菌體(例如U153或PSA李斯特噬菌體)的整合酶基因和連接位點將異源基因插入對應(yīng)的連接位點，該連接位點可以是基因組中的任何適當(dāng)?shù)奈稽c(例如comK，或argtRNA基因的3’末端)。在另一個實施例中，內(nèi)源性原噬菌體在構(gòu)建體或異源基因整合之前從所利用的連接位點解離。在另一個實施例中，該方法產(chǎn)生單拷貝整合體。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，使用各種啟動子中的一者表達抗原或包含該抗原的融合蛋白。在一個實施例中，使用單核細胞增多性李斯特菌啟動子，如基因hly、actA、plca、plcB和mpl的啟動子，這些基因分別編碼李斯特菌蛋白溶血素、actA、磷脂酰肌醇特異性磷脂酶、磷脂酶C和金屬蛋白酶。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法和組合物采用Her-2嵌合蛋白的同源物或本發(fā)明的LLO序列。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法和組合物采用非人類哺乳動物的Her-2嵌合蛋白。在一個實施例中，當(dāng)術(shù)語“同源性”、“同源的”等涉及任何蛋白或肽時，是指在對齊序列和引入空位(如有必要)，以實現(xiàn)最大同源性百分比，并且不考慮作為序列同一性的一部分的任何保守置換之后，候選序列中與對應(yīng)天然多肽的殘基相同的氨基酸殘基的百分比。用于比對的方法和計算機程序是本領(lǐng)域熟知的。在另一個實施例中，當(dāng)提及任何核酸序列時，術(shù)語“同源性”類似地指候選序列中與相應(yīng)天然核酸序列的核苷酸相同的核苷酸的百分比。在另一個實施例中，本發(fā)明提供編碼信號肽或本發(fā)明的重組多肽或融合蛋白的分離的核酸。在一個實施例中，分離的核酸包含與編碼信號肽或本發(fā)明的重組多肽或融合蛋白的核酸共有至少65％同源性的序列。在另一個實施例中，分離的核酸包含與編碼信號肽或本發(fā)明的重組多肽或融合蛋白的核酸共有至少75％同源性的序列。在另一個實施例中，分離的核酸包含與編碼信號肽或本發(fā)明的重組多肽或融合蛋白的核酸共有至少85％同源性的序列。在另一個實施例中，分離的核酸包含與編碼信號肽或本發(fā)明的重組多肽或融合蛋白的核酸共有至少90％同源性的序列。在另一個實施例中，分離的核酸包含與編碼信號肽或本發(fā)明的重組多肽或融合蛋白的核酸共有至少95％同源性的序列。在另一個實施例中，分離的核酸包含與編碼信號肽或本發(fā)明的重組多肽或融合蛋白的核酸共有至少97％同源性的序列。在另一個實施例中，分離的核酸包含與編碼信號肽或本發(fā)明的重組多肽或融合蛋白的核酸共有至少99％同源性的序列。在一個實施例中，通過序列比對的計算機算法、通過本領(lǐng)域中充分描述的方法來確定同源性。例如，核酸序列同源性的計算機算法分析可以包括使用多種可用軟件包，比如BLAST、DOMAIN、BEAUTY(BLASTEnhancedAlignmentUtility)、GENPEPT和TREMBL軟件包。在另一個實施例中，“同源性”是指與選自本文提供的序列(核酸或氨基酸序列)的序列的同一性大于65％。在另一個實施例中，“同源性”是指與選自本文提供的序列的序列的同一性大于70％。在另一個實施例中，該同一性大于75％。在另一個實施例中，該同一性大于78％。在另一個實施例中，該同一性大于80％。在另一個實施例中，該同一性大于82％。在另一個實施例中，該同一性大于83％。在另一個實施例中，該同一性大于85％。在另一個實施例中，該同一性大于87％。在另一個實施例中，該同一性大于88％。在另一個實施例中，該同一性大于90％。在另一個實施例中，該同一性大于92％。在另一個實施例中，該同一性大于93％。在另一個實施例中，該同一性大于95％。在另一個實施例中，該同一性大于96％。在另一個實施例中，該同一性大于97％。在另一個實施例中，該同一性大于98％。在另一個實施例中，該同一性大于99％。在另一個實施例中，該同一性為100％。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，通過確定候選序列雜交來確定同源性，其方法在現(xiàn)有技術(shù)中有充分描述(參見，例如“NucleicAcidHybridization″Hames,B.D.,andHigginsS.J.,Eds.(1985)；Sambrooketal.,2001,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.；和Ausubeletal.,1989,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenPublishingAssociatesandWileyInterscience,N.Y)。例如，可在中等至嚴格條件下進行與編碼天然半胱天冬酶肽的DNA的互補序列雜交的方法。雜交條件為例如在包含以下物質(zhì)的溶液中42℃下溫育過夜：10-20％甲酰胺、5XSSC(150mMNaCl，15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5X登哈特溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml變性的經(jīng)剪切的鮭魚精DNA。在本發(fā)明的一個實施例中，“核酸”是指一串至少兩個堿基-糖-磷酸組合。在一個實施例中，該術(shù)語包括DNA和RNA。在一個實施例中，“核苷酸”是指核酸聚合物的單體單元。在一個實施例中，RNA可為tRNA(轉(zhuǎn)運RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖體RNA)、mRNA(信使RNA)、反義RNA、小干擾RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)和核糖酶的形式。siRNA和miRNA的使用已有所描述(CaudyAAetal,Genes&Devel16:2491-96及其中引用的參考文獻)。DNA可以是質(zhì)粒DNA、病毒DNA、線性DNA或染色體DNA或這些分組的衍生物的形式。此外，這些形式的DNA和RNA可以是單鏈、雙鏈、三鏈或四鏈的。在另一個實施例中，該術(shù)語還包括可包含其他類型的主鏈但具有相同堿基的人工核酸。在一個實施例中，人工核酸是PNA(肽核酸)。PNA包含肽主鏈和核苷酸堿基，并且在一個實施例中能夠結(jié)合DNA和RNA兩種分子。在另一個實施例中，核苷酸是氧雜環(huán)丁烷修飾的。在另一個實施例中，核苷酸通過用硫代磷酸鍵代替一個或多個磷酸二酯鍵來修飾。在另一個實施例中，人工核酸包含本領(lǐng)域已知的天然核酸的磷酸主鏈的任何其他變體。硫代磷酸核酸和PNA的使用是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，并且在例如NeilsenPE,CurrOpinStructBiol9:353-57和RazNKetalBiochemBiophysResCommun.297:1075-84中有所描述。核酸的制備和使用是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，并且在例如MolecularCloning,(2001),SambrookandRussell,eds.和MethodsinEnzymology:Methodsformolecularcloningineukaryoticcells(2003)PurchioandG.C.Fareed中有所描述。每種核酸衍生物表示本發(fā)明的單獨實施例。在一個實施例中，通過本領(lǐng)域充分描述的方法確定蛋白和/或肽對本文列出的任何氨基酸序列的同源性，包括免疫印跡分析，或通過建立的方法采用多種可用軟件包中的任一種通過氨基酸序列的計算機算法分析進行。例如，這些軟件包中的一些可包括FASTA、BLAST、MPsrch或Scanps軟件包，并且可利用Smith和Waterman算法，和/或整體/局部或BLOCKS比對用于分析。每種確定同源性的方法代表了本發(fā)明的獨立實施例。在另一個實施例中，本發(fā)明提供了包括用于進行本發(fā)明的方法的試劑的試劑盒。在另一個實施例中，本發(fā)明提供包括本發(fā)明的組合物、工具或儀器的試劑盒。在一個實施例中，術(shù)語“接觸”或“施用”是指使本發(fā)明的組合物直接接觸癌細胞或腫瘤。在另一個實施例中，該術(shù)語是指使本發(fā)明的組合物間接接觸癌細胞或腫瘤。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法包括其中受試者接觸本發(fā)明的組合物，然后組合物通過擴散或本領(lǐng)域已知的任何其他主動運輸或被動運輸過程(化合物通過該過程在體內(nèi)循環(huán))接觸癌細胞或腫瘤的方法。在另一個實施例中，本發(fā)明的方法可包括至少單次施用本發(fā)明的組合物，其中在另一個實施例中，本發(fā)明的方法可包括多次施用本發(fā)明的組合物。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在一個實施例中，本發(fā)明提供其中僅施用一次重組李斯特菌的方法。在另一個實施例中，施用兩次李斯特菌。在另一個實施例中，施用三次李斯特菌。在另一個實施例中，施用四次李斯特菌。在另一個實施例中，施用四次以上李斯特菌。在另一個實施例中，施用多次李斯特菌。在另一個實施例中，李斯特菌以定期間隔施用，該間隔在一個實施例中可以為每天、每周、每兩周、每三周或每個月。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在一個實施例中，本發(fā)明提供其中僅施用一次放射療法的方法。在另一個實施例中，施用兩次放射療法。在另一個實施例中，施用三次放射療法。在另一個實施例中，施用四次放射療法。在另一個實施例中，施用四次以上放射療法。在另一個實施例中，施用多次放射療法。在另一個實施例中，放射療法以定期間隔施用，該間隔在一個實施例中可以為每天、每周、每兩周、每三周或每個月。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。在一個實施例中，放射療法在施用重組減毒李斯特菌之前施用。在另一個實施例中，放射療法在首次施用重組減毒李斯特菌之前已施用兩次。在另一個實施例中，放射療法在首次施用重組減毒李斯特菌之前已施用三次。在另一個實施例中，重組減毒李斯特菌在施用放射療法之前施用。在另一個實施例中，重組減毒李斯特菌在首次施用放射療法之前已施用兩次。在另一個實施例中，重組減毒李斯特菌在首次施用放射療法之前已施用三次。在另一個實施例中，術(shù)語“基因”和“重組基因”是指包含編碼本發(fā)明的多肽的開放閱讀框的核酸分子。此類天然等位基因變異通?？蓪?dǎo)致給定基因的核苷酸序列的1-5％變化?？赏ㄟ^多個不同個體或生物體中所關(guān)注的基因的測序鑒定替代等位基因。這易于通過使用雜交探針鑒定多個個體或生物體中相同的遺傳基因座來進行。作為天然等位基因變異的結(jié)果并且不改變功能活性的任何和所有此類核苷酸變異和所得的氨基酸多態(tài)性或變異均旨在在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。藥物組合物技術(shù)人員將會知道，術(shù)語“免疫原性組合物”、“組合物”和“藥物組合物”可互換使用。還應(yīng)理解的是，此類組合物的施用增強免疫應(yīng)答或增加T效應(yīng)細胞與調(diào)節(jié)性T細胞比率或者引起抗腫瘤免疫應(yīng)答，如本文進一步提供的。在一個實施例中，本文提供的免疫原性組合物包含本文提供的重組李斯特菌。在一個實施例中，“聯(lián)合療法”是指與本文提供的包含重組李斯特菌的組合物相結(jié)合或在其之前聯(lián)合施用本文所述的放射療法。在另一個實施例中，通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何方法，諸如腸胃外、癌旁側(cè)、經(jīng)粘膜、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、心室內(nèi)、顱內(nèi)、陰道內(nèi)或腫瘤內(nèi)將包含本發(fā)明的疫苗和組合物的藥物組合物施用于受試者。在本文提供的方法和組合物的另一個實施例中，該疫苗或組合物經(jīng)口施用，并因此將其被配制為適合經(jīng)口施用的形式，即，作為固體或液體制備物。適合的固體口服制劑包括片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、藥丸等。適合的液體口服制劑包括溶液、混懸液、分散劑、乳劑、油劑等。在本發(fā)明的另一個實施例中，將活性成分配制在膠囊中。根據(jù)該實施例，除活性化合物和惰性載體或稀釋劑之外，本發(fā)明的組合物還包括硬明膠膠囊。在另一個實施例中，通過靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)或肌肉內(nèi)注射液體制備物來以疫苗或組合物施用。適合的液體制劑包括溶液、混懸劑、分散劑、乳劑、油劑等。在一個實施例中，將藥物組合物靜脈內(nèi)施用，因此將其配制為適合靜脈內(nèi)施用的形式。在另一個實施例中，將藥物組合物動脈內(nèi)施用，因此將其配制為適合動脈內(nèi)施用的形式。在另一個實施例中，將藥物組合物肌肉內(nèi)施用，因此將其配制為適合肌肉內(nèi)施用的形式。在一個實施例中，本發(fā)明的組合物的重復(fù)施用(加強劑量)可在治療的第一療程后立即進行或在幾天、幾周或幾個月的間隔后進行，以實現(xiàn)腫瘤消退。在另一個實施例中，重復(fù)劑量可在治療的第一療程后立即進行或在幾天、幾周或幾個月的間隔后進行，以實現(xiàn)腫瘤生長的抑制。評估可通過本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)確定，包括診斷方法諸如成像技術(shù)、血清腫瘤標(biāo)志物分析、活組織檢查、腫瘤相關(guān)癥狀的存在、不存在或改善。在一個實施例中，受試者每1-2周、每2-3周、每3-4周、每4-5周、每6-7周、每7-8周或每9-10周施用一次加強劑量以實現(xiàn)預(yù)期的抗腫瘤應(yīng)答。在一個實施例中，受試者每1-2個月、每2-3個月、每3-4個月、每4-5個月、每6-7個月、每7-8個月或每9-10個月施用一次加強劑量以實現(xiàn)預(yù)期的抗腫瘤應(yīng)答。在一個實施例中，術(shù)語“治療”是指治愈疾病。在另一個實施例中，“治療”是指防止疾病。在另一個實施例中，“治療”是指減少疾病的發(fā)生。在另一個實施例中，“治療”是指改善疾病的癥狀。在另一個實施例中，“治療”是指提高患者的無進展存活期或總體存活期。在另一個實施例中，“治療”是指穩(wěn)定疾病的進展。在另一個實施例中，“治療”是指誘導(dǎo)緩解。在另一個實施例中，“治療”是指減緩疾病的進展。在另一個實施例中，術(shù)語“減少”、“阻遏”和“抑制”是指減輕或降低。每種可能性代表了本發(fā)明的獨立實施例。如本文所用，術(shù)語“約”是數(shù)量術(shù)語，意指加或減5％，或在另一個實施例中，加或減10％，或在另一個實施例中，加或減15％，或在另一個實施例中，加或減20％。技術(shù)人員理解，術(shù)語“受試者”可涵蓋哺乳動物，包括需要治療病癥或其后遺癥或易受其影響的人類成人或兒童、少年或青少年，并且還可包括非人類哺乳動物，諸如狗、貓、豬、乳牛、綿羊、山羊、馬、大鼠和小鼠。應(yīng)當(dāng)理解，該術(shù)語可以涵蓋家畜。術(shù)語”受試者”不排除在所有方面都正常的個體。在一個實施例中，術(shù)語“受試者”還涵蓋不能經(jīng)受截肢的人。在另一個實施例中，術(shù)語“受試者”還涵蓋不能經(jīng)受手術(shù)的人。在另一個實施例中，術(shù)語“受試者”還涵蓋不能經(jīng)受截肢的人。技術(shù)人員將會知道，出于治療目的，術(shù)語“哺乳動物”是指被歸為哺乳動物的任何動物，包括但不限于人、家畜和農(nóng)畜以及動物園、比賽動物或?qū)櫸铮T如包括狗的犬科動物和馬、貓、黃牛、豬、綿羊等。涉及腫瘤治療的“治療有效量”是指能夠產(chǎn)生一種或多種以下效應(yīng)的量：(1)在一定程度上抑制腫瘤生長，包括減緩和完全生長停滯；(2)減少腫瘤細胞的數(shù)量；(3)減小腫瘤的大??；(4)抑制(即，減少、緩解或完全阻止)腫瘤細胞浸潤外周器官；(5)抑制(即，減少、緩解或完全阻止)轉(zhuǎn)移；(6)增強抗腫瘤免疫應(yīng)答，這可以(但不一定)導(dǎo)致腫瘤消退或排斥；和/或(7)在一定程度上減輕與失調(diào)相關(guān)的一個或多個癥狀。出于腫瘤治療的目的，本文提供的疫苗的“治療有效量”可憑經(jīng)驗以及以慣例方式確定。在一個實施例中，用于本發(fā)明的方法的組合物包含編碼代謝酶的第二開放閱讀框，其中所述代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中突變的內(nèi)源性基因。在另一個實施例中，該代謝酶互補在所述重組減毒李斯特菌菌株的染色體中缺乏的內(nèi)源性基因。在一個實施例中，“突變的”或“突變體”描述缺失。在另一個實施例中，“突變的”或“突變體”描述失活。在另一個實施例中，“突變的”或“突變體”描述截短。在另一個實施例中，“突變的”或“突變體”描述添加。在另一個實施例中，“突變的”或“突變體”描述置換。在另一個實施例中，“突變的”或“突變體”描述提前終止密碼子的插入。在另一個實施例中，“突變的”或“突變體”描述對基因內(nèi)一個或多個核酸的改變，該改變破壞基因的表達。在一個實施例中，“放射療法”或“放療”是指電離輻射作為癌癥治療的一部分以控制或根治惡性細胞的醫(yī)學(xué)用途。放療可用于治愈性、輔助性或姑息性治療。放療的合適類型包括常規(guī)外照射放療、立體定向放射療法(例如亞瑟刀(Axesse)、射波刀(Cyberknife)、伽馬刀(GammaKnife)、諾力刀(Novalis)、Primatom、Synergy、X線刀(X-Knife)、螺旋刀(TomoTherapy)或Trilogy)、調(diào)強放射療法、粒子療法(例如質(zhì)子療法)、短程療法、遞送放射性同位素、術(shù)中放療、Auger療法、容積旋轉(zhuǎn)調(diào)強療法(VMAT)、虛擬仿真、三維適形放射療法和調(diào)強放射療法等。應(yīng)當(dāng)理解，該列表無意為限制性的。在一個實施例中，放射療法使用高能放射使腫瘤縮小并殺死癌細胞。在一個實施例中，X射線、伽馬射線和帶電粒子是可用于治療癌癥的放射類型。在一個實施例中，放射療法通過直接損壞癌細胞的DNA或通過在細胞內(nèi)形成自由基繼而可損壞DNA來殺死癌細胞。在一個實施例中，放射療法可通過身體之外的機器遞送(外照射放射療法)，或在另一個實施例中其可來自置于體內(nèi)的癌細胞附近的放射性物質(zhì)(內(nèi)放射療法，也稱為短程療法)。在一個實施例中，全身放射療法使用在血液中流動以殺死癌細胞的放射性物質(zhì)，諸如放射性碘。在一個實施例中，本發(fā)明提供使用與免疫療法相結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)放射來同時治療對放射不敏感的癌癥諸如骨肉瘤的方法，諸如在需要較短放射治療時間的方案中施用重組李斯特菌，從而緩和通常與放射治療相關(guān)的副作用。在一個實施例中，放射根據(jù)本發(fā)明通過采用標(biāo)準(zhǔn)巨電壓設(shè)備(諸如AECLTheratron80、VarianClinac4或VarianClinac)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來施用。在一個實施例中，放射門(radiationportal)的最大尺寸不應(yīng)超過300cm2。在一個實施例中，合適的劑量介于約15Gy與35Gy之間，具體的劑量取決于進行治療的身體面積。因此，針對脊髓的劑量將為約35Gy，而針對雙側(cè)腎的劑量將為約15Gy，針對整個肝臟的劑量將為20Gy。治療的中斷由臨床醫(yī)生考慮到患者對放射療法的耐受性而決定。在另一個實施例中，在聯(lián)合療法中的放射劑量按順序施用。在另一個實施例中，在聯(lián)合療法中的放射劑量如本文示例性示出的那樣連續(xù)數(shù)天施用(參見實例11)。在另一個實施例中，在聯(lián)合療法中連續(xù)數(shù)天給予8Gy的放射劑量，總劑量為16Gy，然后每3周一次給予多個劑量(最多8個)的ADXS31-164，如在本文的實例中所示(參見實例11)。在另一個實施例中，在聯(lián)合療法中連續(xù)數(shù)天給予8Gy的放射劑量，總劑量為16Gy，然后每3周一次給予多個劑量(最多8個)的最多3.3×109個CFU的ADXS31-164，如在本文的實例中所示(參見實例11)。在另一個實施例中，在聯(lián)合療法中連續(xù)數(shù)天給予8Gy的放射劑量，總劑量為16Gy，然后每3周一次給予多個劑量(最多8個)的3.3×109個CFU的ADXS31-164，如在本文的實例中所示(參見實例11)。在一個實施例中，本文提供的ADXS31-164的多劑量范圍為1-8、8-15、15-25個，或根據(jù)實現(xiàn)預(yù)期治療目標(biāo)的需要而定。在一個實施例中，為本文提供的聯(lián)合療法而施用的總放射劑量在70-80Gy的范圍內(nèi)。在另一個實施例中，為本文提供的聯(lián)合療法而施用的總放射劑量在10-26GY的范圍內(nèi)在另一個實施例中，按順序施用10-26GY范圍內(nèi)的放射劑量。在一個實施例中，該順序可以為每小時、每天、每周或每兩周。在一個實施例中，按順序施用70-80GY范圍內(nèi)的放射劑量。在另一個實施例中，施用10-26GY范圍內(nèi)的放射劑量。在另一個實施例中，對于成年男性而言，放射劑量為約α/β＝5.4Gy和μ＝1.73Gy-1。在一個實施例中，本發(fā)明中作為聯(lián)合療法的一部分所述的放射療法為姑息性放射療法。在一個實施例中，放射療法可出于姑息性目的而給予。在一個實施例中，姑息性治療旨在緩解癥狀并減輕癌癥或腫瘤導(dǎo)致的痛苦。在另一個實施例中，本文作為聯(lián)合療法的一部分所述的放射療法旨在治愈癌癥或腫瘤。為了更充分地舉例說明本發(fā)明的優(yōu)選實施例，提供了以下實例。然而，它們絕不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的廣泛范圍。實例材料和方法寡核苷酸由Invitrogen(Carlsbad,CA)合成，DNA測序由GenewizInc,SouthPlainfield,NJ進行。流式細胞術(shù)試劑購自BectonDickinsonBiosciences(BD,SanDiego,CA)。除非另外指明，否則細胞培養(yǎng)基、補充劑和所有其他試劑均購自Sigma(St.Louise,MO)。Her-2/neuHLA-A2肽由EZbiolabs(Westfield,IN)合成。完全RPMI1640(C-RPMI)培養(yǎng)基包含2mM谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸和1mM丙酮酸鈉、10％胎牛血清、青霉素/鏈霉素、Hepes(25mM)。多克隆抗LLO抗體如上文所述，并且抗Her-2/neu抗體購自Sigma。小鼠和細胞系所有動物實驗均根據(jù)UniversityofPennsylvania或RutgersUniversity的IACUC批準(zhǔn)的方案進行。FVB/N小鼠購自Jacksonlaboratories(BarHarbor,ME)。過表達大鼠Her-2/neu癌蛋白的FVB/NHer-2/neu轉(zhuǎn)基因小鼠關(guān)在UniversityofPennsylvania的動物飼養(yǎng)中心(animalcorefacility)并繁殖。表達高水平的大鼠Her-2/neu蛋白的NT-2腫瘤細胞系來源于這些小鼠的自發(fā)性乳腺腫瘤，并且如上文所述生長。DHFR-G8(3T3/neu)細胞得自ATCC并且根據(jù)ATCC推薦方案生長。EMT6-Luc細胞系由JohnOhlfest博士(UniversityofMinnesota,MN)慷慨贈送，并在完全C-RPMI培養(yǎng)基中生長。生物熒光工作在UniversityofPennsylvania(Philadelphia,PA)的SmallAnimalImagingFacility(SAIF)的指導(dǎo)下進行。李斯特菌構(gòu)建體和抗原表達Her-2/neu-pGEM7Z由UniversityofPennsylvania的MarkGreene博士友情提供，并且包含克隆至pGEM7Z質(zhì)粒(Promega,MadisonWI)的全長人Her-2/neu(hHer2)基因。將該質(zhì)粒用作模板，以使用表1所示的pfxDNA聚合酶(Invitrogen)和寡聚物，通過PCR擴增hHer-2/neu的三個區(qū)段，即EC1、EC2和IC1。表2：用于克隆人her-2嵌合體的引物表2通過SOEingPCR方法，并將每個單獨的hHer-2/neu區(qū)段作為模板，通過直接融合產(chǎn)生Her-2/neu嵌合構(gòu)建體。引物顯示在表3中。用于擴增不同區(qū)段人Her2區(qū)域的引物的序列。表3使用XhoI和SpeI限制性酶從pAdv138切下ChHer2基因，并與Lmdd穿梭載體pAdv134中截短的LLO非溶血片段在同一閱讀框內(nèi)克隆。插入序列LLO和hly啟動子通過DNA測序分析確認。將該質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)化至電感受態(tài)actA、dal、dat突變單核細胞增多性李斯特菌菌株，在包含鏈霉素(250μg/ml)的腦心浸液(BHI)瓊脂平板上選擇LmddA和陽性克隆。在一些實驗中，將表達hHer-2/neu(Lm-hHer2)片段的類似李斯特菌菌株用于對比目的。這些內(nèi)容在上文有所描述。在所有研究中，包括不相關(guān)李斯特菌構(gòu)建體(Lm-對照)，以考慮到李斯特菌對免疫系統(tǒng)的抗原非依賴性效應(yīng)。Lm-對照基于與ADXS31-164相同的李斯特菌平臺，但表達不同的抗原，諸如HPV16-E7或NY-ESO-1。測試李斯特菌的融合蛋白的表達和分泌。每個構(gòu)建體體內(nèi)傳代兩次。細胞毒性分析以3-5只FVB/N小鼠為一組，使用1×108個集落形成單位(CFU)的Lm-LLO-ChHer2、ADXS31-164、Lm-hHer2ICI或Lm-對照(表達不相關(guān)抗原)以一周為間隔免疫三次或保持未暴露的。使NT-2細胞體外生長，通過胰蛋白酶脫壁，并用絲裂霉素C(250μg/ml，溶于無血清C-RPMI培養(yǎng)基)在37℃下處理45分鐘。在洗滌5次后，將其與從免疫或未暴露的動物收集的脾細胞以1:5(刺激因子:應(yīng)答細胞)的比率在37℃和5％CO2下一起溫育5天。標(biāo)準(zhǔn)細胞毒性分析使用銪標(biāo)記的3T3/neu(DHFR-G8)細胞作為靶標(biāo)根據(jù)前述方法進行。在4小時溫育后使用分光光度計(PerkinElmer，Victor2)在590nm下測定從殺死的靶細胞釋放的銪。特異性裂解的百分比定義為(實驗組的裂解-自發(fā)性裂解)/(最大裂解-自發(fā)性裂解)。免疫小鼠的脾細胞分泌的干擾素-γ以3-5只FVB/N或HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠為一組，使用1×108個CFU的陰性李斯特菌對照ADXS31-164(表達不相關(guān)抗原)以一周為間隔免疫三次或保持未暴露的。在最后免疫后一周分離FVB/N小鼠的脾細胞，并以5×106個細胞/孔在24孔板中的C-RPMI培養(yǎng)基中在存在絲裂霉素C處理的NT-2細胞的情況下共培養(yǎng)。在1μMHLA-A2特異性肽或1μg/ml重組His-標(biāo)記的ChHer2蛋白(大腸桿菌中產(chǎn)生并且通過基于鎳的親和色譜系統(tǒng)純化)存在下，溫育來自HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠的脾細胞。在24或72小時后從上清液獲得樣品，使用小鼠IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)試劑盒根據(jù)制造商的推薦方案測試干擾素-γ(IFN-γ)的存在。INF-γELISpot分析在每個指定的時間點解凍冷藏的PBMC，在37℃下放置過夜，然后計數(shù)。細胞用2.5μM重疊人Her-2/neu肽庫(11個單位重疊5個氨基酸)(表示嵌合疫苗中存在的Her-2/neu的EC1、EC2和IC1域)和重組人IL-2(Invitrogen,Fredrick,MD)刺激5天。收集細胞，在1×PBS中洗滌兩次并計數(shù)。IFN-γELISpot分析使用商業(yè)化犬科動物IFN-γELISpot分析試劑盒(R&DSystems,Minneapolis,MN)根據(jù)制造商的方案進行。簡而言之，將0.8-2×105個經(jīng)刺激的細胞與2.5μMEC1、EC2或IC1肽庫加上IL-2或單獨的IL-2(以測定背景計數(shù))一起溫育。所有分析一式兩份地進行。根據(jù)制造商的說明對平板顯色。使用CTL-Immunospot分析儀(C.T.L,ShakerHeights,OH)對斑點進行計數(shù)。斑點的數(shù)量通過減去未刺激孔中的斑點數(shù)量的兩倍進行歸一化。Her2轉(zhuǎn)基因動物中的腫瘤研究六周齡FVB/N大鼠Her-2/neu轉(zhuǎn)基因小鼠(9-14只/組)使用5×108個CFU的Lm-LLO-ChHer2、ADXS31-164或Lm-對照免疫6次。每周觀察自發(fā)性乳腺腫瘤的出現(xiàn)兩次，使用電子卡尺測量腫瘤，最多52周。當(dāng)平均直徑大小達到1cm2時切下逃逸的腫瘤，在-20℃下保存于RNAlater中°。為確定Her-2/neu蛋白中的突變對這些腫瘤逃逸的影響，使用基因組DNA分離試劑盒提取基因組DNA，并測序。ADXS31-164對脾臟和腫瘤中調(diào)節(jié)性T細胞的作用將小鼠皮下(s.c.)植入1×106個NT-2細胞。在第7、14和21天，使用1×108個CFU的ADXS31-164、LmddA-對照對它們進行免疫或保持未暴露的。在第28天提取腫瘤和脾臟并通過FACS分析測試CD3+/CD4+/FoxP3+Treg的存在。簡而言之，通過在C-RPMI培養(yǎng)基中勻化兩個載玻片之間的脾臟而分離脾細胞。使用無菌刀片切碎腫瘤，并用包含DNA酶(12U/ml)和溶于PBS的膠原酶(2mg/ml)的緩沖液消化。在室溫下攪拌溫育60min后，通過猛烈吹打而分離細胞。用RBC裂解緩沖液裂解紅細胞，然后用包含10％FBS的完全RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌多次。在通過尼龍網(wǎng)過濾后，將腫瘤細胞和脾細胞重懸于FACS緩沖液(2％FBS/PBS)中，用抗CD3-PerCP-Cy5.5、CD4-FITC、CD25-APC抗體染色，然后進行透化和抗Foxp3-PE染色。使用4色FACScalibur(BD)進行流式細胞分析，使用cellquest軟件(BD)分析數(shù)據(jù)。統(tǒng)計學(xué)分析將對數(shù)秩卡方檢驗用于存活期數(shù)據(jù)，并將學(xué)生t-檢驗用于CTL和ELISA分析，所述分析一式三份地進行。在這些分析中，小于0.05的p-值(以*標(biāo)記)被視為具有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性。所有統(tǒng)計學(xué)分析均使用Prism軟件V.4.0a(2006)或SPSS軟件V.15.0(2006)進行。對于所有FVB/N大鼠Her-2/neu轉(zhuǎn)基因研究，我們使用了8-14只小鼠/組，對于所有野生型FVB/N研究，我們使用了至少8只小鼠/組，除非另外指明。除Her-2/neu轉(zhuǎn)基因小鼠模型中的長期腫瘤研究外，所有研究重復(fù)至少一次。實例1：產(chǎn)生分泌融合至Her-2片段的LLO片段的單核細胞增多性李斯特菌菌株：ADXS31-164的構(gòu)建。嵌合Her-2/neu基因(ChHer2)的構(gòu)建如上文所述。簡而言之，ChHer2基因通過SOEingPCR法直接融合Her-2/neu蛋白的兩個胞外片段(aa40-170和aa359-433)和一個胞內(nèi)片段(aa678-808)來制備。嵌合蛋白具有蛋白的大部分已知的人MHCI類表位。從質(zhì)粒pAdv138(其用于構(gòu)建Lm-LLO-ChHer2)切下ChHer2基因并克隆至LmddA穿梭質(zhì)粒中，得到質(zhì)粒pAdv164(圖1A)。這兩個質(zhì)粒骨架之間有兩個主要差異。1)pAdv138使用氯霉素抗性標(biāo)記(cat)進行重組細菌的體外選擇，而pAdv164具有枯草芽孢桿菌的D-丙氨酸消旋酶基因(dal)，它使用缺乏dal-dat基因的LmddA菌株中的體外選擇和體內(nèi)質(zhì)粒保持的代謝互補途徑。此疫苗平臺被設(shè)計和開發(fā)成解決FDA對工程化李斯特菌疫苗株的抗生素抗性的關(guān)注。2)與pAdv138不同，pAdv164不具有質(zhì)粒中的prfA基因拷貝(參見以下序列和圖1A)，因為這不是Lmdd菌株的體內(nèi)互補必需的。LmddA疫苗株還缺乏actA基因(負責(zé)李斯特菌的胞內(nèi)移動和細胞間播散)，因此來源于此骨架的重組疫苗株的毒性比來源于其親代菌株Lmdd的那些小100倍?；贚mddA的疫苗從免疫小鼠脾臟的清除也比基于Lmdd的疫苗快(在不到48小時內(nèi))。來自此菌株的融合蛋白tLLO-ChHer2的表達和分泌與在體外生長8小時后TCA沉淀細胞培養(yǎng)上清液中的Lm-LLO-ChHer2相當(dāng)(圖1B)，因為使用Western印跡分析通過抗LLO抗體檢測到～104KD的條帶。僅表達tLLO的李斯特菌骨架菌株用作陰性對照。pAdv164序列(7075個堿基對)(參見圖1)：cggagtgtatactggcttactatgttggcactgatgagggtgtcagtgaagtgcttcatgtggcaggagaaaaaaggctgcaccggtgcgtcagcagaatatgtgatacaggatatattccgcttcctcgctcactgactcgctacgctcggtcgttcgactgcggcgagcggaaatggcttacgaacggggcggagatttcctggaagatgccaggaagatacttaacagggaagtgagagggccgcggcaaagccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacgaaatctgacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggcggctccctcgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcattccgctgttatggccgcgtttgtctcattccacgcctgacactcagttccgggtaggcagttcgctccaagctggactgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggaaagacatgcaaaagcaccactggcagcagccactggtaattgatttagaggagttagtcttgaagtcatgcgccggttaaggctaaactgaaaggacaagttttggtgactgcgctcctccaagccagttacctcggttcaaagagttggtagctcagagaaccttcgaaaaaccgccctgcaaggcggttttttcgttttcagagcaagagattacgcgcagaccaaaacgatctcaagaagatcatcttattaatcagataaaatatttctagccctcctttgattagtatattcctatcttaaagttacttttatgtggaggcattaacatttgttaatgacgtcaaaaggatagcaagactagaataaagctataaagcaagcatataatattgcgtttcatctttagaagcgaatttcgccaatattataattatcaaaagagaggggtggcaaacggtatttggcattattaggttaaaaaatgtagaaggagagtgaaacccatgaaaaaaataatgctagtttttattacacttatattagttagtctaccaattgcgcaacaaactgaagcaaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccatggcaccaccagcatctccgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaaatcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacggagatgcagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgttgtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgcaatttcgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaatcaaccagatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggtatgactaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgccactaaatcaaacgttaacaacgcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttatccaaatgtaagtgcaaaaattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttggtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagtgaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgttaatgaacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaagcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgtcaagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgatgctgccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaattcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgacggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccaggagttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaacatcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattatgatctcgagacccacctggacatgctccgccacctctaccagggctgccaggtggtgcagggaaacctggaactcacctacctgcccaccaatgccagcctgtccttcctgcaggatatccaggaggtgcagggctacgtgctcatcgctcacaaccaagtgaggcaggtcccactgcagaggctgcggattgtgcgaggcacccagctctttgaggacaactatgccctggccgtgctagacaatggagacccgctgaacaataccacccctgtcacaggggcctccccaggaggcctgcgggagctgcagcttcgaagcctcacagagatcttgaaaggaggggtcttgatccagcggaacccccagctctgctaccaggacacgattttgtggaagaatatccaggagtttgctggctgcaagaagatctttgggagcctggcatttctgccggagagctttgatggggacccagcctccaacactgccccgctccagccagagcagctccaagtgtttgagactctggaagagatcacaggttacctatacatctcagcatggccggacagcctgcctgacctcagcgtcttccagaacctgcaagtaatccggggacgaattctgcacaatggcgcctactcgctgaccctgcaagggctgggcatcagctggctggggctgcgctcactgagggaactgggcagtggactggccctcatccaccataacacccacctctgcttcgtgcacacggtgccctgggaccagctctttcggaacccgcaccaagctctgctccacactgccaaccggccagaggacgagtgtgtgggcgagggcctggcctgccaccagctgtgcgcccgagggcagcagaagatccggaagtacacgatgcggagactgctgcaggaaacggagctggtggagccgctgacacctagcggagcgatgcccaaccaggcgcagatgcggatcctgaaagagacggagctgaggaaggtgaaggtgcttggatctggcgcttttggcacagtctacaagggcatctggatccctgatggggagaatgtgaaaattccagtggccatcaaagtgttgagggaaaacacatcccccaaagccaacaaagaaatcttagacgaagcatacgtgatggctggtgtgggctccccatatgtctcccgccttctgggcatctgcctgacatccacggtgcagctggtgacacagcttatgccctatggctgcctcttagactaatctagacccgggccactaactcaacgctagtagtggatttaatcccaaatgagccaacagaaccagaaccagaaacagaacaagtaacattggagttagaaatggaagaagaaaaaagcaatgatttcgtgtgaataatgcacgaaatcattgcttatttttttaaaaagcgatatactagatataacgaaacaacgaactgaataaagaatacaaaaaaagagccacgaccagttaaagcctgagaaactttaactgcgagccttaattgattaccaccaatcaattaaagaagtcgagacccaaaatttggtaaagtatttaattactttattaatcagatacttaaatatctgtaaacccattatatcgggtttttgaggggatttcaagtctttaagaagataccaggcaatcaattaagaaaaacttagttgattgccttttttgttgtgattcaactttgatcgtagcttctaactaattaattttcgtaagaaaggagaacagctgaatgaatatcccttttgttgtagaaactgtgcttcatgacggcttgttaaagtacaaatttaaaaatagtaaaattcgctcaatcactaccaagccaggtaaaagtaaaggggctatttttgcgtatcgctcaaaaaaaagcatgattggcggacgtggcgttgttctgacttccgaagaagcgattcacgaaaatcaagatacatttacgcattggacaccaaacgtttatcgttatggtacgtatgcagacgaaaaccgttcatacactaaaggacattctgaaaacaatttaagacaaatcaataccttctttattgattttgatattcacacggaaaaagaaactatttcagcaagcgatattttaacaacagctattgatttaggttttatgcctacgttaattatcaaatctgataaaggttatcaagcatattttgttttagaaacgccagtctatgtgacttcaaaatcagaatttaaatctgtcaaagcagccaaaataatctcgcaaaatatccgagaatattttggaaagtctttgccagttgatctaacgtgcaatcattttgggattgctcgtataccaagaacggacaatgtagaattttttgatcccaattaccgttattctttcaaagaatggcaagattggtctttcaaacaaacagataataagggctttactcgttcaagtctaacggttttaagcggtacagaaggcaaaaaacaagtagatgaaccctggtttaatctcttattgcacgaaacgaaattttcaggagaaaagggtttagtagggcgcaatagcgttatgtttaccctctctttagcctactttagttcaggctattcaatcgaaacgtgcgaatataatatgtttgagtttaataatcgattagatcaacccttagaagaaaaagaagtaatcaaaattgttagaagtgcctattcagaaaactatcaaggggctaatagggaatacattaccattctttgcaaagcttgggtatcaagtgatttaaccagtaaagatttatttgtccgtcaagggtggtttaaattcaagaaaaaaagaagcgaacgtcaacgtgttcatttgtcagaatggaaagaagatttaatggcttatattagcgaaaaaagcgatgtatacaagccttatttagcgacgaccaaaaaagagattagagaagtgctaggcattcctgaacggacattagataaattgctgaaggtactgaaggcgaatcaggaaattttctttaagattaaaccaggaagaaatggtggcattcaacttgctagtgttaaatcattgttgctatcgatcattaaattaaaaaaagaagaacgagaaagctatataaaggcgctgacagcttcgtttaatttagaacgtacatttattcaagaaactctaaacaaattggcagaacgccccaaaacggacccacaactcgatttgtttagctacgatacaggctgaaaataaaacccgcactatgccattacatttatatctatgatacgtgtttgtttttctttgctggctagcttaattgcttatatttacctgcaataaaggatttcttacttccattatactcccattttccaaaaacatacggggaacacgggaacttattgtacaggccacctcatagttaatggtttcgagccttcctgcaatctcatccatggaaatatattcatccccctgccggcctattaatgtgacttttgtgcccggcggatattcctgatccagctccaccataaattggtccatgcaaattcggccggcaattttcaggcgttttcccttcacaaggatgtcggtccctttcaattttcggagccagccgtccgcatagcctacaggcaccgtcccgatccatgtgtctttttccgctgtgtactcggctccgtagctgacgctctcgccttttctgatcagtttgacatgtgacagtgtcgaatgcagggtaaatgccggacgcagctgaaacggtatctcgtccgacatgtcagcagacgggcgaaggccatacatgccgatgccgaatctgactgcattaaaaaagccttttttcagccggagtccagcggcgctgttcgcgcagtggaccattagattctttaacggcagcggagcaatcagctctttaaagcgctcaaactgcattaagaaatagcctctttctttttcatccgctgtcgcaaaatgggtaaatacccctttgcactttaaacgagggttgcggtcaagaattgccatcacgttctgaacttcttcctctgtttttacaccaagtctgttcatccccgtatcgaccttcagatgaaaatgaagagaaccttttttcgtgtggcgggctgcctcctgaagccattcaacagaataacctgttaaggtcacgtcatactcagcagcgattgccacatactccgggggaaccgcgccaagcaccaatataggcgccttcaatccctttttgcgcagtgaaatcgcttcatccaaaatggccacggccaagcatgaagcacctgcgtcaagagcagcctttgctgtttctgcatcaccatgcccgtaggcgtttgctttcacaactgccatcaagtggacatgttcaccgatatgttttttcatattgctgacattttcctttatcgcggacaagtcaatttccgcccacgtatctctgtaaaaaggttttgtgctcatggaaaactcctctcttttttcagaaaatcccagtacgtaattaagtatttgagaattaattttatattgattaatactaagtttacccagttttcacctaaaaaacaaatgatgagataatagctccaaaggctaaagaggactataccaactatttgttaattaa(SEDIDNO:53)實例2：ADXS31-164的免疫原性與LM-LLO-ChHER2一樣。在標(biāo)準(zhǔn)CTL分析中將ADXS31-164產(chǎn)生抗Her-2/neu特異性細胞毒性T細胞的免疫原性與Lm-LLO-ChHer2疫苗進行比較。兩種疫苗均引起對3T3/neu靶細胞表達的Her-2/neu抗原的強烈但類似的細胞毒性T細胞應(yīng)答。因此，使用僅表達融合至LLO的Her2胞內(nèi)片段的李斯特菌免疫的小鼠顯示出比包含多個MHCI類表位的嵌合體更低的裂解活性。在未暴露的動物或不相關(guān)李斯特菌疫苗注射的小鼠中未檢測到CTL活性(圖2A)。ADXS31-164也能夠刺激野生型FVB/N小鼠的脾細胞分泌IFN-γ(圖2B)。這在與絲裂霉素C處理的NT-2細胞(表達高水平的Her-2/neu抗原)共培養(yǎng)的這些細胞的培養(yǎng)上清液中檢測到(圖5C)。在HLA-A2小鼠中測試了ADXS31-164免疫后人MHCI類表位的適當(dāng)處理和呈遞。將來自經(jīng)免疫的HLA-A2轉(zhuǎn)基因動物的脾細胞與對應(yīng)于標(biāo)繪的HLA-A2限制性表位的肽一起溫育72小時，所述HLA-A2限制性表位位于Her-2/neu分子的胞外(HLYQGCQVVSEQIDNO:11或KIFGSLAFLSEQIDNO:12)或胞內(nèi)(RLLQETELVSEQIDNO:13)域。重組ChHer2蛋白用作陽性對照，不相關(guān)肽或無肽作為陰性對照。該實驗的數(shù)據(jù)顯示，ADXS31-164能夠引起對位于靶抗原的不同域的人表位的抗Her-2/neu特異性免疫應(yīng)答。實例3：ADXS31-164抑制自發(fā)性乳腺腫瘤的發(fā)病比LM-LLO-ChHER2更有效。將ADXS31-164的抗腫瘤效應(yīng)與Her-2/neu轉(zhuǎn)基因動物中的Lm-LLO-ChHer2比較，該Her-2/neu轉(zhuǎn)基因動物在20-25周齡患上緩慢生長的自發(fā)性乳腺腫瘤。所有使用不相關(guān)李斯特菌對照疫苗免疫的動物在21-25周內(nèi)患上乳腺腫瘤并且在第33周前處死。相比之下，李斯特菌-Her-2/neu重組疫苗使乳腺腫瘤的形成顯著延緩。在第45周，超過50％的ADXS31-164疫苗接種的小鼠(9只中的5只)仍無腫瘤，相比之下，使用Lm-LLO-ChHer2免疫的小鼠只有25％。在第52周，使用ADXS31-164免疫的8只小鼠中的2只仍無腫瘤，而其他實驗組的所有小鼠已死于疾病(圖3)。這些結(jié)果表明，盡管是減毒程度更高的，但ADXS31-164防止Her-2/neu轉(zhuǎn)基因動物的自發(fā)性乳腺腫瘤的發(fā)病比Lm-LLO-ChHer2更有效。實例4：ADXS31-164免疫時HER-2/NEU基因的突變。Her-2/neu的MHCI類表位的突變已被視為在小片段疫苗或曲妥單抗(Herceptin)(一種靶向Her-2/neu的胞外域中的表位的單克隆抗體)免疫時負責(zé)腫瘤逃逸。為評估該作用，從轉(zhuǎn)基因動物中的逃逸腫瘤提取基因組物質(zhì)，并對嵌合或?qū)φ找呙缑庖叩哪[瘤中neu基因的對應(yīng)片段進行測序。在任何接種疫苗的腫瘤樣品的Her-2/neu基因中均未觀察到突變，這提示替代性逃逸機制(數(shù)據(jù)未顯示)。實例5：ADXS31-164使腫瘤內(nèi)調(diào)節(jié)性T細胞顯著減少。為闡明ADXS31-164對脾臟和腫瘤中調(diào)節(jié)性T細胞頻率的影響，將NT-2腫瘤細胞植入小鼠。在三次免疫后分離脾細胞和腫瘤內(nèi)淋巴細胞并對Treg染色，Treg定義為CD3+/CD4+/CD25+/FoxP3+細胞，但是當(dāng)單獨分析時，F(xiàn)oxP3或CD25標(biāo)記獲得了類似的結(jié)果。結(jié)果表明，與不相關(guān)李斯特菌疫苗或未暴露的動物相比，ADXS31-164免疫對脾臟中Treg的頻率無影響(參見圖4)。相比之下，李斯特菌疫苗免疫對腫瘤中Treg的存在產(chǎn)生很大的影響(圖5A)。而未治療的腫瘤中平均而言所有CD3+T細胞的19.0％為Treg，對于不相關(guān)疫苗該頻率降低至4.2％，對于ADXS31-164降低至3.4％，腫瘤內(nèi)Treg的頻率降低5倍(圖5B)。任一LmddA疫苗治療的小鼠中腫瘤內(nèi)Treg的頻率降低不能歸因于腫瘤大小的差異。在代表性實驗中，ADXS31-164免疫的小鼠的腫瘤顯著小于[平均直徑(mm)±SD，6.71±0.43，n＝5]未治療的小鼠(8.69±0.98,n＝5,p<0.01)或不相關(guān)疫苗治療的小鼠(8.41±1.47,n＝5,p＝0.04)的腫瘤，而最后兩組的比較未顯示出腫瘤大小的統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異(p＝0.73)。LmddA疫苗處理的腫瘤中Treg頻率的下降使腫瘤內(nèi)CD8/Treg比率升高，暗示在LmddA疫苗免疫后可獲得更有利的腫瘤微環(huán)境。然而，只有表達靶抗原Her-2/neu的疫苗(ADXS31-164)能夠減緩腫瘤生長，表明Treg的減少僅在腫瘤中存在抗原特異性應(yīng)答的情況下具有作用。實例6：表達HER-2嵌合體的李斯特菌疫苗未引入逃逸突變。收集不同疫苗諸如Lm-LLO-138、LmddA164和不相關(guān)疫苗Lm-LLO-NY免疫的小鼠的腫瘤樣品。從這些樣品純化DNA，擴增Her-2/neu區(qū)域IC1、EC1和EC2對應(yīng)的DNA片段，并測序以確定是否存在任何免疫逃逸突變。使用CLUSTALW進行每個DNA的序列比對。分析結(jié)果表明，從腫瘤收集的DNA序列中無突變。參考序列在下面列出：EC2的比對(Her-2-neu的975-1029bp)GGTCACAGCTGAGGACGGAACACAGCGTTGTGAGAAATGCAGCAAGCCCTGTGCT(SEQIDNO:14)CGAGTGTGCTATGGTCTGGGCATGGAGCACCTTCGAGGGGCGAGGGCCATCACCAGTGAC(SEQIDNO:15)AATGTCCAGGAGTTTGATGGCTGCAAGAAGATCTTTGGGAGCCTGGCATTTTTGCCGGAG(SEQIDNo:16)AGCTTTGATGGGGACCCCTCCTCCGGCATTGCTCCGCTGAGGCCTGAGCAGCTCCAAGTG(SEQIDNo:17)TTCGAAACCCTGGAGGAGATCACAGGTTACCTGTACATCTCAGCATGGCCAGACAGTCTC(SEQIDNO:18)CGTGACCTCAGTGTCTTCCAGAACCTTCGAATCATTCGGGGACGGATTCTCCACGATGGC(SEQIDNO:19)GCGTACTCATTGACACTGCAAGGCCTGGGGATCCACTCGCTGGGGCTGCGCTCACTGCGG(SEQIDNO:20)GAGCTGGGCAGTGGATTGGCTCTGATTCACCGCAACGCCCATCTCTGCTTTGTACACACT(SEQIDNO:21)GTACCTTGGGACCAGCTCTTCCGGAACCCACATCAGGCCCTGCTCCACAGTGGGAACCGG(SEQIDNO:22)CCGGAAGAGGATTGTGGTCTCGAGGGCTTGGTCTGTAACTCACTGTGTGCCCACGGGCAC(SEQIDNO:23)TGCTGGGGGCCAGGGCCCACCCAGTGTGTCAACTGCAGTCATTTCCTTCGGGGCCAGGAG(SEQIDNO:24)IC1的比對(Her-2-neu的2114-3042bp)CGCCCAGCGGAGCAATGCCCAACCAGGCTCAGATGCGGATCCTAAAAGAGACGGAGC(SEQIDNO:25)TAAGGAAGGTGAAGGTGCTTGGATCAGGAGCTTTTGGCACTGTCTACAAGGGCATCTGGA(SEQIDNO:26)TCCCAGATGGGGAGAATGTGAAAATCCCCGTGGCTATCAAGGTGTTGAGAGAAAACACAT(SEQIDNO:27)CTCCTAAAGCCAACAAAGAAATTCTAGATGAAGCGTATGTGATGGCTGGTGTGGGTTCTC(SEQIDNO:28)CGTATGTGTCCCGCCTCCTGGGCATCTGCCTGACATCCACAGTACAGCTGGTGACACAGC(SEQIDNO:29)TTATGCCCTACGGCTGCCTTCTGGACCATGTCCGAGAACACCGAGGTCGCCTAGGCTCCC(SEQIDNO:30)AGGACCTGCTCAACTGGTGTGTTCAGATTGCCAAGGGGATGAGCTACCTGGAGGACGTGC(SEQIDNO:31)GGCTTGTACACAGGGACCTGGCTGCCCGGAATGTGCTAGTCAAGAGTCCCAACCACGTCA(SEQIDNO:32)AGATTACAGATTTCGGGCTGGCTCGGCTGCTGGACATTGATGAGACAGAGTACCATGCAG(SEQIDNO:33)ATGGGGGCAAGGTGCCCATCAAATGGATGGCATTGGAATCTATTCTCAGACGCCGGTTCA(SEQIDNO:34)CCCATCAGAGTGATGTGTGGAGCTATGGAGTGACTGTGTGGGAGCTGATGACTTTTGGGG(SEQIDNO:35)CCAAACCTTACGATGGAATCCCAGCCCGGGAGATCCCTGATTTGCTGGAGAAGGGAGAA(SEQIDNO:36)CGCCTACCTCAGCCTCCAATCTGCACCATTGATGTCTACATGATTATGGTCAAATGTT(SEQIDNO:37)GGATGATTGACTCTGAATGTCGCCCGAGATTCCGGGAGTTGGTGTCAGAATTTT(SEQIDNO:38)CACGTATGGCGAGGGACCCCCAGCGTTTTGTGGTCATCCAGAACGAGGACTT(SEQIDNO:39)EC1的比對(Her-2-neu的399-758bp)CCCAGGCAGAACCCCAGAGGGGCTGCGGGAGCTGCAGCTTCGAAGTCTCACAGAGATCCT(SEQIDNO:40)GAAGGGAGGAGTTTTGATCCGTGGGAACCCTCAGCTCTGCTACCAGGACATGGTTTTGTG(SEQIDNO:41)CCGGGCCTGTCCACCTTGTGCCCCCGCCTGCAAAGACAATCACTGTTGGGGTGAGAGTCC(SEQIDNO:42)GGAAGACTGTCAGATCTTGACTGGCACCATCTGTACCAGTGGTTGTGCCCGGTGCAAGGG(SEQIDNO:43)CCGGCTGCCCACTGACTGCTGCCATGAGCAGTGTGCCGCAGGCTGCACGGGCCCCAAGCA(SEQIDNO:44)實例7：ADXS31-164的外周免疫可延緩腦中轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞系的生長。使用ADXS31-164或不相關(guān)Lm-對照疫苗IP免疫小鼠，然后顱內(nèi)植入5,000個表達熒光素酶和低水平Her-2/neu的EMT6-Luc腫瘤細胞(圖6C)。在接種后的不同時間通過麻醉小鼠的離體成像監(jiān)測腫瘤。在腫瘤接種后第8天，檢測所有對照動物中的腫瘤，但ADXS31-164中的小鼠均未顯示出任何可檢測的腫瘤(圖6A和B)。ADXS31-164可明顯延緩這些腫瘤的發(fā)病，因為在腫瘤接種后第11天陰性對照組中的所有小鼠已死于腫瘤，但ADXS31-164組中的所有小鼠仍然存活，并且僅顯示出少量腫瘤生長的跡象。這些結(jié)果強烈暗示，ADXS31-164的外周施用得到的免疫應(yīng)答可能到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并且基于LmddA的疫苗可具有治療CNS腫瘤的潛在用途。實例8：通過ADXS31-164免疫治療犬科動物骨肉瘤。犬科動物骨肉瘤是長(腿)骨的癌癥，是年齡超過10歲的大狗的主要殺手。標(biāo)準(zhǔn)治療是在診斷后立即截肢，然后化療。然而，不變的是癌癥轉(zhuǎn)移到肺。與未治療的6-12個月存活期相比，通過化療可使狗存活約18個月。據(jù)信，HER2抗原存在于多達50％的骨肉瘤中。ADXS31-164對表達此抗原的細胞形成免疫攻擊，并且已開發(fā)用于治療人乳腺癌。組織學(xué)診斷為骨肉瘤并且具有惡性細胞表達HER2/neu的證據(jù)的狗符合入選資格。犬科動物骨肉瘤試驗在第一隊中，進行截肢，然后接受幾輪化療治療。隨后施用3劑Her-2疫苗，6個月間隔期后加強或不加強。所有狗接受4周的卡鉑治療。在最后卡鉑給藥后四周，狗每三周接受一次ADXS-HER2，總共給藥3次。第1組(3只狗)接受1×108個CFU/劑，第2組(3只狗)每只接受5×108個CFU/劑，第3組(3只狗)接受1×109個CFU/劑。如果觀察到潛在的劑量限制毒性，則向組中加入另外的狗以收集更多的數(shù)據(jù)。因此，在初步研究中可治療9-18只狗。在第二隊中，與第一隊相同重復(fù)治療，不同的是在化療前(1個月前)僅施用單劑疫苗，總共給藥4次。另外，在化療后一個月給兩隊施用單劑。實例9：評估ADXS-cHER2在患有HER-2/NEU過表達的犬科動物骨肉瘤的伴侶狗中的安全性的1期劑量遞增研究進行前期I期劑量遞增研究以確定可安全和有效地刺激患有骨肉瘤的狗的腫瘤特異性免疫的表達人Her-2/neu重組疫苗的單核細胞增多性李斯特菌的劑量。例行收集由于懷疑或確認患有OSA而提供給PennVet進行截肢的所有狗的腫瘤，并進行組織病理學(xué)評估以確認OSA的診斷。此外，通過IHC和Western印跡分析來評估所有狗的腫瘤切片，以確定腫瘤是否表達Her-2/neu。只有組織學(xué)診斷為OSA并且具有惡性細胞表達Her-2/neu的證據(jù)的狗才符合入選資格。冷藏在手術(shù)時采集的腫瘤組織的單細胞懸液，并在鉻釋放分析中用作自體腫瘤靶標(biāo)，以確定抗腫瘤免疫。入選了最多18只患有肢體OSA并確認表達Her2-neu的私有狗(圖7)。在入選時(最后卡鉑治療后3周)，所有狗接受了基本臨床實驗室測試，包括全血細胞計數(shù)(CBC)、化學(xué)篩選(CS)和尿分析(UA)以及通過超聲心動描記法進行心臟功能的基線評估和測定心臟特異性肌鈣蛋白I(cTnI)水平。通過胸部放射顯影確定是否存在肺轉(zhuǎn)移。只有無肺轉(zhuǎn)移證據(jù)的狗才符合研究入選資格。在入選時，收集外周血單核細胞(PBMC)以評估抗腫瘤免疫的基線水平(參見抗腫瘤免疫的評估)。此外，采血評估基線免疫功能，以確保它們不再受卡鉑免疫抑制。只有具有功能完整的免疫系統(tǒng)的狗才符合接受李斯特菌疫苗的資格。Lm重組給藥和數(shù)據(jù)采集使用單個Lm-huHer-2/neu重組疫苗給所有狗接種。在最后卡鉑給藥后三周給予第一次Lm-huHer2-neu疫苗，此后每三周給予一次，總共給藥3次(圖7)。第1組(3只狗)接受1×108個CFU/劑的ADXS31-164(Lm-hucHer-2/neu)疫苗，第2組(3只狗)每只接受5×108個CFU/劑，第3組(3只狗)接受1×109個CFU/劑和3.3×109個CFU/劑(1只狗)。重組Lm經(jīng)30分鐘以緩慢靜脈內(nèi)輸注而施用。第1組所選的劑量為小鼠中嵌合huHer-2/neu重組體的確定安全劑量。在人中，Lm-LLO-E7的無毒劑量僅比小鼠中確定的劑量高一個數(shù)量級，并且該劑量為該前期試驗中第3組評估的劑量。在Lm施用時，監(jiān)測狗的全身性不利影響的證據(jù)。在輸注期間，通過ECG監(jiān)測心搏率和心律并記錄呼吸率。另外，使用超聲波并通過測定肌鈣蛋白I水平來監(jiān)測心臟損傷(圖8)。在輸注后，密切監(jiān)測狗48小時。在輸注后使用MiniMitterRespironics制造的VitalSense連續(xù)體溫監(jiān)控系統(tǒng)(獸醫(yī)臨床試驗中心(VCIC)常用儀器)連續(xù)監(jiān)控核心體溫<12小時。在前6小時的每小時和其后的每4小時監(jiān)測并記錄脈搏率、脈搏節(jié)律和脈象、呼吸率和呼吸努力，以及血壓和體溫(圖9)。記錄所有符合免疫刺激的癥狀，根據(jù)需要使用流體、止痛劑、止吐劑和抗組胺劑控制嚴重反應(yīng)。所有狗每天觀察六次，記錄重組體的任何毒性效應(yīng)的跡象，包括不適、嗜睡、惡心、嘔吐和腹瀉。在第一次ADXS31-164疫苗接種后24、48和72小時采集血樣進行培養(yǎng)，以評估全身施用后Lm的清除?？鼓[瘤免疫的評估在最后卡鉑給藥后三周，狗接受常規(guī)臨床檢查和基線血液工作，包括CBC、CS、UA和cTnI水平。在該時間采集PBMC進行抗腫瘤免疫的基線評估。在每次疫苗接種時和最后疫苗接種后三周進行重復(fù)的免疫評估。通過CFSE增殖、細胞因子生成(ELISpot和qRT-PCR)和CTL分析法來分析PBMC對自體腫瘤靶標(biāo)的Her-2/neu特異性T細胞應(yīng)答，如下文所概述(圖12)。結(jié)果迄今為止，我們在16只狗中進行了總共41次ADXS31-164輸注。ADXS31-164劑量的范圍為1×108、5×108、1×109和3.3×109個CFU。接受的劑量施用的總劑量數(shù)狗的數(shù)量報告的副作用1×10893發(fā)熱、惡心、嘔吐、肝臟酶升高5×10893發(fā)熱、惡心、嘔吐、肝臟酶升高1×1091710發(fā)熱、惡心、嘔吐、肝臟酶升高、血小板減少3.3×10911惡心、嘔吐疫苗施用的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程開發(fā)ADXS31-164施用的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。在疫苗接種前一小時，患者通過肌內(nèi)注射接受2mg/kg苯海拉明，以及緩慢靜脈推注0.2mg/kg昂丹司瓊。疫苗保持在-80℃下，在給患者施用時解凍。它溶于200ml0.9％NaCl中經(jīng)30分鐘施用。然后用30mlPlasmalyte沖洗輸注管線。將狗送回籠舍，三天一個療程施用阿莫西林(疫苗接種后72小時開始)，7天一個療程施用肝臟補充劑(S-腺苷-甲硫氨酸)，以幫助細胞生長和修復(fù)。研究的主要終點是確定ADXS31-164的最大耐受劑量。體重在25kg至67kg范圍內(nèi)的狗能很好地耐受高達3.3×109的劑量。所有報告的副作用均為I級毒性，最大耐受劑量尚未達到。通常在疫苗施用的2-4小時內(nèi)出現(xiàn)副作用。高熱通常以維持速率(4ml/kg/小時)靜脈內(nèi)遞送等滲流體2-4小時而消退。在其中發(fā)熱達到104.7和更高的兩種情況下，單次皮下注射卡洛芬在1-2小時內(nèi)使體溫恢復(fù)正常。惡心和嘔吐通常是自限性的，但在其中記錄到多次發(fā)作的情況下，施用1mg/kgCerenia，這對預(yù)防進一步的惡心和嘔吐非常有效。在疫苗施用的48小時內(nèi)，總共5只狗的肝臟酶出現(xiàn)輕度、I級升高，這在疫苗接種一周后消退。李斯特菌的清除在對迄今為止接種疫苗的所有16只狗進行血液培養(yǎng)后，疫苗接種后24小時任何一只狗的外周循環(huán)中均未檢測到李斯特菌。未評估疫苗接種狗的尿液和糞便中李斯特菌的流出。研究的次要終點是無進展存活期和總體存活期。在截肢和4劑卡鉑后施用ADXS31-164時已觀察到患有骨肉瘤的狗具有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性的總體存活期優(yōu)勢。前兩劑組(6只狗)的早期結(jié)果顯示，與其主人選擇不參與試驗但跟蹤存活期的6只狗相比，接受ADXS31-164的狗具有顯著的存活期優(yōu)勢(p＝0.003)(圖13)。未接種疫苗的狗的平均存活時間為239.5天。未到達接種疫苗的狗的平均存活時間。當(dāng)分析包括意向治療組中的所有狗時，這也成立。因此，沒有證據(jù)顯示對心血管、造血、肝臟或腎臟系統(tǒng)造成顯著的短期或長期副作用。此外，在存在微小殘留病的情況下，ADXS31-164的施用可延緩/預(yù)防轉(zhuǎn)移性疾病，并延長患有Her-2/neu陽性骨肉瘤的狗的總體存活期。實例10：在骨肉瘤(OSA)的自發(fā)性犬科動物模型中評估ADXS31-164的1期臨床試驗。疫苗制造ADXS31-164的設(shè)計和產(chǎn)生。簡而言之，用攜帶嵌合人HER2/neu構(gòu)建體的pADV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染單核細胞增多性李斯特菌(Lm)的daldatactA突變體菌株。該構(gòu)建體包含人HER2/neu分子的2個胞外域(EC1和EC2)和一個胞內(nèi)域(IC1)，人HER2/neu分子包含大部分融合至截短的李斯特菌溶血素O構(gòu)建體的HLA-A2限制免疫優(yōu)勢表位。轉(zhuǎn)移質(zhì)粒還包含芽孢桿菌p60dal基因，并且通過營養(yǎng)缺陷型互補而維持在突變體Lm內(nèi)。不存在細菌抗性盒。疫苗由VibalogicsGmbH(Cuxhaven,Germany)制造，在使用之前保存在-80℃。組織病理學(xué)、分期和免疫組織化學(xué)所有原發(fā)性肢體骨肉瘤腫瘤的組織病理學(xué)評估由委員會認證的獸醫(yī)病理學(xué)家(J.E.)進行。根據(jù)組織學(xué)特征將腫瘤描述為成骨細胞腫瘤、軟骨母細胞腫瘤、纖維母細胞腫瘤和血管擴張性腫瘤。根據(jù)有絲分裂指數(shù)、核多形性以及基質(zhì)和壞死的存在量對原發(fā)性腫瘤進行評分。將組織學(xué)評分轉(zhuǎn)換為級別(I、II或III)。對于HER2/neu染色，將福爾馬林固定、脫鈣、石蠟包埋組織的5微米厚連續(xù)切片安裝到帶負電的載玻片上。切片在80℃下加熱20分鐘，浸入ProPar(clearant)中，在乙醇中再水化。通過在檸檬酸鈉緩沖液(pH～9.0)中煮沸切片進行抗原修復(fù)。使用3％過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶。使用兔抗人HER2/neu抗體(Neu(c-18):sc-284,SantaCruzBiotecnology)或兔IgG同種型(通用陰性對照血清(UniversalNegativeControlserum)，NC498，BiocareMedical)進行染色。使用通用鏈親和素-生物素2系統(tǒng)(UniversalStreptavadin-Biotin2System)(DAKO/LSAB2,HRP)檢測結(jié)合的抗體。組織用3,3'-二氨基聯(lián)苯胺溶液(DAKO)染色，并用蘇木精復(fù)染色。使用NikonE600infinity經(jīng)校正的正立顯微鏡觀察玻片。使用NikonDigitalSightDS-Fi1彩色照相機獲取亮視野圖像，并使用NIS-ElementBR3.0進行圖像分析。由委員會認證的病理學(xué)家(J.E.)根據(jù)贅生性細胞的HER2/neu染色百分比(<10％＝1、10％-50％＝2、>50％＝3)和HER2/neu染色強度(弱＝1、中＝2、強＝3)對組織切片的HER2/neu陽性進行評估和評分。每個組織切片的得分基于10hpf內(nèi)分析的細胞。合并的HER2/neu得分通過HER2/neu染色陽性的腫瘤細胞百分比和HER2/neu染色強度給出的兩個單獨的得分相乘得到。只有HER2/neu染色陽性的腫瘤細胞大于10％的狗才符合試驗入選資格。合格標(biāo)準(zhǔn)和臨床試驗設(shè)計組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)診斷為HER2/neu陽性O(shè)SA的狗接受了通過截肢或保肢手術(shù)進行的原發(fā)性腫瘤摘除，并接受了4劑300mg/m2的卡鉑作為輔助性化療，卡鉑每3周給予一次(或如果出現(xiàn)骨髓抑制，則每4周一次)，此類狗符合篩選資格。在最后卡鉑治療后三周對狗進行篩選。進行全面體檢、全血細胞計數(shù)(CBC)、化學(xué)篩選(CS)和尿分析(UA)以確定一般健康狀態(tài)。分別使用流式細胞中性粒細胞氧化爆發(fā)分析和有絲分裂原誘導(dǎo)的淋巴細胞增殖分析來測試基本先天性和適應(yīng)性免疫功能。通過心電描記法、超聲心動描記法和血清心臟肌鈣蛋白I水平評估基線心臟狀態(tài)。進行胸部放射顯影以確定肺轉(zhuǎn)移性疾病的存在(參見圖14B)。只有經(jīng)發(fā)現(xiàn)全身健康、先天性和適應(yīng)性免疫功能完整、無潛在心臟疾病證據(jù)并且無肺轉(zhuǎn)移性疾病證據(jù)的那些狗才符合入選資格。在研究的過程中死亡的狗接受尸檢。記錄轉(zhuǎn)移性疾病的存在和位置，進行組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)分析，以評估轉(zhuǎn)移性病灶中的HER2/neu表達。免疫分析中性粒細胞氧化爆發(fā)分析。使用0.83％NH4Cl裂解肝素鈉抗凝血中的紅細胞，其余的白細胞在1×PBS中洗滌兩次。用15μg/ml二氫若丹明123(DHR-123；MolecularProbes,GrandIsland,NY)標(biāo)記細胞，并用3nM佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯(PMA,Sigma,St.Louis,MO)在37℃下活化30分鐘。將細胞置于冰上15分鐘，然后進行流式細胞分析。在FACSCanto細胞計數(shù)器(BDBiosciences,SanJose,CA)上獲取細胞，并使用FloJo軟件(Treestar,SanCarlos,CA)進行分析。淋巴細胞增殖分析。通過密度離心從肝素鈉抗凝全血分離外周血單核細胞(PBMC)。PBMC在1×PBS中洗滌兩次并計數(shù)。用5μMCFSE標(biāo)記細胞，并用1.25μM伴刀豆球蛋白A在37℃下刺激5天。收集細胞，在FACS緩沖液中洗滌兩次，用APC綴合的大鼠抗犬科動物CD4和PE綴合的大鼠抗犬科動物CD8抗體Serotec,Raleigh,NC)標(biāo)記，并通過流式細胞術(shù)分析。對于免疫功能分析，使用從健康集落狗(IACUC#804197)采集的外周血作為陽性對照。T細胞亞群分析。在基線、每次疫苗接種之前、再分期時以及其后每2個月采集PBMC，進行CD4和CD8T細胞亞群分析。簡而言之，解凍冷藏的細胞，在FACS緩沖液(1×PBS、0.2％BSA組分V和4mM疊氮化鈉)中洗滌兩次，然后用小鼠抗犬科動物CD3、PE標(biāo)記的大鼠抗狗CD8或Alexa標(biāo)記的大鼠抗狗CD4(Serotec,Raleigh,NC)進行表面染色。在流式細胞采集之前立即用活體染料7-ADD溫育細胞。由使用CellDyn3700CS血液分析儀測定的流式細胞百分比和總淋巴細胞計數(shù)來計算CD4+和CD8+T細胞總數(shù)。疫苗施用在疫苗接種之前，狗接受靜脈內(nèi)施用5HT3拮抗劑昂丹司瓊(0.2mg/kg)和肌內(nèi)施用H1受體阻斷劑苯海拉明(2mg/kg)，分別用于預(yù)防惡心和過敏。利用標(biāo)準(zhǔn)3+3臨床試驗設(shè)計。ADXS31-164按以下劑量施用；第1組(2×108個CFU)、第2組(5×108個CFU)、第3組(1×109個CFU)以及第4組(3.3×109個CFU)。在100ml0.9％NaCl(第1和2組)和200ml0.9％NaCl(第3和4組)中稀釋ADXS31-164，并經(jīng)30分鐘靜脈內(nèi)施用。在輸注后每小時監(jiān)測體溫、脈搏、呼吸率、心率和心律(通過EKG)以及血壓。在其中體溫超過103℉的情況下，給狗靜脈內(nèi)施用4ml/kg/hPlasmalyte，直到體溫降至103℉之下。每小時監(jiān)測狗的嗜睡、惡心或嘔吐跡象。在24小時和疫苗接種后一周采集血樣，以評估血液學(xué)或生物化學(xué)參數(shù)的任何變化，并且在疫苗接種后24小時進行血液培養(yǎng)，以確定血流中活細菌的持續(xù)存在性。在疫苗接種后72小時，所有狗接受短療程的阿莫西林和S-腺苷甲硫氨酸(SAMe)，以殺死任何殘留的李斯特菌，以及為肝臟提供抗氧化劑支持。在接受初始系列中的最后疫苗后至少5個月無轉(zhuǎn)移性疾病的狗的主人可選擇接受1×109個CFU的標(biāo)準(zhǔn)劑量的加強疫苗。如上文所述施用加強疫苗，并且如上文所述在輸注后對狗進行監(jiān)測。毒性根據(jù)VeterinaryCo-operativeOncologyGroup-CommonTerminologyCriteriaforAdverseEvents(VCOG-CTCAE)(獸醫(yī)合作腫瘤學(xué)組-不良事件的常用術(shù)語標(biāo)準(zhǔn))對毒性進行分級。在基線、每次疫苗接種時、最后疫苗接種后3周以及其后每2個月通過連續(xù)心電圖、超聲心動圖和血清心臟肌鈣蛋白I水平進行心臟毒性的評估，直到死亡。所評估的參數(shù)包括左室縮短分數(shù)(LVFS)和左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)以及左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)。將LVIDd和LVIDs歸一化為體重，以考慮狗中寬范圍的體格大小。ELISpot分析在每個指定的時間點解凍冷藏的PBMC，在37℃下放置過夜，然后計數(shù)。細胞用2.5μM重疊人HER2/Neu肽庫(11個單位重疊5個氨基酸)(表示嵌合疫苗中存在的HER2/Neu的EC1、EC2和IC1域)和重組人IL-2(Invitrogen,Fredrick,MD)刺激5天。收集細胞，在1×PBS中洗滌兩次并計數(shù)。IFN-γELISpot分析使用商業(yè)化犬科動物IFN-γELISpot分析試劑盒(R&DSystems,Minneapolis,MN)根據(jù)制造商的方案進行。簡而言之，將0.8-2×105個經(jīng)刺激的細胞與2.5μMEC1、EC2或IC1肽庫加上IL-2或單獨的IL-2(以測定背景計數(shù))一起溫育。所有分析一式兩份地進行。根據(jù)制造商的說明對平板顯色。使用CTL-Immunospot分析儀(C.T.L,ShakerHeights,OH)對斑點進行計數(shù)。主要和次要結(jié)局測定轉(zhuǎn)移時間(TTM)以截肢和發(fā)生轉(zhuǎn)移性疾病之間的時間計算。OSA特異性存活期以截肢和死亡之間的時間計算。對死于不相關(guān)原因的患者在死亡時進行審查。結(jié)果達到合格標(biāo)準(zhǔn)的十八只狗入選該I期臨床試驗。記錄年齡、品種、性別、腫瘤位置、亞類、等級和HER2/neu狀態(tài)(表4)。利用標(biāo)準(zhǔn)3+3臨床試驗設(shè)計。ADXS31-164按以下劑量施用；第1組：2×108個CFU(n＝3)、第2組：5×108個CFU(n＝3)、第3組：1×109個CFU(n＝9)以及第4組：3×109個CFU(n＝3)。出于關(guān)懷護理，五只另外的在篩選時鑒定為患有預(yù)先存在的肺轉(zhuǎn)移性疾病的狗也接受ADXS31-164(表4)。這些狗中的四只在>50％的來自原發(fā)性腫瘤的贅生性細胞中具有強HER2/neu染色。在篩選時，這些狗中的三只具有多個肺轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)，兩只狗具有單個轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)。具有多個肺結(jié)節(jié)的狗每只在疾病進展前接受一劑疫苗，并退出研究進行替代治療。具有單個結(jié)節(jié)的兩只狗每只接受全程三劑疫苗?；加蓄A(yù)先存在的轉(zhuǎn)移性疾病的狗接受1×109個CFU(n＝3)或3×109個CFU(n＝2)ADXS31-164(表5)。圖15示出了1期臨床試驗的時間線示意圖，其中三次疫苗接種在截肢和隨訪化療后施用。表4：入選的狗的特征描述和腫瘤特征表5：出于關(guān)懷護理而治療的患有預(yù)先存在的轉(zhuǎn)移性疾病的狗的特征描述和腫瘤特征。結(jié)果安全性和毒性＝評估所有23只疫苗接種狗的安全性。所有狗能很好地耐受ADXS31-164施用，僅在疫苗接種日觀察到瞬時低級別毒性(表6)。在所有組中，ADXS31-164施用后4小時出現(xiàn)具有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性的體溫升高，與劑量無關(guān)(圖9A)。在任何時間點或任何劑量下均未觀察到低血壓(圖9B)。8/18只狗(未患預(yù)先存在的轉(zhuǎn)移性疾病)和3/5只狗(患有預(yù)先存在的轉(zhuǎn)移性疾病)在疫苗接種的4小時內(nèi)出現(xiàn)>103℉的發(fā)熱，此時給予靜脈補液。三只狗接受單劑量的非甾體抗炎藥，以降低體溫。在所有情況下，發(fā)熱的消退無需另外干預(yù)。在疫苗接種的4小時內(nèi)出現(xiàn)不需要治療干預(yù)的瞬時嗜睡、惡心和嘔吐，與劑量無關(guān)。在疫苗接種后不久，在兩只狗中鑒定到瞬時單或二聯(lián)室性早搏。在疫苗接種的2小時內(nèi)，一只患有預(yù)先存在的轉(zhuǎn)移性疾病的狗出現(xiàn)室性心動過速。然而，利多卡因、普魯卡因胺、索他洛爾和皮質(zhì)類固醇的治療沒有效果，心律失常在72小時內(nèi)消退。在ADXS31-164施用24小時后出現(xiàn)瞬時、但具有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性的白細胞和中性粒細胞計數(shù)增加，并且伴有血小板和淋巴細胞瞬時減少(圖17)。雖然ADXS31-164劑量和血液學(xué)變化幅度之間無相關(guān)性，但存活的狗和死亡的狗之間的白細胞、中性粒細胞和單核細胞應(yīng)答幅度存在顯著的差異(圖18A-F)。大約一半的狗的肝臟酶血清濃度出現(xiàn)輕度、瞬時升高，與親肝李斯特菌引起的輕度炎癥一致(表6)。外周血中鑒定的所有變化均為無癥狀的，并且在ADXS31-164施用的一周內(nèi)消退。在任何狗中均未記錄到腎功能的顯著變化。19/23只狗在ADXS31-164施用后24小時進行了血液培養(yǎng)，并且均為陰性的，與高度減毒LmddA菌株的快速清除一致。鑒于HER2/neu靶向單克隆抗體會引起心臟毒性，我們在基線、每次疫苗接種之前以及其后每2個月評估了心臟損傷的生物標(biāo)志物和機能障礙的超聲心動描記計測量，包括心臟肌鈣蛋白I、縮短分數(shù)(％)、LVIDd和LVIDs。在任何疫苗接種狗中均未鑒定到心臟肌鈣蛋白I、縮短分數(shù)、LVIDd或LVIDs的顯著、持續(xù)變化(圖26A-D)。然而，第3組的一只狗在每次疫苗接種時顯示出血清心臟肌鈣蛋白I的階躍升高，不伴有超聲心動描記的機能障礙跡象。值在最后疫苗接種后返回基線，并且在重復(fù)評估時未升高。在整個臨床試驗中，測定心臟肌鈣蛋白I水平，以及縮短分數(shù)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)和左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)，如圖25(A-D)所示，在ADXS31-164的施用后，不存在長期或短期心臟毒性的證據(jù)。下表6提供的數(shù)據(jù)示出，在臨床試驗期間報告了極少的治療相關(guān)不良事件。表6：在ADXS31-164疫苗接種時或48小時內(nèi)出現(xiàn)的治療相關(guān)不良事件。結(jié)論：ADSX31-164毒性是低級別的并且是瞬時的對ADXS31-164的免疫應(yīng)答圖18提供的結(jié)果證實，在接受疫苗的狗中，對ADXS31-164的早期免疫應(yīng)答預(yù)測了狗的存活期。圖18顯示，ADXS31-164誘導(dǎo)了與存活期相關(guān)的WBC、中性粒細胞和單核細胞計數(shù)增加，并且伴有血小板和淋巴細胞的瞬時減少(圖17)。在臨床試驗期間評估了ADXS31-164誘導(dǎo)和維持免疫應(yīng)答，具體地講誘導(dǎo)HER2/neu特異性T細胞免疫的能力。為了評估免疫應(yīng)答以及確定ADXS31-164是否誘導(dǎo)了HER2/neu特異性T細胞應(yīng)答，通過IFN-γELISpot評估了HER2/neu特異性T細胞數(shù)量。在基線(卡鉑施用后3周)、每次疫苗接種時以及其后每2個月采集樣品。圖19示出了ELISpot分析的結(jié)果。HER2/neu特異性免疫應(yīng)答。在基線分別對4/18、6/18和1/18只狗檢測對人HER2/neu的EC1、EC2和IC1域(分別與犬科動物HER2/neu共有89％、93％和98％同一性)的免疫應(yīng)答。在第三次ADXS31-164疫苗接種后3周對7只狗檢測對一個或多個HER2/neu域的誘導(dǎo)的IFN-γ應(yīng)答(表7)。這些狗中的五只出現(xiàn)對高度保守的IC1域的免疫應(yīng)答。在2個月后五只另外的狗出現(xiàn)對IC1域的IFN-γ應(yīng)答。在復(fù)發(fā)時，三只另外的狗出現(xiàn)對單獨的EC2、EC2和IC1或EC1、EC2和EC3的IFN-γ應(yīng)答(狗001、002和017)。通過IFN-γELISpot評估在初始疫苗接種系列期間出現(xiàn)對HER2/neu的免疫應(yīng)答的3只狗15至17個月。然而，并未維持HER2/neu特異性IFN-γ應(yīng)答，在此期間狗仍無轉(zhuǎn)移性疾病。10只狗接受另外的加強疫苗接種，其中6只可評估，在加強疫苗接種后2個月，2只狗檢測到HER2/neu特異性IFN-γ應(yīng)答增加。在ADXS31-164施用后3周，復(fù)發(fā)的8只狗中，5只的HER2/neu特異性IFN-γ應(yīng)答不增加。表7加強疫苗接種。在18只入選時無轉(zhuǎn)移性疾病的狗中，十只在初始疫苗系列后5和10個月之間施用單劑加強疫苗。這些狗中的四只接受在首次加強疫苗后4和15個月之間給予的另外加強疫苗。在加強疫苗接種時，與初始疫苗接種系列一樣，記錄到了類似的低級別、瞬時副作用。圖20(A和B)示出，重復(fù)加強疫苗接種還刺激了HER2特異性免疫。在6和10個月對動物289-003施用重復(fù)加強疫苗接種，在8個月對動物289-004施用。臨床結(jié)局。疫苗接種組中8/18只狗復(fù)發(fā)，4只患有肺轉(zhuǎn)移性疾病，4只出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移。兩只骨轉(zhuǎn)移的狗進展到肺轉(zhuǎn)移。一只骶骨具有骨病灶的狗死于吸入性肺炎，一只具有單個肺結(jié)節(jié)的狗死于腎胚細胞瘤，然而，分別來自骨和肺病灶的尸檢樣本不適于轉(zhuǎn)移性骨肉瘤的組織病理學(xué)確認。通過OSA特異性存活期分析，對這兩只狗進行審查。復(fù)發(fā)的狗在初診判斷時接受不同的挽救化療和放療。4只骨轉(zhuǎn)移的狗僅用止痛劑治療(1只狗)、單獨的姑息性放療(1只狗)或與化療聯(lián)合(2只狗)。兩只狗接受阿霉素，1只狗接受Palladia，以治療肺轉(zhuǎn)移性疾病。未達到疫苗接種狗的中值OSA特異性存活期。TTM的Kaplan-Meier存活期曲線和OSA特異性存活期如圖21所示。疫苗接種狗的1年和2年總體存活率分別為71.4％和57％。在疫苗接種的2個月內(nèi)出現(xiàn)HER2/neu特異性IFN-γ應(yīng)答的12只狗中，9只仍然存活(3只狗>900天，1只狗>700天，3只狗>400天，2只狗>300天，并且7只目前仍無腫瘤(表7))。圖24提供的結(jié)果顯示，ADXS31-164破壞了對HER2/Neu的耐受性。這對OSA以及其他HER2/neu腫瘤和/或癌癥的治療是重要的。尸檢結(jié)果。6/18只狗在研究期間死亡，對這些狗中的4只進行尸檢。三只狗被發(fā)現(xiàn)患有多灶性II和III級轉(zhuǎn)移性骨肉瘤，涉及肺(3只狗)、骨(2只狗)、縱隔(1只狗)和腎(1只狗)。一只狗由于大型進行性腎臟腫塊而被實施安樂死，被發(fā)現(xiàn)患有腎胚細胞瘤。這只狗還具有單個肺結(jié)節(jié)，但遺憾的是未通過組織病理學(xué)評估。ADXS31-164施用后的存活期、長存活期、腫瘤進展在篩選時三只具有多個轉(zhuǎn)移性肺結(jié)節(jié)的狗，出于關(guān)懷護理，在疾病進行前每只接受一劑疫苗治療，并從研究中移除。在篩選時兩只存在孤立性轉(zhuǎn)移性肺結(jié)節(jié)的狗接受全部三劑疫苗(參見表5的特征描述和腫瘤特征)。盡管進行了疫苗接種，這些狗中的一只仍出現(xiàn)進行性肺轉(zhuǎn)移性疾病。在第二只狗中，盡管預(yù)先存在的肺結(jié)節(jié)每3周大小加倍，但未出現(xiàn)另外的肺病灶(圖22A和B)。在最后疫苗接種后一周，CT掃描確認不存在另外的轉(zhuǎn)移性病灶，并且狗接受轉(zhuǎn)移灶切除。在手術(shù)前，靜脈內(nèi)施用用于檢測腫瘤邊緣和炎癥區(qū)域的染料吲哚菁綠(ICG)，在手術(shù)時，在近紅外光下觀察到肺結(jié)節(jié)中以及孤立性結(jié)節(jié)附近的多個其他外觀健康的肺實質(zhì)區(qū)域中的熒光(圖22C和D)。肺結(jié)節(jié)的組織病理學(xué)揭示，轉(zhuǎn)移性O(shè)SA具有被厚纖維囊圍繞的很大的出血和壞死區(qū)域(圖22E)。IHC顯示CD3+T細胞在纖維囊周圍積聚，結(jié)節(jié)本身內(nèi)的T細胞很少(圖22G和H)。近紅外熒光識別的其他區(qū)域示出了T細胞浸潤的局灶性區(qū)域(圖22F、22I和22J)。在具有顯著的有絲分裂象的異常大的波形蛋白陽性細胞周圍觀察到T細胞(圖22K和22L)。這些發(fā)現(xiàn)暗示，單個轉(zhuǎn)移性肉瘤細胞可被肺內(nèi)的腫瘤特異性T細胞有效地靶向，并且提供ADXS31-164防止轉(zhuǎn)移性肺疾病的可能機制。狗能很好地從手術(shù)恢復(fù)，并且保持無肺轉(zhuǎn)移性疾病5個月，隨后在皮下組織(成骨細胞腫瘤，II級；和軟骨母細胞腫瘤，III級)、縱隔(成骨細胞腫瘤，II級)和隔膜(成骨細胞腫瘤，III級)中出現(xiàn)廣泛的侵襲性HER2/neu+轉(zhuǎn)移性疾病。結(jié)果顯示，盡管誘導(dǎo)了HER2/neu特異性T細胞應(yīng)答，但未鑒定到脫腫瘤副作用，因此HER2/neu特異性T細胞的誘導(dǎo)負責(zé)消除HER2/neu陽性轉(zhuǎn)移性細胞，以及長期防止疾病復(fù)發(fā)。這可由以下方面支持：HER2/Neu-特異性T細胞擴增的時間(在5只狗中出現(xiàn)在診斷后大約8個月，當(dāng)時很多狗將出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性疾病)，以及疫苗接種和轉(zhuǎn)移灶切除后一只狗的肺實質(zhì)內(nèi)局灶性T細胞應(yīng)答的組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)。圖22和圖23提供的結(jié)果證實，ADXS31-164的施用延緩了和/或防止了轉(zhuǎn)移性疾病，并且延長了患有自發(fā)性HER2+骨肉瘤的狗的總體存活期。從兩張圖中可以看出，接受疫苗的狗的存活時間顯著延長，而其他的則未達到那些接受疫苗的狗的中值存活期。雖然我們的研究證實了此方法防止轉(zhuǎn)移性疾病的有效性，但在出于關(guān)懷護理治療的5只狗中，ADXS31-164疫苗接種不能誘導(dǎo)預(yù)先存在的嚴重肺轉(zhuǎn)移性疾病的消退。在一只狗中，這似乎與T細胞不能穿透圍繞轉(zhuǎn)移性病灶的纖維囊或那些細胞不能在已建立的腫瘤微環(huán)境中存活相關(guān)(圖22C)。然而，在相同的狗中，總體正常的肺實質(zhì)中觀察到大型、活躍分裂的旨在成為轉(zhuǎn)移性O(shè)SA細胞的間充質(zhì)細胞周圍的T細胞浸潤的局灶性區(qū)域，出乎意料的是，在轉(zhuǎn)移灶切除后，該狗未發(fā)生進一步的肺轉(zhuǎn)移性疾病。這些數(shù)據(jù)共同暗示，ADXS31-164通過其誘導(dǎo)強大先天性免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的能力防止了肺轉(zhuǎn)移性疾病，該先天性免疫應(yīng)答可敏化轉(zhuǎn)移性O(shè)SA細胞發(fā)生FAS/FASL介導(dǎo)的細胞凋亡，該適應(yīng)性免疫應(yīng)答為消除微轉(zhuǎn)移性肺疾病的HER2/neu特異性T細胞的形式。結(jié)論：在提交本申請時，12/18只狗未發(fā)生肺轉(zhuǎn)移性疾病，證實了在微小殘留病的背景中施用時，ADXS31-164防止了患有自發(fā)性HER2+骨肉瘤的受試者的轉(zhuǎn)移性疾病。與歷史HER2/Neu+對照組相比，疫苗接種狗顯示出具有統(tǒng)計學(xué)上的顯著性的總體存活期延長。HER2/Neu+對照狗(n＝11)的中值存活期為316天(p＝0.032)，其中未達到ADSX31-164治療狗的中值存活期。另外，結(jié)果表明，ADXS31-164破壞了對HER2/neu的高度保守IC1域的外周耐受性(圖26)。在ADXS31-164施用24小時內(nèi)白細胞增加的幅度(圖18)與存活期相關(guān)，暗示結(jié)局部分取決于狗的免疫系統(tǒng)對疫苗作出應(yīng)答的能力。重要的是，本研究顯示將高達3×109個CFU的ADXS31-164施用于患有自發(fā)性O(shè)SA的狗是安全的，并且在施用時僅引起瞬時、低級別的副作用。此外，防止肺轉(zhuǎn)移性疾病可能部分地與肺中CD3+T細胞介導(dǎo)的微觀轉(zhuǎn)移性疾病消除相關(guān)。本研究對于表達HER2/Neu的小兒OSA和其他人類癌癥具有重要意義。此外，我們在這里示出，在狗中劑量高達3.3×10^9個CFU的ADXS31-164的施用是安全的，盡管誘導(dǎo)了HER2/neu特異性免疫但不會導(dǎo)致短期或長期心臟毒性。包括心臟毒性的在靶、脫腫瘤副作用與大量HER2/neu特異性T細胞的施用相關(guān)，或當(dāng)曲妥單抗與蒽環(huán)類同時使用時出現(xiàn)。我們利用無多柔比星的標(biāo)準(zhǔn)化療方案減小心臟毒性的任何潛在風(fēng)險。我們的研究證實，ADXS31-164可防止患有OSA的狗的肺轉(zhuǎn)移性疾病。這些結(jié)果證實了患有OSA的狗的安全性和史無前例的存活時間，并且為研究ADXS31-164防止患有HER2/neu表達性腫瘤(包括小兒骨肉瘤和乳腺癌)的患者的轉(zhuǎn)移性疾病的能力鋪平了道路。實例11：聯(lián)合ADXS31-164和放射療法治療犬科動物和人類骨肉瘤(OSA)以及肺轉(zhuǎn)移性疾病。描述了與姑息性放療結(jié)合使用表達人嵌合Her-2/neu構(gòu)建體(ADXS31-164)的重組單核細胞增多性李斯特菌來預(yù)防具有自發(fā)性肢體骨肉瘤的狗中的肺轉(zhuǎn)移性疾病并延長總體存活期。鑒于犬科動物與人骨肉瘤之間的相似性，我們相信，該聯(lián)合將是對人類疾病有效的療法。材料和方法疫苗制備ADXS31-164疫苗的構(gòu)建細節(jié)在上文已進行了描述。制備了ADXS31-164庫存疫苗，并作為1ml等分試樣儲存在-70℃的冷凍機中。注射前，將庫存疫苗在37℃下解凍2-3分鐘，然后用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌兩次并以5×108個集落形成單位(CFU)/ml的濃度重懸在PBS中。將每只狗用200μl該懸浮液經(jīng)腹膜內(nèi)免疫。RT和免疫療法入選了十只全身健康的狗，它們具有經(jīng)組織病理學(xué)確認的、未經(jīng)治療的HER2+肢體OSA，無心臟病或轉(zhuǎn)移性疾病的跡象。所有狗連續(xù)兩天接受分成兩個部分的16Gy的RT，然后首次接受8個ADXS31-164靜脈內(nèi)劑量(3.3×10^9個CFU/劑)，每3周給予一次。每3周進行基于李斯特菌的疫苗的免疫(例如，在第7、28、49、70、91、112、133和154)天(圖10)。在免疫當(dāng)天還進行了免疫分析。在第4和5天，使用Siemens6MV線性加速器遞送8Gy的外照射RT。RT在全身麻醉下給予。每三周在臨床上對腫瘤進行評估，并在基線時、在第四次疫苗施用(第70天)時以及在第八次疫苗施用(第154天)時通過放射照相對腫瘤進行評估。在這些時間點，進行胸部放射顯影以確定肺轉(zhuǎn)移性疾病的存在。在入選時進行了骨活檢以確認骨肉瘤的診斷。在第0、70和133天以及在之后的每2個月直到實施安樂死，進行了全血細胞計數(shù)(CBC)、化學(xué)篩選(CS)、尿分析(UA)、心電圖(EKG)/超聲心動圖/心臟肌鈣蛋白I(cTnl)血清濃度以及受影響肢體和胸部的放射顯影照片采集。在安樂死當(dāng)天，進行了全血細胞計數(shù)(CBC)、化學(xué)篩選(CS)、尿分析(UA)、免疫分析、心電圖(EKG)/超聲心動圖/心臟肌鈣蛋白I(cTnl)血清濃度采集和尸檢。ELISpot分析在每個指定的時間點解凍冷藏的PBMC，在37℃下放置過夜，然后計數(shù)。細胞用2.0μM重疊人HER2/Neu肽庫(11個單位重疊5個氨基酸)(表示嵌合疫苗中存在的HER2/Neu的EC1、EC2和IC1域)和重組人IL-2(Invitrogen,Fredrick,MD)刺激5天。收集細胞，在1×PBS中洗滌兩次并計數(shù)。IFN-γELISpot分析使用商業(yè)化犬科動物IFN-γELISpot分析試劑盒(R&DSystems,Minneapolis,MN)根據(jù)制造商的方案進行。簡而言之，將0.1-3×105個經(jīng)刺激的細胞與2.5μMEC1、EC2或IC1肽庫或不與肽(以測定背景計數(shù))一起溫育。所有分析一式兩份地進行。根據(jù)制造商的說明對平板顯色。使用CTL-Immunospot分析儀(C.T.L,ShakerHeights,OH)對斑點進行計數(shù)。結(jié)果我們評估了ADXS31-164作為輔助療法在如上文所述的患有自發(fā)性骨肉瘤的狗中的使用。ADXS31-164在連續(xù)兩天施用16GyRT后施用給患有自發(fā)性肢體OSA的狗。施用了最多8個劑量的ADXS31-164。這項研究顯示反復(fù)施用3.3×109個CFU的ADXS31-164是安全的。然后探索了放射療法與ADXS31-164之間促進抗腫瘤免疫(具體地講，產(chǎn)生Her-2/neu特異性T細胞)、阻礙原發(fā)性腫瘤進展并預(yù)防/延遲肺轉(zhuǎn)移性疾病的潛在協(xié)同作用。圖10描述了治療方案。在入選進試驗的第0天對狗進行了篩選。篩選包括評價基線血檢、尿液分析、心臟評估、胸部和受影響的肢體的放射顯影以及骨活檢以確認骨肉瘤的診斷。在入選后連續(xù)2天給予姑息性放射。在姑息性放療后，給予多劑量(最多8個)的ADXS31-164，每3周一次，僅有暫時性的、低等級的副作用(數(shù)據(jù)未示出)。在第70和154天重復(fù)進行胸部和肢體放射顯影。在每個時間點由兩名經(jīng)委員會認證的獸醫(yī)整形外科醫(yī)生基于他/她們對每個時間點每只狗獲取的視頻的評估而為每只狗給出跛行評分。主人還填寫了經(jīng)驗證的疼痛問卷，該問卷記錄主人對生活質(zhì)量的感知(圖28)。10只狗中有5只仍然活著，三只無腫瘤進展或肺轉(zhuǎn)移性疾病的跡象。在撰寫時，中值存活期為285天，其有利地與僅使用RT實現(xiàn)的136天的歷史中值存活期形成對比。在一個患者中，在試驗入選時呈現(xiàn)出近端肱骨的病理性骨折(通過2塊骨板和一顆髓內(nèi)釘穩(wěn)定化)，在放射療法和ADXS31-164施用后三個月，放射顯影顯示出骨折愈合的跡象，而無肺轉(zhuǎn)移性疾病的跡象(圖11)。此外，結(jié)果表明與ADXS31-164療法結(jié)合的姑息性放射療法減少溶解、促進腫瘤合并并延長受試者存活期(圖29A-D和圖30-A-B)。在16Gy的放射(從2014年9月13日開始連續(xù)2天給予8Gy)和3劑ADXS31-164(2014年11月25日)后，遠端脛骨骨肉瘤病變的橫向(圖29A)和AP(圖29C)放射線視圖展示出明顯的皮質(zhì)骨重建和溶解減少。用16Gy的放射(從2014年7月16日開始連續(xù)2天給予8Gy)和3劑ADXS31-164(2014年10月13日)治療的遠端橈骨骨肉瘤病變的橫向(圖29B)和AP(圖29D)放射線視圖。注意，在橈骨的遠端部分中的腫脹和骨溶解明顯減少(在圖29B中將2014年10月13日的放射顯影照片與2014年7月16日的放射顯影照片進行比較)。在遠端脛骨的內(nèi)側(cè)面上骨密度增加(在圖29D中將2014年10月13日的放射顯影照片與2014年7月16日的放射顯影照片進行比較)。在圖29D中2014年10月13日的放射顯影照片上見到遠端撓骨的內(nèi)側(cè)面的骨折有微小的移置。因此，ADXS31-164可在不進行化療的情況下使用；與放療結(jié)合并可能在新輔助治療情況下在截肢和化療前使用以預(yù)防轉(zhuǎn)移性疾病。雖然本文已示出和描述了本發(fā)明的某些特征，但現(xiàn)在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將想到許多修改、置換、變化和等同形式。因此，應(yīng)當(dāng)理解，所附權(quán)利要求書旨在涵蓋落在本發(fā)明的真實精神范圍內(nèi)的所有此類修改和變化。序列表<110>賓夕法尼亞大學(xué)理事會<120>用于治療HER-2陽性癌癥的聯(lián)合免疫療法和放療<130>P-73423-PC3<140>PCT/US15/999999<141>2015-04-02<150>14/669,629<151>2015-03-26<150>14/268,436<151>2014-05-02<150>PCT/US15/17559<151>2015-02-25<150>62/076,411<151>2014-11-06<160>74<170>PatentIn3.5版<210>1<211>1263<212>DNA<213>人工序列<220><223>Her-2嵌合蛋白<400>1gagacccacctggacatgctccgccacctctaccagggctgccaggtggtgcagggaaac60ctggaactcacctacctgcccaccaatgccagcctgtccttcctgcaggatatccaggag120gtgcagggctacgtgctcatcgctcacaaccaagtgaggcaggtcccactgcagaggctg180cggattgtgcgaggcacccagctctttgaggacaactatgccctggccgtgctagacaat240ggagacccgctgaacaataccacccctgtcacaggggcctccccaggaggcctgcgggag300ctgcagcttcgaagcctcacagagatcttgaaaggaggggtcttgatccagcggaacccc360cagctctgctaccaggacacgattttgtggaagaatatccaggagtttgctggctgcaag420aagatctttgggagcctggcatttctgccggagagctttgatggggacccagcctccaac480actgccccgctccagccagagcagctccaagtgtttgagactctggaagagatcacaggt540tacctatacatctcagcatggccggacagcctgcctgacctcagcgtcttccagaacctg600caagtaatccggggacgaattctgcacaatggcgcctactcgctgaccctgcaagggctg660ggcatcagctggctggggctgcgctcactgagggaactgggcagtggactggccctcatc720caccataacacccacctctgcttcgtgcacacggtgccctgggaccagctctttcggaac780ccgcaccaagctctgctccacactgccaaccggccagaggacgagtgtgtgggcgagggc840ctggcctgccaccagctgtgcgcccgagggcagcagaagatccggaagtacacgatgcgg900agactgctgcaggaaacggagctggtggagccgctgacacctagcggagcgatgcccaac960caggcgcagatgcggatcctgaaagagacggagctgaggaaggtgaaggtgcttggatct1020ggcgcttttggcacagtctacaagggcatctggatccctgatggggagaatgtgaaaatt1080ccagtggccatcaaagtgttgagggaaaacacatcccccaaagccaacaaagaaatctta1140gacgaagcatacgtgatggctggtgtgggctccccatatgtctcccgccttctgggcatc1200tgcctgacatccacggtgcagctggtgacacagcttatgccctatggctgcctcttagac1260taa1263<210>2<211>420<212>PRT<213>人工序列<220><223>Her-2嵌合蛋白<400>2GluThrHisLeuAspMetLeuArgHisLeuTyrGlnGlyCysGlnVal151015ValGlnGlyAsnLeuGluLeuThrTyrLeuProThrAsnAlaSerLeu202530SerPheLeuGlnAspIleGlnGluValGlnGlyTyrValLeuIleAla354045HisAsnGlnValArgGlnValProLeuGlnArgLeuArgIleValArg505560GlyThrGlnLeuPheGluAspAsnTyrAlaLeuAlaValLeuAspAsn65707580GlyAspProLeuAsnAsnThrThrProValThrGlyAlaSerProGly859095GlyLeuArgGluLeuGlnLeuArgSerLeuThrGluIleLeuLysGly100105110GlyValLeuIleGlnArgAsnProGlnLeuCysTyrGlnAspThrIle115120125LeuTrpLysAsnIleGlnGluPheAlaGlyCysLysLysIlePheGly130135140SerLeuAlaPheLeuProGluSerPheAspGlyAspProAlaSerAsn145150155160ThrAlaProLeuGlnProGluGlnLeuGlnValPheGluThrLeuGlu165170175GluIleThrGlyTyrLeuTyrIleSerAlaTrpProAspSerLeuPro180185190AspLeuSerValPheGlnAsnLeuGlnValIleArgGlyArgIleLeu195200205HisAsnGlyAlaTyrSerLeuThrLeuGlnGlyLeuGlyIleSerTrp210215220LeuGlyLeuArgSerLeuArgGluLeuGlySerGlyLeuAlaLeuIle225230235240HisHisAsnThrHisLeuCysPheValHisThrValProTrpAspGln245250255LeuPheArgAsnProHisGlnAlaLeuLeuHisThrAlaAsnArgPro260265270GluAspGluCysValGlyGluGlyLeuAlaCysHisGlnLeuCysAla275280285ArgGlyGlnGlnLysIleArgLysTyrThrMetArgArgLeuLeuGln290295300GluThrGluLeuValGluProLeuThrProSerGlyAlaMetProAsn305310315320GlnAlaGlnMetArgIleLeuLysGluThrGluLeuArgLysValLys325330335ValLeuGlySerGlyAlaPheGlyThrValTyrLysGlyIleTrpIle340345350ProAspGlyGluAsnValLysIleProValAlaIleLysValLeuArg355360365GluAsnThrSerProLysAlaAsnLysGluIleLeuAspGluAlaTyr370375380ValMetAlaGlyValGlySerProTyrValSerArgLeuLeuGlyIle385390395400CysLeuThrSerThrValGlnLeuValThrGlnLeuMetProTyrGly405410415CysLeuLeuAsp420<210>3<211>1323<212>DNA<213>單核細胞增多性李斯特菌<400>3atgaaaaaaataatgctagtttttattacacttatattagttagtctaccaattgcgcaa60caaactgaagcaaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccatggca120ccaccagcatctccgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaa180atcgataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacgga240gatgcagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgtt300gtggagaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgca360atttcgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaat420caaccagatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggt480atgactaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgccactaaatcaaacgttaacaac540gcagtaaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttatccaaatgta600agtgcaaaaattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaa660tttggtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagt720gaagggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgtt780aatgaacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaa840gcgcttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgt900caagtttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgat960gctgccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaat1020tcttccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgac1080ggcaacctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaaca1140ccaggagttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttatt1200aaaaacaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaac1260atcgatcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattat1320gat1323<210>4<211>441<212>PRT<213>單核細胞增多性李斯特菌<400>4MetLysLysIleMetLeuValPheIleThrLeuIleLeuValSerLeu151015ProIleAlaGlnGlnThrGluAlaLysAspAlaSerAlaPheAsnLys202530GluAsnSerIleSerSerMetAlaProProAlaSerProProAlaSer354045ProLysThrProIleGluLysLysHisAlaAspGluIleAspLysTyr505560IleGlnGlyLeuAspTyrAsnLysAsnAsnValLeuValTyrHisGly65707580AspAlaValThrAsnValProProArgLysGlyTyrLysAspGlyAsn859095GluTyrIleValValGluLysLysLysLysSerIleAsnGlnAsnAsn100105110AlaAspIleGlnValValAsnAlaIleSerSerLeuThrTyrProGly115120125AlaLeuValLysAlaAsnSerGluLeuValGluAsnGlnProAspVal130135140LeuProValLysArgAspSerLeuThrLeuSerIleAspLeuProGly145150155160MetThrAsnGlnAspAsnLysIleValValLysAsnAlaThrLysSer165170175AsnValAsnAsnAlaValAsnThrLeuValGluArgTrpAsnGluLys180185190TyrAlaGlnAlaTyrProAsnValSerAlaLysIleAspTyrAspAsp195200205GluMetAlaTyrSerGluSerGlnLeuIleAlaLysPheGlyThrAla210215220PheLysAlaValAsnAsnSerLeuAsnValAsnPheGlyAlaIleSer225230235240GluGlyLysMetGlnGluGluValIleSerPheLysGlnIleTyrTyr245250255AsnValAsnValAsnGluProThrArgProSerArgPhePheGlyLys260265270AlaValThrLysGluGlnLeuGlnAlaLeuGlyValAsnAlaGluAsn275280285ProProAlaTyrIleSerSerValAlaTyrGlyArgGlnValTyrLeu290295300LysLeuSerThrAsnSerHisSerThrLysValLysAlaAlaPheAsp305310315320AlaAlaValSerGlyLysSerValSerGlyAspValGluLeuThrAsn325330335IleIleLysAsnSerSerPheLysAlaValIleTyrGlyGlySerAla340345350LysAspGluValGlnIleIleAspGlyAsnLeuGlyAspLeuArgAsp355360365IleLeuLysLysGlyAlaThrPheAsnArgGluThrProGlyValPro370375380IleAlaTyrThrThrAsnPheLeuLysAspAsnGluLeuAlaValIle385390395400LysAsnAsnSerGluTyrIleGluThrThrSerLysAlaTyrThrAsp405410415GlyLysIleAsnIleAspHisSerGlyGlyTyrValAlaGlnPheAsn420425430IleSerTrpAspGluValAsnTyrAsp435440<210>5<211>14<212>PRT<213>單核細胞增多性李斯特菌<400>5LysThrGluGluGlnProSerGluValAsnThrGlyProArg1510<210>6<211>28<212>PRT<213>單核細胞增多性李斯特菌<400>6LysAlaSerValThrAspThrSerGluGlyAspLeuAspSerSerMet151015GlnSerAlaAspGluSerThrProGlnProLeuLys2025<210>7<211>20<212>PRT<213>單核細胞增多性李斯特菌<400>7LysAsnGluGluValAsnAlaSerAspPheProProProProThrAsp151015GluGluLeuArg20<210>8<211>33<212>PRT<213>單核細胞增多性李斯特菌<400>8ArgGlyGlyIleProThrSerGluGluPheSerSerLeuAsnSerGly151015AspPheThrAspAspGluAsnSerGluThrThrGluGluGluIleAsp202530Arg<210>9<211>17<212>PRT<213>釀膿鏈球菌<400>9LysGlnAsnThrAlaSerThrGluThrThrThrThrAsnGluGlnPro151015Lys<210>10<211>17<212>PRT<213>類馬鏈球菌<400>10LysGlnAsnThrAlaAsnThrGluThrThrThrThrAsnGluGlnPro151015Lys<210>11<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>位于HER2的胞外域上的標(biāo)繪HLA-A2表位<400>11HisLeuTyrGlnGlyCysGlnValVal15<210>12<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>位于HER3的胞外域上的標(biāo)繪HLA-A2表位<400>12LysIlePheGlySerLeuAlaPheLeu15<210>13<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>位于HER2的胞內(nèi)域上的標(biāo)繪HLA-A2表位<400>13ArgLeuLeuGlnGluThrGluLeuVal15<210>14<211>55<212>DNA<213>人工序列<220><223>EC2的比對（Her-2-neu的975-1029bp）<400>14ggtcacagctgaggacggaacacagcgttgtgagaaatgcagcaagccctgtgct55<210>15<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>EC2的比對（Her-2-neu的975-1029bp）<400>15cgagtgtgctatggtctgggcatggagcaccttcgaggggcgagggccatcaccagtgac60<210>16<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>EC2的比對（Her-2-neu的975-1029bp）<400>16aatgtccaggagtttgatggctgcaagaagatctttgggagcctggcatttttgccggag60<210>17<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>EC2的比對（Her-2-neu的975-1029bp）<400>17agctttgatggggacccctcctccggcattgctccgctgaggcctgagcagctccaagtg60<210>18<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>EC2的比對（Her-2-neu的975-1029bp）<400>18ttcgaaaccctggaggagatcacaggttacctgtacatctcagcatggccagacagtctc60<210>19<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>EC2的比對（Her-2-neu的975-1029bp）<400>19cgtgacctcagtgtcttccagaaccttcgaatcattcggggacggattctccacgatggc60<210>20<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>EC2的比對（Her-2-neu的975-1029bp）<400>20gcgtactcattgacactgcaaggcctggggatccactcgctggggctgcgctcactgcgg60<210>21<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>EC2的比對（Her-2-neu的975-1029bp）<400>21gagctgggcagtggattggctctgattcaccgcaacgcccatctctgctttgtacacact60<210>22<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>EC2的比對（Her-2-neu的975-1029bp）<400>22gtaccttgggaccagctcttccggaacccacatcaggccctgctccacagtgggaaccgg60<210>23<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>EC2的比對（Her-2-neu的975-1029bp）<400>23ccggaagaggattgtggtctcgagggcttggtctgtaactcactgtgtgcccacgggcac60<210>24<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>EC2的比對（Her-2-neu的975-1029bp）<400>24tgctgggggccagggcccacccagtgtgtcaactgcagtcatttccttcggggccaggag60<210>25<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223>IC1的比對（Her-2-neu的2114-3042bp）<400>25cgcccagcggagcaatgcccaaccaggctcagatgcggatcctaaaagagacggagc57<210>26<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>IC1的比對（Her-2-neu的2114-3042bp）<400>26taaggaaggtgaaggtgcttggatcaggagcttttggcactgtctacaagggcatctgga60<210>27<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>IC1的比對（Her-2-neu的2114-3042bp）<400>27tcccagatggggagaatgtgaaaatccccgtggctatcaaggtgttgagagaaaacacat60<210>28<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>IC1的比對（Her-2-neu的2114-3042bp）<400>28ctcctaaagccaacaaagaaattctagatgaagcgtatgtgatggctggtgtgggttctc60<210>29<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>IC1的比對（Her-2-neu的2114-3042bp）<400>29cgtatgtgtcccgcctcctgggcatctgcctgacatccacagtacagctggtgacacagc60<210>30<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>IC1的比對（Her-2-neu的2114-3042bp）<400>30ttatgccctacggctgccttctggaccatgtccgagaacaccgaggtcgcctaggctccc60<210>31<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>IC1的比對（Her-2-neu的2114-3042bp）<400>31aggacctgctcaactggtgtgttcagattgccaaggggatgagctacctggaggacgtgc60<210>32<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>IC1的比對（Her-2-neu的2114-3042bp）<400>32ggcttgtacacagggacctggctgcccggaatgtgctagtcaagagtcccaaccacgtca60<210>33<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>IC1的比對（Her-2-neu的2114-3042bp）<400>33agattacagatttcgggctggctcggctgctggacattgatgagacagagtaccatgcag60<210>34<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>IC1的比對（Her-2-neu的2114-3042bp）<400>34atgggggcaaggtgcccatcaaatggatggcattggaatctattctcagacgccggttca60<210>35<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>IC1的比對（Her-2-neu的2114-3042bp）<400>35cccatcagagtgatgtgtggagctatggagtgactgtgtgggagctgatgacttttgggg60<210>36<211>59<212>DNA<213>人工序列<220><223>IC1的比對（Her-2-neu的2114-3042bp）<400>36ccaaaccttacgatggaatcccagcccgggagatccctgatttgctggagaagggagaa59<210>37<211>58<212>DNA<213>人工序列<220><223>IC1的比對（Her-2-neu的2114-3042bp）<400>37cgcctacctcagcctccaatctgcaccattgatgtctacatgattatggtcaaatgtt58<210>38<211>54<212>DNA<213>人工序列<220><223>IC1的比對（Her-2-neu的2114-3042bp）<400>38ggatgattgactctgaatgtcgcccgagattccgggagttggtgtcagaatttt54<210>39<211>52<212>DNA<213>人工序列<220><223>IC1的比對（Her-2-neu的2114-3042bp）<400>39cacgtatggcgagggacccccagcgttttgtggtcatccagaacgaggactt52<210>40<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>EC1的比對（Her-2-neu的399-758bp）<400>40cccaggcagaaccccagaggggctgcgggagctgcagcttcgaagtctcacagagatcct60<210>41<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>EC1的比對（Her-2-neu的399-758bp）<400>41gaagggaggagttttgatccgtgggaaccctcagctctgctaccaggacatggttttgtg60<210>42<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>EC1的比對（Her-2-neu的399-758bp）<400>42ccgggcctgtccaccttgtgcccccgcctgcaaagacaatcactgttggggtgagagtcc60<210>43<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>EC1的比對（Her-2-neu的399-758bp）<400>43ggaagactgtcagatcttgactggcaccatctgtaccagtggttgtgcccggtgcaaggg60<210>44<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>EC1的比對（Her-2-neu的399-758bp）<400>44ccggctgcccactgactgctgccatgagcagtgtgccgcaggctgcacgggccccaagca60<210>45<211>3716<212>DNA<213>褐家鼠<400>45ccggaatcgcgggcacccaagtgtgtaccggcacagacatgaagttgcggctccctgcca60gtcctgagacccacctggacatgctccgccacctgtaccagggctgtcaggtagtgcagg120gcaacttggagcttacctacgtgcctgccaatgccagcctctcattcctgcaggacatcc180aggaagttcagggttacatgctcatcgctcacaaccaggtgaagcgcgtcccactgcaaa240ggctgcgcatcgtgagagggacccagctctttgaggacaagtatgccctggctgtgctag300acaaccgagatcctcaggacaatgtcgccgcctccaccccaggcagaaccccagaggggc360tgcgggagctgcagcttcgaagtctcacagagatcctgaagggaggagttttgatccgtg420ggaaccctcagctctgctaccaggacatggttttgtggaaggacgtcttccgcaagaata480accaactggctcctgtcgatatagacaccaatcgttcccgggcctgtccaccttgtgccc540ccgcctgcaaagacaatcactgttggggtgagagtccggaagactgtcagatcttgactg600gcaccatctgtaccagtggttgtgcccggtgcaagggccggctgcccactgactgctgcc660atgagcagtgtgccgcaggctgcacgggccccaagcattctgactgcctggcctgcctcc720acttcaatcatagtggtatctgtgagctgcactgcccagccctcgtcacctacaacacag780acacctttgagtccatgcacaaccctgagggtcgctacacctttggtgccagctgcgtga840ccacctgcccctacaactacctgtctacggaagtgggatcctgcactctggtgtgtcccc900cgaataaccaagaggtcacagctgaggacggaacacagcgttgtgagaaatgcagcaagc960cctgtgctcgagtgtgctatggtctgggcatggagcaccttcgaggggcgagggccatca1020ccagtgacaatgtccaggagtttgatggctgcaagaagatctttgggagcctggcatttt1080tgccggagagctttgatggggacccctcctccggcattgctccgctgaggcctgagcagc1140tccaagtgttcgaaaccctggaggagatcacaggttacctgtacatctcagcatggccag1200acagtctccgtgacctcagtgtcttccagaaccttcgaatcattcggggacggattctcc1260acgatggcgcgtactcattgacactgcaaggcctggggatccactcgctggggctgcgct1320cactgcgggagctgggcagtggattggctctgattcaccgcaacgcccatctctgctttg1380tacacactgtaccttgggaccagctcttccggaacccacatcaggccctgctccacagtg1440ggaaccggccggaagaggattgtggtctcgagggcttggtctgtaactcactgtgtgccc1500acgggcactgctgggggccagggcccacccagtgtgtcaactgcagtcatttccttcggg1560gccaggagtgtgtggaggagtgccgagtatggaaggggctcccccgggagtatgtgagtg1620acaagcgctgtctgccgtgtcaccccgagtgtcagcctcaaaacagctcagagacctgct1680ttggatcggaggctgatcagtgtgcagcctgcgcccactacaaggactcgtcctcctgtg1740tggctcgctgccccagtggtgtgaaaccggacctctcctacatgcccatctggaagtacc1800cggatgaggagggcatatgccagccgtgccccatcaactgcacccactcctgtgtggatc1860tggatgaacgaggctgcccagcagagcagagagccagcccggtgacattcatcattgcaa1920ctgtagtgggcgtcctgctgttcctgatcttagtggtggtcgttggaatcctaatcaaac1980gaaggagacagaagatccggaagtatacgatgcgtaggctgctgcaggaaactgagttag2040tggagccgctgacgcccagcggagcaatgcccaaccaggctcagatgcggatcctaaaag2100agacggagctaaggaaggtgaaggtgcttggatcaggagcttttggcactgtctacaagg2160gcatctggatcccagatggggagaatgtgaaaatccccgtggctatcaaggtgttgagag2220aaaacacatctcctaaagccaacaaagaaattctagatgaagcgtatgtgatggctggtg2280tgggttctccgtatgtgtcccgcctcctgggcatctgcctgacatccacagtacagctgg2340tgacacagcttatgccctacggctgccttctggaccatgtccgagaacaccgaggtcgcc2400taggctcccaggacctgctcaactggtgtgttcagattgccaaggggatgagctacctgg2460aggacgtgcggcttgtacacagggacctggctgcccggaatgtgctagtcaagagtccca2520accacgtcaagattacagatttcgggctggctcggctgctggacattgatgagacagagt2580accatgcagatgggggcaaggtgcccatcaaatggatggcattggaatctattctcagac2640gccggttcacccatcagagtgatgtgtggagctatggagtgactgtgtgggagctgatga2700cttttggggccaaaccttacgatggaatcccagcccgggagatccctgatttgctggaga2760agggagaacgcctacctcagcctccaatctgcaccattgatgtctacatgattatggtca2820aatgttggatgattgactctgaatgtcgcccgagattccgggagttggtgtcagaatttt2880cacgtatggcgagggacccccagcgttttgtggtcatccagaacgaggacttgggcccat2940ccagccccatggacagtaccttctaccgttcactgctggaagatgatgacatgggtgacc3000tggtagacgctgaagagtatctggtgccccagcagggattcttctccccggaccctaccc3060caggcactgggagcacagcccatagaaggcaccgcagctcgtccaccaggagtggaggtg3120gtgagctgacactgggcctggagccctcggaagaagggccccccagatctccactggctc3180cctcggaaggggctggctccgatgtgtttgatggtgacctggcaatgggggtaaccaaag3240ggctgcagagcctctctccacatgacctcagccctctacagcggtacagcgaggacccca3300cattacctctgccccccgagactgatggctatgttgctcccctggcctgcagcccccagc3360ccgagtatgtgaaccaatcagaggttcagcctcagcctcctttaaccccagagggtcctc3420tgcctcctgtccggcctgctggtgctactctagaaagacccaagactctctctcctggga3480agaatggggttgtcaaagacgtttttgccttcgggggtgctgtggagaaccctgaatact3540tagtaccgagagaaggcactgcctctccgccccacccttctcctgccttcagcccagcct3600ttgacaacctctattactgggaccagaactcatcggagcaggggcctccaccaagtaact3660ttgaagggacccccactgcagagaaccctgagtacctaggcctggatgtacctgta3716<210>46<211>360<212>DNA<213>褐家鼠<400>46cccaggcagaaccccagaggggctgcgggagctgcagcttcgaagtctcacagagatcct60gaagggaggagttttgatccgtgggaaccctcagctctgctaccaggacatggttttgtg120gaaggacgtcttccgcaagaataaccaactggctcctgtcgatatagacaccaatcgttc180ccgggcctgtccaccttgtgcccccgcctgcaaagacaatcactgttggggtgagagtcc240ggaagactgtcagatcttgactggcaccatctgtaccagtggttgtgcccggtgcaaggg300ccggctgcccactgactgctgccatgagcagtgtgccgcaggctgcacgggccccaagca360<210>47<211>618<212>DNA<213>褐家鼠<400>47ggtcacagctgaggacggaacacagcgttgtgagaaatgcagcaagccctgtgctcgagt60gtgctatggtctgggcatggagcaccttcgaggggcgagggccatcaccagtgacaatgt120ccaggagtttgatggctgcaagaagatctttgggagcctggcatttttgccggagagctt180tgatggggacccctcctccggcattgctccgctgaggcctgagcagctccaagtgttcga240aaccctggaggagatcacaggttacctgtacatctcagcatggccagacagtctccgtga300cctcagtgtcttccagaaccttcgaatcattcggggacggattctccacgatggcgcgta360ctcattgacactgcaaggcctggggatccactcgctggggctgcgctcactgcgggagct420gggcagtggattggctctgattcaccgcaacgcccatctctgctttgtacacactgtacc480ttgggaccagctcttccggaacccacatcaggccctgctccacagtgggaaccggccgga540agaggattgtggtctcgagggcttggtctgtaactcactgtgtgcccacgggcactgctg600ggggccagggcccaccca618<210>48<211>929<212>DNA<213>褐家鼠<400>48cgcccagcggagcaatgcccaaccaggctcagatgcggatcctaaaagagacggagctaa60ggaaggtgaaggtgcttggatcaggagcttttggcactgtctacaagggcatctggatcc120cagatggggagaatgtgaaaatccccgtggctatcaaggtgttgagagaaaacacatctc180ctaaagccaacaaagaaattctagatgaagcgtatgtgatggctggtgtgggttctccgt240atgtgtcccgcctcctgggcatctgcctgacatccacagtacagctggtgacacagctta300tgccctacggctgccttctggaccatgtccgagaacaccgaggtcgcctaggctcccagg360acctgctcaactggtgtgttcagattgccaaggggatgagctacctggaggacgtgcggc420ttgtacacagggacctggctgcccggaatgtgctagtcaagagtcccaaccacgtcaaga480ttacagatttcgggctggctcggctgctggacattgatgagacagagtaccatgcagatg540ggggcaaggtgcccatcaaatggatggcattggaatctattctcagacgccggttcaccc600atcagagtgatgtgtggagctatggagtgactgtgtgggagctgatgacttttggggcca660aaccttacgatggaatcccagcccgggagatccctgatttgctggagaagggagaacgcc720tacctcagcctccaatctgcaccattgatgtctacatgattatggtcaaatgttggatga780ttgactctgaatgtcgcccgagattccgggagttggtgtcagaattttcacgtatggcga840gggacccccagcgttttgtggtcatccagaacgaggacttgggcccatccagccccatgg900acagtaccttctaccgttcactgctggaa929<210>49<211>3798<212>DNA<213>智人<400>49atggagctggcggccttgtgccgctgggggctcctcctcgccctcttgccccccggagcc60gcgagcacccaagtgtgcaccggcacagacatgaagctgcggctccctgccagtcccgag120acccacctggacatgctccgccacctctaccagggctgccaggtggtgcagggaaacctg180gaactcacctacctgcccaccaatgccagcctgtccttcctgcaggatatccaggaggtg240cagggctacgtgctcatcgctcacaaccaagtgaggcaggtcccactgcagaggctgcgg300attgtgcgaggcacccagctctttgaggacaactatgccctggccgtgctagacaatgga360gacccgctgaacaataccacccctgtcacaggggcctccccaggaggcctgcgggagctg420cagcttcgaagcctcacagagatcttgaaaggaggggtcttgatccagcggaacccccag480ctctgctaccaggacacgattttgtggaaggacatcttccacaagaacaaccagctggct540ctcacactgatagacaccaaccgctctcgggcctgccacccctgttctccgatgtgtaag600ggctcccgctgctggggagagagttctgaggattgtcagagcctgacgcgcactgtctgt660gccggtggctgtgcccgctgcaaggggccactgcccactgactgctgccatgagcagtgt720gctgccggctgcacgggccccaagcactctgactgcctggcctgcctccacttcaaccac780agtggcatctgtgagctgcactgcccagccctggtcacctacaacacagacacgtttgag840tccatgcccaatcccgagggccggtatacattcggcgccagctgtgtgactgcctgtccc900tacaactacctttctacggacgtgggatcctgcaccctcgtctgccccctgcacaaccaa960gaggtgacagcagaggatggaacacagcggtgtgagaagtgcagcaagccctgtgcccga1020gtgtgctatggtctgggcatggagcacttgcgagaggtgagggcagttaccagtgccaat1080atccaggagtttgctggctgcaagaagatctttgggagcctggcatttctgccggagagc1140tttgatggggacccagcctccaacactgccccgctccagccagagcagctccaagtgttt1200gagactctggaagagatcacaggttacctatacatctcagcatggccggacagcctgcct1260gacctcagcgtcttccagaacctgcaagtaatccggggacgaattctgcacaatggcgcc1320tactcgctgaccctgcaagggctgggcatcagctggctggggctgcgctcactgagggaa1380ctgggcagtggactggccctcatccaccataacacccacctctgcttcgtgcacacggtg1440ccctgggaccagctctttcggaacccgcaccaagctctgctccacactgccaaccggcca1500gaggacgagtgtgtgggcgagggcctggcctgccaccagctgtgcgcccgagggcactgc1560tggggtccagggcccacccagtgtgtcaactgcagccagttccttcggggccaggagtgc1620gtggaggaatgccgagtactgcaggggctccccagggagtatgtgaatgccaggcactgt1680ttgccgtgccaccctgagtgtcagccccagaatggctcagtgacctgttttggaccggag1740gctgaccagtgtgtggcctgtgcccactataaggaccctcccttctgcgtggcccgctgc1800cccagcggtgtgaaacctgacctctcctacatgcccatctggaagtttccagatgaggag1860ggcgcatgccagccttgccccatcaactgcacccactcctgtgtggacctggatgacaag1920ggctgccccgccgagcagagagccagccctctgacgtccatcgtctctgcggtggttggc1980attctgctggtcgtggtcttgggggtggtctttgggatcctcatcaagcgacggcagcag2040aagatccggaagtacacgatgcggagactgctgcaggaaacggagctggtggagccgctg2100acacctagcggagcgatgcccaaccaggcgcagatgcggatcctgaaagagacggagctg2160aggaaggtgaaggtgcttggatctggcgcttttggcacagtctacaagggcatctggatc2220cctgatggggagaatgtgaaaattccagtggccatcaaagtgttgagggaaaacacatcc2280cccaaagccaacaaagaaatcttagacgaagcatacgtgatggctggtgtgggctcccca2340tatgtctcccgccttctgggcatctgcctgacatccacggtgcagctggtgacacagctt2400atgccctatggctgcctcttagaccatgtccgggaaaaccgcggacgcctgggctcccag2460gacctgctgaactggtgtatgcagattgccaaggggatgagctacctggaggatgtgcgg2520ctcgtacacagggacttggccgctcggaacgtgctggtcaagagtcccaaccatgtcaaa2580attacagacttcgggctggctcggctgctggacattgacgagacagagtaccatgcagat2640gggggcaaggtgcccatcaagtggatggcgctggagtccattctccgccggcggttcacc2700caccagagtgatgtgtggagttatggtgtgactgtgtgggagctgatgacttttggggcc2760aaaccttacgatgggatcccagcccgggagatccctgacctgctggaaaagggggagcgg2820ctgccccagccccccatctgcaccattgatgtctacatgatcatggtcaaatgttggatg2880attgactctgaatgtcggccaagattccgggagttggtgtctgaattctcccgcatggcc2940agggacccccagcgctttgtggtcatccagaatgaggacttgggcccagccagtcccttg3000gacagcaccttctaccgctcactgctggaggacgatgacatgggggacctggtggatgct3060gaggagtatctggtaccccagcagggcttcttctgtccagaccctgccccgggcgctggg3120ggcatggtccaccacaggcaccgcagctcatctaccaggagtggcggtggggacctgaca3180ctagggctggagccctctgaagaggaggcccccaggtctccactggcaccctccgaaggg3240gctggctccgatgtatttgatggtgacctgggaatgggggcagccaaggggctgcaaagc3300ctccccacacatgaccccagccctctacagcggtacagtgaggaccccacagtacccctg3360ccctctgagactgatggctacgttgcccccctgacctgcagcccccagcctgaatatgtg3420aaccagccagatgttcggccccagcccccttcgccccgagagggccctctgcctgctgcc3480cgacctgctggtgccactctggaaagggccaagactctctccccagggaagaatggggtc3540gtcaaagacgtttttgcctttgggggtgccgtggagaaccccgagtacttgacaccccag3600ggaggagctgcccctcagccccaccctcctcctgccttcagcccagccttcgacaacctc3660tattactgggaccaggacccaccagagcggggggctccacccagcaccttcaaagggaca3720cctacggcagagaacccagagtacctgggtctggacgtgccagtgtgaaccagaaggcca3780agtccgcagaagccctga3798<210>50<211>393<212>DNA<213>智人<400>50gagacccacctggacatgctccgccacctctaccagggctgccaggtggtgcagggaaac60ctggaactcacctacctgcccaccaatgccagcctgtccttcctgcaggatatccaggag120gtgcagggctacgtgctcatcgctcacaaccaagtgaggcaggtcccactgcagaggctg180cggattgtgcgaggcacccagctctttgaggacaactatgccctggccgtgctagacaat240ggagacccgctgaacaataccacccctgtcacaggggcctccccaggaggcctgcgggag300ctgcagcttcgaagcctcacagagatcttgaaaggaggggtcttgatccagcggaacccc360cagctctgctaccaggacacgattttgtggaag393<210>51<211>477<212>DNA<213>智人<400>51aatatccaggagtttgctggctgcaagaagatctttgggagcctggcatttctgccggag60agctttgatggggacccagcctccaacactgccccgctccagccagagcagctccaagtg120tttgagactctggaagagatcacaggttacctatacatctcagcatggccggacagcctg180cctgacctcagcgtcttccagaacctgcaagtaatccggggacgaattctgcacaatggc240gcctactcgctgaccctgcaagggctgggcatcagctggctggggctgcgctcactgagg300gaactgggcagtggactggccctcatccaccataacacccacctctgcttcgtgcacacg360gtgccctgggaccagctctttcggaacccgcaccaagctctgctccacactgccaaccgg420ccagaggacgagtgtgtgggcgagggcctggcctgccaccagctgtgcgcccgaggg477<210>52<211>391<212>DNA<213>智人<400>52cagcagaagatccggaagtacacgatgcggagactgctgcaggaaacggagctggtggag60ccgctgacacctagcggagcgatgcccaaccaggcgcagatgcggatcctgaaagagacg120gagctgaggaaggtgaaggtgcttggatctggcgcttttggcacagtctacaagggcatc180tggatccctgatggggagaatgtgaaaattccagtggccatcaaagtgttgagggaaaac240acatcccccaaagccaacaaagaaatcttagacgaagcatacgtgatggctggtgtgggc300tccccatatgtctcccgccttctgggcatctgcctgacatccacggtgcagctggtgaca360cagcttatgccctatggctgcctcttagact391<210>53<211>7075<212>DNA<213>人工序列<220><223>pAdv164序列（7075個堿基對）<400>53cggagtgtatactggcttactatgttggcactgatgagggtgtcagtgaagtgcttcatg60tggcaggagaaaaaaggctgcaccggtgcgtcagcagaatatgtgatacaggatatattc120cgcttcctcgctcactgactcgctacgctcggtcgttcgactgcggcgagcggaaatggc180ttacgaacggggcggagatttcctggaagatgccaggaagatacttaacagggaagtgag240agggccgcggcaaagccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacgaaatc300tgacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccc360cctggcggctccctcgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcattccg420ctgttatggccgcgtttgtctcattccacgcctgacactcagttccgggtaggcagttcg480ctccaagctggactgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgccttatccgg540taactatcgtcttgagtccaacccggaaagacatgcaaaagcaccactggcagcagccac600tggtaattgatttagaggagttagtcttgaagtcatgcgccggttaaggctaaactgaaa660ggacaagttttggtgactgcgctcctccaagccagttacctcggttcaaagagttggtag720ctcagagaaccttcgaaaaaccgccctgcaaggcggttttttcgttttcagagcaagaga780ttacgcgcagaccaaaacgatctcaagaagatcatcttattaatcagataaaatatttct840agccctcctttgattagtatattcctatcttaaagttacttttatgtggaggcattaaca900tttgttaatgacgtcaaaaggatagcaagactagaataaagctataaagcaagcatataa960tattgcgtttcatctttagaagcgaatttcgccaatattataattatcaaaagagagggg1020tggcaaacggtatttggcattattaggttaaaaaatgtagaaggagagtgaaacccatga1080aaaaaataatgctagtttttattacacttatattagttagtctaccaattgcgcaacaaa1140ctgaagcaaaggatgcatctgcattcaataaagaaaattcaatttcatccatggcaccac1200cagcatctccgcctgcaagtcctaagacgccaatcgaaaagaaacacgcggatgaaatcg1260ataagtatatacaaggattggattacaataaaaacaatgtattagtataccacggagatg1320cagtgacaaatgtgccgccaagaaaaggttacaaagatggaaatgaatatattgttgtgg1380agaaaaagaagaaatccatcaatcaaaataatgcagacattcaagttgtgaatgcaattt1440cgagcctaacctatccaggtgctctcgtaaaagcgaattcggaattagtagaaaatcaac1500cagatgttctccctgtaaaacgtgattcattaacactcagcattgatttgccaggtatga1560ctaatcaagacaataaaatagttgtaaaaaatgccactaaatcaaacgttaacaacgcag1620taaatacattagtggaaagatggaatgaaaaatatgctcaagcttatccaaatgtaagtg1680caaaaattgattatgatgacgaaatggcttacagtgaatcacaattaattgcgaaatttg1740gtacagcatttaaagctgtaaataatagcttgaatgtaaacttcggcgcaatcagtgaag1800ggaaaatgcaagaagaagtcattagttttaaacaaatttactataacgtgaatgttaatg1860aacctacaagaccttccagatttttcggcaaagctgttactaaagagcagttgcaagcgc1920ttggagtgaatgcagaaaatcctcctgcatatatctcaagtgtggcgtatggccgtcaag1980tttatttgaaattatcaactaattcccatagtactaaagtaaaagctgcttttgatgctg2040ccgtaagcggaaaatctgtctcaggtgatgtagaactaacaaatatcatcaaaaattctt2100ccttcaaagccgtaatttacggaggttccgcaaaagatgaagttcaaatcatcgacggca2160acctcggagacttacgcgatattttgaaaaaaggcgctacttttaatcgagaaacaccag2220gagttcccattgcttatacaacaaacttcctaaaagacaatgaattagctgttattaaaa2280acaactcagaatatattgaaacaacttcaaaagcttatacagatggaaaaattaacatcg2340atcactctggaggatacgttgctcaattcaacatttcttgggatgaagtaaattatgatc2400tcgagacccacctggacatgctccgccacctctaccagggctgccaggtggtgcagggaa2460acctggaactcacctacctgcccaccaatgccagcctgtccttcctgcaggatatccagg2520aggtgcagggctacgtgctcatcgctcacaaccaagtgaggcaggtcccactgcagaggc2580tgcggattgtgcgaggcacccagctctttgaggacaactatgccctggccgtgctagaca2640atggagacccgctgaacaataccacccctgtcacaggggcctccccaggaggcctgcggg2700agctgcagcttcgaagcctcacagagatcttgaaaggaggggtcttgatccagcggaacc2760cccagctctgctaccaggacacgattttgtggaagaatatccaggagtttgctggctgca2820agaagatctttgggagcctggcatttctgccggagagctttgatggggacccagcctcca2880acactgccccgctccagccagagcagctccaagtgtttgagactctggaagagatcacag2940gttacctatacatctcagcatggccggacagcctgcctgacctcagcgtcttccagaacc3000tgcaagtaatccggggacgaattctgcacaatggcgcctactcgctgaccctgcaagggc3060tgggcatcagctggctggggctgcgctcactgagggaactgggcagtggactggccctca3120tccaccataacacccacctctgcttcgtgcacacggtgccctgggaccagctctttcgga3180acccgcaccaagctctgctccacactgccaaccggccagaggacgagtgtgtgggcgagg3240gcctggcctgccaccagctgtgcgcccgagggcagcagaagatccggaagtacacgatgc3300ggagactgctgcaggaaacggagctggtggagccgctgacacctagcggagcgatgccca3360accaggcgcagatgcggatcctgaaagagacggagctgaggaaggtgaaggtgcttggat3420ctggcgcttttggcacagtctacaagggcatctggatccctgatggggagaatgtgaaaa3480ttccagtggccatcaaagtgttgagggaaaacacatcccccaaagccaacaaagaaatct3540tagacgaagcatacgtgatggctggtgtgggctccccatatgtctcccgccttctgggca3600tctgcctgacatccacggtgcagctggtgacacagcttatgccctatggctgcctcttag3660actaatctagacccgggccactaactcaacgctagtagtggatttaatcccaaatgagcc3720aacagaaccagaaccagaaacagaacaagtaacattggagttagaaatggaagaagaaaa3780aagcaatgatttcgtgtgaataatgcacgaaatcattgcttatttttttaaaaagcgata3840tactagatataacgaaacaacgaactgaataaagaatacaaaaaaagagccacgaccagt3900taaagcctgagaaactttaactgcgagccttaattgattaccaccaatcaattaaagaag3960tcgagacccaaaatttggtaaagtatttaattactttattaatcagatacttaaatatct4020gtaaacccattatatcgggtttttgaggggatttcaagtctttaagaagataccaggcaa4080tcaattaagaaaaacttagttgattgccttttttgttgtgattcaactttgatcgtagct4140tctaactaattaattttcgtaagaaaggagaacagctgaatgaatatcccttttgttgta4200gaaactgtgcttcatgacggcttgttaaagtacaaatttaaaaatagtaaaattcgctca4260atcactaccaagccaggtaaaagtaaaggggctatttttgcgtatcgctcaaaaaaaagc4320atgattggcggacgtggcgttgttctgacttccgaagaagcgattcacgaaaatcaagat4380acatttacgcattggacaccaaacgtttatcgttatggtacgtatgcagacgaaaaccgt4440tcatacactaaaggacattctgaaaacaatttaagacaaatcaataccttctttattgat4500tttgatattcacacggaaaaagaaactatttcagcaagcgatattttaacaacagctatt4560gatttaggttttatgcctacgttaattatcaaatctgataaaggttatcaagcatatttt4620gttttagaaacgccagtctatgtgacttcaaaatcagaatttaaatctgtcaaagcagcc4680aaaataatctcgcaaaatatccgagaatattttggaaagtctttgccagttgatctaacg4740tgcaatcattttgggattgctcgtataccaagaacggacaatgtagaattttttgatccc4800aattaccgttattctttcaaagaatggcaagattggtctttcaaacaaacagataataag4860ggctttactcgttcaagtctaacggttttaagcggtacagaaggcaaaaaacaagtagat4920gaaccctggtttaatctcttattgcacgaaacgaaattttcaggagaaaagggtttagta4980gggcgcaatagcgttatgtttaccctctctttagcctactttagttcaggctattcaatc5040gaaacgtgcgaatataatatgtttgagtttaataatcgattagatcaacccttagaagaa5100aaagaagtaatcaaaattgttagaagtgcctattcagaaaactatcaaggggctaatagg5160gaatacattaccattctttgcaaagcttgggtatcaagtgatttaaccagtaaagattta5220tttgtccgtcaagggtggtttaaattcaagaaaaaaagaagcgaacgtcaacgtgttcat5280ttgtcagaatggaaagaagatttaatggcttatattagcgaaaaaagcgatgtatacaag5340ccttatttagcgacgaccaaaaaagagattagagaagtgctaggcattcctgaacggaca5400ttagataaattgctgaaggtactgaaggcgaatcaggaaattttctttaagattaaacca5460ggaagaaatggtggcattcaacttgctagtgttaaatcattgttgctatcgatcattaaa5520ttaaaaaaagaagaacgagaaagctatataaaggcgctgacagcttcgtttaatttagaa5580cgtacatttattcaagaaactctaaacaaattggcagaacgccccaaaacggacccacaa5640ctcgatttgtttagctacgatacaggctgaaaataaaacccgcactatgccattacattt5700atatctatgatacgtgtttgtttttctttgctggctagcttaattgcttatatttacctg5760caataaaggatttcttacttccattatactcccattttccaaaaacatacggggaacacg5820ggaacttattgtacaggccacctcatagttaatggtttcgagccttcctgcaatctcatc5880catggaaatatattcatccccctgccggcctattaatgtgacttttgtgcccggcggata5940ttcctgatccagctccaccataaattggtccatgcaaattcggccggcaattttcaggcg6000ttttcccttcacaaggatgtcggtccctttcaattttcggagccagccgtccgcatagcc6060tacaggcaccgtcccgatccatgtgtctttttccgctgtgtactcggctccgtagctgac6120gctctcgccttttctgatcagtttgacatgtgacagtgtcgaatgcagggtaaatgccgg6180acgcagctgaaacggtatctcgtccgacatgtcagcagacgggcgaaggccatacatgcc6240gatgccgaatctgactgcattaaaaaagccttttttcagccggagtccagcggcgctgtt6300cgcgcagtggaccattagattctttaacggcagcggagcaatcagctctttaaagcgctc6360aaactgcattaagaaatagcctctttctttttcatccgctgtcgcaaaatgggtaaatac6420ccctttgcactttaaacgagggttgcggtcaagaattgccatcacgttctgaacttcttc6480ctctgtttttacaccaagtctgttcatccccgtatcgaccttcagatgaaaatgaagaga6540accttttttcgtgtggcgggctgcctcctgaagccattcaacagaataacctgttaaggt6600cacgtcatactcagcagcgattgccacatactccgggggaaccgcgccaagcaccaatat6660aggcgccttcaatccctttttgcgcagtgaaatcgcttcatccaaaatggccacggccaa6720gcatgaagcacctgcgtcaagagcagcctttgctgtttctgcatcaccatgcccgtaggc6780gtttgctttcacaactgccatcaagtggacatgttcaccgatatgttttttcatattgct6840gacattttcctttatcgcggacaagtcaatttccgcccacgtatctctgtaaaaaggttt6900tgtgctcatggaaaactcctctcttttttcagaaaatcccagtacgtaattaagtatttg6960agaattaattttatattgattaatactaagtttacccagttttcacctaaaaaacaaatg7020atgagataatagctccaaaggctaaagaggactataccaactatttgttaattaa7075<210>54<211>921<212>DNA<213>智人<400>54gccgcgagcacccaagtgtgcaccggcacagacatgaagctgcggctccctgccagtccc60gagacccacctggacatgctccgccacctctaccagggctgccaggtggtgcagggaaac120ctggaactcacctacctgcccaccaatgccagcctgtccttcctgcaggatatccaggag180gtgcagggctacgtgctcatcgctcacaaccaagtgaggcaggtcccactgcagaggctg240cggattgtgcgaggcacccagctctttgaggacaactatgccctggccgtgctagacaat300ggagacccgctgaacaataccacccctgtcacaggggcctccccaggaggcctgcgggag360ctgcagcttcgaagcctcacagagatcttgaaaggaggggtcttgatccagcggaacccc420cagctctgctaccaggacacgattttgtggaaggacatcttccacaagaacaaccagctg480gctctcacactgatagacaccaaccgctctcgggcctgccacccctgttctccgatgtgt540aagggctcccgctgctggggagagagttctgaggattgtcagagcctgacgcgcactgtc600tgtgccggtggctgtgcccgctgcaaggggccactgcccactgactgctgccatgagcag660tgtgctgccggctgcacgggccccaagcactctgactgcctggcctgcctccacttcaac720cacagtggcatctgtgagctgcactgcccagccctggtcacctacaacacagacacgttt780gagtccatgcccaatcccgagggccggtatacattcggcgccagctgtgtgactgcctgt840ccctacaactacctttctacggacgtgggatcctgcaccctcgtctgccccctgcacaac900caagaggtgacagcagaggat921<210>55<211>597<212>DNA<213>智人<400>55tacctttctacggacgtgggatcctgcaccctcgtctgccccctgcacaaccaagaggtg60acagcagaggatggaacacagcggtgtgagaagtgcagcaagccctgtgcccgagtgtgc120tatggtctgggcatggagcacttgcgagaggtgagggcagttaccagtgccaatatccag180gagtttgctggctgcaagaagatctttgggagcctggcatttctgccggagagctttgat240ggggacccagcctccaacactgccccgctccagccagagcagctccaagtgtttgagact300ctggaagagatcacaggttacctatacatctcagcatggccggacagcctgcctgacctc360agcgtcttccagaacctgcaagtaatccggggacgaattctgcacaatggcgcctactcg420ctgaccctgcaagggctgggcatcagctggctggggctgcgctcactgagggaactgggc480agtggactggccctcatccaccataacacccacctctgcttcgtgcacacggtgccctgg540gaccagctctttcggaacccgcaccaagctctgctccacactgccaaccggccagag597<210>56<211>1209<212>DNA<213>智人<400>56cagcagaagatccggaagtacacgatgcggagactgctgcaggaaacggagctggtggag60ccgctgacacctagcggagcgatgcccaaccaggcgcagatgcggatcctgaaagagacg120gagctgaggaaggtgaaggtgcttggatctggcgcttttggcacagtctacaagggcatc180tggatccctgatggggagaatgtgaaaattccagtggccatcaaagtgttgagggaaaac240acatcccccaaagccaacaaagaaatcttagacgaagcatacgtgatggctggtgtgggc300tccccatatgtctcccgccttctgggcatctgcctgacatccacggtgcagctggtgaca360cagcttatgccctatggctgcctcttagaccatgtccgggaaaaccgcggacgcctgggc420tcccaggacctgctgaactggtgtatgcagattgccaaggggatgagctacctggaggat480gtgcggctcgtacacagggacttggccgctcggaacgtgctggtcaagagtcccaaccat540gtcaaaattacagacttcgggctggctcggctgctggacattgacgagacagagtaccat600gcagatgggggcaaggtgcccatcaagtggatggcgctggagtccattctccgccggcgg660ttcacccaccagagtgatgtgtggagttatggtgtgactgtgtgggagctgatgactttt720ggggccaaaccttacgatgggatcccagcccgggagatccctgacctgctggaaaagggg780gagcggctgccccagccccccatctgcaccattgatgtctacatgatcatggtcaaatgt840tggatgattgactctgaatgtcggccaagattccgggagttggtgtctgaattctcccgc900atggccagggacccccagcgctttgtggtcatccagaatgaggacttgggcccagccagt960cccttggacagcaccttctaccgctcactgctggaggacgatgacatgggggacctggtg1020gatgctgaggagtatctggtaccccagcagggcttcttctgtccagaccctgccccgggc1080gctgggggcatggtccaccacaggcaccgcagctcatctaccaggagtggcggtggggac1140ctgacactagggctggagccctctgaagaggaggcccccaggtctccactggcaccctcc1200gaaggggct1209<210>57<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>Her-2-嵌合體(F)<400>57tgatctcgagacccacctggacatgctc28<210>58<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>HerEC1-EC2F（連接）<400>58ctaccaggacacgattttgtggaagaatatccaggagtttgctggctgc49<210>59<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>HerEC1-EC2R（連接）<400>59gcagccagcaaactcctggatattcttccacaaaatcgtgtcctggtag49<210>60<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>HerEC2-ICIF（連接）<400>60ctgccaccagctgtgcgcccgagggcagcagaagatccggaagtacacga50<210>61<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>HerEC2-ICIR（連接）<400>61tcgtgtacttccggatcttctgctgccctcgggcgcacagctggtggcag50<210>62<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>Her-2-嵌合體(R)<400>62gtggcccgggtctagattagtctaagaggcagccatagg39<210>63<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>Her-2-EC1(F)<400>63ccgcctcgaggccgcgagcacccaagtg28<210>64<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>Her-2-EC1(R)<400>64cgcgactagtttaatcctctgctgtcacctc31<210>65<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>Her-2-EC2(F)<400>65ccgcctcgagtacctttctacggacgtg28<210>66<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>Her-2-EC2(R)<400>66cgcgactagtttactctggccggttggcag30<210>67<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>Her-2-Her-2-IC1(F)<400>67ccgcctcgagcagcagaagatccggaagtac31<210>68<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>Her-2-IC1(R)<400>68cgcgactagtttaagccccttcggagggtg30<210>69<211>131<212>PRT<213>智人<400>69SerLeuSerPheLeuGlnAspIleGlnGluValGlnGlyTyrValLeu151015IleAlaHisAsnGlnValArgGlnValProLeuGlnArgLeuArgIle202530ValArgGlyThrGlnLeuPheGluAspAsnTyrAlaLeuAlaValLeu354045AspAsnGlyAspProLeuAsnAsnThrThrProValThrGlyAlaSer505560ProGlyGlyLeuArgGluLeuGlnLeuArgSerLeuThrGluIleLeu65707580LysGlyGlyValLeuIleGlnArgAsnProGlnLeuCysTyrGlnAsp859095ThrIleLeuTrpLysAspIlePheHisLysAsnAsnGlnLeuAlaLeu100105110ThrLeuIleAspThrAsnArgSerArgAlaCysHisProCysSerPro115120125MetCysLys130<210>70<211>131<212>PRT<213>家犬<400>70SerLeuSerPheLeuGlnAspIleGlnGluValGlnGlyTyrValLeu151015IleAlaHisSerGlnValArgGlnIleProLeuGlnArgLeuArgIle202530ValArgGlyThrGlnLeuPheGluAspAsnTyrAlaLeuAlaValLeu354045AspAsnGlyAspProLeuGluGlyGlyIleProAlaProGlyAlaAla505560ProGlyGlyLeuArgGluLeuGlnLeuArgSerLeuThrGluIleLeu65707580LysGlyGlyValLeuIleGlnArgSerProGlnLeuCysHisGlnAsp859095ThrIleLeuTrpLysAspValPheHisLysAsnAsnGlnLeuAlaLeu100105110ThrLeuIleAspThrAsnArgSerArgAlaCysProProCysSerPro115120125AlaCysLys130<210>71<211>75<212>PRT<213>智人<400>71ThrAlaProLeuGlnProGluGlnLeuGlnValPheGluThrLeuGlu151015GluIleThrGlyTyrLeuTyrIleSerAlaTrpProAspSerLeuPro202530AspLeuSerValPheGlnAsnLeuGlnValIleArgGlyArgIleLeu354045HisAsnGlyAlaTyrSerLeuThrLeuGlnGlyLeuGlyIleSerTrp505560LeuGlyLeuArgSerLeuArgGluLeuGlySer657075<210>72<211>75<212>PRT<213>家犬<400>72ThrAlaProLeuGlnProGluGlnLeuArgValPheGluAlaLeuGlu151015GluIleThrGlyTyrLeuTyrIleSerAlaTrpProAspSerLeuPro202530AsnLeuSerValPheGlnAsnLeuArgValIleArgGlyArgValLeu354045HisAspGlyAlaTyrSerLeuThrLeuGlnGlyLeuGlyIleSerTrp505560LeuGlyLeuArgSerLeuArgGluLeuGlySer657075<210>73<211>131<212>PRT<213>智人<400>73AsnGlnAlaGlnMetArgIleLeuLysGluThrGluLeuArgLysVal151015LysValLeuGlySerGlyAlaPheGlyThrValTyrLysGlyIleTrp202530IleProAspGlyGluAsnValLysIleProValAlaIleLysValLeu354045ArgGluAsnThrSerProLysAlaAsnLysGluIleLeuAspGluAla505560TyrValMetAlaGlyValGlySerProTyrValSerArgLeuLeuGly65707580IleCysLeuThrSerThrValGlnLeuValThrGlnLeuMetProTyr859095GlyCysLeuLeuAspHisValArgGluAsnArgGlyArgLeuGlySer100105110GlnAspLeuLeuAsnTrpCysMetGlnIleAlaLysGlyMetSerTyr115120125LeuGluAsp130<210>74<211>131<212>PRT<213>家犬<400>74AsnGlnAlaGlnMetArgIleLeuLysGluThrGluLeuArgLysVal151015LysValLeuGlySerGlyAlaPheGlyThrValTyrLysGlyIleTrp202530IleProAspGlyGluAsnValLysIleProValAlaIleLysValLeu354045ArgGluAsnThrSerProLysAlaAsnLysGluIleLeuAspGluAla505560TyrValMetAlaGlyValGlySerProTyrValSerArgLeuLeuGly65707580IleCysLeuThrSerThrValGlnLeuValThrGlnLeuMetProTyr859095GlyCysLeuLeuAspHisValArgGluAsnArgGlyArgLeuGlySer100105110GlnAspLeuLeuAsnTrpCysMetGlnIleAlaLysGlyMetSerTyr115120125LeuGluAsp130當(dāng)前第1頁1 2 3