本發(fā)明涉及一種手術(shù)止血材料，特別是指一種適用于進(jìn)行靜脈注射的具有止血功能的醫(yī)藥組合物的制造方法。

背景技術(shù)：

眾所周知，人體血液充足是健康之本，許多手術(shù)(如癌癥手術(shù))及內(nèi)科治療過程均會引起失血，尤其對于血小板缺乏的病人來說，失血過多就可能有生命危險；另外，輸血又是個很復(fù)雜的過程。因此，在醫(yī)療現(xiàn)場亟需一種對凝血有幫助的物質(zhì)，用以縮短止血時間，或?qū)⑹а靠刂圃谧钚〕潭取?/p>

此類凝血物質(zhì)的功效如同血小板，可減少開刀和手術(shù)后病人及血小板缺乏的病人的失血量；一般來說，此類凝血物質(zhì)須具有能夠允許其參與血液凝固的表面分子，例如纖維蛋白原。而此類凝血物質(zhì)是以注射方式注入人體，故須滿足以下要求：其一，由于人體微血管的直徑約7微米，因此凝血物質(zhì)(如微粒)的直徑須小于7微米；其二，此類凝血物質(zhì)不能在血液中凝聚，卻能在傷口處凝聚，且此類凝血物質(zhì)不能引起血細(xì)胞在血液中凝聚，卻會參與促進(jìn)血細(xì)胞在傷口處凝聚。

現(xiàn)在技術(shù)中，k.i.widder等人在文獻(xiàn)“藥理及化學(xué)治療法的發(fā)展(v0l.16.213-271)”中的一篇文章《抗癌試劑生物物理示蹤中的磁活性微球體及其他載體》揭露“用蛋白質(zhì)水溶液和油，并通過加熱或聚合，得到乳化液合成蛋白質(zhì)微球體”的技術(shù)內(nèi)容；然而，在實際治療中需要能在血管中保存至少一天以上且不會變質(zhì)的凝血物質(zhì)，所述蛋白質(zhì)微球體在合成過程中容易變質(zhì)，故其半衰期很短。

oppenhein等人在美國第us4,107,288號專利“注射組合物中有效的極微粒子及其生產(chǎn)方法”中揭露一種方法，主要是通過使用一種相反的增溶劑來調(diào)節(jié)去溶劑試劑的濃度，使蛋白質(zhì)溶液達(dá)到一個去溶劑極限。然而，此方法于反應(yīng)初始時條件極不穩(wěn)定，且反應(yīng)中間常伴隨著引起球體生成的大量的聚合，而聚凝球體的直徑通常都會大于7微米，易造成血管阻塞而引起生命 危險。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的在于提供一種具有止血功能的醫(yī)藥組合物的制造方法，此方法所制成的醫(yī)藥組合物可用于治療血小板缺乏的患者，不僅無毒副作用、止血速度快且效果好。

為達(dá)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種具有止血功能的醫(yī)藥組合物的制造方法，適于進(jìn)行靜脈注射，所述制造方法包括以下步驟：首先，將人體白蛋白分子溶于一緩沖液中，得到一白蛋白溶液，其中所述人體白蛋白溶液的濃度為5-20wt％；接著，在所述白蛋白溶液中依特定時序分別加入一表面活性劑、一交聯(lián)劑、及一溶劑，得到一白蛋白球體懸浮液；然后，在所述白蛋白球體懸浮液中加入纖維蛋白原，其中纖維蛋白原以共價鍵結(jié)合于白蛋白球體表面，形成雙層蛋白質(zhì)球狀顆粒。

本發(fā)明具有益效果如下：本發(fā)明的制造方法所制成的醫(yī)藥組合物中，由于纖維蛋白原可藉共價鍵結(jié)合于白蛋白球體表面，因此不會對懸浮液中的白蛋白球體的數(shù)量造成任何損失，且所形成的表面具有纖維蛋白原包覆的白蛋白球體不會發(fā)生團聚現(xiàn)象。

再者，本發(fā)明通過選用特定的交聯(lián)劑，表面具有纖維蛋白原包覆的白蛋白球體的平均直徑可小于1微米，且變異系數(shù)很小，所以在通過靜脈注射后不會導(dǎo)致血管阻塞；進(jìn)一步地，纖維蛋白原可作為示蹤分子(tracer)，其用以攜帶白蛋白球體到達(dá)傷口部位，并使白蛋白球體會凝聚在一起，以達(dá)到止血或減少出血量的效果。

此外，所述醫(yī)藥組合物可作為血小板的替代品(fibrinoplate,plateletaggregationsubstitute)，其用在外傷、手術(shù)或大量出血的病人身上時，不會產(chǎn)生抗體，不會有血源不足和血型不合的問題，可避免通過血液傳播的疾病。

為便審查員能對本發(fā)明目的、技術(shù)特征及其功效，做更進(jìn)一步的認(rèn)識與了解，茲舉以下所描述的具體實施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明范圍，實施例配合附圖，詳細(xì)說明如下。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的具有止血功能的醫(yī)藥組合物的制造方法的流程示意圖。

具體實施方式

本發(fā)明較佳實施例提供一種醫(yī)藥組合物、其制造方法與用途，所述醫(yī)藥組合物的特點在于，白蛋白球體在懸浮液中不會發(fā)生團聚，白蛋白球體的直徑小于1微米，且表面具有纖維蛋白原。

接下來將先說明醫(yī)藥組合物的制造方法及其具體施行方式，而后再適時地補充醫(yī)藥組合物中各組成成分的重量配比及其具體例；盡管本實施例中是使用人體白蛋白，但是人體其他蛋白質(zhì)，例如免疫蛋白、肌紅蛋白、膠原、明膠等等，同樣也可使用并能夠形成球體。

熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員可由本說明書內(nèi)容了解本發(fā)明的優(yōu)點與功效。應(yīng)理解，本說明書內(nèi)容中所記載的各項細(xì)節(jié)可基于不同觀點加以施行或應(yīng)用，因此在本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾與變更，均屬本發(fā)明等效結(jié)構(gòu)的創(chuàng)意范疇內(nèi)。

請參閱圖1，為本發(fā)明較佳實施例的具有止血功能的醫(yī)藥組合物的制造方法的流程示意圖。所述制造方法主要包括：

步驟s100：將人體白蛋白分子溶于一緩沖液中，得到一人體白蛋白溶液，其中所述人體白蛋白溶液的濃度為5-20wt％。本實施例中，緩沖液的ph值范圍介于4-8，且較佳為5-7.3；緩沖液的滲透壓范圍介于14-680mosm，且較佳為250-400mosm。

緩沖液的具體例包括以下成分中的一種或多種：tris、tris-hcl、醋酸鈉、hepes、hepes-na、aces、ada、ampso、bes、bicine、bis-tris、bis-trispropane、cabs、caps、capso、ches、檸檬酸、dipso、epps、甘氨酸、hepbs、heppso、咪唑、mes、mobs、mops、mopso、pipes、popso、二鉀胂酸鈉、檸檬酸鈉、tabs、taps、tapso、tea、及tes。

步驟s102：在所述人體白蛋白溶液中依特定時序分別加入一表面活性劑、一交聯(lián)劑、及一溶劑，得到一白蛋白球體懸浮液。理想化條件是，在形成所述白蛋白球體時，所述表面活性劑的濃度為0.1-10mg/ml，所述交聯(lián)劑的濃度為0.625-2.5mg/ml，所述溶劑的濃度至少大于48wt％；據(jù)此，所形成白蛋白球體的平均直徑可小于1微米，且白蛋白球體可均勻分散于懸浮液中而不會發(fā)生團聚現(xiàn)象。

本實施例使用的表面活性劑可選自于四癸基硫酸鈉、tritonx-151、或 tween80，亦可為洗滌劑。本實施例使用的交聯(lián)劑包括戊二醛的共價小分子。溶劑的具體例包括以下成分中的一種或多種：氯仿、2-丙醇、甲苯、苯、芐基醇、二氯甲烷、四氯化碳、環(huán)己烷、環(huán)己酮、三氯乙烷、甲基乙基酮、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、四氫呋喃、1,4-二惡烷、1-丙醇、苯酚、吡啶、乙酸、甲酸、六氟-2-丙醇、六氟丙酮、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、乙腈、n-甲基-2-吡咯烷酮、n-甲基嗎啉-n-氧化物、1,3-二氧雜環(huán)戊烷、及水；較佳地，本實施例使用的溶劑可為醇溶液，特別是2-丙醇或乙醇。

步驟s104：在所述白蛋白球體懸浮液中加入纖維蛋白原，其中纖維蛋白原以共價鍵結(jié)合于白蛋白球體表面，形成雙層蛋白質(zhì)球狀顆粒。理想化條件是，纖維蛋白原為溶液形式，且纖維蛋白原是在完成步驟s102后，等待10分鐘至1小時再加入于所述白蛋白球體懸浮液中；依此方式，雙層蛋白質(zhì)球狀顆粒的產(chǎn)率可超過99％，反應(yīng)過程中幾乎不會對懸浮液中的白蛋白球體的數(shù)量造成任何損失。

在完成步驟s104后，所述制造方法可進(jìn)一步包括步驟s106：對雙層蛋白質(zhì)球狀顆粒的懸浮液進(jìn)行后處理，例如進(jìn)行稀釋、過濾、滲析、再過濾、離心分離、電泳分離和色譜柱分離等程序，然后再通過真空冷凍干燥及冷凍后的粉末重構(gòu)化，以制成適于進(jìn)行靜脈注射的凍干型醫(yī)藥組成物(即蛋白質(zhì)顆粒組成物)，其中相對于100重量份的所述人體白蛋白，所述纖維蛋白原的含量為0.02-6重量份，較佳為0.8-5.7重量份；順帶一提，重構(gòu)化的過程中需加入緩沖液或改變緩沖液及防腐劑等生物相溶體，而這類試劑的種類和用量是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的，故在此不予贅述。

值得注意的是，通過重構(gòu)化形成的雙層蛋白質(zhì)球狀顆粒(即表面具有纖維蛋白原包覆的蛋白質(zhì)顆粒)，其平均直徑可介于0.1至100μm，遠(yuǎn)小于人體微血管的直徑，因此在通過靜脈注射后不會導(dǎo)致血管阻塞。

在不損害本發(fā)明所期望的效果的范圍內(nèi)，在具體施行步驟s106時，可再加入類凝血酶、賦形劑(excipient)及/或其他添加劑。類凝血酶可為任何一種將纖維蛋白原催化為非交聯(lián)的纖維蛋白的酶；賦形劑的添加不妨礙雙層蛋白質(zhì)球狀顆粒的發(fā)揮，且能增加醫(yī)藥組成物的均勻性和穩(wěn)定性，同時減少醫(yī)藥組成物的刺激性和不良?xì)馕兜?，賦形劑的具體例包括：乳糖、蔗糖、甘露糖醇、及甘露糖醇的醣類等；添加劑可包括以下成分中的一種或多種：

(1)甘氨酸；

(2)離子濃度為1-200mmol的鈣離子；

(3)凝血因子xiii；

(4)具有抑菌或殺菌作用的成分；

(5)抑制蛋白分解的物質(zhì)；以及

(6)促進(jìn)細(xì)胞生長的細(xì)胞生長因子。

根據(jù)本發(fā)明物的制造方法所制成的具有止血功能的醫(yī)藥組合物，其包括：(a)16-22重量％的雙層蛋白質(zhì)球狀顆粒，包含內(nèi)層的人體白蛋白球體及以共價鍵結(jié)合于所述人體白蛋白球體表面的纖維蛋白原；(b)0.8-2.3重量％的表面活性劑；(c)12-16重量％的交聯(lián)劑；以及(d)45-75重量％的溶劑；其中，相對于100重量份的所述人體白蛋白，所述纖維蛋白原的含量為0.8-5.7重量份。理想化條件是，所述醫(yī)藥組成物中成分(a)雙層蛋白質(zhì)球狀顆粒的含量為20重量％，成分(b)表面活性劑的含量為1.5重量％，成分(c)交聯(lián)劑的含量為14重量％，成分(c)表溶劑的含量為64.5重量％。

再者，在不損及本發(fā)明目的的范圍內(nèi)，所述醫(yī)藥組合物可進(jìn)一步包括：成分(e)2-5重量％的類凝血酶；成分(f)1-10重量％的添加劑；以及成分(g)0.4-1.3重量％的賦形劑。

[實施例1]

沒有纖維蛋白原形成微粒的方法：

將人體白蛋白粉末放入0.9％的氯化鈉溶液中，并加入濃度在0.05mg/ml-15mg/ml的表面活性劑，如四癸基硫酸鈉、tween-80或tritonx-151，形成濃度在5-20％重量體積比的蛋白質(zhì)溶液。然后于含有不同濃度的表面活性劑的含2ml上述蛋白質(zhì)溶液的系列試管中加入2ml以氯化鈉溶液稀釋過的，其濃度范圍為0.01-3.0％的戊二醛。10分鐘以后，再加入10ml的乙醇〔用水釋到80％(體積比)〕，這時溶液立刻出現(xiàn)混濁。再過10分鐘，以5倍體積的氯化鈉溶液稀釋來觀察此懸浮液是否澄清，結(jié)果為否定的。此后以1000倍的顯微鏡觀察此懸浮液，發(fā)現(xiàn)此懸浮液中粒子的直徑小于1微米。

同時也發(fā)現(xiàn)，用濃度為1-2.5mg/ml的tritonx-151和濃度為100-200mg/ml的白蛋白制成的合劑效果最好。另外也發(fā)現(xiàn)用濃度為1-12mg/ml的四癸基硫 酸鈉制成的合劑其微粒直徑的變異系數(shù)最小。

[實施例2]

將纖維蛋白原連到蛋白粒子上作為示蹤粒子的方法：

采用與實施例1相同的條件，使用1-125的標(biāo)志的人體白蛋白。通過以離心法沉淀球體，測量沉淀中和清液中各自含有的放射性蛋白質(zhì)微粒數(shù)目，發(fā)現(xiàn)有95％的白蛋白粒子形成球體。如果將溶液的溶質(zhì)度由0.9％的氯化鈉溶液濃度提2倍，即變成1.8％的氯化鈉溶液或?qū)?.9％的氯化鈉溶液降到0.09％的氯化鈉溶液，發(fā)現(xiàn)對球體的產(chǎn)量沒有很大影響。如果將緩沖溶液的ph降到4以下，則發(fā)現(xiàn)在形成球體時所需的醇的量比ph為8時所需醇的量要多，且ph在4以下時使球體的產(chǎn)率稍微有所下降。

[實施例3]

在最優(yōu)先的條件下重復(fù)實施例2，所不同的是用熒光異硫氰酸酯包覆人體白蛋白，采用實施例1的最佳條件，在出現(xiàn)混濁后不同的時間間隔內(nèi)將纖維蛋白原加到球懸浮液中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在球體形成后十五分鐘內(nèi)加入纖維蛋白原能夠使球體穩(wěn)定且獲得最好的合劑。另外，必須對球體懸浮液進(jìn)行進(jìn)一步處理，其中包括進(jìn)行稀釋、過濾、滲析、再過濾、離心分離，電泳分離和色譜柱分離，通過真空冷凍干燥及冷凍粉末的重構(gòu)化后完成，其中在此過程中需加入或改變緩沖液或防腐劑。

根據(jù)mcgill等人的在j.lab.clin.med.1987,109：127-133上的“血小板模腔可降低血小板缺乏的兔子的流血時間”一文，使用血小板缺乏的兔子進(jìn)行藥理試驗，以70mg/kg的busulfan法處理過的十只兔子的流血時間為697秒，經(jīng)過注射1ml/kg的纖維蛋白原包覆的球體(用0.9％的氯化鈉溶液溶解冷凍的粉末)，流血時間降為115秒(標(biāo)準(zhǔn)偏差為43秒)。將兔子耳朵傷處切片并移至熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)凝血內(nèi)有熒光粒子。如果對血小板缺乏的兔子注射不含纖維蛋白原的球體懸浮液(1mg/ml)，發(fā)現(xiàn)流血時間并未縮短，在耳朵凝血處也沒有發(fā)現(xiàn)熒光粒子，這說明纖維蛋白原是作為引導(dǎo)分子將粒子導(dǎo)至凝血活躍區(qū)域，并導(dǎo)致縮短流血時間及減少失血量。

對于那些有外傷或可能并未患有血小板缺乏癥的手術(shù)患者來說，本發(fā)明的粒子同樣具有療效，并能感受較快的凝血時間和較少的失血量之利。

[本發(fā)明實施例可能帶來的功效]

首先，本發(fā)明的制造方法所制成的醫(yī)藥組合物中，由于纖維蛋白原可藉共價鍵結(jié)合于白蛋白球體表面，因此不會對懸浮液中的白蛋白球體的數(shù)量造成任何損失，且所形成的表面具有纖維蛋白原包覆的白蛋白球體不會發(fā)生團聚現(xiàn)象。

再者，本發(fā)明通過選用特定的交聯(lián)劑，表面具有纖維蛋白原包覆的白蛋白球體的平均直徑可小于1微米，且變異系數(shù)很小，所以在通過靜脈注射后不會導(dǎo)致血管阻塞；進(jìn)一步地，纖維蛋白原可作為示蹤分子(tracer)，其用以攜帶白蛋白球體到達(dá)傷口部位，并使白蛋白球體會凝聚在一起，以達(dá)到止血或減少出血量的效果。

此外，所述醫(yī)藥組合物可作為血小板的替代品(fibrinoplate,plateletaggregationsubstitute)，其用在外傷、手術(shù)或大量出血的病人身上時，不會產(chǎn)生抗體，不會有血源不足和血型不合的問題，可避免通過血液傳播的疾病。

雖然本發(fā)明是以實施例作說明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不離本發(fā)明精神與范疇下制作各種不同形式的改變，以上所舉實施例僅用以說明本發(fā)明，并非用來限制本發(fā)明范圍，本發(fā)明不限于上述各實施形態(tài)者，可在權(quán)利要求書所示的范圍內(nèi)進(jìn)行各種變更，且在不同實施形態(tài)中分別揭示的適當(dāng)組合技術(shù)手段而得的實施形態(tài)，亦包含在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)，即凡依本發(fā)明權(quán)利要求書所作的均等變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明的專利涵蓋范圍內(nèi)。