本發(fā)明屬于醫(yī)療止血海綿領域，具體的涉及一種以膠原蛋白和氧化再生纖維素進行交聯(lián)制備的復合止血海綿及其制備方法。

背景技術(shù)：

止血對于口腔頜面外科手術(shù)的成功至關重要，尤其對于伴有并發(fā)癥且經(jīng)歷了正頜外科手術(shù)后患者以及具有出血傾向如血小板減少癥患者。隨著止血方法的發(fā)展，很多填塞和縫合方法在臨床常用。許多填塞止血材料，包括明膠海綿、甲殼素和殼聚糖海綿被用于手術(shù)中，這些材料各有優(yōu)勢和局限性。例如，明膠海綿敷于傷口，材質(zhì)柔軟，壓力不足，使止血時間略長，無抗炎作用因此無法控制牙槽內(nèi)感染。而且它的生物降解速度較快，不適于植入體內(nèi)。甲殼素和殼聚糖海綿止血作用研究仍處于初期，需要更多論述。因此不斷開發(fā)新型的、生物相容性好、止血效果快的止血材料是本領域不斷研發(fā)的課題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種新型高效復合止血海綿及其制備方法，該復合止血海綿，將氧化再生纖維素及I型膠原蛋白按一定比例進行交聯(lián)，所制備的止血海綿加速了止血進程，且無生物毒性、促進組織愈合。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種新型高效復合止血海綿：由膠原蛋白和氧化再生纖維素交聯(lián)制得；所述的氧化再生纖維素的質(zhì)量為膠原蛋白質(zhì)量的0.1-1％。

一種新型高效復合止血海綿的制備方法，方法如下：

1)復合材料Col-ORC的制備：將膠原蛋白海綿(Col)溶于乙酸水溶液中，得到膠原蛋白乙酸水溶液，將適量氧化再生纖維素(ORC)加入到膠原蛋白乙酸水溶液中，常溫下，磁力攪拌至粉末分散均勻后，冷凍干燥24-48h，得到膠原蛋白和氧化再生纖維素的復合材料Col-ORC。

優(yōu)選的，所述的膠原蛋白乙酸水溶液為：每10ml乙酸水溶液加入0.03-0.1g膠原蛋白海綿；按體積百分比，所述的乙酸水溶液的濃度為0.5-1.2％。

優(yōu)選的，氧化再生纖維素的加入量為膠原蛋白質(zhì)量的0.1-1％。

2)將復合材料Col-ORC置于體積百分濃度為15-45％的乙醇/MES緩沖液中浸泡30-45min，過濾，棄濾液得過濾物；再按料液比1：2.5-4.5，取過濾物和體積百分濃度為35-45％的乙醇/MES緩沖液，浸泡3-6h后，緩慢添加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)至濃度為10-20mg/mL，隨后再添加N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)至濃度為2.25-3.75mg/mL，反應4-8h后，用1M磷酸一氫鈉中和過量的EDC和NHS 1-3h，過濾，棄濾液，去離子水洗滌，得交聯(lián)產(chǎn)物。

3)將交聯(lián)產(chǎn)物冷凍干燥，得到新型高效復合止血海綿。

上述的新型高效復合止血海綿的制備方法，所述的膠原蛋白海綿的制備方法如下：

1)去脂：將新鮮牛跟腱刮去表面的筋膜、油脂，用蒸餾水浸泡、洗滌，切碎后，放入組織搗碎機中，搗碎勻漿；用質(zhì)量分數(shù)為0.05％-0.2％的碳酸鈉溶液浸泡10-18h，過濾，得去脂處理的牛跟腱。

2)提?。喝∪ブ幚淼呐８?，加入胃蛋白酶和乙酸水溶液，在0-4℃下攪拌3-4天，所得粗提液，離心，取上清液。優(yōu)選的，胃蛋白酶的加入量為，每100克去脂處理的牛跟腱，加入胃蛋白酶3-5g。

3)鹽析：向離心后的上清液中，攪拌下，加入NaCl顆粒至氯化鈉的濃度達到2-3M，待沉淀析出后靜置12-18h，過濾，得白色粘稠狀的沉淀。

4)透析：將白色粘稠狀的沉淀用0.1M Tris-HCl溶液溶脹10-18h，之后裝入截留分子量為7000-14000的透析袋中，依次采用0.5M、0.3M、0.1M的乙酸溶液作為透析外液，每種濃度分別透析1.5-3天，最后用蒸餾水作為透析外液，透析2-4天，得到透析后的膠原蛋白溶液。

5)干燥：將透析后的膠原蛋白溶液放入容器中，冰箱預凍后，放入冷凍干燥機中，冷凍干燥24-48h，得到膠原蛋白海綿。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明從牛跟腱中提取膠原蛋白溶液后，引入氧化再生纖維素粉末，經(jīng)無毒交聯(lián)后，制成不同比例的Col/ORC止血復合材料。通過表面結(jié)構(gòu)觀察，理化性能分析，生物安全性和有效性分析，使新型Col/ORC止血復合材料達到更有效的止血，快速體內(nèi)降解，并且促進組織愈合。

附圖說明

圖1a是膠原蛋白海綿和不同/氧化再生纖維素含量的復合止血海綿的SEM圖；

其中：(A)Control(創(chuàng)爾膠原蛋白海綿)，500×，(a)200×；

(B)Col(自制膠原蛋白海綿)，500×，(b)200×；

(C)Col-0.25％ORC，500×，(c)200×；

(D)Col-0.5％ORC，500×，(d)200×；

(E)Col-1％ORC，500×，(e)200×。

圖1b是膠原蛋白海綿和不同/氧化再生纖維素含量的復合止血海綿的孔徑分布圖。

圖2是膠原蛋白海綿和不同/氧化再生纖維素含量的復合止血海綿的紅外譜圖。

圖3是為實施例1-實施例3制備的復合止血海綿對ACC-M細胞的細胞毒性。

圖4a是Col與不同含量Col/ORC復合止血海綿拉伸強度對比圖。

圖4b是Col與不同含量Col/ORC復合止血海綿接觸角測定對比圖。

圖4c是Col與不同含量Col/ORC復合止血海綿孔隙率對比圖。

圖4d是Col與不同含量Col/ORC復合止血海綿吸水率對比圖。

圖5是在兔耳動脈和肝損傷模型中，Col和不同含量Col/ORC復合止血海綿的出血量。

圖6是不同材料分別植入兔腿部1天，7天，14天和28天后的局部組織病理圖(HE染色)。

具體實施方式

實施例1

(一)膠原蛋白海綿的制備

1)去脂：將新鮮牛跟腱刮去表面的筋膜、油脂，用蒸餾水浸泡、洗滌，切碎后，放入組織搗碎機中搗碎勻漿。用質(zhì)量分數(shù)為0.1％的碳酸鈉溶液浸泡12h，過濾、得去脂處理的牛跟腱。

2)提取：取上述得到的去脂處理的牛跟腱10g放入三口燒瓶中，加入0.45g的胃蛋白酶和約1000ml的0.3％乙酸溶液。在0-4℃下攪拌3天。將所得粗提液在高速冷凍離心機中離心，轉(zhuǎn)速10000rpm離心20min，取上清液。

3)鹽析：向離心后的上清液中，攪拌下，加入NaCl顆粒至氯化鈉的濃度達到2-3M，待沉淀析出后靜置12-18h，過濾，得白色粘稠狀的沉淀。

4)透析：將白色粘稠狀的沉淀，用0.1M Tris-HCl溶液溶脹12h，之后裝入截留分子量為1萬的透析袋中，依次采用0.5M、0.3M、0.1M的乙酸溶液作為透析外液，每種濃度透析2天。最后用蒸餾水作為透析外液，透析3天，得到透析后的膠原蛋白溶液。

5)干燥：將透析后的膠原蛋白溶液放入不銹鋼盤中，冰箱預凍，然后放入冷凍干燥機中，冷凍干燥24-48h，得到膠原蛋白海綿(Col)，存儲于-20℃，備用。

(二)復合止血海綿的制備

1)復合材料Col-ORC的制備：按照每10ml乙酸水溶液(1％v/v)加入0.06g膠原蛋白海綿(Col)，配制膠原蛋白乙酸水溶液。取100ml膠原蛋白乙酸水溶液，加入氧化再生纖維素(ORC)，氧化再生纖維素(ORC)的加入量為膠原蛋白質(zhì)量的0.25％，常溫下，磁力攪拌至粉末分散均勻后，冷凍干燥24-48h，得到膠原蛋白和氧化再生纖維素的復合材料Col-0.25％ORC。

2)取25mg復合材料Col-0.25％ORC，置于10ml乙醇/MES緩沖液(40％v/v)中，浸泡30min，過濾，棄濾液得過濾物；再按料液比1：3.5，取1mg過濾物和3.5ml乙醇/MES緩沖液(40％v/v)，浸泡4h后，緩慢添加EDC至濃度為15mg/mL，隨后再添加NHS至濃度為3.75mg/mL，反應4h后，用1M磷酸一氫鈉中和過量的EDC和NHS 1h，過濾，棄濾液，用去離子水洗滌30min，得交聯(lián)產(chǎn)物。

3)將交聯(lián)產(chǎn)物放入冷凍干燥機中干燥72h，得到ORC含量為0.25％的新型高效復合止血海綿Col-0.25％ORC，存儲于-20℃。

實施例2

(一)膠原蛋白海綿的制備：同實施例1

(二)復合止血海綿的制備

1)復合材料Col-ORC的制備：按照每10ml乙酸水溶液(1％v/v)加入0.06g膠原蛋白海綿(Col)，配制膠原蛋白乙酸水溶液。取100ml膠原蛋白乙酸水溶液，加入氧化再生纖維素(ORC)，氧化再生纖維素(ORC)的加入量為膠原蛋白質(zhì)量的0.5％，常溫下，磁力攪拌至粉末分散均勻后，冷凍干燥24-48h，得到膠原蛋白和氧化再生纖維素的復合材料Col-0.5％ORC。

2)取25mg復合材料Col-0.5％ORC，置于10ml乙醇/MES緩沖液(40％v/v)中，浸泡30min，過濾，棄濾液得過濾物；再按料液比1：3.5，取1mg過濾物和3.5ml乙醇/MES緩沖液(40％v/v)，浸泡4h后，緩慢添加EDC至濃度為15mg/mL，隨后再添加NHS至濃度為3.75mg/mL，反應4h后，用1M磷酸一氫鈉中和過量的EDC和NHS 1h，過濾，棄濾液，用去離子水洗滌30min，得交聯(lián)產(chǎn)物。

3)將交聯(lián)產(chǎn)物放入冷凍干燥機中干燥72h，得到ORC含量為0.5％的新型高效復合止血海綿Col-0.5％ORC，存儲于-20℃。

實施例3

(一)膠原蛋白海綿的制備：同實施例1

(二)復合止血海綿的制備

1)復合材料Col-ORC的制備：按照每10ml乙酸水溶液(1％v/v)加入0.06g膠原蛋白海綿(Col)，配制膠原蛋白乙酸水溶液。取100ml膠原蛋白乙酸水溶液，加入氧化再生纖維素(ORC)，氧化再生纖維素(ORC)的加入量為膠原蛋白質(zhì)量的1.0％，常溫下磁力攪拌至粉末分散均勻后，冷凍干燥24-48h，得到膠原蛋白與氧化再生纖維素的復合材料Col-1％ORC。

2)取25mg復合材料Col-0.25％ORC，置于10ml乙醇/MES緩沖液(40％v/v)中，浸泡30min，過濾，棄濾液得產(chǎn)物；再按料液比1：3.5，取1mg過濾物和3.5ml乙醇/MES緩沖液(40％v/v)，浸泡4h后，緩慢添加EDC至濃度為15mg/mL，隨后再添加NHS至濃度為3.75mg/mL，反應4h后，用1M磷酸一氫鈉中和過量的EDC和NHS 1h，過濾，棄濾液，用去離子水洗滌30min，得交聯(lián)產(chǎn)物。

3)將交聯(lián)產(chǎn)物放入冷凍干燥機中干燥72h，得到ORC含量為1％的新型高效復合止血海綿Col-1％ORC，存儲于-20℃。

實施例4效果實驗

1、圖1a和圖1b為膠原蛋白海綿和不同/氧化再生纖維素含量的復合止血海綿的SEM圖。由圖1a和圖1b可見，Control和Col的表面呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。當添加氧化再生纖維素短纖維后，呈束狀的氧化再生纖維素纖維穿插于膠原蛋白海綿中，導致一部分膠原蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)發(fā)生斷裂。測量不同海綿的平均孔徑數(shù)據(jù)表明，對比其他含氧化再生纖維素短纖維的海綿材料，自制的純膠原蛋白海綿Col孔徑最大，為209μm；而商品膠原蛋白海綿Control最小，為120μm。Col-0.25％ORC,Col-0.5％ORC和Col-1％ORC的孔徑大小分別為181.5μm,168.2μm和145.5μm。顯然，隨著氧化再生纖維素在Col/ORC復合物中含量的增多，材料的孔徑逐漸減小。

2、圖2為實施例1-實施例3制備的復合止血海綿的紅外譜圖，由圖2可見，3305cm^-1處的峰是分子間氫鍵O-H伸縮振動。-NH一般在3540～3180cm^-1有兩個弱而尖吸收峰。1632cm^-1，1543cm^-1以及1235cm^-1處的峰分別代表收縮振動在1680～1630cm^-1的C＝O(酰胺Ⅰ帶)，收縮振動在1570～1510cm^-1的酰胺Ⅱ帶，以及收縮振動在1335～1200cm^-1的酰胺Ⅲ帶。根據(jù)化學分子式和FT-IR光譜對ORC官能團的分析表明：1.在3420cm^-1處的特征峰-OH的收縮振動，一般在3400～3450cm^-1之間出現(xiàn)；2.1728cm^-1處的峰代表羧基C＝O的收縮振動，C＝O通常在3000cm^-1左右會有個小峰，在1700cm^-1會有強峰；3.1016cm^-1處的峰是CH₂OH中C-O的收縮振動。對比Col和Col/ORC的FTIR光譜，除了在1728cm^-1處輕微的羧基C＝O吸收振動外，無新的波峰出現(xiàn)。隨著氧化再生纖維素粉末在Col/ORC復合物中含量的增加，1080cm^-1處峰的強度和1728cm^-1處羧基C＝O的峰肩逐漸增加。這表明膠原蛋白和氧化再生纖維素之間發(fā)生了特殊的分子間相互作用。1080cm^-1處的峰在復合材料里可能是仲醇上C-O伸縮振動，也可能是膠原蛋白里與氨基相連的碳的C-H伸縮振動峰。1724cm^-1處的峰是ORC的酯鍵上C＝O伸縮振動特征峰，1314cm^-1處的峰可能是亞甲基的彎曲振動，也可能是酯的C-O伸縮振動，而1080cm^-1峰在復合材料里可能是仲醇上C-O伸縮振動，在膠原蛋白里則可能是與氨基相連的碳的C-H伸縮振動峰。

3、圖3為實施1、實施例2和實施例3制備的復合止血海綿對ACC-M細胞的細胞毒性。以各材料浸提液作用于ACC-M細胞1、3和5天進行MTT實驗觀察，分組為：Control(陰性對照，商品膠原蛋白海綿)，Col，含不同質(zhì)量分數(shù)ORC(0.25％,0.5％和1％)的膠原蛋白復合材料，空白對照(未做任何處理)，陽性對照(64g/L苯酚)。結(jié)果以隨時間變化的相對細胞活性表示，空白對照組細胞培養(yǎng)1天時的細胞活性作為對照，n＝6。(*P<0.05和**P<0.01，T-text)。除加入64g/L苯酚的陽性對照組之外，其他材料與ACC-M細胞培養(yǎng)1天和3天時均對細胞無毒性。Col-1％ORC組細胞在培養(yǎng)5天時，相對細胞活性值與空白對照組相比有統(tǒng)計學差異。膠原蛋白材料無毒性是由于提取自牛跟腱的膠原蛋白的生物安全性已被認可，材料的制備過程嚴格消毒，且未添加有毒化學試劑。而0.1％ORC組對培養(yǎng)5天后的細胞產(chǎn)生輕微毒性，分析原因可能是由于其羧基含量較多，長期的酸性環(huán)境下，抑制了對數(shù)生長期后細胞的生長。

4、采用實施例1制備的復合止血海綿進行急性全身毒性試驗，結(jié)果如表1。不論在檢測組還是對照組，所有小鼠均未發(fā)現(xiàn)死亡情況，且未發(fā)現(xiàn)任何急性全身毒性發(fā)作病理癥狀，表1的結(jié)果顯示所有測試小鼠在24h及72h的體重變化情況。所有小鼠體重均有增加，并未見明顯異常反應，說明材料無急性全身毒性。

表1急性毒性試驗監(jiān)測結(jié)果

5、圖4a-圖4d是Col與不同含量的Col/ORC復合止血海綿的拉伸強度對比，接觸角測定對比，海綿孔隙率對比，海綿吸水率對比。由圖4a-圖4d可見，理化性能測試結(jié)果顯示Col的拉伸強度最大，相比之下，Col-0.25％ORC的拉伸強度小于Col，且隨著復合材料中氧化再生纖維素含量的增加，材料的拉伸強度逐漸減小。此結(jié)果也與SEM圖像數(shù)據(jù)吻合，束狀的氧化再生纖維素纖維穿插于膠原蛋白之間，導致部分膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)發(fā)生斷裂?？傊?，對比其他測試材料，因為Col-0.25％ORC具有突出的孔隙率，表面濕潤性以及吸水性，同時在理化性能測試中，Col的拉伸強度最佳，Col-0.25％ORC次之。

6、復合止血海綿的止血性能如表2和圖5所示。通過對兔耳動脈損傷模型和肝損傷模型的止血時間和出血量進行評價。由表2和圖5可見，在耳動脈損傷模型中，四種材料(Col,Col-0.25％ORC,Col-0.5％ORC和Col-1％ORC)的止血時間明顯低于Control組136s的止血時間(P<0.05)。Col-0.25％ORC的止血速度(22.5±3.99s)最快，其次是Col-0.5％ORC，止血時間為30.5±8.29s。圖5顯示，四種材料(Col,Col-0.25％ORC,Col-0.5％ORC和Col-1％ORC)的出血量明顯低于出血量為82.95±2.67g的Control組(P<0.05)。Col-0.25％ORC(36.87±9.07g)和Col-0.5％ORC(33.28±10.08g)的出血量無明顯差異。Col-1％ORC和Col的出血量分別是49.18±8.29g和63.92±12.52g。

表2兩種創(chuàng)傷模型中Col及不同Col/ORC復合海綿的平均止血時間

7、圖6為不同材料分別植入兔腿部1天，7天，14天和28天后的局部組織病理圖(HE染色)。圖6為具有代表性的每種材料植入體內(nèi)1、7、14、28天時的組織學圖像。經(jīng)HE染色的材料呈不規(guī)則團狀或散在的碎片狀，顏色為比正常組織深的深紫色或深紅色。有些大塊材料并未著色，是由于材料的缺失或者切片及染色過程中存在未染色區(qū)域。植入1天后，一些未被染色的Col材料在肌肉組織內(nèi)呈島狀(圖6a)。圖6b可見真皮內(nèi)急性炎癥反應和散在的Col-ORC材料碎片被多核巨細胞吞噬。圖6c可見不規(guī)則的Control材料，可能由于部分肌細胞壞死所致。植入7天后，大量炎癥細胞浸潤，毛細血管出血以及成纖維細胞增生見于肌肉組織內(nèi)(圖6d)。在圖6e的頂部，可見炎癥細胞圍繞在未被染色呈島狀的Col/ORC材料周圍。圖6f所示，部分壞死的肌纖維被纖維性結(jié)締組織取代，可見不規(guī)則Control材料和多核巨細胞。植入14天后(圖6g-i)，三組均有炎癥反應，Col和Col-ORC組可見纖維組織增生。最后，殘留的Col-ORC和Control材料分別見于圖5h和圖6i。另外，Control組仍然存在多核巨細胞。植入28天后，各組肌肉組織內(nèi)均未見殘留的材料碎片(圖6j-l)。

由以上結(jié)果表明：FT-IR光譜結(jié)果表明氧化再生纖維素含有親水基團，因此具有很強的韌性。氧化再生纖維素粉末可增加膠原蛋白海綿的表面濕潤性、吸水性、拉伸強度?？傊?，對比其他測試材料，因為Col-0.25％ORC具有突出的孔隙率，表面濕潤性以及吸水性，同時在理化性能測試中，Col的拉伸強度最佳，Col-0.25％ORC次之。

與Control相比，Col和Col/ORC復合物具有卓越的止血性能。Col-0.25％ORC的止血作用比Col好是由于優(yōu)越的止血性能包括止血時間以及出血量。Col-0.25％ORC在止血時間上的優(yōu)勢主要歸因于兩個原因。首先，良好的表面濕潤性可以使血液快速浸入具有較大擴散面積的材料表面。其次，Col-0.25％ORC含有羧基親水基團以及良好的物理性能，從而增加了吸血量并且提供快速止血。

Col-0.25％ORC不僅可以快速吸收血液，還可以通過影響凝血因子直接參與止血過程，該材料的止血效果大幅提升，并可以在植入體內(nèi)28天后完全降解，對周圍組織無明顯異常影響。綜上所述，此復合材料可以作為止血填充體廣泛用于口腔頜面外科手術(shù)中，具有廣闊的應用前景。