本發(fā)明屬于生物與新醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及高穿透性腫瘤靶向生物膜載藥體系、主動靶向性高穿透性細胞的制備及其在抗腫瘤中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

本發(fā)明之前，包括傳統(tǒng)化療藥物、抗腫瘤藥物納米制劑在內(nèi)的多種抗腫瘤藥物多缺乏主動的腫瘤靶向性，治療效果差強人意。這些藥物進入人體后的分布多無組織特異性，且由于復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境，藥物無法滲透至腫瘤病灶深部，影響其抗腫瘤效果。至目前，經(jīng)過研究者們的不斷努力，也有不同類型的主動腫瘤靶向納米載體被研發(fā)出來，但這些技術(shù)大多限于實驗研究。近十年來，腫瘤納米靶向藥物載體領(lǐng)域發(fā)展迅速，制備載體的材料經(jīng)歷了一個由天然高分子材料到人工合成智能化材料再到天然材料的轉(zhuǎn)變過程。然而這些fda批準的材料仍然是異體物質(zhì)，我們迫切地想尋找到一種以人體自身物質(zhì)為材料構(gòu)建的納米藥物載體。

在越來越引起人們重視的免疫細胞治療領(lǐng)域，盡管存在類似于嵌合抗原受體t細胞療法等可以實現(xiàn)腫瘤的靶向性，但卻在實體瘤的治療中進展緩慢。免疫細胞難以有效進入腫瘤組織是其中一個重要的原因。因此，改善免疫細胞的主動靶向性與穿透性是進一步提高抗腫瘤治療效果的關(guān)鍵。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明是在考慮到目前研究進展、臨床迫切需求等信息后設(shè)計、實施的，其優(yōu)勢恰巧在于可以一定程度上克服上述局限。

本發(fā)明利用含有穿透肽irgd成分的物質(zhì)作為實現(xiàn)腫瘤主動靶向性、高穿透性的分子，將其修飾一段脂質(zhì)分子，形成一個能夠明確增強腫瘤靶向性的多用腫瘤靶向插件。成功構(gòu)建后經(jīng)反復(fù)實驗驗證，本發(fā)明具有明確腫瘤靶向性，能夠切實地增強免疫細胞、細胞膜制劑的腫瘤局部聚集，提高抗腫瘤治療效果。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：

實現(xiàn)主動腫瘤靶向、高穿透的含有穿透肽irgd成分的脂質(zhì)插件，該插件由含有高穿透肽irgd的成分以及dspe-peg-mal構(gòu)成，可嵌插在多種載藥體系、免疫細胞上，實現(xiàn)其主動腫瘤靶向性。

所述含有高穿透肽irgd的成分為irgd、含有irgd成分的多肽或融合蛋白如anti-egfr-irgd等以及含有irgd成分的其他物質(zhì)。

所述的主動腫瘤靶向、高穿透的含有穿透肽irgd成分的脂質(zhì)插件的制備方法為：通過加成方法(如邁克爾加成法)將含有穿透肽irgd的成分進行dspe-peg-mal修飾，再進行細胞或者細胞膜插入，具體包括以下步驟：

(1)含有穿透肽irgd成分的脂質(zhì)插件的制備方法：

將含有穿透肽irgd成分的多肽或蛋白與dspe-peg-mal以一定比例在緩沖液(如hepes緩沖液)中進行加成反應(yīng)(如邁克爾加成反應(yīng))，在一定溫度下置于搖床上孵育一段時間，反應(yīng)后溶液進行多次透析，透析后液體制備成凍干粉備用，得到含有irgd成分的多肽/蛋白-peg-dspe；

(2)插件修飾：

插件修飾細胞：將含有irgd成分的多肽/蛋白-peg-dspe與細胞37℃孵育一定時間(如30分鐘)，離心棄上清，用培養(yǎng)基重懸備用；

或者插件修飾生物膜類制劑：將含有irgd成分的多肽/蛋白-peg-dspe與生物膜類制劑37℃孵育一定時間(如30分鐘)，孵育后離心(參數(shù)舉例：14000rpm，15分鐘)，棄上清，沉淀加入適量生理鹽水重懸，探頭超聲一定時間(參數(shù)舉例：30s)進行重懸。

本發(fā)明還提供上述的主動腫瘤靶向、高穿透的含有穿透肽irgd成分的脂質(zhì)插件用于免疫治療及其他抗腫瘤治療，含有穿透肽irgd成分的脂質(zhì)插件作為腫瘤靶向分子在免疫治療和生物膜載體中用于腫瘤的治療。

含有穿透肽irgd成分的脂質(zhì)插件嵌插至各種細胞(如免疫細胞)，作為提高細胞靶向性應(yīng)用。細胞不受限于細胞類型及分子表型。

所述腫瘤不限于腫瘤類型。

含有穿透肽irgd成分的脂質(zhì)插件的液體制劑、粉劑，適于經(jīng)直腸、鼻內(nèi)、肺部、陰道內(nèi)、外部、口服或腸胃外，包括皮下、植入、靜脈內(nèi)、腹腔和肌內(nèi)給藥。

有益效果：

1、本發(fā)明所制備的含有irgd成分的多肽/蛋白-peg-dspe制備過程簡單、不涉及有毒有機溶劑、可重復(fù)性好。

2、高穿透性irgd成分使修飾的細胞積聚于腫瘤局部，同時使細胞在腫瘤局部獲得良好的穿透性，使其更多地進入腫瘤組織而發(fā)揮作用。

3、高穿透性irgd成分使修飾的細胞膜制劑積聚于腫瘤局部，并在腫瘤局部獲得良好的穿透性，使其更多地進入腫瘤組織而發(fā)揮抗腫瘤作用。

4、可選用生物膜為載體包載藥物(如紫杉醇等模式藥物)，將其用本發(fā)明所制備的含有irgd成分的多肽/蛋白-peg-dspe修飾后，具有更好的腫瘤靶向性、穿透性及抗腫瘤作用，具體表現(xiàn)參見附圖。

附圖說明

圖1——irgd-peg-dspe連接t細胞。

irgd嵌插上t細胞后，在流式細胞儀上可以檢測到穿透肽irgd的熒光峰向右偏移，證明irgd已連接至t細胞。

圖2——irgd-peg-dspe連接10^6個t細胞飽和量。

irgd-peg-dspe連接10^6個t細胞飽和量在3ug左右。

圖3——irgd、irgd-peg-dspe對t細胞活力的影響。

irgd-peg-dspe對t細胞活力的影響與irgd組相比無明顯差異。

圖4——irgd、irgd-peg-dspe對t細胞增殖能力的影響。

游離irgd+t細胞組、irgd嵌插t細胞組與單獨t細胞組相比，增殖能力未見明顯改變。

圖5——irgd、irgd-peg-dspe對t細胞體外殺傷能力的影響(靶細胞snu719)。

游離irgd+t細胞組、irgd嵌插t細胞組與單獨t細胞組相比，對腫瘤細胞snu719的殺傷能力類似。

圖6——t細胞三維球穿透實驗。

irgd嵌插t細胞組中，t細胞對腫瘤三維球的滲透明顯強于單獨t細胞組及游離irgd+t細胞組。

圖7——t細胞腫瘤組織靶向浸潤實驗(共聚焦結(jié)果圖)。

本實驗中，綠色熒光代表的t細胞，irgd嵌插t細胞組的腫瘤組織中的綠色熒光明顯強于游離irgd+t細胞組及單獨t細胞組。

圖8——t細胞腫瘤組織靶向浸潤實驗(近紅外結(jié)果圖)。

本實驗中，irgd嵌插t細胞組腫瘤組織處的信號明顯強于游離irgd+t細胞組及單獨t細胞組。

圖9——t細胞抑瘤實驗。

相比于對照組、單獨t細胞組及游離irgd+t細胞組，irgd嵌插t細胞組的腫瘤體積平均值最小，提示該組具有更好的抗腫瘤作用。

圖10——anti-egfr-irgd脂鏈修飾。

圖中泳道1系標準蛋白分子量，泳道2是表達純化后的anti-egfr-irgd融合蛋白，泳道3是anti-egfr-irgd脂鏈修飾后產(chǎn)物，泳道4是空白脂鏈，1、2、4泳道分別作為標準參照、陽性參照、內(nèi)部參照。

圖11——驗證納米抗體融合蛋白嵌插入生物膜。

圖11系流式細胞儀檢測結(jié)果，從左至右，第一幅圖是空白細胞本底，第2幅圖系anti-egfr-irgd脂鏈修飾后，分別驗證了紅細胞、白細胞、腫瘤細胞(由上至下)等多種不同細胞。

圖12——納米抗體融合蛋白與參照藥物共定位驗證。

圖12中藍色為腫瘤細胞核，綠色為包載的模式藥物，紅色為納米抗體融合蛋白。由圖可見，三者定位關(guān)系良好。

圖13——納米抗體融合蛋白修飾對于所包載藥物抗腫瘤作用的影響。

從圖13中可以看出，納米抗體融合蛋白的嵌插修飾并未降低模式藥物體外對腫瘤細胞株的抗腫瘤作用。

圖14——體內(nèi)腫瘤靶向性。

近紅外結(jié)果顯示，與單純模式藥物相比，納米抗體融合蛋白修飾后的荷瘤動物皮下瘤具有較強的熒光信號。這提示嵌插修飾的模式下，載體能更多地靶向至腫瘤區(qū)域，同時載體內(nèi)的藥物也更多地聚集至腫瘤部位。

圖15——藥物的滲透。

冰凍切片結(jié)果顯示，經(jīng)納米抗體融合蛋白修飾后的模式藥物，與模式藥物裸藥相比，能夠更多地進入腫瘤組織，且滲透到腫瘤組織的深部。

圖16——體內(nèi)抗腫瘤作用。

由圖16可見，相比于對照組、紅細胞膜載紫杉醇(ptx)單獨給藥組、融合蛋白與紅細胞膜載ptx系統(tǒng)共同給藥組，融合蛋白嵌插的紅細胞膜載ptx具有更好的抗腫瘤作用。

圖17——各組動物體重比較。

實驗動物對各組藥物的耐受性良好，各組無明顯體重差異。

圖18——各給藥組重要器官的毒性。

與對照組、單純模式藥物組相比，給予融合蛋白修飾后的模式藥物，各組小鼠的心、肝、脾、肺、腎等重要器官無明顯毒性。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和具體實施方式詳細說明，但不限制本發(fā)明。

實施例1

以irgd-peg-dspe修飾t細胞為例進行含有穿透肽irgd成分的脂質(zhì)插件修飾細胞。

本發(fā)明技術(shù)思路是：將脂鏈修飾的irgd嵌插至各種方式活化的免疫細胞表面，促進細胞在腫瘤中的靶向聚集，提高免疫細胞治療療效。本發(fā)明以eb病毒抗原肽刺激的細胞毒t淋巴細胞(ctl)細胞為例，但不受限于這種免疫細胞。

圖1-圖9是以irgd-peg-dspe修飾t細胞為例進行含有穿透肽irgd成分的脂質(zhì)插件修飾細胞的介紹。但本發(fā)明不受限于細胞的類型及分子表型。

具有主動腫瘤靶向能力的穿透肽插件的制備及其功能驗證如下：

1、irgd與脂鏈連接：

合成的irgd與dspe-peg3400-mal以一定的比例(如：摩爾比1:1)在緩沖液(如：hepes緩沖液ph＝6.5)中進行反應(yīng)(如：邁克爾加成反應(yīng))，室溫搖床孵育24-48h，反應(yīng)后溶液置于3000分子量透析袋中透析3次，每次至少8h，透析后液體制備成凍干粉備用。

2、外周血pbmc的獲取：

抽取健康人外周血于抗凝管；

用等體積生理鹽水稀釋；

在50ml離心管內(nèi)加入相同體積的人淋巴細胞分離液；

將生理鹽水稀釋后的細胞液用巴氏吸管沿管壁緩慢疊加于人淋巴細胞分離液上；

水平離心800g，20分鐘；

離心后管內(nèi)分為三層，中層界面處有一以單個核細胞為主的白膜層，即為外周血單個核細胞層；

用吸管吸到白膜層，吸取單個核細胞，置入另一個50ml離心管，補加生理鹽水，水平離心1000rpm，5分鐘；

棄上清，用aim-v培養(yǎng)液稀釋，細胞計數(shù)。

3、ebv-ctl培養(yǎng)：

將獲得的pbmc置于6孔板，aim-v培養(yǎng)液培養(yǎng)；

37℃，5％co2培養(yǎng)箱中孵育2h，使單核細胞貼壁；

2h后吸取懸浮細胞，調(diào)整濃度至1-2×10^6/ml，加入okt-3(50ng/ml)，il-2(300u/ml)進行t細胞活化擴增，每2-3天補加相應(yīng)濃度培養(yǎng)基及細胞因子；貼壁細胞加入2mlaim-v培養(yǎng)基，補充gm-csf(500u/ml)，il-4(500u/ml)，37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘導(dǎo)單核細胞向dc分化；

第六天加dc促成熟因子lps(100ng/ml)誘導(dǎo)dc成熟；

第七天獲得成熟dc，加入ebv抗原肽孵育5h后，將負載抗原肽的dc加入t細胞，補加il-7(10ng/ml)、il-15(10ng/ml)誘導(dǎo)ebv反應(yīng)性t細胞。

4、irgd修飾ctl：

irgd-peg-dspe與活化t細胞37℃孵育30分鐘，離心棄上清，用aim-v培養(yǎng)基重懸備用。

5、體外評估irgd、irgd-peg-dspe對t細胞增殖的影響：

將新分離的pbmc標記cfse，okt-3(50ng/ml)，il-2(300u/ml)活化，均分三組，分別為單獨t細胞組，游離irgd+t細胞組，irgd嵌插t細胞組；37℃孵箱培養(yǎng)4天，流式檢測細胞增殖水平。

6、體外評估irgd、irgd-peg-dspe對t細胞活力的影響：

將體外培養(yǎng)的ebv-ctl與不同濃度irgd、irgd-peg-cfse37℃孵育30分鐘，pi染色，流式檢測t細胞活力。

7、體外評估irgd、irgd-peg-dspe對t細胞殺傷能力的影響：

將體外培養(yǎng)的ebv-ctl分三組：單獨t細胞組，游離irgd+t細胞組，irgd嵌插t細胞組；分別按5：1、10：1、20：1的效靶比與cfse標記的snu719共孵育6-8小時，pi染色，流式檢測殺傷比例。

8、體外評估irgd、irgd-peg-cfse對活化t細胞三維球穿透能力的影響：

將hcg27按2000細胞/孔的數(shù)量接種于96孔超低吸附培養(yǎng)板，3天后形成直徑約500nm的三維細胞球，將cfse標記的t細胞分為單獨t細胞組、游離irgd+t細胞組、irgd嵌插t細胞組，按5：1比例分別加入各三維球培養(yǎng)孔中，37℃孵育24h，熒光顯微鏡觀察t細胞對三維球穿透水平。

9、體內(nèi)評估irgd-t細胞的腫瘤靶向性：

利用snu719細胞建立裸鼠皮下瘤模型。待裸鼠皮下瘤體積增至約100mm³時，隨機分為3組，即：單獨t細胞組、游離irgd+t細胞組、irgd嵌插t細胞組，每組至少3只，分別尾靜脈注射活化t細胞，irgd+t細胞，irgd嵌插的t細胞，每只鼠尾靜脈注射藥物100ul,給藥后2h、6h、24h、72h分別使用maestro^tmautomatedinvivoimagingsystem(cri)進行檢測。按同樣的方法將t細胞用cfse標記后按不同分組進行尾靜脈注射，24h后斷頸處死小鼠，取腫瘤組織，中性甲醛固定4h后用30％蔗糖脫水，24h后制備冰凍切片，anti-cd31抗體標記血管，dapi標記細胞核，共聚焦顯微鏡下觀察t細胞在腫瘤組織中浸潤水平。

10、體內(nèi)實驗評估irgd-t細胞的抗腫瘤作用：

選用24只生長良好的裸鼠，于每只鼠的腋下注射人snu719細胞懸液100ul，內(nèi)含腫瘤細胞約10^7個。待裸鼠皮下瘤體積增長至約100mm³時，隨機分為7組，即：對照組、單獨ctl組、ctl+irgd組、ctl-irgd組，每組6只，依次分別給予ns、ebv-ctl、ebv-ctl與irgd聯(lián)合給藥、ebv-ctl-irgd。每3-4天給藥一次，連續(xù)給藥三次。期間每兩天測量皮下瘤大小(v＝1/2長徑*短徑*短徑)、稱量裸鼠體重，同時觀察各組小鼠日常飲食、活動，給藥后第十五天處死小鼠，取出皮下瘤、心、肝、脾、肺、腎等組織備檢。

實施例2

以anti-egfr-irgd-peg-dspe修飾紅細胞膜載藥粒子為例進行含有穿透肽irgd成分的脂質(zhì)插件修飾細胞膜制劑。

本發(fā)明技術(shù)思路是：通過基因重組技術(shù)獲得anti-egfr-irgd基因編碼片段，將其轉(zhuǎn)入原核表達載體中，活化表達，表達后進行提取、純化，并進行鑒定。隨后，對制備的納米抗體融合蛋白進行脂質(zhì)修飾，嵌插至多種細胞膜載體等，實現(xiàn)載體的腫瘤靶向。

圖10-圖18是以anti-egfr-irgd-peg-dspe修飾紅細胞膜載藥粒子為例進行含有穿透肽irgd成分的脂質(zhì)插件修飾細胞膜制劑的介紹。但本發(fā)明不受限于anti-egfr-irgd融合蛋白、細胞膜的種類及包載藥物。

具有主動腫瘤靶向能力的納米抗體融合蛋白插件的制備及其功能驗證如下：

1、腫瘤靶向分子anti-egfr-irgd的表達純化：

通過基因重組技術(shù)獲得anti-egfr-irgd基因編碼片段，pcr擴增，構(gòu)建pet28a-anti-egfr–irgd蛋白表達載體，轉(zhuǎn)化至表達菌株bl21de3，搖菌，提取、純化并鑒定蛋白。

2、anti-egfr-irgd與脂鏈連接：

純化的anti-egfr-irgd與dspe-peg3400-mal以一定的比例(如：摩爾比1:1)在緩沖液(如：hepes緩沖液，ph＝6.5)中進行反應(yīng)(如：邁克爾加成反應(yīng))，室溫搖床孵育24-48h，反應(yīng)后溶液置于7000分子量透析袋中透析3次，每次至少8h，透析后液體制備成凍干粉備用。

3、載藥紅細胞膜納米粒子制備：

a)采集外周血，分離紅細胞，洗滌后低滲破膜，提取紅細胞膜；

b)得到紅細胞膜后，加生理鹽水重懸至2ml，置于冰水浴中超聲10min(80％，37khz)，至溶液透明；

c)向其中緩慢滴入200ul無水乙醇溶解的ptx1mg，磁力攪拌5min，隨后用探頭超聲1min；

d)超好后4℃14000rpm離心15min，棄上清，沉淀即載藥納米粒子，加入適量生理鹽水重懸，探頭超聲30s重懸。

4、融合蛋白脂質(zhì)插件修飾載藥紅細胞膜納米粒子：

dspe-peg-anti-egfr-irgd與載藥紅細胞膜納米粒子37℃孵育30min，孵育后14000rpm離心15min，棄上清，沉淀加入適量生理鹽水重懸，探頭超聲30s重懸，備用。

5、體外評估驗證納米抗體融合蛋白修飾與否對于載藥紅細胞膜納米粒子抗腫瘤作用的影響：

以胃癌mkn45細胞株為研究對象，以8000個細胞/孔密度接種96孔板，37℃孵育過夜，按0.05、0.2、1、5、20、100ng/ml濃度梯度分別加入rbc-ptx，anti-egfr-irgd-rbc-ptx，anti-egfr-irgd與rbc-ptx聯(lián)合給藥，空白細胞作為對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，吸出培養(yǎng)液，向每孔加入mtt溶液100ul，繼續(xù)培養(yǎng)4h，隨后棄去溶液每孔加入dmso溶解結(jié)晶150ul，酶標儀490nm檢測。

6、活體內(nèi)腫瘤靶向性評估：

利用mkn45細胞建立裸鼠皮下瘤模型。待裸鼠皮下瘤體積增至約100mm³時，隨機分為3組，即：單純rbc-ptx組、rbc-ptx與anti-egfr-irgd聯(lián)合給藥組、anti-egfr-irgd-rbc-ptx組，每組至少3只，依次分別給予rbc-dir、rbc-dir與anti-egfr-irgd聯(lián)合給藥、anti-egfr-irgd-rbc-dir，每只鼠尾靜脈注射藥物100ul，給藥后2h、24h、48h分別使用maestro^tmautomatedinvivoimagingsystem(cri)進行檢測。

7、體內(nèi)實驗評估融合蛋白脂質(zhì)修飾的載ptx紅細胞納米粒子腫瘤靶向性及抗腫瘤作用：

選用40只生長良好的裸鼠，于每只鼠的腋下注射人mkn45細胞懸液100ul，內(nèi)含腫瘤細胞約5x10^5個。待裸鼠皮下瘤體積增至約100mm³時，隨機分為4組，即：對照組、單純rbc-ptx組、rbc-ptx與anti-egfr-irgd聯(lián)合給藥組、anti-egfr-irgd-rbc-ptx組，每組10只，依次分別給予生理鹽水ns、rbc-ptx、rbc-ptx與anti-egfr-irgd聯(lián)合給藥、anti-egfr-irgd-rbc-ptx。荷瘤裸鼠的給藥量以ptx10mg/kg計，經(jīng)尾靜脈注射100ul，每周給藥2次，連續(xù)給藥2周。期間每兩天測量皮下瘤大小(v＝1/2長徑*短徑*短徑)、裸鼠體重，同時觀察各組小鼠日常飲食、活動，第十五天處死小鼠，取出皮下瘤、心、肝、脾、肺、腎等組織備檢。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)，對以上實施例所作的任何簡單的修改、等同替換與改進等，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護范圍之內(nèi)。