本發(fā)明屬靶向脂質(zhì)納米粒及制備方法，主要涉及一種肝癌靶向脂質(zhì)納米粒及其制備方法。

背景技術(shù)：

脂質(zhì)納米粒主要以室溫下為固態(tài)脂質(zhì)或少量液態(tài)油脂為載體，藥物分散或包裹于脂質(zhì)核中，制成粒徑約為50～1000nm的固體膠粒給藥體系，形成脂質(zhì)納米給藥系統(tǒng)。脂質(zhì)納米粒具有良好的生物相容性，同時可提高不穩(wěn)定藥物的穩(wěn)定性，具有緩控釋、長效作用?？刹捎靡欢ū壤囊簯B(tài)油或混合脂質(zhì)為組成部分，克服固體脂質(zhì)材料結(jié)晶度高、載藥量低等缺點，實現(xiàn)多種藥物的有效包封。脂質(zhì)納米粒表面亦可進(jìn)行不同修飾，如聚乙二醇、靶向多肽等，改善動物體內(nèi)分布，起到腫瘤靶向及增強(qiáng)藥效的作用。

靶向載體可提高藥物的靶向特異性，減少常規(guī)化療藥物由于對癌細(xì)胞沒有選擇性而導(dǎo)致的副作用。一些小分子多肽具備高特異性、高親和力等優(yōu)點，能夠靶向并作用于特定的受體，因而可被用作靶頭修飾藥物載體，如脂質(zhì)納米粒、聚合物膠束等，將非特異性的藥物靶向輸送至特定部位，提高抗癌效果并減少毒副作用。

奧沙利鉑是繼順鉑之后的第三代鉑類抗腫瘤藥物，以dna為靶點，與dna鏈上鳥嘌呤(g)共價結(jié)合，形成鏈內(nèi)交聯(lián)、鏈間交聯(lián)以及dna蛋白交聯(lián)，損傷dna，破壞dna復(fù)制，造成腫瘤細(xì)胞凋亡。奧沙利鉑在水性溶劑中微溶、乙醇中不溶，限制其臨床應(yīng)用及其給藥系統(tǒng)的設(shè)計。采用物理復(fù)合的方法，利用奧沙利鉑的氮原子有較強(qiáng)的失電子傾向、大豆磷脂磷脂酰膽堿的磷原子上羥基氧原子有較強(qiáng)得電子傾向，產(chǎn)生靜電作用形成復(fù)合物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供一種肝癌靶向脂質(zhì)納米粒，該靶向脂質(zhì)納米粒由a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物、單硬脂酸聚乙二醇酯、奧沙利鉑磷脂復(fù)合物及單硬脂酸甘油酯組成，其組成的重量百分比為：5.3～18.2wt％的a54多肽--聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物、5.2～18.2wt％的單硬脂酸聚乙二醇酯，15.2～35.0wt％的奧沙利鉑磷脂復(fù)合物、45.6～60.6wt％的單硬脂酸甘油酯。

本發(fā)明的第二個目的是提供a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物的合成方法，通過以下步驟實現(xiàn)：

稱取a54多肽，溶于無水二甲亞砜，配置成濃度為20mg/ml的溶液。按照摩爾比1:1～2(a54多肽：二碳酸二叔丁酯)加入二碳酸二叔丁酯，室溫反應(yīng)12h。取a54多肽3～5倍摩爾量的碳二亞胺和n-羥基琥珀酰亞胺，無水二甲亞砜，分別加入室溫反應(yīng)1.5h，得反應(yīng)液1。

反應(yīng)液滴加至a54多肽等摩爾的兩端氨基聚乙二醇無水二甲亞砜溶液，室溫反應(yīng)12h。加入與多肽等摩爾的n,n-二琥珀酰亞胺基碳酸酯，室溫反應(yīng)9h。另加入與多肽等摩爾硬脂胺的乙醇溶液，加熱超聲溶解，室溫反應(yīng)24h，得反應(yīng)也2。

反應(yīng)液2加入超純水，用濃鹽酸調(diào)ph值至1.0～2.0，室溫反應(yīng)2h，脫二碳酸二叔丁酯保護(hù)基。2m氫氧化鈉溶液調(diào)ph至7.0。反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至透析袋，超純水透析72h。透析后反應(yīng)產(chǎn)物冷凍干燥，得a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物。

本發(fā)明的第三個目的是提供所述肝癌靶向脂質(zhì)納米粒的制備方法，具體通過以下步驟實現(xiàn)：分別取2～8mg的a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物、2～8mg的單硬脂酸聚乙二醇酯，5～15mg的奧沙利鉑磷脂復(fù)合物、15～25mg的單硬脂酸甘油酯，精密稱定。置于4ml無水乙醇中，水浴50℃溶解，作為有機(jī)相。以蒸餾水為分散相，置50℃水浴中，400rpm機(jī)械攪拌條件下，將有機(jī)相快速注入40ml分散相，繼續(xù)攪拌5min，得肝癌靶向脂質(zhì)納米粒分散液。飽和氯化鈉溶液調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，絮凝納米粒，得肝癌靶向脂質(zhì)納米粒。

本發(fā)明的第四個目的是提供所述肝癌靶向脂質(zhì)納米粒在制備抗肝癌給藥系統(tǒng)中的應(yīng)用。所述肝癌因bel-7402細(xì)胞引起。bel-7402細(xì)胞是一種重要的組成肝癌的腫瘤細(xì)胞，靶向bel-7402細(xì)胞有助于抗肝癌藥物的開發(fā)和制備應(yīng)用。

本發(fā)明選取對肝癌bel-7402細(xì)胞高親和力的a54多肽，通過親水的聚乙二醇化學(xué)鏈接硬脂胺，制備a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物，作為靶頭。該嫁接物的十八碳鏈親脂性強(qiáng)，可插入脂質(zhì)納米粒脂質(zhì)核；a54多肽-聚乙二醇段，親水性較強(qiáng)，可分布在脂質(zhì)納米粒外圍，起到靶向作用。市售奧沙利鉑制劑多為藥物凍干粉針，而奧沙利鉑為水微溶藥物，不利于臨床應(yīng)用。本發(fā)明中肝癌靶向脂質(zhì)納米粒包封奧沙利鉑磷脂復(fù)合物制備納米給藥系統(tǒng)，應(yīng)用于肝癌藥物制備。修飾有a54多肽的肝癌靶向脂質(zhì)納米粒的細(xì)胞抗腫瘤藥效優(yōu)于非靶向脂質(zhì)納米粒，增強(qiáng)奧沙利鉑藥效。

附圖說明

圖1a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物合成反應(yīng)原料及產(chǎn)物薄層色譜圖。從左到右依次為a54多肽、聚乙二醇(peg)、硬脂胺(oda)及反應(yīng)產(chǎn)物(a54/peg/oda)。

圖2是肝癌靶向脂質(zhì)納米粒及普通脂質(zhì)納米粒的bel-7402細(xì)胞攝取熒光照片，標(biāo)尺20μm。

圖3肝癌靶向脂質(zhì)納米粒分別在bel-7402細(xì)胞、l-02細(xì)胞及hepg2細(xì)胞的攝取圖，標(biāo)尺20μm。

具體實施方式

本發(fā)明結(jié)合附圖和實施例作進(jìn)一步的說明。

一、a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物制備

實施例1：

取a54多肽10mg，精密稱定，溶于0.5ml無水二甲亞砜，配成濃度為20mg/ml的溶液。向a54多肽溶液中加入4μl二碳酸二叔丁酯試劑，磁力攪拌(300rpm)，室溫避光反應(yīng)12h。加入5mg的碳二亞胺和和3mg的n-羥基琥珀酰亞胺，室溫攪拌反應(yīng)1.5h，得反應(yīng)液1。另取17.6mg含有兩端氨基的聚乙二醇，精密稱定，溶于200μl無水二甲亞砜。將反應(yīng)液1滴加至聚乙二醇溶液，室溫攪拌反應(yīng)12h。加3mgn,n-二琥珀酰亞胺基碳酸酯，室溫攪拌反應(yīng)9h，得反應(yīng)液2。取硬脂胺2.36mg，精密稱定，水浴超聲溶于300μl無水乙醇后，加入反應(yīng)液2，室溫攪拌反應(yīng)24h。終反應(yīng)液中加入200μl超純水，滴加125μl濃鹽酸，與ph精密試紙對照，調(diào)ph值為1.5，繼續(xù)攪拌2h脫二碳酸二叔丁酯。2m氫氧化鈉溶液調(diào)ph至7.0。將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至透析袋(mwco1000da)，去離子水透析72h，去除二甲亞砜及水溶性副產(chǎn)物，透析后產(chǎn)物冷凍干燥，得a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物。

實施例2：

取a54多肽10mg，精密稱定，溶于0.5ml無水二甲亞砜，配成濃度為20mg/ml的溶液。向a54多肽溶液中加入6μl二碳酸二叔丁酯試劑，磁力攪拌(300rpm)，室溫避光反應(yīng)12h。加入5mg的碳二亞胺和和3mg的n-羥基琥珀酰亞胺，室溫攪拌反應(yīng)1.5h，得反應(yīng)液1。另取17.6mg含有兩端氨基的聚乙二醇，精密稱定，溶于200μl無水二甲亞砜。將反應(yīng)液1滴加至聚乙二醇溶液，室溫攪拌反應(yīng)12h。加3mgn,n-二琥珀酰亞胺基碳酸酯，室溫攪拌反應(yīng)9h，得反應(yīng)液2。取硬脂胺2.36mg，精密稱定，水浴超聲溶于300μl無水乙醇后，加入反應(yīng)液2，室溫攪拌反應(yīng)24h。終反應(yīng)液中加入200μl超純水，滴加120μl濃鹽酸，ph精密試紙對照，調(diào)ph值約為2.0，繼續(xù)攪拌2h脫二碳酸二叔丁酯。2m氫氧化鈉溶液調(diào)ph至7.0。將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至透析袋(mwco1000da)，去離子水透析72h，去除二甲亞砜及水溶性副產(chǎn)物，透析后產(chǎn)物冷凍干燥，得a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物。

實施例3：

取a54多肽10mg，精密稱定，溶于0.5ml無水二甲亞砜，配成濃度為20mg/ml的溶液。向a54多肽溶液中加入6μl二碳酸二叔丁酯試劑，磁力攪拌(300rpm)，室溫避光反應(yīng)12h。加入6mg的碳二亞胺和和3.6mg的n-羥基琥珀酰亞胺，室溫攪拌反應(yīng)1.5h，得反應(yīng)液1。另取17.6mg含有兩端氨基的聚乙二醇，精密稱定，溶于200μl無水二甲亞砜。將反應(yīng)液1滴加至聚乙二醇溶液，室溫攪拌反應(yīng)12h。加3mgn,n-二琥珀酰亞胺基碳酸酯，室溫攪拌反應(yīng)9h，得反應(yīng)液2。取硬脂胺2.36mg，精密稱定，水浴超聲溶于300μl無水乙醇后，加入反應(yīng)液2，室溫攪拌反應(yīng)24h。終反應(yīng)液中加入200μl超純水，滴加130μl濃鹽酸，ph精密試紙對照，調(diào)ph值約為1.0，繼續(xù)攪拌2h脫二碳酸二叔丁酯。2m氫氧化鈉溶液調(diào)ph至7.0。將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至透析袋(mwco1000da)，去離子水透析72h，去除二甲亞砜及水溶性副產(chǎn)物，透析后產(chǎn)物冷凍干燥，得a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物。

實施例4：

取a54多肽10mg，精密稱定，溶于0.5ml無水二甲亞砜，配成濃度為20mg/ml的溶液。向a54多肽溶液中加入8μl二碳酸二叔丁酯試劑，磁力攪拌(300rpm)，室溫避光反應(yīng)12h。加入8.5mg的碳二亞胺和和5.1mg的n-羥基琥珀酰亞胺，室溫攪拌反應(yīng)1.5h，得反應(yīng)液1。另取17.6mg含有兩端氨基的聚乙二醇，精密稱定，溶于200μl無水二甲亞砜。將反應(yīng)液1滴加至聚乙二醇溶液，室溫攪拌反應(yīng)12h。加3mgn,n-二琥珀酰亞胺基碳酸酯，室溫攪拌反應(yīng)9h，得反應(yīng)液2。取硬脂胺2.36mg，精密稱定，水浴超聲溶于300μl無水乙醇后，加入反應(yīng)液2，室溫攪拌反應(yīng)24h。終反應(yīng)液中加入200μl超純水，滴加120μl濃鹽酸，ph精密試紙對照，調(diào)ph值約為2.0，繼續(xù)攪拌2h脫二碳酸二叔丁酯。2m氫氧化鈉溶液調(diào)ph至7.0。將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至透析袋(mwco1000da)，去離子水透析72h，去除二甲亞砜及水溶性副產(chǎn)物，透析后產(chǎn)物冷凍干燥，得a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物。

實施例5：

取a54多肽10mg，精密稱定，溶于0.5ml無水二甲亞砜，配成濃度為20mg/ml的溶液。向a54多肽溶液中加入8μl二碳酸二叔丁酯試劑，磁力攪拌(300rpm)，室溫避光反應(yīng)12h。加入8.5mg的碳二亞胺和和5.1mg的n-羥基琥珀酰亞胺，室溫攪拌反應(yīng)1.5h，得反應(yīng)液1。另取17.6mg含有兩端氨基的聚乙二醇，精密稱定，溶于200μl無水二甲亞砜。將反應(yīng)液1滴加至聚乙二醇溶液，室溫攪拌反應(yīng)12h。加3mgn,n-二琥珀酰亞胺基碳酸酯，室溫攪拌反應(yīng)9h，得反應(yīng)液2。取硬脂胺2.36mg，精密稱定，水浴超聲溶于300μl無水乙醇后，加入反應(yīng)液2，室溫攪拌反應(yīng)24h。終反應(yīng)液中加入200μl超純水，滴加125μl濃鹽酸，ph精密試紙對照，調(diào)ph值約為1.5，繼續(xù)攪拌2h脫二碳酸二叔丁酯。2m氫氧化鈉溶液調(diào)ph至7.0。將反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至透析袋(mwco1000da)，去離子水透析72h，去除二甲亞砜及水溶性副產(chǎn)物，透析后產(chǎn)物冷凍干燥，得a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物。薄層色譜法根據(jù)反應(yīng)原料及產(chǎn)物的極性不同，確證嫁接物生成(附圖1)。

二、肝癌靶向脂質(zhì)納米粒的制備及特征

采用溶劑揮發(fā)法制備奧沙利鉑磷脂復(fù)合物。取10mg奧沙利鉑，精密稱定，加入10ml甲醇，水浴超聲溶解，配成1.0mg/ml的奧沙利鉑/甲醇溶液。另取大豆磷脂，溶于二氯甲烷，配成40.0mg/ml的磷脂/二氯甲烷溶液。奧沙利鉑/甲醇溶液于30℃水浴鍋中預(yù)熱。量取0.625ml的二氯甲烷溶液，滴加至奧沙利鉑/甲醇溶液，30℃磁力攪拌(400rpm)2h。35℃水浴真空旋蒸，形成磷脂薄膜，5ml乙醇分散薄膜。分散液于1000rpm離心10min，除去未溶解固體，上清烘干，得奧沙利鉑磷脂復(fù)合物。復(fù)合物中奧沙利鉑與大豆磷脂的質(zhì)量比為0.21±0.04。

實施例1：

分別取2mg的a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物、4mg的單硬脂酸聚乙二醇酯、12mg奧沙利鉑磷脂復(fù)合物、20mg單硬脂酸甘油酯，置于4ml無水乙醇，水浴50℃加熱溶解，作為有機(jī)相。以超純水為分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力攪拌條件下，將有機(jī)相快速注入40ml分散相，繼續(xù)攪拌5min，得到肝癌靶向脂質(zhì)納米粒分散液。飽和氯化鈉溶液1ml調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，絮凝納米粒，得肝癌靶向脂質(zhì)納米粒。經(jīng)測定肝癌靶向脂質(zhì)納米粒的粒徑為63.6nm，電位為-19.0mv。

實施例2：

分別取4mg的a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物、4mg的單硬脂酸聚乙二醇酯、12mg奧沙利鉑磷脂復(fù)合物、20mg單硬脂酸甘油酯，置于4ml無水乙醇，水浴50℃加熱溶解，作為有機(jī)相。以超純水為分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力攪拌條件下，將有機(jī)相快速注入40ml分散相，繼續(xù)攪拌5min，得到肝癌靶向脂質(zhì)納米粒分散液。飽和氯化鈉溶液1ml調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，絮凝納米粒，得肝癌靶向脂質(zhì)納米粒。經(jīng)測定肝癌靶向脂質(zhì)納米粒的粒徑為64.1nm，電位為-18.5mv。

實施例3：

分別取6mg的a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物、4mg的單硬脂酸聚乙二醇酯、12mg奧沙利鉑磷脂復(fù)合物、20mg單硬脂酸甘油酯，置于4ml無水乙醇，水浴50℃加熱溶解，作為有機(jī)相。以超純水為分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力攪拌條件下，將有機(jī)相快速注入40ml分散相，繼續(xù)攪拌5min，得到肝癌靶向脂質(zhì)納米粒分散液。飽和氯化鈉溶液1ml調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，絮凝納米粒，得肝癌靶向脂質(zhì)納米粒。經(jīng)測定肝癌靶向脂質(zhì)納米粒的粒徑為62.5nm，電位為-18.0mv。

實施例4：

分別取8mg的a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物、4mg的單硬脂酸聚乙二醇酯、12mg奧沙利鉑磷脂復(fù)合物、20mg單硬脂酸甘油酯，置于4ml無水乙醇，水浴50℃加熱溶解，作為有機(jī)相。以超純水為分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力攪拌條件下，將有機(jī)相快速注入40ml分散相，繼續(xù)攪拌5min，得到肝癌靶向脂質(zhì)納米粒分散液。飽和氯化鈉溶液1ml調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，絮凝納米粒，得肝癌靶向脂質(zhì)納米粒。經(jīng)測定肝癌靶向脂質(zhì)納米粒的粒徑為65.6nm，電位為-17.8mv。

實施例5：

分別取4mg的a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物、2mg的單硬脂酸聚乙二醇酯、12mg奧沙利鉑磷脂復(fù)合物、20mg單硬脂酸甘油酯，置于4ml無水乙醇，水浴50℃加熱溶解，作為有機(jī)相。以超純水為分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力攪拌條件下，將有機(jī)相快速注入40ml分散相，繼續(xù)攪拌5min，得到肝癌靶向脂質(zhì)納米粒分散液。飽和氯化鈉溶液1ml調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，絮凝納米粒，得肝癌靶向脂質(zhì)納米粒。經(jīng)測定肝癌靶向脂質(zhì)納米粒的粒徑為65.8nm，電位為-18.2mv。

實施例6：

分別取4mg的a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物、6mg的單硬脂酸聚乙二醇酯、12mg奧沙利鉑磷脂復(fù)合物、20mg單硬脂酸甘油酯，置于4ml無水乙醇，水浴50℃加熱溶解，作為有機(jī)相。以超純水為分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力攪拌條件下，將有機(jī)相快速注入40ml分散相，繼續(xù)攪拌5min，得到肝癌靶向脂質(zhì)納米粒分散液。飽和氯化鈉溶液1ml調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，絮凝納米粒，得肝癌靶向脂質(zhì)納米粒。經(jīng)測定肝癌靶向脂質(zhì)納米粒的粒徑為63.2nm，電位為-18.6mv。

實施例7：

分別取4mg的a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物、8mg的單硬脂酸聚乙二醇酯、12mg奧沙利鉑磷脂復(fù)合物、20mg單硬脂酸甘油酯，置于4ml無水乙醇，水浴50℃加熱溶解，作為有機(jī)相。以超純水為分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力攪拌條件下，將有機(jī)相快速注入40ml分散相，繼續(xù)攪拌5min，得到肝癌靶向脂質(zhì)納米粒分散液。飽和氯化鈉溶液1ml調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，絮凝納米粒，得肝癌靶向脂質(zhì)納米粒。經(jīng)測定肝癌靶向脂質(zhì)納米粒的粒徑為62.0nm，電位為-17.8mv。

實施例8：

分別取4mg的a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物、4mg的單硬脂酸聚乙二醇酯、5mg奧沙利鉑磷脂復(fù)合物、20mg單硬脂酸甘油酯，置于4ml無水乙醇，水浴50℃加熱溶解，作為有機(jī)相。以超純水為分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力攪拌條件下，將有機(jī)相快速注入40ml分散相，繼續(xù)攪拌5min，得到肝癌靶向脂質(zhì)納米粒分散液。飽和氯化鈉溶液1ml調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，絮凝納米粒，得肝癌靶向脂質(zhì)納米粒。經(jīng)測定肝癌靶向脂質(zhì)納米粒的粒徑為68.3nm，電位為-19.0mv。

實施例9：

分別取4mg的a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物、4mg的單硬脂酸聚乙二醇酯、10mg奧沙利鉑磷脂復(fù)合物、20mg單硬脂酸甘油酯，置于4ml無水乙醇，水浴50℃加熱溶解，作為有機(jī)相。以超純水為分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力攪拌條件下，將有機(jī)相快速注入40ml分散相，繼續(xù)攪拌5min，得到肝癌靶向脂質(zhì)納米粒分散液。飽和氯化鈉溶液1ml調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，絮凝納米粒，得肝癌靶向脂質(zhì)納米粒。經(jīng)測定肝癌靶向脂質(zhì)納米粒的粒徑為62.8nm，電位為-17.8mv。

實施例10：

分別取4mg的a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物、4mg的單硬脂酸聚乙二醇酯、15mg奧沙利鉑磷脂復(fù)合物、20mg單硬脂酸甘油酯，置于4ml無水乙醇，水浴50℃加熱溶解，作為有機(jī)相。以超純水為分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力攪拌條件下，將有機(jī)相快速注入40ml分散相，繼續(xù)攪拌5min，得到肝癌靶向脂質(zhì)納米粒分散液。飽和氯化鈉溶液1ml調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，絮凝納米粒，得肝癌靶向脂質(zhì)納米粒。經(jīng)測定肝癌靶向脂質(zhì)納米粒的粒徑為59.6nm，電位為-19.6mv。

實施例11：

分別取4mg的a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物、4mg的單硬脂酸聚乙二醇酯、10mg奧沙利鉑磷脂復(fù)合物、15mg單硬脂酸甘油酯，置于4ml無水乙醇，水浴50℃加熱溶解，作為有機(jī)相。以超純水為分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力攪拌條件下，將有機(jī)相快速注入40ml分散相，繼續(xù)攪拌5min，得到肝癌靶向脂質(zhì)納米粒分散液。飽和氯化鈉溶液1ml調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，絮凝納米粒，得肝癌靶向脂質(zhì)納米粒。經(jīng)測定肝癌靶向脂質(zhì)納米粒的粒徑為63.4nm，電位為-18.7mv。

實施例12：

分別取4mg的a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物、4mg的單硬脂酸聚乙二醇酯、10mg奧沙利鉑磷脂復(fù)合物、20mg單硬脂酸甘油酯，置于4ml無水乙醇，水浴50℃加熱溶解，作為有機(jī)相。以超純水為分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力攪拌條件下，將有機(jī)相快速注入40ml分散相，繼續(xù)攪拌5min，得到肝癌靶向脂質(zhì)納米粒分散液。飽和氯化鈉溶液1ml調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，絮凝納米粒，得肝癌靶向脂質(zhì)納米粒。經(jīng)測定肝癌靶向脂質(zhì)納米粒的粒徑為67.6nm，電位為-17.2mv。

實施例13：

分別取4mg的a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物、4mg的單硬脂酸聚乙二醇酯、10mg奧沙利鉑磷脂復(fù)合物、25mg單硬脂酸甘油酯，置于4ml無水乙醇，水浴50℃加熱溶解，作為有機(jī)相。以超純水為分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力攪拌條件下，將有機(jī)相快速注入40ml分散相，繼續(xù)攪拌5min，得到肝癌靶向脂質(zhì)納米粒分散液。飽和氯化鈉溶液1ml調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，絮凝納米粒，得肝癌靶向脂質(zhì)納米粒。經(jīng)測定肝癌靶向脂質(zhì)納米粒的粒徑為65.9nm，電位為-18.8mv。

三、肝癌靶向脂質(zhì)納米粒作為藥物載體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用

實施例1：

分別取4mg的單硬脂酸聚乙二醇酯、12mg大豆磷脂、20mg單硬脂酸甘油酯、0.4mg異硫氰酸熒光素-硬脂胺，精密稱定，置于4ml無水乙醇，水浴50℃加熱溶解，，作為有機(jī)相。以蒸餾水為分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力攪拌條件下，將有機(jī)相快速注入40ml分散相，繼續(xù)攪拌5min，得異硫氰酸熒光素標(biāo)記未的普通脂質(zhì)納米粒。

分別稱取4mg的a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物、4mg的單硬脂酸聚乙二醇酯、12mg大豆磷脂、20mg單硬脂酸甘油酯、0.4mg異硫氰酸熒光素-硬脂胺，精密稱定，置于4ml無水乙醇中，水浴50℃加熱溶解，作為有機(jī)相。以蒸餾水為分散相，置50℃水浴中，在400rpm磁力攪拌條件下，將有機(jī)相快速注入40ml分散相，繼續(xù)攪拌5min，得到異硫氰酸熒光素標(biāo)記未包封奧沙利鉑的肝癌靶向脂質(zhì)納米粒。

取生長狀態(tài)良好的肝癌bel-7402細(xì)胞，以5×10⁴/ml密度接種于覆有蓋玻片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃、5％co2條件下孵育。細(xì)胞貼壁后，加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的普通脂質(zhì)納米粒及肝癌靶向脂質(zhì)納米粒，培養(yǎng)液中終濃度均為20μg/ml。孵育0.5、2、6h后，pbs清洗除去細(xì)胞表面吸附的納米粒。4％多聚甲醛固定15min，甘油封片，激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。攝取圖參見圖2，a54多肽修飾可促進(jìn)肝癌bel-7402細(xì)胞對納米粒的攝取。

實施例2：

正常肝細(xì)胞l-02、肝癌細(xì)胞hepg2及bel-7402細(xì)胞，以相同的密度(2×10⁵個/ml)分別接種于置有方形玻片的24孔板中。細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞染料pkh67加入培養(yǎng)有bel-7402細(xì)胞的培養(yǎng)孔內(nèi)，染料終濃度50μg/ml，37℃孵育10min，培養(yǎng)液清洗去除游離染料。將覆有bel-7402細(xì)胞的方形玻片分別與覆有l(wèi)-02細(xì)胞或hepg2細(xì)胞的方形玻片置于六孔板的同一孔中。加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的肝癌靶向脂質(zhì)納米粒，37℃孵育1h。核染試劑hoechst33342染色10min，pbs沖洗細(xì)胞3次，4％甲醛固定。甘油封片后，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞攝取，并拍攝熒光照片。

攝取結(jié)果參見圖3，與共孵育的l-02及hepg2細(xì)胞相比，bel-7402細(xì)胞的熒光強(qiáng)度更高。表明經(jīng)a54多肽修飾的肝癌靶向脂質(zhì)納米粒，對細(xì)胞具有較明顯的選擇性，優(yōu)先被bel-7402細(xì)胞攝取，正常細(xì)胞及其他肝癌細(xì)胞攝取較少。

實施例3：

分別取10mg奧沙利鉑磷脂復(fù)合物、30mg單硬脂酸甘油酯，置于4ml無水乙醇，水浴50℃加熱溶解，作為有機(jī)相。以超純水為分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力攪拌條件下，將有機(jī)相快速注入40ml分散相，繼續(xù)攪拌5min，得到非靶向脂質(zhì)納米粒分散液。飽和氯化鈉溶液1ml調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，絮凝納米粒，得非靶向脂質(zhì)納米粒。

分別取4mg的a54多肽-聚乙二醇-十八碳鏈嫁接物、4mg的單硬脂酸聚乙二醇酯、10mg奧沙利鉑磷脂復(fù)合物、22mg單硬脂酸甘油酯，置于4ml無水乙醇，水浴50℃加熱溶解，作為有機(jī)相。以超純水為分散相，置50℃水浴，在400rpm磁力攪拌條件下，將有機(jī)相快速注入40ml分散相，繼續(xù)攪拌5min，得到肝癌靶向脂質(zhì)納米粒分散液。飽和氯化鈉溶液1ml調(diào)節(jié)離子強(qiáng)度，絮凝納米粒，得肝癌靶向脂質(zhì)納米粒

mtt法考察肝癌靶向脂質(zhì)納米粒及非靶向脂質(zhì)納米粒的的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞藥效。bel-7402細(xì)胞分別以1×10⁴個/孔的密度接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后，按預(yù)先設(shè)計的藥物濃度梯度分別加入兩種脂質(zhì)納米粒。以未加藥處理的空白細(xì)胞為對照，每個濃度設(shè)定三個平行組。孵育后，照mtt法，測定570nm處吸光度，按式(1)計算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率(％)＝a570(樣品)/a570對照品100％(1)

其中a570(樣品)為加入納米混懸液的細(xì)胞吸收度，a570(對照)為空白對照的細(xì)胞吸收度。經(jīng)測定，肝癌靶向脂質(zhì)納米粒及的非靶向脂質(zhì)納米粒bel-7402細(xì)胞ic50值分別為16.0±1.2μg/ml及22.5±3.7μg/m，a54多肽修飾脂質(zhì)納米?？稍鰪?qiáng)奧沙利鉑的肝癌腫瘤細(xì)胞治療效果。